BRPI0417592B1 - Molécula de dna, segmento de ácido nucleico, polinucleotídeo, sonda e métodos para detecção de evento de milho e determinação de zigosidade do mesmo - Google Patents
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Abstract
"planta de milho mon88017 e composições e métodos para detecção da mesma". a presente invenção proporciona uma planta de milho designada mon88017 e composições de dna contidas na mesma. também são proporcionados testes para detectar a presença da planta de milho mon88017 baseados na seqüência de dna e o uso desta seqüência de dna como um marcador molecular em um método de detecção de dna.
Description
[001] Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório No. 60/529.477, arquivado em 15 de dezembro de 2003.
[002] A presente invenção refere-se ao campo da biologia mole cular vegetal. Mais especificamente, a invenção se refere a uma planta de milho MON88017 tolerante a glifosato e resistente a insetos e a testes e métodos para detectar a presença de DNA da planta de milho MON88017 em uma amostra de planta e composições da mesma.
[003] O milho é uma colheita importante e é uma fonte de alimen to essencial em muitas áreas do mundo. Os métodos de biotecnologia têm sido aplicados ao milho para melhora das características agronômicas e da qualidade do produto. Uma característica agronômica semelhante é a tolerância a herbicidas, em particular, tolerância ao herbicida de glifosato. Esta característica no milho tem sido conferida pela expressão de um transgene na planta de milho que expressa uma 5- enolpiruvil-3-fosfoshiquimato sintase resistente a glifosato (CP4 EPSPS, Patente dos Estados Unidos No. 5.633.435). Outra característica agronômica é resistência a insetos, por exemplo resistência da planta de milho produzida por engenharia genética à broca do milho e à lagarta da raiz (rootworm) do milho (Patente dos Estados Unidos No. 6.489.542 e Patente dos Estados Unidos No. 6.620.988). Seria vantajoso ser capaz de detectar a presença de DNA transgênico/genômico de uma planta em particular de modo a determinar se a progênie de um cruzamento sexual contém o DNA transgênico/genômico de interesse. Além disso, um método para detectar uma planta em particular seria útil ao obedecer aos regulamentos exigidos para a pré-aprovação do mercado e a rotulação de alimentos derivados das plantas de safras recombinantes.
[004] Sabe-se que a expressão de genes estranhos em plantas é influenciada por sua posição cromossômica, talvez devido à estrutura da cromatina (por exemplo, heterocromatina) ou à proximidade de elementos de regulação transcricional (por exemplo, reforçadores) junto ao sítio de integração (Weising et al., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988). Por este motivo, freqüentemente é necessário triar um grande número de plantas de modo a identificar uma planta caracterizada por expressão ótima de um gene de interesse introduzido. Por exemplo, tem sido observado em plantas e em outros organismos que pode haver uma ampla variação em níveis de expressão de um transgene introduzido entre as plantas. Também pode haver diferenças em padrões de expressão espaciais ou temporais, por exemplo, diferenças na expressão relativa de um transgene em vários tecidos vegetais, que podem não corresponder aos padrões esperados de elementos regula- tórios transcricionais presentes no constructo genético introduzido. Por este motivo, é comum produzir centenas a milhares de diferentes plantas transgênicas e triar estas plantas para uma única planta que tenha fenótipo e níveis desejados de expressão de transgene para fins comerciais. Uma planta que tenha níveis desejados ou padrões de expressão de transgene é útil para introgressar o transgene em outros antecedentes genéticos por reprodução sexual usando métodos de reprodução convencionais. A progênie de semelhantes cruzamentos mantêm as características de expressão de transgene do transforman- te original. Esta estratégia é usada para assegurar expressão genética confiável em uma série de variedades que são bem-adaptadas às condições locais de crescimento e às demandas de mercado.
[005] É possível detectar a presença de um transgene por quais quer métodos de detecção de ácido nucléico de conhecimento geral tais como reação de cadeia polimerase (PCR) ou hibridização de DNA usando sondas de ácido polinucléico. Estes métodos de detecção usam de modo geral moléculas de iniciadores ou sondas de DNA que são específicas para os elementos genéticos, tais como promotores, líderes, íntrons, regiões codificantes, 3' terminadores de transcrição, marcadores genéticos, e etc., que são os componentes dos transgenes de um constructo de DNA. Em conseqüência, os métodos referidos podem não ser úteis para discriminar entre diferentes eventos transgênicos, particularmente os produzidos usando o mesmo cons- tructo de DNA transgênico a menos que seja conhecida a seqüência de DNA genômico adjacente ao DNA transgênico inserido. Têm sido desenvolvidos métodos de detecção de DNA evento-específicos para muitas introduções de plantas de safras transgênicas, por exemplo beterraba sacarina (patente dos Estados Unidos No. 6.531.649), trigo (publicação de patente dos Estados Unidos No. 20020062503), milho resistente a inseto (publicação de patente dos Estados Unidos No. 20020102582), e um milho evento nk603 tolerante a glifosato (publicação de patente dos Estados Unidos No. 20020013960).
[006] A presente invenção se refere a uma planta de milho MON88017 tolerante a glifosato e resistente à lagarta da raiz do milho, e composições contidas na mesma, e ao método para a detecção da região de inserção transgênica/genômica na planta de milho MON88017 e progênie da mesma contendo estas composições.
[007] A presente invenção se refere à planta de milho transgênico designada MON88017 tendo semente depositada na American Type Culture Collection (ATCC) com No. de Acesso PTA-5582. Outro aspec- to da invenção compreende as plantas da progênie, ou sementes, ou partes regeneráveis das plantas e sementes da planta MON88017. A invenção também inclui partes de planta da planta de milho MON88017 que incluem, porém não estão limitadas a pólen, óvulo, semente, raízes, e folhas. A invenção se refere a uma planta de milho MON88017 tendo um fenótipo tolerante a glifosato e um fenótipo resistente à lagarta da raiz do milho e as novas composições genéticas contidas no genoma de MON88017.
[008] Um aspecto da invenção proporciona composições de DNA e métodos para detectar a presença de uma região de junção transgê- nica/genômica da planta de milho MON88017. São proporcionadas moléculas de DNA isoladas que compreendem no mínimo uma molécula de DNA de junção transgênica/genômica selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, e complementos da mesma, em que a molécula da junção atravessa o sítio de inserção transgênica, o qual compreende um DNA heterólogo inserido no ge- noma do milho e DNA genômico de milho flanqueando o sítio de inserção na planta de milho MON88017. Uma semente de milho e material da planta da mesma compreendendo qualquer uma destas moléculas de DNA é um aspecto desta invenção.
[009] É proporcionada uma molécula de DNA isolada que é uma região transgênica/genômica SEQ ID NO:3 ou o complemento da mesma, em que esta molécula de DNA é nova no genoma da planta de milho MON88017. Uma planta de milho e semente compreendendo SEQ ID NO:3 em seu genoma é um aspecto desta invenção.
[0010] De acordo com outro aspecto da invenção, é proporcionada uma molécula de DNA isolada que é uma região transgênica/genômica SEQ ID NO:4, ou o complemento da mesma, em que esta molécula de DNA é nova no genoma da planta de milho MON88017. Uma planta de milho e semente compreendendo SEQ ID NO:4 em seu genoma é um aspecto desta invenção.
[0011] É proporcionada uma molécula de DNA isolada que é uma região transgênica/genômica, SEQ ID NO:5 de MON88017 ou o complemento da mesma, em que esta molécula de DNA é nova no geno- ma da planta de milho MON88017. Uma planta de milho e semente compreendendo SEQ ID NO:5 em seu genoma é um aspecto desta invenção.
[0012] De acordo com outro aspecto da invenção, são proporcio nadas duas moléculas de DNA compreendendo um par de primers para uso em um método de detecção de DNA, em que a primeira molécula de DNA compreende no mínimo 11 ou mais polinucleotídeos contíguos de qualquer porção da região de DNA transgênico da molécula de DNA de SEQ ID NO:3 ou o complemento da mesma, e uma segunda molécula de DNA compreendendo no mínimo 11 ou mais polinucle- otídeos contíguos de qualquer porção de uma região de DNA genômi- co de milho de SEQ ID NO:3 ou complemento da mesma, em que estas moléculas de DNA quando usadas juntas compreendem uma série de primers de DNA em um método de amplificação de DNA que pro-duz um amplicon. O amplicon produzido usando o par de primers de DNA no método de amplificação de DNA é diagnóstico para planta de milho MON88017 quando o amplicon contém SEQ ID NO:1. Amplicon de qualquer extensão produzido a partir de DNA de MON88017 em que o amplicon compreende SEQ ID NO:1 é um aspecto da invenção. O técnico versado reconhecerá que não é necessário que a primeira e a segunda moléculas de DNA consistam somente em DNA mas também podem consistir exclusivamente em RNA, uma mistura de DNA e RNA, ou uma combinação de DNA, RNA, ou outros nucleotídeos ou análogos dos mesmos que não atuem como templates para uma ou mais polimerases. Além disso, o técnico versado reconhecerá que uma sonda ou um primer conforme determinado neste relatório terá no mí- nimo a partir de cerca de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, e 20 nucle- otídeos consecutivos de extensão e selecionados do grupo de nucleo- tídeos conforme determinado na SEQ ID NO:1 (designada arbitrariamente junção 5'), SEQ ID NO:2 (designada arbitrariamente junção 3'), SEQ ID NO:3 (porção da seqüência flanqueadora designada arbitrariamente 5'), SEQ ID NO:4 (porção da seqüência flanqueadora designada arbitrariamente 3'), e SEQ ID NO:5 (toda ou uma porção da se- qüência de nucleotídeos inserida). São possíveis sondas e primers no mínimo a partir de cerca de 21 a cerca de 50 ou mais nucleotídeos consecutivos de extensão quando selecionados do grupo de nucleotí- deos conforme determinado na SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, e SEQ ID NO:5.
[0013] De acordo com outro aspecto da invenção, são proporcio nadas duas moléculas de DNA compreendendo um par de primers para uso em um método de detecção de DNA, em que a primeira molécula de DNA compreende no mínimo 11 ou mais polinucleotídeos contíguos de qualquer porção da região de DNA transgênico da molécula de DNA de SEQ ID NO:4 ou o complemento da mesma, e uma segunda molécula de DNA compreendendo no mínimo 11 ou mais polinucle- otídeos contíguos de qualquer porção de uma região de DNA genômi- co de milho de SEQ ID NO:4 ou complemento da mesma, em que estas moléculas de DNA quando usadas juntas compreendem uma série de primers de DNA em um método de amplificação de DNA que pro-duz um amplicon. O amplicon produzido usando o par de primers de DNA no método de amplificação de DNA é diagnóstico para planta de milho MON88017 quando compreende SEQ ID NO:2. Amplicon de qualquer extensão produzido a partir de DNA de MON88017, em que o amplicon compreende SEQ ID NO:2 é um aspecto da invenção.
[0014] De acordo com outro aspecto da invenção, são proporcio nados métodos para detectar a presença de DNA correspondendo es- pecificamente ao DNA da planta de milho MON88017 em uma amostra. Os métodos referidos compreendem: (a) pôr a amostra compreendendo DNA genômico MON88017 em contato com um par de primers de DNA; e (b) realizar uma reação de amplificação de ácido nucléico, deste modo produzindo um amplicon; e (c) detectar o amplicon, em que o amplicon compreende SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2.
[0015] De acordo com outro aspecto da invenção, são proporcionados métodos para detectar a presença de DNA correspondendo es-pecificamente ao DNA da planta de milho MON88017 em uma amostra. Os métodos referidos compreendendo: (a) pôr a amostra compreendendo DNA de MON88017 em contato com uma sonda de DNA compreendendo SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2, ou moléculas de DNA essencialmente homólogas à SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2 que hibri- dizam sob condições de hibridização estringentes com DNA genômico da planta de milho MON88017 e não hibridizam sob as condições de hibridização estringentes com DNA de planta de milho não- MON88017; (b) submeter a amostra e sonda a condições de hibridiza- ção estringentes; e (c) detectar hibridização da sonda ao DNA da planta de milho MON88017.
[0016] De acordo com outro aspecto da invenção, são proporcionados métodos para produzir uma planta de milho que tolera aplicação de glifosato e é resistente à lagarta da raiz do milho que compreendem a etapa de: reproduzir sexualmente uma primeira planta de milho MON88017 parental com uma segunda planta de milho parental que carece da tolerância a glifosato e resistência à lagarta da raiz do milho, deste modo produzindo plantas da progênie híbridas que são tolerantes a glifosato e resistentes à lagarta da raiz do milho.
[0017] Em outro aspecto da invenção está um método para determinar a zigosidade da progênie de evento de milho MON88017 com-preendendo: (a) por a amostra compreendendo DNA de milho em con- tato com uma série de primers compreendendo SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33 e SEQ ID NO:34, que quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucléico com DNA genômico de evento de milho MON88017, produz um primeiro amplicon que é diagnóstico para evento de milho MON88017; e (b) realizar uma reação de amplificação de ácido nucléico, deste modo produzindo o primeiro amplicon; e (c) detectar o primeiro amplicon; e (d) por a amostra compreendendo corn DNA de milho em contato com o dito conjunto, que quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucléico com DNA genômico de plantas de milho produz um segundo amplicon compreendendo o DNA genômico de milho nativo homólogo à região genômica do milho de uma inserção de transgene identificada como evento de milho MON88017; e (e) realizar uma reação de amplificação de ácido nucléi- co, deste modo produzindo o segundo amplicon; e (f) detectar o segundo amplicon; e (g) comparar os primeiro e segundo amplicons em uma amostra, em que a presença de ambos os amplicons indica que a amostra é heterozigota para a inserção do transgene.
[0018] Um método para controlar ervas daninhas em um campo da planta de milho MON88017 compreendendo a etapa de aplicar uma quantidade eficaz de glifosato contendo herbicida no campo de plantas de milho MON88017.
[0019] Uma semente de milho híbrido em que no mínimo uma ma triz é MON88017.
[0020] Uma planta de milho transformada com um constructo de DNA vegetal compreendendo os cassetes de expressão vegetal de pMON53616.
[0021] Os precedentes e outros aspectos da invenção se tornarão mais evidentes a partir da descrição detalhada seguinte e dos desenhos anexados.
[0022] Figura 1. Mapa de plasmídeo de pMON53616.
[0023] Figura 2. Organização genômica de inserção na planta de milho MON88017.
[0024] Figura 3. Região de DNA transgênico/genômico MON880175' (SEQ ID NO:3).
[0025] Figura 4. Região de DNA transgênico/genômico MON88017 3' (SEQ ID NO:4).
[0026] Figura 5. Região de DNA transgênico/genômico MON88017 (SEQ ID NO:5)
[0027] Uma planta de milho transgênica, referida nas partes que se seguem como "planta MON88017" ou "MON88017", é resistente à lesão por alimentação pela lagarta da raiz do milho da praga de Cole- optera (Diabrotica spp.), e é tolerante à ação fitotóxica de herbicidas agrícolas contendo glifosato. Esta planta de milho de dupla característica expressa uma variante modificada da proteína CRY3Bb1 (Patente dos Estados Unidos No. 6.501.009) de Bacillus thuringiensis (subsp. kumamotoensis), que proporciona resistência à lesão por alimentação por larvas de lagarta da raiz do milho, e uma proteína 5- enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase resistente a glifosato (CP4 EPSPS) (Patente dos Estados Unidos No. 5.633.435) de Agrobacterium sp. cepa CP4 que confere à planta tolerância ao glifosato. O uso de milho com dupla característica proporcionará maiores benefícios aos produtores de milho: a) proteção contra perdas econômicas devido às larvas da lagarta da raiz do milho, uma praga de insetos importante nos Estados Unidos e que está aumentando de importância em muitas áreas do mundo de cultivo de milho, e b) a capacidade de aplicar herbicidas agrícolas contendo glifosato à safra de milho para controle de ervas daninhas de amplo espectro. Adicionalmente, os transgenes codificando as características de tolerante a glifosato e lagarta da raiz do milho estão encadeados no mesmo segmento de DNA e ocorrem em um único lócus no genoma de MON88017, isto proporciona aumento da eficiência de reprodução e possibilita o uso de marcadores moleculares para rastrear a inserção transgênica nas populações do cruzamento e progênie das mesmas.
[0028] A planta de milho MON88017 foi produzida por um proces so de transformação mediado por Agrobacterium de uma linhagem de milho procriada por endogamia com o constructo de plasmídeo pMON53616 (Figura 1). Este constructo de plasmídeo contém os cassetes de expressão vegetal encadeados com os elementos genéticos regulatórios necessários para expressão da proteína CRY3Bb1 e a proteína CP4 EPSPS nas células das plantas de milho. Células de milho foram regeneradas em plantas de milho intactas e plantas individuais foram selecionadas da população de plantas que apresentou integridade dos cassetes de expressão vegetal e resistência a glifosato e lesão por alimentação por larvas da lagarta da raiz do milho. Uma planta de milho que contém em seu genoma os cassetes de expressão vegetal encadeados de pMON53616 é um aspecto da presente invenção.
[0029] O DNA de plasmídeo inserido no genoma da planta de milho MON88017 foi caracterizado por análises moleculares detalhadas. Estas análises incluíram: o número da inserção (número de sítios de integração dentro do genoma do milho), o número de cópias (o número de cópias do T-DNA dentro de um lócus), e a integridade dos cassetes genéticos inseridos. Foram usadas sondas moleculares de DNA que incluíram as regiões codificantes intactas CP4 EPSPS e CRY3Bb1 e seus respectivos elementos regulatórios, os promotores, íntrons, e se- qüências de poliadenilação dos cassetes de expressão vegetal, e a região de DNA da estrutura principal de pMON53616 do plasmídeo. Os dados mostram que MON88017 contém uma única inserção de T-DNA com uma cópia tanto dos cassetes CRY3Bb1 quanto CP4 EPSPS. Não foram detectados elementos adicionais do vetor de transformação pMON53616, encadeados ou não encadeados a cassetes genéticos intactos, no genoma de MON88017. Finalmente, foram realizadas análises de PCR e de seqüência de DNA para determinar as junções do genoma 5' e 3' inserção-a-planta, confirmar a organização dos elementos dentro da inserção (Figura 2), e determinar a seqüência de DNA completa da inserção na planta de milho MON88017 (SEQ ID NO:5).
[0030] Uma planta de milho tolerante a glifosato, resistente à la garta da raiz do milho pode ser reproduzida primeiro cruzando sexualmente uma primeira planta de milho parental, consistindo em uma planta de milho cultivada a partir de MON88017, com uma segunda planta de milho parental que carece da tolerância a herbicida de glifo- sato, deste modo produzindo uma pluralidade de plantas da progênie híbridas. Linhagens de milho procriadas por endogamia podem ser geradas por um processo que inclui, retrocruzamento com a matriz recorrente, e seleção com tratamento com glifosato. Descrições de outros métodos de reprodução que são comumente usados para diferentes características e colheitas podem ser encontradas em referências conhecidas na técnica, por exemplo, Fehr, in Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987).
[0031] A menos que mencionado de outro modo, os termos devem ser entendidos de acordo com o uso convencional por aqueles versados na técnica relevante. Definições de termos comuns em biologia molecular também podem ser encontradas em Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag: New York, 1991; e Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994. É usada a nomenclatura para bases de DNA conforme determinado em 37 CFR § 1.822.
[0032] Conforme usado neste relatório, o termo "milho" significa Zea mays e inclui todas as variedades de plantas que podem ser reproduzidas com a planta de milho MON88017.
[0033] Conforme usado neste relatório, o termo "compreendendo" significa "incluindo porém não limitado a".
[0034] "Glifosato" se refere a N-fosfonometilglicina e seus sais. N- fosfonometilglicina é um herbicida de conhecimneto geral que tem atividade sobre um amplo espectro de espécies de plantas. Glifosato é o ingrediente ativo do Roundup® (Monsanto Co.), um herbicida seguro que tem uma meia-vida desejavelmente curta no meio ambiente. Glifo- sato é o ingrediente ativo do herbicida Roundup® (Monsanto Co.). Tratamentos com "herbicida glifosato" se referem a tratamentos com o herbicida Roundup®, Roundup Ultra®, Roundup Pro® ou qualquer outra formulação de herbicida contendo glifosato. Exemplos de formulações comerciais de glifosato incluem, sem restrição, as vendidas pela Empresa Monsanto como os herbicidas ROUNDUP®, ROUNDUP® ULTRA, ROUNDUP® ULTRAMAX, ROUNDUP® WEATHERMAX, ROUNDUP® CT, ROUNDUP® EXTRA, ROUNDUP® BIACTIVE, ROUNDUP® BIOFORCE, RODEO®, POLARIS®, SPARK® e ACCORD®, todas as quais contêm glifosato como seu sal de isopropilamônio; as vendidas pela Empresa Monsanto como os herbicidas ROUNDUP® DRY e RIVAL®, as quais contêm glifosato como seu sal de amônio; a vendida pela Empresa Monsanto como ROUNDUP® GEOFORCE, a qual contém glifosato com seu sal de sódio; e a vendida pela Syngenta Crop Protection como o herbicida TOUCHDOWN®, o qual contém glifosato como seu sal de trimetilsulfônio. Quando aplicado a uma superfície vegetal, o glifosato se move sistemicamente através da planta. O glifosato é fitotóxico devido a sua inibição do caminho do ácido shiquímico, o qual proporciona um precursor para a síntese de aminoácidos aromáticos. O glifosa- to inibe a enzima 5-enolpiruvil-3-fosfoshiquimato sintase (EPSPS) encontrada nas plantas. Pode ser obtida tolerância ao glifosato pela expressão de variantes de EPSPS bacterianas e variantes de EPSPS vegetais que têm menor afinidade para o glifosato e, portanto, conservam sua atividade catalítica na presença de glifosato (Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.633.435, 5.094.945, 4.535.060, e 6.040.497).
[0035] As larvas da lagarta da raiz do milho (CRW, Diabrotica spp) se alimentam das raízes de plantas de milho em desenvolvimento. Substancial despesa e tempo é devotada ao controle do prejuízo econômico provocado por esta praga. Inseticidas químicos, incluindo or- ganofosfatos, carbamatos e piretróides são incorporados no solo sobre mais de 16 milhões de acres de milho anualmente para controlar a lagarta da raiz do milho. Os benefícios de mudar de inseticidas do solo para uma abordagem transgênica são impressionantes e incluem uma redução nos riscos de saúde e segurança humana potenciais, redução dos impactos diretos sobre organismos não alvo, redução da contaminação dos suprimentos de águas subterrâneas e superficiais, redução dos problemas de descarte dos recipientes de pesticidas, e compatibilidade geral com outros programas agronômicos e de tratamento de pragas.
[0036] A presente invenção proporciona plantas transgênicas as quais foram transformadas com um constructo de DNA que contém no mínimo um cassete de expressão que expressa altos níveis de CRY3Bb1 delta-endotoxina e no mínimo um cassete de expressão que expressa uma enzima de tolerância a glifosato. Plantas de milho transformadas de acordo com os métodos e com o constructo de DNA descrito neste relatório são resistentes à lagarta da raiz do milho. As mesmas plantas de milho também são resistentes ao herbicida glifosa- to. As características agronômicas ligadas proporcionam facilidade na manutenção destas características juntas em uma população para re-produção.
[0037] Uma "planta" transgênica é produzida por transformação de uma célula vegetal com DNA heterólogo, isto é, um constructo de ácido polinucléico que inclui um transgene de interesse; a regeneração de uma população de plantas resultante da inserção do transgene no genoma da célula vegetal, e seleção de uma planta particular caracterizada por inserção em uma localização do genoma em particular. O termo "evento" se refere à planta transformante original e progênie da transformante que inclui o DNA heterólogo. O termo "evento" também inclui progênie produzida por um acasalamento sexual de indivíduos da mesma raça mas sem parentesco entre si entre o evento e outra planta em que a progênie inclui o DNA heterólogo. Mesmo depois de retrocruzamento repetido com uma matriz recorrente, o DNA inserido e o DNA genômico flanqueando do evento parental transformado está presente na progênie da reprodução na mesma localização cromos- sômica. O termo "evento" também se refere a DNA do transformante original compreendendo o DNA inserido, e seqüência genômica flan- queante imediatamente adjacente ao DNA inserido, que se esperaria que fosse transferida a uma progênie que recebe o DNA inserido incluindo o transgene de interesse em conseqüência de uma reprodução sexual de uma linhagem parental que inclui o DNA inserido (por exemplo, o transformante original e progênie resultante de uniformização) e uma linhagem parental que não contém o DNA inserido. A presente invenção se refere ao evento transgênico, à planta de milho MON88017, à progênie da mesma, e a composições de DNA contidas na mesma.
[0038] Uma "sonda" é um ácido nucléico isolado ao qual é fixada uma etiqueta detectável convencional ou molécula repórter, por exemplo, um isótopo radioativo, ligante, agente quimioluminescente, ou enzima. Uma sonda semelhante é complementar a um filamento de um ácido nucléico alvo, no caso da presente invenção, a um filamento de DNA genômico de MON88017 quer de uma planta MON88017 ou de uma amostra que inclui DNA de MON88017. Sondas de acordo com a presente invenção incluem não somente ácidos desoxirribonucléicos ou ribonucléicos, mas também poliamidas e outros materiais de sondas que ligam especificamente a uma seqüência de DNA alvo e podem ser usadas para detectar a presença da seqüência de DNA alvo.
[0039] Primers de DNA são ácidos polinucléicos isolados que são recozidos a um filamento de DNA alvo complementar por hibridização de ácido nucléico para formar um híbrido entre o primer e o filamento de DNA alvo, em seguida estendidos ao longo do filamento de DNA alvo por uma polimerase, por exemplo, uma DNA polimerase. Um par de primers de DNA ou uma série de primers de DNA da presente invenção se refere a dois primers de DNA úteis para amplificação de uma seqüência de ácidos nucléicos alvo, por exemplo, pela reação de cadeia polimerase (PCR) ou outros métodos de amplificação de ácido polinucléico convencionais.
[0040] Sondas de DNA e primers de DNA têm geralmente 11 poli- nucleotídeos ou mais de extensão, freqüentemente 18 polinucleotí- deos ou mais, 24 polinucleotídeos ou mais, ou 30 polinucleotídeos ou mais. As sondas e primers referidos são selecionados para serem de suficiente extensão para hibridizarem especificamente a uma seqüên- cia alvo sob condições de hibridização de alta estringência. Preferencialmente, sondas e primers de acordo com a presente invenção têm completa similaridade de seqüência com a seqüência alvo, embora sondas diferindo da seqüência alvo que conservam a capacidade para hibridizar a seqüências alvo possam ser designadas por métodos convencionais.
[0041] Métodos para preparar e usar sondas e primers são descritos, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (nas partes que se seguem, "Sambrook et al., 1989"); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992 (com atualizações periódicas) (nas partes que se seguem, "Ausubel et al., 1992"); e Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. PCR de pares de primers de DNA pode ser derivada de uma seqüência conhecida, por exemplo, usando programas de computador pretendidos para este fim tais como Primer (Version 0.5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA).
[0042] Primers e sondas baseados nas seqüências de DNA ge-nômico flanqueantes e inserções descritas neste relatório podem ser usados para confirmar (e, caso necessário, corrigir) as seqüências de DNA descritas por métodos convencionais, por exemplo, reclonando e seqüenciando as moléculas de DNA referidas.
[0043] As sondas e primers de ácidos nucléicos da presente invenção hibridizam sob condições estringentes a uma molécula de DNA alvo. Pode ser usado qualquer método convencional de hibridização ou amplificação de ácido nucléico para identificar a presença de DNA de uma planta transgênica em uma amostra. Moléculas de ácidos poli- nucléicos, também referidas como segmentos de ácidos nucléicos, ou fragmentos das mesmas são capazes de hibridizar especificamente a outras moléculas de ácidos nucléicos sob determinadas circunstâncias. Conforme usado neste relatório, diz-se que duas moléculas de ácidos polinucléicos são capazes de hibridizar especificamente uma à outra se as duas moléculas forem capazes de formar uma estrutura de ácido nucléico de filamento duplo antiparalelos. Diz-se que uma molécula de ácido nucléico é o "complemento" de outra molécula de ácido nucléico se elas apresentarem completa complementaridade. Confor- me usado neste relatório, diz-se que moléculas apresentam "completa complementaridade" quando cada nucleotídeo de uma das moléculas é complementar a um nucleotídeo da outra. Diz-se que duas moléculas são "minimamente complementares" se elas puderem hibridizar uma à outra com suficiente estabilidade para permitir que as mesmas permaneçam recozidas uma à outra sob no mínimo condições convencionais de "baixa estringência". Do mesmo modo, diz-se que as moléculas são "complementares" se elas puderem hibridizar uma à outra com suficiente estabilidade para permitir que permaneçam recozidas uma à outra sob condições convencionais de "alta estringência". Condições convencionais de estringência são descritas por Sambrook et al., 1989, e por Haymes et al., In: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985), Afastamentos da completa complementaridade são, portanto, permissíveis desde que semelhan-tes afastamentos não excluam completamente a capacidade das moléculas para formarem uma estrutura de filamento duplo. De modo à molécula de ácido nucléico servir como um primer ou sonda, é necessário somente ser suficientemnte complementar na seqüência para ser capaz de formar uma estrutura estável de filamento duplo sob as concentrações particulares de solvente e sal empregadas.
[0044] Conforme usado neste relatório, uma seqüência essencial mente homóloga é uma seqüência de ácidos nucléicos que hibridizará especificamente ao complemento da seqüência de ácidos nucléicos à qual está sendo comparada sob condições de alta estringência. Condições de estringência apropriadas que estimulam hibridização de DNA, por exemplo, 6,0 x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguida por uma lavagem de 2,0 x SSC a 50°C, são conhecidas das pessoas versadas na técnica ou podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por exemplo, a concentração de sais na etapa de lavagem pode ser selecionada a partir de uma baixa estringência de cerca de 2,0 x SSC a 50°C até uma alta estringência de cerca de 0,2 x SSC a 50°C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada a partir de condições de baixa estringência em temperatura ambiente, cerca de 22°C, até condições de alta estringência a cerca de 65°C. Tanto a temperatura quanto o sal podem ser variados, ou quer a temperatura ou a concentração de sal podem ser mantidas constantes enquanto as outras variáveis são alteradas. Em uma modalidade preferencial, um ácido polinucléico da presente invenção hibridi- zará especificamente a uma ou mais das moléculas de ácido nucléico determinadas na SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, ou 5, ou complementos das mesmas ou fragmentos de qualquer uma sob condições moderadamente estringentes, por exemplo a cerca de 2,0 x SSC e cerca de 65°C. Em uma modalidade particularmente preferencial, um ácido nu- cléico da presente invenção hibridizará especificamente a uma ou mais das moléculas de ácido nucléico determinadas na SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, ou 5 ou complementos ou fragmentos de qualquer uma sob condições de alta estringência. Em um aspecto da presente invenção, uma molécula de marcador de ácido nucléico preferencial da presente invenção tem a seqüência de ácido nucléico determinada na SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2 ou complementos da mesma ou fragmentos de qualquer uma. Em outro aspecto da presente invenção, uma molécula de marcador de ácido nucléico preferencial da presente invenção partilha entre 80% e 100% ou 90% e 100% de identidade de seqüência com a seqüência de ácido nucléico determinada na SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2 ou complemento da mesma ou fragmentos de qualquer uma. Em um aspecto adicional da presente invenção, uma molécula de marcador de ácido nucléico preferencial da presente invenção partilha entre 95% e 100% de identidade de seqüência com a seqüência determinada na SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2 ou complemento da mesma ou fragmentos de qualquer uma. A SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2 pode ser usada como marcadores em métodos de reprodução vegetal para identificaar a progênie de cruzamentos genéticos similares aos métodos descritos para simples análise de marcador de DNA de repetição de seqüência, em "DNA markers: Protocols, applications, and overviews": (1997) 173-185, Cregan, et al., eds., Wiley-Liss NY. A hibridização da sonda à molécula de DNA alvo pode ser detectada por qualquer número de métodos de conhecimento das pessoas versadas na técnica, estes podem incluir, porém não estão limitados a, etiquetas fluorescentes, etiquetas radioativas, etiquetas à base de anticorpos, e etiquetas quimioluminescentes.
[0045] Com referência à amplificação de uma seqüência de ácidos nucléicos alvo (por exemplo, por PCR) usando um par de primers de amplificação em particular, "condições estringentes" são condições que permitem que o par de primers hibridize somente à seqüência de ácidos nucléicos alvo à qual um primer tendo a seqüência de tipo selvagem correspondente (ou seu complemento) se ligaria e preferencialmente para produzir um único produto de amplificação, o amplicon, em uma reação de amplificação térmica de DNA.
[0046] O termo "específico para (uma seqüência alvo)" indica que uma sonda ou primer hibridiza sob condições de hibridização estrin- gentes somente à seqüência alvo em uma amostra compreendendo a seqüência alvo.
[0047] Conforme usado neste relatório, "DNA amplificado" ou "amplicon" se refere ao produto do método de amplificação de ácido poli- nucléico dirigido a uma molécula alvo de ácido polinucléico que é parte de um modelo de ácido polinucléico. Por exemplo, para determinar se uma planta de milho resultante de um cruzamento sexual contém DNA genômico de planta transgênica da planta de milho MON88017 da presente invenção, DNA que é extraído de uma amostra de tecido de planta de milho pode ser submetido a um método de amplificação de ácido polinucléico usando um par de primers que inclui um primer derivado da seqüência de DNA no genoma da planta MON88017 adjacente ao sítio de inserção do DNA inserido heterólogo (DNA transgênico), e um segundo primer derivado do DNA inserido heterólogo para produzir um amplicon que é diagnóstico para a presença do DNA da planta MON88017. O amplicon diagnóstico é de uma extensão e tem uma seqüência de DNA que também é diagnóstica para o DNA genômico da planta, a seqüência de DNA do amplicon compreendendo a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2. O amplicon pode variar de extensão da extensão combinada do par de primers mais um par de bases de nucleotí- deos, preferencialmente mais cerca de cinqüenta pares de bases de nucleotídeos, mais preferencialmente mais cerca de duzentos e cin- qüenta pares de bases de nucleotídeos, e ainda mais preferencialmente mais cerca de quatrocentos e cinqüenta pares de bases de nucleo- tídeos ou mais. Alternativamente, um par de primers pode ser derivado da seqüência genômica em ambos os lados do DNA inserido heterólo- go de modo a produzir um amplicon que inclui toda a seqüência de polinucleotídeos da inserção (por exemplo, um primer forward isolado da porção genômica de SEQ ID NO:3 e um primer reverso isolado da porção genômica de SEQ ID NO:4 que amplifica uma molécula de DNA compreendendo os dois cassetes de expressão do fragmento de DNA pMON53616 que foi inserido no genoma MON88017, a inserção compreendendo cerca de 7125 nucleotídeos de SEQ ID NO:5, Figura 2 e Figura 5). Um membro de um par de primers derivado da seqüên- cia genômica da planta adjacente ao DNA da inserção transgênica está localizado em uma distância da seqüência de DNA inserida, esta distância pode variar de um par de bases de nucleotídeos até cerca de vinte mil pares de bases de nucleotídeos. O uso do termo "amplicon" exclui especificamente dímeros de primers que podem ser formados na reação de amplificação térmica de DNA.
[0048] Amplificação de ácido polinucléico pode ser realizada por qualquer um dos vários métodos de amplificação de ácido polinucléico conhecidos na técnica, incluindo a reação de cadeia polimerase (PCR). Os métodos de amplificação são conhecidos na técnica e são descritos, entre outros, nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.683.195 e 4.683.202 e em PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis et al., Academic Press, San Diego, 1990. Métodos de amplificação por PCR foram desenvolvidos para amplificar até 22 kb (quilobase) de DNA genômico e até 42 kb de DNA de bacterió- fago (Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699, 1994). Estes métodos bem como outros métodos conhecidos na técnica de amplificação de DNA podem ser usados na prática da presente invenção. A seqüência da inserção de DNA heterólogo ou seqüência de DNA genômico flanqueante de MON88017 pode ser verificada (e corrigida caso necessário) amplificando as moléculas de DNA referidas da semente MON88017 ou plantas cultivadas a partir da semente depositada junto à ATCC tendo no. de acesso PTA-5582, usando primers derivados das seqüências proporcionadas neste relatório, seguidas por seqüenciamento de DNA padrão do amplicon por PCR ou fragmentos de DNA clonados das mesmas.
[0049] Kits de detecção de DNA que se baseiam em métodos de amplificação de DNA contêm moléculas de primers de DNA que hibri- dizam especificamente a um DNA alvo e amplificam um amplicon diagnóstico sob as condições de reação apropriadas. O kit pode proporcionar um gel agarose com base no método de detecção ou qualquer número de métodos para detectar o amplicon diagnóstico que são conhecidos na técnica. Um kit que contém primers de DNA que são homólogos ou complementares a qualquer porção da região genômica do milho de SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4 e a qualquer porção da re- gião de inserção de transgene de SEQ ID NO:5 é um objeto da invenção. Especificamente identificada como um par de primers útil em um método de amplificação de DNA é a SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:7 que amplificam um amplicon diagnóstico homólogo à porção da região 5' transgênica/genômica de MON88017, em que o amplicon compreende a SEQ ID NO:1. Outras moléculas de DNA úteis como primers de DNA podem ser selecionadas a partir da seqüência de DNA transgêni- co/genômico descrita de MON88017 (SEQ ID NO:5) por aqueles versados na técnica de amplificação de DNA.
[0050] O amplicon diagnóstico produzido por estes métodos pode ser detectado por uma pluralidade de técnicas. Um método semelhante é Genetic Bit Analysis (Nikiforov, et al. Nucleic Acid Res. 22:41674175, 1994) onde é designado um oligonucleotídeo de DNA que so- brepoõe tanto a seqüência de DNA genômico adjacente flanqueando quanto a seqüência de DNA inserido. O oligonucleotídeo é imobilizado em cavidades de uma placa de microtítulo. Depois de PCR da região de interesse (usando um primer na seqüência inserida e um na se- qüência genômica flanqueando adjacente), um produto de PCR de filamento único pode ser hibridizado ao oligonucleotídeo imobilizado e servir como um template para uma reação de extensão de base única usando uma DNA polimerase e dideoxinucleotídeo trifosfatos marcados (ddNTPs) específicos para a próxima base esperada. A leitura pode ser fluorescente ou à base de ELISA. Um sinal indica presença da seqüência transgênica/genômica devido ao sucesso da amplificação, hibridização, e extensão de base única.
[0051] Outro método é a técnica de Pirosseqüenciamento confor me descrito por Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). Neste método é designado um oligonucleotídeo que sobrepõe o DNA genô- mico adjacente e junção de DNA da inserção. O oligonucleotídeo é hibridizado ao produto de PCR de filamento único da região de inte-resse (um primer na seqüência inserida e um na seqüência genômica flanqueante) e incubado na presença de uma DNA polimerase, ATP, sulfurilase, luciferase, apirase, adenosina 5' fosfossulfato e luciferina. DNTPs são adicionados individualmente e a incorporação resulta em um sinal luminoso que é medido. Um sinal luminoso indica a presença da seqüência transgênica/genômica devido ao sucesso da amplificação, hibridização, e extensão de base única ou multibase.
[0052] Polarização por Fluorescência conforme descrito por Chen, et al., (Genome Res. 9:492-498, 1999) é um método que pode ser usado para detectar o amplicon da presente invenção. Usando este método é designado um oligonucleotídeo que sobrepõe a junção do DNA inserido e flanqueando genômico. O oligonucleotídeo é hibridiza- do ao produto de PCR de filamento único da região de interesse (um primer no DNA inserido e um na seqüência de DNA genômico flanqueando) e incubado na presença de uma DNA polimerase e um ddNTP marcado com fluorescente. Extensão de base única resulta em incorporação do ddNTP. A incorporação pode ser medida como uma alteração na polarização usando um fluorômetro. Uma alteração na polari-zação indica a presença da seqüência transgênica/genômica devido ao sucesso da amplificação, hibridização, e extensão de base única.
[0053] Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) é des crito como um método para detectar e quantificar a presença da se- qüência de DNA e é totalmente entendido nas instruções proporcionadas pelo fabricante. Em resumo, é designada uma sonda de oligonu- cleotídeo FRET que sobrepõe a junção de DNA da inserção de DNA e flanqueando genômica. A sonda FRET e primers de PCR (um primer na seqüência de DNA da inserção e um na seqüência genômica flan- quando) são ciclados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Hibridização da sonda FRET resulta em clivagem e liberação da porção fluorescente para fora da porção de extinção sobre a sonda FRET. Um sinal fluorescente indica a presença da seqüência transgê- nica/genômica devido ao sucesso da amplificação e hibridização.
[0054] Feixes Moleculares foram descritos para uso em detecção de seqüência conforme descrito em Tyangi, et al. (Nature Bio- tech.14:303-308, 1996) Em resumo, é designada uma sonda de oligo- nucleotídeo FRET que sobrepõe a junção do DNA de inserção e ge- nômica flanqueante. A estrutura única da sonda FRET resulta nesta contendo estrutura secundária que mantém as porções fluorescentes e de extinção em íntima proximidade. A sonda FRET e primers de PCR (um primer na seqüência de DNA da inserção e uma na seqüência ge- nômica flanqueando) são cicladas na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Depois do sucesso da amplificação por PCR, hibridização da sonda FRET à seqüência alvo resulta na remoção da estrutura secundária da sonda e separação espacial das porções fluorescente e de extinção. Resulta um sinal fluorescente. Um sinal fluorescente indica a presença da seqüência flanqueante/de inserção de transgene devido ao sucesso da amplificação e hibridização.
[0055] Kits de detecção de DNA podem ser desenvolvidos usando as composições descritas neste relatório e os métodos de conhecio- mento geral na técnica de detecção de DNA. Os kits são úteis para identificação do DNA da planta de milho MON88017 em uma amostra e podem ser aplicados a métodos para reprodução de plantas de milho contendo DNA de MON88017. Um kit contém moléculas de DNA que são úteis como primers ou sondas e que são homólogas ou complementares a no mínimo uma porção de SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, ou 5. As moléculas de DNA podem ser usadas nos métodos de amplificação de DNA (PCR) ou as sondas nos métodos de hibridização de ácido poli- nucléico, isto é, análise Southern, análise northern. O vetor de plasmí- deo pMON53616 usado para produzir o evento de milho MON88017 contém dois cassetes de expressão: o cassete de expressão um com- preende o promotor CaMV 35S com reforçador duplicado encadeado à seqüência líder CAB 5' de trigo encadeada ao íntron de actina 1 do arroz encadeado à região codificante CRY3Bb1 encadeada à seqüên- cia de poliadenilação Hsp17 3' de trigo; e encadeada ao cassete de expressão dois que compreende o promotor de actina 1 do arroz encadeado ao íntron de actina 1 do arroz orientando a transcrição de um peptídeo de trânsito de cloroplasto fundido à região codificante CP4 EPSPS e encadeado à região de poliadenilação NOS 3', a seqüência dos cassetes de expressão encadeados está contida na SEQ ID NO:5.
[0056] Os exemplos seguintes são incluídos para demonstrar exemplos de determinadas modalidades preferenciais da invenção. Deve ser reconhecido por aqueles versados na técnica que as técnicas descritas nos exemplos que se seguem representam abordagens que os inventores descobriram que funcionam bem na prática da invenção, e portanto podem ser consideradas para constituírem exemplos de modos preferenciais para sua prática. No entanto, os versados na técnica, à luz da presente descrição, devem reconhecer que podem ser feitas muitas alterações nas modalidades específicas que são descritas e ainda obter um resultado igual ou semelhante sem se afastar do espírito e do âmbito da invenção.
[0057] A planta de milho transgênico MON88017 foi gerada por uma transformação mediada por Agrobacterium de células de milho com um fragmento de DNA derivado de pMON53616 (Figura 1). O constructo de transformação vegetal, pMON53616 foi reproduzido em Agrobacterium usando um procedimento de cruzamento triparental (Ditta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77:7347-7351, 1980). O fragmento de DNA de pMON53616 que contém dois cassetes de expressão vegetal transgênicos foi inserido no genoma de uma célula vegetal de milho, célula vegetal de milho foi regenerada na planta de milho MON88017. A configuração da inserção no genoma de MON88017 é mostrada na (Figura 2). MON88017 e sua progênie têm tolerância a glifosato e é resistente à lesão por alimentação das larvas da lagarta da raiz do milho. A transformação do milho foi realizada essencialmente conforme descrito neste relatório.
[0058] Culturas líquidas de Agrobacterium contendo pMON53616 são iniciadas a partir de matérias-primas de glicerol ou de uma placa recém-traçada e cultivada de um dia para o outro a 26°C-28°C com agitação (aproximadamente 150 revoluções por minuto, rpm) para midlog da fase de crescimento em meio LB líquido, pH 7,0, contendo 50 mg/l (miligrama por litro) de canamicina, e ou 50 mg/l de estreptomici- na ou 50 mg/l de espectinomicina, e 25 mg/l de cloranfenicol com 200 μM de acetossiringona (AS). As células de Agrobacterium são ressus- pensas no meio de inoculação (CM4C líquido, conforme descrito na Tabela 8 da Patente dos Estados Unidos No. 6.573.361) e a densidade celular é ajustada de tal modo que as células ressuspensas têm uma densidade ótica de 1 quando medidas em um espectrofotômetro em um comprimento de onda de 660 nm (isto é, OD660). Embriões de milho recém-isolados Tipo II imaturo HiIIxLH198 e HiII são inoculados com Agrobacterium e co-cultivados 2 a 3 dias no escuro a 23°C. Os embriões são em seguida transferidos para meio de retardo (N6 1-10012; conforme descrito na Tabela 1 da Patente dos Estados Unidos No. 5.424.412) suplementado com 500 mg/l de Carbenicilina (Sigma- Aldrich, St Louis, MO) e 20 μM de AgNO3) e incubados a 28 °C durante 4 a 5 dias. Todas as culturas subseqüentes são mantidas nesta temperatura.
[0059] Os coleóptilos de milho são removidos uma semana depois da inoculação. Os embriões são transferidos para o primeiro meio de seleção (N61-0-12, conforme descrito na Tabela 1 da Patente dos Es- tados Unidos No. 5.424.412), suplementado com 500 mg/l de Carbeni- cilina e 0,5 mM de glifosato. Duas semanas depois, os tecidos sobreviventes são transferidos para o segundo meio de seleção (N61-0-12) suplementado com 500mg/l de Carbenicilina e 1,0 mM de glifosato. O calo sobrevivente é subcultivado a cada 2 semanas por cerca de 3 subculturas sobre 1,0 mM de glifosato. Quando são identificados tecidos tolerantes a glifosato, o tecido é aumentado para regeneração. Para regeneração, tecidos do calo são transferidos para o meio de regeneração (MSOD, conforme descrito na Tabela 1 da Patente dos Estados Unidos No. 5.424.412) suplementado com 0,1 μM de ácido abs- císico (ABA; Sigma-Aldrich, St Louis, MO) e incubado por duas semanas. Os calos regenerantes são transferidos para um meio de alto teor de sacarose e incubados durante duas semanas. As plântulas são transferidas para meio MSOD (sem ABA) em um recipiente de cultura e incubadas durante duas semanas. Em seguida, as plantas com raízes são transferidas para o solo. Os versados na ténica dos métodos de transformação de células de milho podem modificar este método para proporcionar plantas de milho transgênicas contendo o constructo de DNA da presente invenção, ou usar outros métodos, tais como, pís- tola de partículas, que se sabe que proporcionam plantas monocot transgênicas.
[0060] A planta MON88017 e semente tem partes regeneráveis. As partes regeneráveis da semente incluem, porém não estão limitadas ao embrião, o cotilédone, e o broto ou meristema da raiz. A invenção também inclui partes de planta da planta de milho MON88017 que incluem, porém não estão limitadas a pólen, óvulo, brotos, raízes, e folhas. A invenção também inclui componentes extraíveis de semente MON88017 que incluem, porém não estão limitadas à proteína, farinha grossa, polvilho, e óleo.
[0061] A planta de milho MON88017 foi selecionada de muitas plantas de milho transgênicas por tolerância vegetativa a glifosato e lesão reprodutiva. O sucesso da produção de uma planta transgênica de qualidade comercial atualmente requer produzir um grande número de plantas transgênicas. Na presente invenção, MON88017 foi uma planta entre aproximadamente 472 R0 eventos que foram transformados com diferentes constructos de DNA que incluíram pMON53616. O evento MON88017 foi selecionado dentre muitos eventos por uma série de análise molecular, triagens para tolerância a glifosato, triagens para resistência a insetos, e triagens por análise de expressão.
[0062] Plantas de milho transgênicas foram testadas para resis tência à lagarta da raiz do milho à lesão por alimentação por triagens em estufa e de campo. A lesão da raiz foi classificada usando a escala de lesão de nó "Node-Injury Scale" (NIS) desenvolvida por Oleson e Tollefson da Iowa State University, esta escala classifica lesão feita a raízes de milho usando valores de 0 a 3. O valor 0,00 descreve nenhuma lesão por alimentação e é a menor classificação, 1,00 descreve um nó ou o equivalente de um nó inteiro comido para dentro de aproximadamente 5 cm (duas polegadas) da espiga, 2,00 descreve dois nós completos comidos, e 3,00 descreve três ou mais nós comidos e é a classificação mais alta. Lesão entre nós completos comidos é notada como a percentagem do nó que falta, isto é, 1,50 descreve 1 ^ nós comidos, 0,25 descreve % de um nó comido. Lotes de campo foram infestados artificialmente com larvas da lagarta da raiz do milho aplicando 1500-2000 ovos por pé linear de fileira no estágio de crescimento V3 a V4. Fileiras tratadas com inseticida foram tratadas com o inseticida Teflutrin (Force® 3G, Zeneca Ag Products) em um índice de 147,86 ml (5 onças) por 304,8 m (1000 pés) de fileira. MON88017 demonstrou uma classificação de lesão da raiz (RDR) dentre 0,08 e 0,11 em múltiplos testes. A isolina não tratada com inseticida apresentou um RDR médio de 1,28. As plantas de milho contendo proteína não inseticida tratadas com inseticida apresentaram um RDR médio de 0.44.
[0063] As plantas de milho transgênicas foram tratadas com herbi cida glifosato para determinar o nível de tolerância ao herbicida. Lotes de teste foram pulverizados com glifosato (Roundup® WeatherMax, Monsanto Co, St Louis, MO) que foi aplicado duas vezes durante a estação de crescimento uma vez no estágio de crescimento V4 e uma no estágio V8 em um índice de 510,3 g e 1,02 kg (1,125 e 2,25 libras) de ingrediente ativo por acre. O rendimento em semente de milho foi medido na colheita como percentagem do rendimento relativa aos lotes MON88017 não pulverizados (WeatherMax 0). Os resultados apresentados na Tabela 1 demonstram que MON88017 é altamente tolerante a glifosato e não foi reduzido em rendimento, surpreendentemente os lotes tratados tiveram em média rendimento maior do que os lotes não tratados.Tabela 1. Percentagem de Rendimento de MON88017 tratado com glifosato comparado com não tratadoTabela 1 Legenda: Percentagem de rendimento para cada tratamento com WeatherMax nos estágios de folha de V4 a V8 foi comparada com percentagem de rendimento para tratamentos com WeatherMax nos estágios de folha de 0 a V4, com resultados de tratamentos 0-V4 estabelecendo a linha basal de 100 por cento de rendimento para cada repetição de tratamento.
[0064] DNA genômico de MON88017 e substâncias controle foi extraído de grão de milho primeiro processando o grão para um pó fino. Aproximadamente 6 gramas do grão processado foram transferidos para um tubo cônico de 50 ml (mililitro), em seguida ~16 ml de tampão de extração CTAB [1,5% (peso/v) CTAB, 75 mM de Tris-HCl pH 8,0, 100 mM de EDTA pH 8,0, 1,05 M de NaCl, e 0,75% (peso/v) de PVP (peso molecular 40.000)] e 8 microlitros de RNase (10 mg/ml, Roche) foram adicionados ao grão processado. As amostras foram incubadas a 65°C durante 30-60 minutos com mistura intermitente e em seguida foram deixadas para esfriar em temperatura ambiente. Aproximadamente 15 ml de clorofórmio : álcool isoamílico (24:1 (v/v)) foi adicionado às amostras. A suspensão foi misturada durante 5 minutos e as duas fases foram separadas por centrifugação a ~16.000 x g du-rante 5 minutos em temperatura ambiente. A camada aquosa (superior) foi transferida para um tubo cônico limpo de 50 ml. Aproximadamente 1/10 volume (~1,5 ml) de 10% de tampão CTAB [10% (peso /v) CTAB e 0,7 M NaCl] e um volume igual de clorofórmio : álcool isoamí- lico [24:1 (v/v)] foi adicionado à fase aquosa, a qual foi em seguida misturada durante 5 minutos. As amostras foram centrifugadas a ~16.000 x g durante 5 minutos para separar as fases. A camada aquosa (superior) foi removida, misturada com um volume igual (~15 ml) de tampão de precipitação CTAB [1% (peso /v) CTAB, 50 mM de Tris pH 8,0, e 10 mM de EDTA pH 8,0] e foi deixada descansar em temperatura ambiente durante 1 a 2 horas. As amostras foram centrifugadas a ~10.000 x g durante 10 minutos em temperatura ambiente para peleti- zar o DNA. O sobrenadante foi descartado, e o pélete foi dissolvido em aproximadamente 2 ml de tampão TE com alto teor de sais (10mM de Tris-HCl pH 8,0, 10 mM de EDTA pH 8,0, e 1 M de NaCl). Suave agitação a 37°C foi realizada para auxiliar na dissolução do pélete. Caso necessário, as amostras foram centrifugadas a ~23.000 x g em tempe- ratura ambiente durante 2 minutos para peletizar e remover os fragmentos. Aproximadamente 1/10 volume (~150 μl) de 3 M de NaOAc (pH 5,2) e 2 volumes (~4 ml relativo ao sobrenadante) de 100% de etanol gelado foram adicionados para precipitar o DNA. O DNA precipitado foi reunido em um tubo de microcentrífuga contendo 70% de eta- nol. O DNA foi peletizado em uma microcentrífuga em velocidade máxima (~14,000 rpm) durante ~5 minutos, seco a vácuo, e redissolvido em tampão TE (pH 8,0). O DNA foi em seguida armazenado em um refrigerador a 4°C.
[0065] Dez μg de DNA genômico foi digerido com uma enzima de restrição selecionada, por exemplo, SspI, EcoRV, ScaI, e SmaI, em 200 μl de tampão de enzima de restrição a 37°C durante mais de 4 horas, e em seguida inativada a enzima a 70-80°C durante 15 minutos. O DNA foi extraido com Fenol e clorofórmio, e precipitado com EtOH, e dissolvido em 200 μl. I DNA foi em seguida autoligado em 1 ml de tampão de ligação e T4 DNA ligase a 4°C de um dia para o outro. A reação de ligação foi inativada a 70-80°C durante 15 minutos, e precipitada com EtOH, e dissolvida em 200 μl. O DNA foi em seguida usado como template para PCR com primers específicos dentro das regiões codificantes CP4 EPSPS ou CRY3Bb usando o sistema High Fidelity Expand System (Roche), seguido o protocolo proporcionado pelo fabricante. Um PCR secundário com primers aninhados foi usado para amplificação específica. O produto de PCR foi em seguida clonado para análise do seqüenciamento. Um kit Universal GenomeWalker (cat no. K1807-1, Clonetech, Palo Alto, CA) foi usado para isolamento do DNA da região transgênica/genômica 5' e 3' usando primers adaptadores AP1 e AP2 incluídos no mesmo e o protocolo proporcionado pelo fabricante.
[0066] O DNA da região transgênica/genômica 5' (SEQ ID NO:3, Figura 3) e 3' (SEQ ID NO:4, Figura 4) são isolados do DNA genômico MON88017 utilizando PCR. DNA genômico total (~10 μg) é digerido com as enzimas de restrição. As colunas de purificação de PCR QIA- quick são usadas para purificar o DNA depois de digestão de um dia para o outro a 37°C. O DNA é eluído das colunas com 50 μl de água e em seguida diluído para 1 ml. O eluente diluído (85 μl) é combinado com 10 μl de tampão (10X) e 5 μl de T4 Ligase para circularizar os fragmentos. Depois de uma incubação de um dia para o outro a 16°C, a ligase é inativada termicamente a 70°C. As amostras são amplificadas por PCR com uma série de primers aninhados. As combinações de primer para isolamento da região transgênica/genômica 3' incluíram a SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, e AP1 como primers primários, a SEQ ID NO:10 e AP2 como os primers secundários, e a SEQ ID NO:11 para uso como um primer de seqüenciamento; o isolamento da região transgênica/genômica 5' incluiu a SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 e AP1 como primers primários, a SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15 e AP2 como primers secundários.
[0067] As condições para a reação de PCR incluem: PCR primário = 7 ciclos de 94°C durante 2 segundos, 72°C durante 10 minutos; 37 ciclos de 94°C durante 2 segundos, 67°C durante 10 minutos; 1 ciclo de 67°C durante 10 minutos; PCR secundário e terciário = 5 ciclos de 94°C durante 2 segundos, 72°C durante 10 minutos; 24 ciclos de 94°C durante 2 segundos, 67°C durante 10 minutos; 1 ciclo de 67°C durante 10 minutos.
[0068] Alternativamente, a amplificação de DNA por PCR das re giões de inserções transgênicas/genômicas 5' e 3' do evento MON88017 pode ser realizada com condições que incluem: 7 ciclos de 94°C durante 25 segundos, 72°C durante 3 minutos; 37 ciclos de 94°C durante 25 segundos, 67°C durante 3 minutos; 1 ciclo de 67°C durante 7 minutos. Todas as amplificações subseqüentes conduzidas com as seguintes condições: 7 ciclos de 94°C durante 2 segundos, 72°C du rante 4 minutos; 37 ciclos de 94°C durante 2 segundos, 67°C durante 4 minutos; 1 ciclo de 67°C durante 7 minutos. Todos os amplicons são visualizados sobre géis de agarose a 0,8% corados com brometo de etídio. O DNA é preparado para seqüenciamento ou purificação das amostras de PCR diretamente com o kit de purificação de PCR QIA- quick (cat no. 28104, Qiagen Inc., Valencia, CA) ou extraindo o fragmento apropriado do gel e usando o kit de extração de gel QIAquick Gel Extraction (cat no. 28704, Qiagen Inc.). Os fragmentos de DNA das regiões flanqueantes de inserção transgênica/genômica MON88017 foram subclonados usando um kit TOPO TA Cloning® (In- vitrogen, Carlsbad, CA). A seqüência de DNA da região transgêni- ca/genômica 5' é mostrada na Figura 3, a seqüência de DNA da região transgênica/genômica 3' é mostrada na Figura 4 e a inserção transgê- nica completa e DNA genômico flanqueando encadeado é mostrada na Figura 5.
[0069] A seqüência de inserção transgênica/genômica de exten são total (SEQ ID NO:5, Figura 5) foi isolada de DNA genômico MON88017 sobrepondo produtos de PCR. Uma série de primers de DNA foram designados para produzir amplicons que contêm fragmentos de DNA da inserção transgênica e a porção das regiões genômicas flanqueantes adjacentes do genoma MON88017. Os fragmentos de DNA foram seqüenciados, as seqüências foram combinadas para criar um contig das seqüências de fragmentos que é a SEQ ID NO:5 da presente invenção. As combinações de pares de primers de DNA foram: SEQ ID NO:16 e SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 e SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19 e SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 e SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:27. DNA genômico total foi usado para todas as reações de PCR. Todos os amplicons foram visualizados sobre géis de agarose a 0,8% corados com brometo de etídio. O DNA foi preparado seqüenciando ou por purificação das amostras de PCR diretamente com o kit de purificação de PCR QIAquick ou extraindo o fragmento apropriado do gel e usando o kit de extração de gel QIAquick. A seqüência de DNA foi produzida usando equipamento de análise de seqüência de DNA (ABI Prism® 377, PE Biosystems, Foster City, CA) e programa de análise de seqüência DNASTAR (DNASTAR Inc., Madison, WI).
[0070] Pares de primers do evento de DNA são usados para pro duzir um amplicon diagnóstico para evento de milho MON88017. Um amplicon diagnóstico para MON88017 compreende no mínimo uma seqüência de junção, a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2. Pares de primers do evento que produzirão um amplicon diagnóstico para MON88017, no qual os pares de primers incluem, porém não estão limitados a SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:7 para a seqüência do amplicon 5' conforme resumido na Tabela 2. A localização do primer SEQ ID NO:6 é no genoma do milho conforme mostrado na Figura 3 iniciando na posição do nucleotídeo 952. A localização do primer SEQ ID NO:7 é na inserção do transgene conforme mostrado na Figura 5 iniciando na posição do nucleotídeo 450. O tamanho do amplicon esperado usando a SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:7 em um método de amplificação de DNA com DNA de MON88017 é aproximadamente 550 bps. Além destes pares de primers, qualquer par de primers derivado da SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4 que em uma reação de amplificação de DNA produz um amplicon diagnóstico para MON88017 ou progênie do mesmo é um aspecto da presente invenção. Qualquer molécula de primer de polinucleotídeo de DNA isolada única compreendendo no mínimo 11 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:3, ou seu complemento que é útil em um método de amplificação de DNA para produzir um amplicon diagnóstico para MON88017 é um aspecto da invenção.Qualquer molécula de primer de polinucleotídeo de DNA isolada única compreendendo no mínimo 11 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:4, ou seu complemento que é útil em um método de amplificação de DNA para produzir um amplicon diagnóstico para MON88017 é um aspecto da invenção. Um exemplo das condições de amplificação para esta análise é ilustrado na Tabela 2 e na Tabela 3, no entanto, qualquer modificação destes métodos ou o uso de primers de DNA homólogos ou complementares à SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4 ou se- qüências de DNA dos elementos genéticos contidos na inserção do transgene (SEQ ID NO:5) de MON88017 que produzem um amplicon diagnóstico para MON88017, está dentro da técnica. Um amplicon diagnóstico compreende uma molécula de DNA homóloga ou complementar a no mínimo uma junção de DNA transgênico/genômico (SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2) ou uma porção substancial da mesma.
[0071] Uma análise para amostra de tecido de planta do evento MON88017 deve incluir um controle de tecido positivo do evento MON88017, um controle negativo de uma planta de milho que não é evento MON88017, e um controle negativo que não contém DNA ge- nômico de milho. Um par de primers que amplificará uma molécula de DNA de milho endógena servirá como um controle interno para as condições de amplificação de DNA, um exemplo destas são a SEQ ID NO:28 e SEQ ID NO:29 que amplifica um fragmento de DNA de aproximadamente 239 bp. Seqüências de primer adicionais podem ser selecionadas entre a SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, ou SEQ ID NO:5 por aqueles versados na técnica dos métodos de amplificação de DNA, e as condições selecionadas para a produção de um amplicon pelos métodos mostrados na Tabela 2 e na Tabela 3 podem diferir, mas resultam em um amplicon diagnóstico para o DNA do evento MON88017. O uso destas seqüências de primers de DNA com modificações dos métodos da Tabela 2 e 3 estão dentro do âmbito da invenção. O amplicon produzido por no mínimo uma seqüência de primers de DNA derivada da SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, ou SEQ ID NO:5 que é diagnóstico para MON88017 é um aspecto da invenção.
[0072] Kits de detecção de DNA que contèm no mínimo um primer de DNA derivado da SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4, ou SEQ ID NO:5 que quando usado em um método de amplificação de DNA produz um amplicon diagnóstico para MON88017 é um aspecto da invenção. Uma planta ou semente de milho, em que seu genoma produzirá um amplicon diagnóstico para MON88017 quando testado em um método de amplificação de DNA é um aspecto da invenção. O teste para o amplicon MON88017 pode ser realizado usando um Robocycler Stratagene, thermocycler MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, ou Eppendorf Mastercycler Gradient como mostrado na Tabela 3, ou por métodos e equipamentos de conhecimento das pesssoas versadas na técnica. Tabela 2. Procedimento de PCR e condições da mistura da reação para a identificação de MON88017 a região de 5' inserção transgênica/junção genômica.
Tabela 3. Parâmetros de PCR sugeridos para vários Thermocyclers disponíveis comercialmente.
[0073] Prosseguir com a amplificação de DNA em um Robocycler Stratagene, Thermocycler MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, ou Eppen- dorf Mastercycler Gradient usando os seguintes parâmetros de cicla- gem. O Thermocycler MJ Engine ou Eppendorf Mastercycler Gradient deve ser operado no modo calculado. Operar o Thermocycler Perkin- Elmer 9700 com a velocidade ascendente ajustada no máximo.
[0074] Análise Southern blot foi feita sobre DNA genômico que foi isolado do MON88017 e tecido de milho controle conforme descrito no Exemplo 3. A quantificação das amostras de DNA foi realizada usando um fluorômetro Hoefer DyNA Quant 200 Fluorometer (Pharmacia, Uppsala, Suécia) com marcador do tamanho molecular Roche IX como um padrão de calibração de DNA.
[0075] Aproximadamente 20 μg de DNA genômico da substância de teste e 10 μg de DNA genômico da substância controle foram usados para digestões enzimáticas de restrição. Para a análise da estabilidade da inserção, aproximadamente 10 μg de DNA genômico da substância de teste foram usados. Digestões de um dia para o outro foram realizadas a 37°C em um volume total de ~500 μl usando 100 unidades da enzima de restrição apropriada. Depois da digestão, as amostras foram precipitadas adicionando 1/10 volume (50 μl) de 3 M de NaOAc (pH 5.2) e 2 volumes (1 ml relativo ao volume da digestão original) de 100% de etanol, seguido por incubação em um freezer a - 20°C durante no mínimo 30 minutos. O DNA digerido foi peletizado em velocidade máxima em uma microcentrífuga, lavado com 70% de eta- nol, secado, e redissolvido no tampão TE.
[0076] Sondas de DNA foram preparadas por amplificação por PCR da porção do cassete de expressão vegetal de DNA template pMON53616. Aproximadamente 25 ng de cada sonda (exceto as se- qüências de poliadenilação NOS 3' e TaHsp17 3') foram etiquetadas com 32P-dCTP (6000 Ci/mmol) por um método de priming aleatório (RadPrime DNA Labeling System, Life Technologies). As seqüências de poliadenilação NOS 3' e tahsp17 3' foram marcadas por PCR usando 25 ng de sonda de DNA template na seguinte maneira: primers de sentido e anti-sentido específicos para modelo (0,25 mM cada); 1,5 mM de MgCl2; 3 mM cada e dATP, dGTP e dTTP; ~100 mCi de 32P- dCTP (6000 Ci/mmol); e 2,5 Unidades de Taq DNA polimerase em um volume final de 20 ml. As condições de ciclagem foram como se segue: 1 ciclo a 94oC durante 3 minutos; 2 ciclos a 94oC durante 45 segundos, 52oC durante 30 segundos, 72oC durante 2 minutos; e 1 ciclo a 72oC durante 10 minutos. Todas as sondas radiomarcadas foram purificadas usando uma coluna Sephadex G-50 (Roche, Indianapolis, IN).
[0077] Moléculas de DNA sintéticas para uso como sondas para métodos de reprodução assistida por marcadores ou para a detecção do DNA de MON88017 em uma amostra podem ser preparadas com-preendendo a seqüência de DNA da molécula de DNA da junção transgênica/genômica descrita na SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2 ou uma porção substancial da mesma.
[0078] Os métodos usados para identificar heterozigotos da pro- gênie homozigota contendo evento MON88017 são descritos em um teste de zigosidade para o qual os exemplos de condições são descritos na Tabela 4 e na Tabela 5. Os primers de DNA usados em um teste de zigosidade são primers (SEQ ID NO:30), (SEQ ID NO:31), (SEQ ID NO:32), primer marcado com 6FAM™ (SEQ ID NO:33) e primer marcado com VIC™ (SEQ ID NO:34), 6FAM e VIC são produtos de pigmento fluorescente da Applied Biosystems (Foster City, CA) fixado ao primer de DNA.
[0079] As SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31 e SEQ ID NO:32 quando usadas nestes métodos de reação produzem um amplicon de DNA para milho não transgênico, dois amplicons de DNA para milho hetero- zigoto contendo DNA de evento MON88017, e um amplicon de DNA para milho homozigoto MON88017 que é distinto de qualquer outra planta não milho MON88017. Os controles para esta análise devem incluir um controle positivo de milho homozigoto e heterozigoto contendo DNA de evento MON88017, um controle negativo de milho não transgênico, e um controle negativo que não contém DNA de template. Este teste é otimizado para uso com um Robocycler Stratagene, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, ou Thermocycler Eppendorf Mastercycler Gradient. Outros métodos e equipamentos conhecidos das pessoas versadas na técnica que produzem amplicons que identificam a zigosi- dade da progênie de cruzamentos feitos com plantas MON88017 estão dentro do conhecimento da técnica.
Tabela 5. Condições do thermocycler do teste de zigosidade
[0080] Prosseguir com a amplificação do DNA em um Robocycler Stratagene, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, ou Thermocycler Eppen- dorf Mastercycler Gradient usando os seguintes parâmetros de cicla- gem. Ao realizar a reação de PCR no Eppendorf Mastercycler Gradient ou MJ Engine, o Thermocycler deve ser operado no modo calculado. Ao realizar a reação de PCR no Perkin-Elmer 9700, operar o Thermocycler com a veloxidade ascendente ajustada no máximo.
[0081] Um depósito de semente de milho MON88017 descrito acima e mencionado nas reivindicações foi feito segundo o Tratado de Budapest com a American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110. O númeo de acesso da ATCC é PTA-5582. O depósito será mantido no depositório por um pe-ríodo de 30 anos, ou 5 anos depois do último requerimento, ou pela vida efetiva da patente, o que for mais longo, e será substituído conforme necessário durante este período.
[0082] Produtos tais como materiais de alimentos e mercadorias podem ser produzidos a partir de evento de milho MON88017, e espera-se que semelhantes materiais de alimentos e mercadorias contenham seqüências de nucleotídeos que, caso detectadas em níveis suficientes em semelhantes materiais de alimentos e mercadorias, possam ser diagnósticas quanto à presença de materiais de evento de milho MON88017 dentro de semelhantes mercadorias e materiais de alimentos. Exemplos de semelhantes materiais de alimentos e mercadorias incluem porém não estão limitados a óleo de milho, farinha grossa de milho, polvilho de milho, glúten de milho, bolos de milho, amido de milho, e qualquer outro material de alimento pretendido para consumo como uma fonte de alimento por um animal ou de outro modo, pretendido como um agente de volume, ou pretendido como um componente em uma composição de maquilagem para uso cosmético, e etc. Pode ser desenvolvido um método e/ou kit de detecção de ácido nucléico à base de uma sonda ou um par de primers em que a se- qüência de sondas ou a seqüência dos primers é selecionada do grupo de seqüências conforme determinado na SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, e SEQ ID NO:5 que possibilita a detecção de uma seqüência de nucleotídeos MON88017 tal como SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2 em uma amostra biológica, e seme- lhante detecção seria diagnóstica para o evento de milho MON88017 em semelhante amostra.
[0083] Tendo ilustrado e descrito os princípios da presente invenção, deve ser evidente para as pessoas versadas na técnica que a in-venção pode ser modificada em disposição e detalhes sem se afastar de semelhantes princípios. Todas as modificações que estejam dentro do espírito e do âmbito das reivindicações anexadas são reivindicadas.
[0084] Todas as publicações e documentos de patente publicados citados neste relatório descritivo são incorporados a este relatório por meio de referência na mesma extensão como se cada publicação ou requerimento de patente individual fosse especificamente e individual-mente indicado para ser incorporado por meio de referência.
Claims (14)
1. Molécula de DNA isolada, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de DNA recombinante que é, ou é com-pletamente complementar a, uma molécula de DNA selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2.
2. Molécula de DNA isolada, caracterizada pelo fato de ser para uso como uma sonda de DNA que é diagnóstica para DNA de evento de milho MON88017, compreendendo SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4, compreendendo no mínimo 11 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:1, ou o complemento da mesma.
3. Molécula de DNA isolada, caracterizada pelo fato de ser para uso como uma sonda de DNA que é diagnóstica para evento de milho MON88017, compreendendo SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4, compreendendo no mínimo 11 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:2, ou o complemento completo da mesma.
4. Método para detectar a presença de uma sequência de nucleotídeo de evento de milho MON88017, compreendendo SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4, em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de compreender: (a) pôr a amostra em contato com um par de primers de DNA; (b) realizar uma reação de amplificação de ácido nucleico, deste modo produzindo um amplicon; e (c) detectar o referido amplicon,em que o referido amplicon compreende SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido par de primers de DNA compreende as se-quências de nucleotídeos como mostradas em SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:7.
6. Método para detectar a presença de DNA do evento de milho MON88017 em uma amostra biológica caracterizado pelo fato de compreender: (a) pôr a amostra em contato com uma sonda que hibridiza sob condições de hibridização estringentes com DNA de MON88017, compreendendo SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4, e não hibridiza sob as condições de hibridização estringentes com DNA genômico de uma planta controle, em que a referida sonda é, ou é complementar a, SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2; e (b) submeter a amostra e sonda a condições de hibridiza- ção estringentes; e (c) detectar hibridização da sonda ao DNA de MON88017.
7. Método para determinar a zigosidade do DNA de uma planta de milho compreendendo DNA de evento de milho MON88017, compreendendo SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4, em uma amostra ca-racterizado pelo fato de compreender: (a) pôr a amostra em contato com três diferentes primers compreendendo SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, e SEQ ID NO:32, que (I) quando usada em uma reação de amplificação de ácido nucleico compreendendo DNA de evento de milho MON88017, produz um primeiro amplicon que é diagnóstico para evento de milho MON88017 e (II) quando usada em uma reação de amplificação de ácido nucleico compreendendo DNA genômico de milho nativo diferente de DNA do evento MON88017 produz um segundo amplicon que é diagnóstico para DNA genômico de milho nativo no qual o DNA inserido em MON88017 está presente no evento de milho MON88017; (b) realizar uma reação de amplificação de ácido nucleico, e (c) comparar os amplicons produzidos, em que a presença de ambos os amplicons é diagnóstica da zigosidade da amostra.
8. Segmento de ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende 11 a 20 nucleotídeos consecutivos selecionados do grupo consistindo em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2.
9. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compre-ende uma sequência de nucleotídeos a qual é, ou é completamente complementar à, sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2.
10. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 9, carac-terizado pelo fato de que está inserido no genoma de uma planta de milho.
11. Método para detectar a presença de um polinucleotídeo de evento de milho MON88017, compreendendo SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4, em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de com-preender: (a) pôr a amostra em contato com uma sonda sob condições de hibridização estringentes, em que a referida sonda compreende uma sequência de nucleotídeos contígua que é, ou é complementar a, uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2; e (b) detectar hibridização da referida sonda à referida amostra, em que a hibridização da referida sonda à referida amostra é diagnóstica quanto à presença do referido polinucleotídeo do evento de milho MON88017 na referida amostra.
12. Sonda, caracterizada pelo fato de conter 11 a 20 nucle- otídeos consecutivos de extensão para uso na detecção da presença de DNA de evento de milho MON88017 em uma amostra biológica, em que os referidos nucleotídeos consecutivos são selecionados do grupo consistindo em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2.
13. Sonda de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a referida sonda compreende um nucleotídeo selecio-nado do grupo consistindo em um ácido desoxirribonucleico, um ácido ribonucleico, e um análogo de nucleotídeo.
14. Sonda de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a referida sonda é marcada com no mínimo um fluoró- foro.
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