BR112019018056A2 - molécula de ácido nucleico recombinante, cassete de expressão, célula hospedeira, plantas, sementes transgênicas, polipeptídeo recombinante, métodos para conferir tolerância e para controlar ervas daninhas, produto de utilidade e uso da sequência de nucleotídeos - Google Patents

Abstract

São fornecidos composições e métodos para conferir tolerância a herbicidas a bactérias, plantas, células vegetais, tecidos e sementes. As composições incluem polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de tolerância a herbicidas, vetores compreendendo aqueles polinucleotídeos e células hospedeiras compreendendo os vetores. As sequências de nucleotídeos da invenção podem ser utilizadas em construtos de DNA ou cassetes de expressão para transformação e expressão em organismos, incluindo microrganismos e plantas. As composições também incluem bactérias, plantas, células vegetais, tecidos e sementes transformadas. Em particular, são proporcionados polinucleotídeos isolados que codificam polipeptídeos de tolerância a inibidores de HPPD. Adicionalmente, as sequências de aminoácidos correspondentes aos polinucleotídeos estão abrangidas.

Description

“MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO RECOMBINANTE, CASSETE DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, PLANTAS, SEMENTES TRANSGÊNICAS, POLIPEPTÍDEO RECOMBINANTE, MÉTODOS PARA CONFERIR TOLERÂNCIA E PARA CONTROLAR ERVAS DANINHAS, PRODUTO DE UTILIDADE E USO DA SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente nº 62/468.346, depositado em 7 de março de 2017, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS APRESENTADA ELETRONICAMENTE

[002] A cópia oficial da listagem de sequências é enviada eletronicamente via EFS-Web como uma listagem de sequência formatada em ASCII com um arquivo chamado “APA176007WOSEQLIST_ST25.txt”, criado em 1 de março de 2018, e com um tamanho de 31 kilobytes e é depositada simultaneamente com o relatório descritivo. A listagem de sequências contida neste documento formatado em ASCII faz parte do relatório descritivo e é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] Esta invenção refere-se à biologia molecular de plantas, particularmente novos polipeptídeos de HPPD que conferem tolerância melhorada a herbicidas inibidores de HPPD.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] As 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenases (HPPDs) são enzimas que catalisam a reação em que o para-hidroxifenilpiruvato (aqui abreviado como HPP), um produto de degradação de tirosina, é transformado em homogentisato (aqui abreviado como HG), o precursor em plantas de tocoferol e plastoquinona (Crouch NP et al. (1997), Tetrahedron, 53, 20, 6993- 7010, Fritze et al. (2004), Plant Physiology 134: 1388-1400). O tocoferol atua como um antioxidante associado à membrana. A plastoquinona, primeiramente atua como um transportador de elétrons entre o PSII e o complexo citocromo b6/f e, em segundo lugar, é um cofator redox para a fitoeno dessaturase, que está envolvida na biossíntese de carotenóides.

[005] Até agora, mais de 1000 sequências de ácidos nucleicos de vários organismos presentes na base de dados do NCBI foram anotadas como codificando para uma proteína putativa com um domínio de HPPD. Mas para a maioria delas, não foi provado que a proteína teria uma atividade enzimática de HPPD em um ensaio in vitro ou em uma abordagem in planta, nem que tal proteína HPPD possa conferir tolerância a herbicida a herbicidas inibidores de HPPD quando expressos em uma planta. Várias proteínas HPPD e suas sequências primárias foram descritas no estado da técnica, em particular as proteínas HPPD de bactérias tais como Pseudomonas (Rüetschi et al., Eur. J. Biochem., 205, 459-466, 1992, WO 96/38567), Kordia (WO 2011076889) Synechococcus (WO 2011076877), e Rhodococcus (WO 2011076892), de protistas tais como Blepharisma (WO 2011076882), de euryarchaeota tais como Picrophilus (WO 2011076885) de plantas tais como Arabidopsis (WO 96/38567, GENBANK® AF047834), cenoura (WO 96/38567, GENBANK® 87257), Avena sativa (WO 02/046387, WO 11/068567), trigo (WO 02/046387), Brachiaria platyphylla (WO 02/046387), Cenchrus echinatus (WO 02/046387), Lolium rigidum (WO 02/046387), Festuca arundinacea (WO 02/046387), Setaria faberi (WO 02/046387), Eleusine indica (WO 02/046387), sorgo (WO 02/046387, WO 12/ 021785), milho (WO 12/021785), Coccicoides (GENBANK® COITRP), de Coptis japonica (WO 06/132270), Chlamydomonas reinhardtii (ES 2275365)/ WO 2011/145015, ou de mamíferos tais como camundongo ou porco.

[006] A inibição da HPPD leva ao desacoplamento da fotossíntese, deficiência em pigmentos acessórios de coleta de luz e, mais importante, à destruição da clorofila por radiação UV e espécies reativas de oxigênio (branqueamento) devido à falta de foto proteção normalmente fornecida pelos carotenóides (Norris et al. (1995), Plant Cell 7: 2139-2149). O branqueamento de tecidos fotossinteticamente ativos leva à inibição do crescimento e à morte das plantas.

[007] Algumas moléculas que inibem a HPPD, e que inibem a transformação da HPP em homogentisato enquanto se ligam especificamente à enzima, provaram ser herbicidas muito eficazes.

[008] Atualmente, a maioria dos herbicidas inibidores de HPPD disponíveis comercialmente pertence a uma dessas famílias químicas: 1) as tricetonas, e. sulcotriona [ou seja, 2-[2-cloro-4-(metilsulfonil) benzoil]-1,3-ciclohexanodiona], mesotriona [ou seja, 2-[4-(metilsulfonil)-2- nitrobenzoil]-1,3-ciclohexanodiona]; tembotriona [ou seja, 2-[2-cloro-4-(metil sulfonil)-3-[(2,2,2,-tri-fluoroetoxi)metil]benzoil]-1,3-ciclo-hexanodiona]; tefuriltriona [ou seja, 2-[2-cloro-4-(metilsulfonil)-3-[[(tetra-hidro-2-furanil)metoxi] metil]benzoil]-1,3-ciclo-hexanodiona]]; biciclopirona [ou seja, 4-hidroxi-3-[[2-[(2- metoxietoxi)metil]-6-(trifluorometil)-3-piridinil]carbonil]biciclo[3.2.1]oct-3-en-2- ona]; benzobiciclon [ou seja, 3-(2-cloro-4-mesilbenzoil)-2-feniltiobiciclo[3.2.1] oct-2-en-4-ona]; 2) as dicetonitrilas, por exemplo, 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2- metilsulfonil-4-trifluorometilfenil)-propano-1,3-diona e 2-ciano-1-[4-(metil sulfonil)-2-trifluorometilfenil]-3- (1-metilciclopropil)propano-1,3-diona; 3) os isoxazóis, por exemplo, isoxaflutol [ou seja, (5-ciclopropil-4- isoxazolil)[2-(metilsulfonil)-4-(trifluorometil)fenil]metanona]. Nas plantas, o isoxaflutol é rapidamente metabolizado em DKN, um composto de dicetonitrila que exibe a propriedade do inibidor de HPPD; 4) os pirazolinatos, por exemplo, topramezona [ou seja, [3-(4,5-di- hidro-3-isoxazolil)-2-metil-4-(metilsulfonil)fenil](5-hidroxi-1-metil-1H-pirazol-4-il)

metanona] e pirassulfotol [ou seja, (5-hidroxi-1,3-dimetilpirazol-4-il(2-mesil-4- trifluarometilfenil)metanona]; pirazofen [ou seja, 2-[4-(2,4-diclorobenzoil)-1,3- dimetilpirazol-5-iloxi]acetofenona]; 5) N-(1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamidas (WO 2011/035874); e 6) N-(tetrazol-4-il)- ou N-(triazol-3-il)arilcarboxamidas (documento WO 2012/028579).

[009] Estes herbicidas inibidores de HPPD podem ser usados contra ervas daninhas de gramíneas e/ ou folhas largas no campo de plantas de cultura que apresentam tolerância metabólica, tal como milho (Zea mays), arroz (Oryza Sativa) e trigo (Triticum aestivum) em que são rapidamente degradados (Schulz et al. (1993), FEBS letters, 318, 162-166; Mitchell et al.

(2001), Pest Management Science, Vol 57, 120-128; Garcia et al. (2000), Biochem., 39, 7501-7507; Pallett et al., (2001), Pest Management Science, Vol 57, 133-142). Para estender o escopo de uso desses herbicidas inibidores da HPPD, vários esforços foram desenvolvidos para conferir às plantas, particularmente plantas sem ou com uma tolerância metabólica de baixo desempenho, um nível de tolerância aceitável sob condições de campo agronômico.

[010] Além da tentativa de contornar a produção de homogentisato mediada por HPPD (US 6 812 010), tem sido realizada a superexpressão da enzima sensível para produzir quantidades da enzima alvo na planta que são suficientes em relação ao herbicida (WO 96/38567). A superexpressão de HPPD resultou em melhor tolerância pré-emergência ao derivado de dicetonitrila (DKN) do isoxaflutol (IFT), mas a tolerância não foi suficiente para tolerância ao tratamento pós-emergência (Matringe et al. (2005), Pest Management Science 61: 269 -276).

[011] Uma terceira estratégia foi a mutação da HPPD, a fim de obter uma enzima alvo que, ao manter suas propriedades de catalisar a transformação da HPP em homogentisato, é menos sensível aos inibidores da HPPD do que a HPPD nativa antes da mutação.

[012] Esta estratégia foi aplicada com sucesso na produção de plantas tolerantes a 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-metilsulfonil-4-trifluorometilfenil) propano-1,3-diona e a 2-ciano-1-[4-(metilsulfonil)-2-trifluorometilfenil]-3-(1- metilciclopropil)propano-1,3-diona (EP 496630), dois herbicidas inibidores de HPPD pertencentes à família das dicetonitrilas (documento WO 99/24585).

Pro215Leu, Gly336Glu, Gly336Ile, e mais particularmente Gly336Trp (posições do aminoácido mutado, são indicadas com referência à Pseudomonas HPPD) foram identificadas como mutações que são responsáveis por uma maior tolerância ao tratamento com estes herbicidas dicetonitrílicos.

[013] Mais recentemente, a introdução de um gene HPPD de Pseudomonas no genoma plastidial da planta de fumo e da soja mostrou-se mais eficaz que a transformação nuclear, conferindo tolerância à aplicação pós- emergência de isoxaflutol (Dufourmantel et al. (2007), Plant Biotechnol J.5 (1): 118-33).

[014] No documento WO 04/024928, os inventores procuraram aumentar a biossíntese de prenilquinona (por exemplo, síntese de plastoquinonas, tocoferóis) nas células das plantas, aumentando o fluxo do precursor do HPP para as células dessas plantas. Isto foi feito ligando a síntese do referido precursor à via do “chiquimato” pela superexpressão de uma enzima PDH. Eles também notaram que a transformação de plantas com um gene que codifica uma enzima PDH e um gene que codifica uma enzima HPPD torna possível aumentar a tolerância das referidas plantas aos inibidores de HPPD.

[015] No pedido de patente WO 2009/144079, foram divulgadas sequências de ácido nucleico que codificam uma hidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD) com mutações específicas na posição 336 da proteína

HPPD de Pseudomonas fluorescens e a sua utilização na obtenção de plantas que são tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD.

[016] No documento WO 2002/046387, foram identificados vários domínios de proteínas HPPD originárias de plantas que podem ser relevantes para conferir tolerância a vários herbicidas inibidores da HPPD, mas não foram demonstrados dados em plantas ou bioquímicos para confirmar o impacto das funções de domínio descritas.

[017] No documento WO 2008/150473, a combinação de dois mecanismos distintos de tolerância - um gene modificado de Avena sativa que codifica para uma enzima HPPD mutante e uma mono-oxigenase de milho CYP450 (gene nsf1) - foi exemplificada para obter uma tolerância melhorada a herbicidas inibidores de HPPD, mas nenhum dado foi divulgado demonstrando os efeitos sinérgicos baseados na combinação de ambas as proteínas.

[018] Além disso, no documento US 2011 0173718, um método para gerar plantas tolerantes a inibidores de HPPD super-expressando não apenas um gene que codifica para um HPPD tolerante, como por exemplo de Avena sativa, mas também em combinação com vários genes de plantas que codificam para uma proteína HST (homogentisato solanesiltransferase) é divulgado. No entanto, o nível de tolerância a alguns herbicidas inibidores de HPPD selecionados foi bastante limitado.

[019] No documento WO 2011094199 e US 2011 0185444, foi avaliada a tolerância de várias centenas de linhagens do tipo selvagem de soja ao inibidor de HPPD isoxaflutol. Poucas linhagens apresentaram nível razoável de tolerância aos herbicidas. O QTL (locus de traço quantitativo) putativo responsável pela tolerância foi identificado. Nesta região do genoma, um gene que codifica para um transportador ABC foi identificado como sendo a principal característica responsável pela melhor tolerância ao herbicida inibidor de HPPD observado. No entanto, as plantas transgênicas que expressam os genes identificados não apresentaram qualquer melhora na tolerância aos herbicidas inibidores da HPPD testados.

[020] No documento WO 2010/085705, foram divulgados vários mutantes da Avena sativa HPPD. Mostrou-se que algumas das variantes apresentaram melhor tolerância in vitro à tricetona “mesotriona”, no entanto, apenas poucos mutantes foram expressos em plantas de fumo. Além disso, nenhuma das plantas de fumo que expressam esses mutantes exibiu tolerância aprimorada à mesotriona ou isoxaflutol em comparação com as plantas de fumo que expressam o gene HPPD Avena sativa de tipo selvagem.

[021] O documento US 2012/0042413 descreve polipeptídeos possuindo atividade de HPPD, mas também mostrando uma certa insensibilidade a pelo menos um inibidor de HPPD e sugere ainda um certo conjunto de mutações em diferentes posições de enzimas HPPD e finalmente revela dados bioquímicos bem como níveis de tolerância de plantas contendo poucas das tais HPPDs mutadas.

[022] No documento EP 21453012, foram descritos vários mutantes de HPPD; no entanto, a tolerância melhorada dos mutantes descritos não foi demonstrada in planta contra vários herbicidas inibidores da HPPD.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[023] São fornecidas composições e métodos para conferir tolerância a herbicidas inibidores de HPPD. As composições incluem polipeptídeos de HPPD que são tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD e moléculas de ácido nucleico isoladas, recombinantes ou quiméricas que codificam esses polipeptídeos, vetores e células hospedeiras que compreendem essas moléculas de ácido nucleico. As composições também incluem os anticorpos para esses polipeptídeos. As sequências de nucleotídeos podem ser usadas em construtos de DNA ou cassetes de expressão para transformação e expressão em organismos, incluindo microrganismos e plantas. As sequências de nucleotídeos podem ser sequências sintéticas que foram projetadas para expressão em um organismo incluindo, mas não se limitando a, um microrganismo ou uma planta.

[024] As composições incluem moléculas de ácido nucleico que codificam polipeptídeos tolerantes a herbicidas, incluindo moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína HPPD com uma ou mais substituições de amino aminoácidos nas posições que correspondem às posições de aminoácidos 264, 268, 270, 335, 336, 337, 339, 340., 344 e/ ou 345 da SEQ ID NO: 1, incluindo a proteína HPPD apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 1 ou 2, em que uma ou mais substituições de aminoácidos nas posições que correspondem às posições de aminoácidos 264, 268, 270, 335, 336, 337, 339, 340, 344 e/ ou 345 da SEQ ID NO: 1 foram introduzidos e incluindo qualquer sequência de ácido nucleico que codifica as sequências de aminoácidos apresentadas em qualquer uma das SEQ ID NO: 12, 2, 3, 4 ou 5, bem como variantes e fragmentos das mesmas. A invenção compreende ainda a proteína HPPD tolerante a herbicida codificada pelas moléculas de ácido nucleico, bem como composições compreendendo a proteína HPPD.

[025] As composições também compreendem bactérias, plantas, células vegetais, tecidos e sementes transformados que são tolerantes aos herbicidas inibidores da HPPD pela introdução da sequência de ácidos nucleicos da invenção no genoma das bactérias, plantas, células vegetais, tecidos e sementes. Quando o organismo é uma planta, a introdução da sequência permite que os herbicidas inibidores da HPPD sejam aplicados às plantas para matar seletivamente ervas daninhas sensíveis ao inibidor da HPPD ou outras plantas não transformadas, mas não o organismo transformado. As sequências podem adicionalmente ser utilizadas como um marcador para a seleção de células vegetais que crescem na presença de um ou mais herbicidas inibidores de HPPD.

[026] Métodos para identificar uma enzima HPPD com atividade de tolerância ao inibidor de HPPD são adicionalmente fornecidos.

[027] As composições e métodos da invenção são úteis para a produção de organismos com maior tolerância aos herbicidas inibidores de HPPD. Estes organismos e composições compreendendo os organismos são desejáveis para fins agrícolas. Plantas ou sementes compreendendo a sequência de ácido nucleico da invenção podem ser cultivadas em um campo e colhidas para obter um produto vegetal. As composições da invenção também são úteis para gerar proteínas modificadas ou melhoradas que possuem atividade de tolerância ao herbicida inibidor de HPPD, ou para detectar a presença de proteínas ou ácidos nucleicos tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD em produtos ou organismos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[028] As presentes invenções serão agora descritas mais completamente a seguir com referência aos desenhos anexos, nos quais algumas, mas não todas as formas de realização da invenção são apresentadas. De fato, estas invenções podem ser incorporadas em muitas formas diferentes e não devem ser interpretadas como limitadas às formas de realização aqui apresentadas; em vez disso, estas formas de realização são fornecidas de modo que esta divulgação satisfaça os requisitos legais aplicáveis. Números semelhantes referem-se a elementos semelhantes por toda parte.

[029] Diversas modificações e outras formas de realização das invenções aqui apresentadas serão lembradas a um técnico no assunto a que essas invenções pertencem, tendo o benefício dos ensinamentos apresentados nas descrições anteriores e nos desenhos associados. Portanto, deve ser entendido que as invenções não devem ser limitadas às formas de realização específicas divulgadas e que modificações e outras formas de realização devem ser incluídas no escopo das reivindicações anexas. Embora termos específicos sejam empregados aqui, eles são usados em um sentido genérico e descritivo apenas, e não para fins de limitação.

VISÃO GERAL

[030] Vários esforços têm sido desenvolvidos para conferir às plantas um nível agronomicamente aceitável de tolerância a uma ampla gama de herbicidas inibidores de HPPD, incluindo a contornar a produção mediada por HPPD de homogentisato (US 6 812 010), superexpressar a enzima sensível de modo a produzir quantidades da enzima alvo na planta que são suficientes em relação ao herbicida (WO 96/38567), e mutar a HPPD de modo a obter uma enzima alvo que, embora mantendo as suas propriedades de catalisar a transformação de HPP em homogentisato, é menos sensível aos inibidores de HPPD do que a HPPD nativa antes da mutação.

[031] Apesar destes sucessos obtidos para o desenvolvimento de plantas que apresentam tolerância a vários herbicidas inibidores de HPPD descritos acima, é ainda necessário desenvolver e/ ou melhorar a tolerância das plantas a inibidores de HPPD mais novos ou diferentes, particularmente inibidores de HPPD pertencentes às classes das tricetonas (por exemplo, sulcotriona, mesotriona, tembotriona, benzobiciclon e biciclopirona), os pirazolinatos (por exemplo, topramezona e pirassulfotol), N-(1,2,5-oxadiazol-3- il)benzamidas (WO 2011/035874) e N-(tetrazol-4-il)- ou N-(triazol-3-il) arilcarboxamidas (WO 2012/ 028579).

[032] Assim, a presente invenção proporciona composições e métodos melhorados para regular a tolerância ao herbicida inibidor de HPPD.

Herbicidas inibidores da HPPD, como os da classe das N (1,2,5-oxadiazol-3-il) benzamidas, N-(tetrazol-4-il)- ou N-(triazol-3-il)arilcarboxamidas, tais como 2- cloro-3-etoxi-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H- tetrazol-5-il)benzamida e 2-cloro-3- (metoximetil)-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il) benzamida, tricetonas,

tais como tembotriona, sulcotriona e mesotriona, a classe dos isoxazóis, tais como isoxaflutol, ou da classe dos pirazolinatos, tais como pirassulfotol e topramezona, particularmente selecionados a partir de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona, isoxaflutol e mesotriona, têm uma excelente atividade herbicida contra um amplo espectro de plantas daninhas anuais, monocotiledôneas e dicotiledôneas economicamente importantes. As substâncias ativas também atuam eficientemente em plantas daninhas perenes que produzem rebentos de rizomas, estoques de madeira ou outros órgãos perenes e que são difíceis de controlar. No sentido da presente invenção, “herbicida” é entendido como sendo uma substância ativa como herbicida por si só ou uma substância que é combinada com um aditivo que altera sua eficácia, como, por exemplo, um agente que aumenta sua atividade (agente sinérgico) ou que limita a sua atividade (um protetor de fitotoxicidade). O herbicida pode ainda compreender adjuvantes ou veículos sólidos ou líquidos que são normalmente utilizados em tecnologia de formulações (por exemplo, substâncias minerais naturais ou regeneradas, solventes, dispersantes, agentes umectantes, agentes de adesividade, emulsionantes, agentes promotores de crescimento e assim por diante), bem como um ou mais herbicidas adicionais e/ ou um ou mais pesticidas (por exemplo, inseticidas, virucidas, microbicidas, amebicidas, pesticidas, fungicidas, bactericidas, nematocidas, moluscicidas e assim por diante).

[033] Os métodos envolvem a transformação de organismos com sequências de nucleotídeos que codificam um gene de tolerância a inibidores de HPPD da invenção ou a introdução de tais genes de tolerância a inibidores de HPPD em organismos que não os contêm (por exemplo, por cruzamento, fusão celular ou por cruzamento de organismos contendo um gene inibidor de HPPD introduzido da invenção com organismos que não o contenha e obtendo progênies contendo esse gene). As sequências de nucleotídeos da invenção são úteis para a preparação de plantas que apresentam tolerância aumentada a herbicidas inibidores de HPPD, particularmente tolerância aumentada a herbicidas inibidores de HPPD da classe de N-(1,2,5-oxadiazol-3-il) benzamidas, N-(tetrazol-4-il)- ou N-(triazol-3-il)arilcarboxamidas, tais como 2- cloro-3-etoxi-4-(metilsulfonil)-N- (1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida e 2-cloro-3- (metoximetil)-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H- tetrazol-5-il) benzamida, tricetonas, tais como tembotriona, sulcotriona e mesotriona, a classe dos isoxazóis tais como isoxaflutol, ou da classe dos pirazolinatos, tais como pirassulfotol e topramezona, particularmente selecionados a partir de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona, isoxaflutol e mesotriona. O gene de tolerância a herbicida inibidor de HPPD da invenção também pode mostrar tolerância em relação aos “herbicidas derivados de cumarona” (descritos nos documentos WO 2009/090401, WO 2009/090402, WO 2008/071918, WO 2008/009908). A este respeito, qualquer um dos genes de tolerância ao herbicida inibidor de HPPD da invenção também pode ser expresso em uma planta expressando também um gene de homogentisato solanesiltransferase (HST) quimérico ou um gene HST mutado como descrito em WO 2011/ 145015, WO 2013/064987, WO 2013/064964, ou WO 2010/029311, para obter plantas tolerantes a herbicidas inibidores de HST. Como aqui utilizado, um “herbicida derivado de cumarona” ou “herbicida inibidor de HST” abrange compostos que se enquadram na nomenclatura IUPAC de 5H-tiopirano[4,3-b] piridin-8-ol, 5H-tiopirano[3,4-b]pirazin-8-ol, oxatiino[5,6-b]piridin-4-ol e oxatino [5,6-b]pirazin-4-ol.

[034] Assim, através do gene de “tolerância ao herbicida inibidor de HPPD” da invenção, pretende-se um gene que codifica uma proteína que confere a uma célula ou organismo a capacidade de tolerar uma concentração mais elevada de um herbicida inibidor de HPPD do que essa célula ou organismo que não expressa a proteína, ou tolerar uma certa concentração de um herbicida inibidor de HPPD por mais tempo do que essa célula ou organismo que não expressa a proteína, ou que confere a uma célula ou organismo a capacidade de realizar fotossíntese, crescer e/ ou reproduzir com menos inibição de crescimento ou dano observada do que tal célula ou organismo que não expressa tal proteína. Uma “proteína de tolerância ao inibidor de HPPD” inclui uma proteína que confere a uma célula ou organismo a capacidade de tolerar uma concentração mais alta de herbicida inibidor de HPPD do que essa célula ou organismo que não expressa a proteína, ou tolerar uma certa concentração de herbicida inibidor de HPPD por um período de tempo mais longo do que essa célula ou organismo que não expressa a proteína ou que confere a uma célula ou organismo a capacidade de realizar a fotossíntese, crescer e/ ou reproduzir com menos danos ou inibição de crescimento observada do que essa célula ou organismo não expressando essa proteína. Por “tolerar” ou “tolerância” entende-se sobreviver a uma aplicação específica de herbicida inibidor de HPPD, ou a capacidade de realizar funções celulares essenciais como fotossíntese, síntese de proteínas ou respiração e reprodução de uma maneira que não seja prontamente discernível de células ou organismos não tratados, ou a capacidade de não ter diferença significativa no rendimento ou mesmo rendimento melhorado para plantas tratadas com herbicida inibidor de HPPD em comparação com essas plantas não tratadas com esse herbicida (mas onde as ervas daninhas foram removidas ou impedidas por um mecanismo diferente da aplicação do herbicida inibidor de HPPD, tal como os métodos descritos em WO 2011/100302, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade).

[035] Além de conferir uma tolerância ao inibidor de HPPD celular, as sequências de ácido nucleico de HPPD da invenção codificam polipeptídeos possuindo atividade de HPPD, ou seja, catalisando a reação em que o para-hidroxifenilpiruvato (pHPP) é transformado em homogentisato.

Preferencialmente, a atividade catalítica da proteína HPPD da presente invenção, quando testada in vitro, não difere daquela de uma proteína HPPD de referência em mais de 90%, mais de 70% ou mais de 50%, quando analisada sob condições idênticas e na ausência dos herbicidas inibidores da HPPD descritos acima. Em algumas formas de realização, a atividade catalítica é melhorada em relação à proteína HPPD de referência. A atividade catalítica de uma enzima HPPD pode ser definida por vários métodos bem conhecidos na técnica. O documento WO 2009/144079 descreve vários métodos de triagem adequados.

[036] As enzimas HPPD que exibem tolerância aprimorada a um herbicida inibidor de HPPD podem fazê-lo em virtude da exibição de, em relação à HPPD de referência: a) um valor Km mais alto para o substrato natural, 4-hidroxifenilpiruvato; b) um valor kcat mais baixo para converter 4- hidroxifenilpiruvato em homogentisato; c) um valor mais baixo da constante de velocidade, kon, que governa a formação de uma enzima: complexo herbicida inibidor de HPPD; d) um valor aumentado da constante de velocidade, koff, que governa a dissociação de uma enzima: complexo herbicida inibidor de HPPD; e/ ou e) como resultado de alterações em um ou ambos de c) e d), um valor aumentado da constante de equilíbrio, Ki (também chamada Kd), que governa a dissociação de uma enzima: complexo herbicida inibidor de HPPD.

[037] A atividade enzimática de proteínas HPPD pode ser medida por qualquer método que permita medir a diminuição da quantidade de substratos HPP ou O2 ou medir o acúmulo de qualquer um dos produtos derivados da reação enzimática, ou seja, homogentisato ou CO2. Em particular, a atividade da HPPD pode ser medida por meio do método descrito em WO 2009/144079; Garcia et al. (1997), Biochem. J. 325, 761-769; Garcia et al. (1999), Plant Physiol. 119, 1507-1516; ou em WO 2012/021785, que são aqui incorporados por referência.

[038] Para os propósitos da presente invenção, uma proteína HPPD “de referência” (ou gene HPPD) é qualquer proteína ou ácido nucleico de HPPD contra o qual a proteína HPPD ou ácido nucleico HPPD da invenção está sendo comparada. Esta HPPD de referência pode ser uma HPPD vegetal nativa, bacteriana ou animal, ou pode ser uma HPPD mutada que é conhecida na técnica. Tal HPPD de referência pode ser utilizada para determinar se a proteína ou o ácido nucleico de HPPD da invenção tem uma propriedade de interesse particular (por exemplo, tolerância ao herbicida inibidor de HPPD ou atividade da enzima HPPD melhorada, comparável ou diminuída; expressão melhorada, comparável ou diminuída em uma célula hospedeira; estabilidade proteica melhorada, comparável ou diminuída e assim por diante).

[039] Em várias formas de realização aqui contidas, o ácido nucleico tolerante a herbicida inibidor de HPPD (incluindo os seus genes isolados, recombinantes e quiméricos, vetores, células hospedeiras, plantas, partes de plantas e sementes compreendendo o ácido nucleico, polipeptídeos de HPPD e suas composições codificadas pelo ácido nucleico, bem como métodos de utilização do ácido nucleico para aumentar a tolerância de uma planta aos herbicidas inibidores de HPPD, particularmente maior tolerância a herbicidas inibidores de HPPD da classe de N-(1,2,5-oxadiazol-3-il) benzamidas, N-(tetrazol-4-il)- ou N-(triazol-3-il)arilcarboxamidas, tais como 2- cloro-3-etoxi-4- (metilsulfonil)-N- (1-metil-1H-tetrazol-5-il) benzamida e 2-cloro- 3- (metoximetil)-4- (metilsulfonil)- N-(1- metil- 1H- tetrazol- 5- il) benzamida, tricetonas, tais como tembotriona, sulcotriona e mesotriona, a classe dos isoxazóis tais como isoxaflutol, ou da classe dos pirazolinatos, tais como o pirassulfotol e a topramezona, particularmente selecionados a partir de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona, isoxaflutol e mesotriona) codificam uma proteína de HPPD que foi modificada para conter uma ou mais substituições de aminoácidos, incluindo 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 substituições de aminoácidos, nas posições que correspondem às posições de aminoácidos 268, 335, 336, 337, 339, 340 e/ ou 345 da SEQ ID NO: 1. Por “que corresponde a” entende-se a posição de aminoácido ou nucleotídeo em relação a essa posição na SEQ ID NO: 1 quando duas (ou mais) sequências estão alinhadas utilizando algoritmos de alinhamento padrão aqui descritos em outra parte.

[040] Em uma forma de realização, a HPPD da presente invenção foi modificada para compreender uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em: (a) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1; (b) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (c) uma serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1; (d) uma tirosina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1; e (e) uma arginina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1.

[041] Em outra forma de realização, a HPPD foi modificada para compreender a(s) substituição(ões) de aminoácidos de: (a) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1; (b) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1; (c) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (d) uma serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1; (e) uma tirosina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1; (f) uma arginina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; e (g) uma metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1.

[042] Em outra forma de realização, a HPPD foi modificada para compreender a(s) substituição(ões) de aminoácidos de: (a) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1; (b) uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 270 da SEQ ID NO: 1; (c) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1; (d) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (e) uma serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1; (f) uma tirosina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1; (g) uma arginina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (h) uma glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 344 da SEQ ID NO: 1; e (i) uma metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1.

[043] Em outra forma de realização, a HPPD foi modificada para compreender a(s) substituição(ões) de aminoácidos de: (a) uma leucina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 264 da SEQ ID NO: 1; (b) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1; (c) uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 270 da SEQ ID NO: 1; (d) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1; (e) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (f) uma serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1; (g) uma tirosina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1; (h) uma arginina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (i) uma glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 344 da SEQ ID NO: 1; e (j) uma metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1.

[044] Em outra forma de realização, a HPPD foi modificada para compreender a(s) substituição(ões) de aminoácidos de: (a) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1; (b) uma asparagina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1; (c) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (d) uma serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1; (e) uma arginina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; e (g) uma metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1.

[045] Em formas de realização específicas, a HPPD da invenção tem pelo menos 53%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos aqui apresentada como SEQ ID NO: 1, em que a HPPD foi modificada para compreender a(s) substituição(ões) de aminoácidos de: (a) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1; (b) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (c) uma serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1; (d) uma tirosina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1; e (e) uma arginina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1.

[046] Em outra forma de realização, a HPPD da invenção tem pelo menos 53%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos

90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos aqui apresentada como SEQ ID NO: 1 e em que a referida HPPD compreende a(s) substituição(ões) de aminoácidos de: (a) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1; (b) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1; (c) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (d) uma serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1; (e) uma tirosina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1; (f) uma arginina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; e (g) uma metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1.

[047] Em outra forma de realização, a HPPD da invenção tem pelo menos 53%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos aqui apresentada como SEQ ID NO: 1 e em que a referida HPPD compreende a(s) substituição(ões) de aminoácidos de: (a) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1; (b) uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 270 da SEQ ID NO: 1; (c) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1; (d) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (e) uma serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1; (f) uma tirosina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1; (g) uma arginina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (h) uma glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 344 da SEQ ID NO: 1; e (i) uma metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1.

[048] Em outra forma de realização, a HPPD da invenção tem pelo menos 53%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos aqui apresentada como SEQ ID NO: 1 e em que a referida HPPD compreende a(s) substituição(ões) de aminoácidos de: (a) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1; (b) uma asparagina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1; (c) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (d) uma serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1; (e) uma arginina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; e (g) uma metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1.

[049] Em outra forma de realização, a HPPD da invenção tem pelo menos 53%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos aqui apresentada como SEQ ID NO: 1 e em que a referida HPPD compreende a(s) substituição(ões) de aminoácidos de: (a) uma leucina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 264 da SEQ ID NO: 1; (b) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1; (c) uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 270 da SEQ ID NO: 1; (d) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1; (e) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (f) uma serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1; (g) uma tirosina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1; (h) uma arginina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (i) uma glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 344 da SEQ ID NO: 1; e (j) uma metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1.

[050] Qualquer sequência de HPPD pode ser modificada para conter uma ou mais das substituições aqui divulgadas. Por exemplo, a HPPD da invenção também abrange quaisquer enzimas HPPD bacterianas, vegetais ou animais de ocorrência natural que tenham sido modificadas para conter uma ou mais das substituições descritas acima.

[051] Ao alcançar a proteína HPPD da presente invenção, uma sequência de aminoácidos de partida de uma proteína existente tem que ser modificada pelo homem, substituindo pelo menos um aminoácido como definido no presente pedido, o que é mais convenientemente feito modificando o DNA que codifica tal proteína substituindo um certo códon por outro códon que codifica outro aminoácido.

[052] Sequências de HPPD exemplificativas que podem ser modificadas de acordo com a presente invenção incluem aquelas das bactérias, por exemplo, do tipo Pseudomonas sp., por exemplo, Pseudomonas fluorescens ou cianobactérias do gênero Synechocystis. A sequência pode também ser de origem vegetal, em particular derivada de plantas dicotiledôneas, plantas umbelíferas ou outras plantas monocotiledôneas. Exemplos vantajosos que podem ser citados são plantas como planta de fumo, Arabidopsis, Daucus carotta, Zea mays (milho), trigo, cevada, Avena sativa,

Brachiaria platyphylla, Cenchrus echinatus, Lolium rigidum, Festuca arundinacea, Setaria faberi, Eleusine indica, sorgo, Cenchrus echinatus, Festuca arundinacea. As sequências codificadoras e o modo de isolamento e clonagem das mesmas são conhecidas na técnica ou aqui descritos em outra parte (por exemplo, SEQ ID NO: 63-76). Em uma forma de realização específica da invenção, a HPPD que pode ser modificada de acordo com a presente invenção é de origem bacteriana, particularmente de Pseudomonas sp., mais particularmente de Pseudomonas fluorescens, Rhodococcus sp., Blepharisma japonicum, Synechococcus sp., Picrophilus torridus, Kordia algicida ou de origem vegetal, incluindo Arabidopsis thaliana, Sorghum bicolor, Oryza sativa, Triticum aestivum, Hordeum vulgare, Lolium rigidum ou Avena sativa.

[053] Para os fins da presente invenção, a HPPD da invenção também pode compreender modificações adicionais, por exemplo, em que alguns aminoácidos (por exemplo, 1 a 10 aminoácidos) foram substituídos, adicionados ou excluídos para fins de clonagem, para fazer uma fusão de peptídeos de trânsito e similares, que retém a atividade de HPPD, isto é, a propriedade de catalisar a conversão de para-hidroxifenilpiruvato em homogentisato, ou pode ser qualquer HPPD que possa ser melhorada ainda mais.

[054] Em algumas formas de realização, a sequência de nucleotídeos da invenção (incluindo os seus genes isolados, recombinantes e quiméricos, vetores, células hospedeiras, plantas, partes de plantas e sementes compreendendo a sequência de ácido nucleico, sequências de aminoácidos e suas composições codificadas pela sequência de ácido nucleico, bem como métodos de utilização da sequência de ácido nucleico para aumentar a tolerância de uma planta aos herbicidas inibidores de HPPD, particularmente aumento da tolerância aos herbicidas inibidores de HPPD da classe de N-(1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamidas, N-(tetrazol-4-il)- ou N-(triazol-3-il) arilcarboxamidas, tais como 2-cloro-3-etoxi-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H- tetrazol-5- il) benzamida e 2-cloro-3-(metoximetil)-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil- 1H-tetrazol-5-il)benzamida, tricetonas, tais como tembotriona, sulcotriona e mesotriona, da classe de isoxazóis, como isoxaflutol, ou da classe de pirazolinatos, como pirassulfotol e topramezona, particularmente selecionados a partir de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona, isoxaflutol e mesotriona) codifica a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 12, 2, 3, 4 ou 5 e fragmentos e variantes das mesmas que codificam um polipeptídeo de tolerância a herbicida inibidor de HPPD. Assim, nesta forma de realização, a HPPD da invenção compreende a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 12, 2, 3, 4 ou 5, e fragmentos e variantes das mesmas, que conferem tolerância aos herbicidas inibidores de HPPD em uma célula hospedeira.

A. MÉTODOS PARA MEDIR A TOLERÂNCIA AO INIBIDOR DE HPPD

[055] Qualquer método adequado para medir a tolerância a herbicidas inibidores de HPPD pode ser usado para avaliar as sequências de HPPD da invenção. A tolerância pode ser medida monitorando a capacidade de uma célula ou organismo de sobreviver a uma aplicação específica de herbicida inibidor de HPPD, ou a capacidade de realizar funções celulares essenciais como fotossíntese, síntese proteica ou respiração e reprodução de uma maneira que não seja prontamente discernível das células ou organismos não tratados, ou a capacidade de não ter diferenças significativas no rendimento ou mesmo rendimento melhorado para plantas tratadas com herbicida inibidor de HPPD em comparação com essas plantas não tratadas com esse herbicida (mas onde as ervas daninhas foram removidas ou impedidas por um mecanismo diferente da aplicação do herbicida inibidor de HPPD). Em algumas formas de realização, a tolerância pode ser medida de acordo com um fenótipo indicador visível da célula ou organismo transformado com um ácido nucleico compreendendo o gene que codifica para a respectiva proteína HPPD, ou em um ensaio in vitro da proteína HPPD, na presença de diferentes concentrações dos vários inibidores da HPPD. Respostas à dose e mudanças relativas nas respostas à dose associadas a estes fenótipos indicadores (formação de cor castanha, inibição do crescimento, branqueamento, efeito herbicida etc.) são convenientemente expressas em termos, por exemplo, de valores GR50 (concentração para 50% de redução do crescimento) ou MIC (concentração inibitória mínima) em que aumentos nos valores correspondem a aumentos na tolerância inerente à HPPD expressa, da maneira normal, com base em danos às plantas, sintomas de branqueamento meristemáticos etc. em uma faixa de diferentes concentrações de herbicidas.

Esses dados podem ser expressos em termos de, por exemplo, valores de GR50 derivados de curvas de dose/ resposta com “dose” plotada no eixo x e “porcentagem de morte”, “efeito herbicida”, “número de plantas verdes emergentes” etc. plotado no eixo y, onde os valores aumentados de GR50 correspondem a níveis aumentados de tolerância inerente à HPPD expressa.

Os herbicidas podem ser aplicados adequadamente pré-emergência ou pós- emergência.

[056] Em várias formas de realização, o nível de tolerância do ácido nucleico ou gene que codifica uma proteína HPPD de acordo com a invenção, ou a proteína HPPD da invenção pode ser triada através de transgênese, regeneração, reprodução e teste de pulverização de uma planta de teste tal como planta de fumo ou planta de cultura, como soja ou algodoeiro.

De acordo com os resultados obtidos por tal triagem, tais plantas são mais tolerantes, desejavelmente tolerantes a pelo menos 2 vezes a dose normal recomendada para aplicações em campo, ainda mais preferencialmente tolerantes até 4 vezes a dose normal recomendada para aplicações em campo,

aos inibidores de HPPD (por exemplo, herbicidas inibidores de HPPD da classe de N-(1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamidas, N-(tetrazol-4-il)- ou N-(triazol-3-il) arilcarboxamidas, tais como 2-cloro-3-etoxi-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H- tetrazol-5-il)benzamida e 2-cloro-3-(metoximetil)-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil- 1H- tetrazol-5-il)benzamida, tricetonas, tais como tembotriona, sulcotriona e mesotriona, da classe de isoxazóis, como isoxaflutol, ou da classe de pirazolinatos, como pirassulfotol e topramezona, particularmente selecionados a partir de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona, isoxaflutol e mesotriona) do que plantas que não contêm nenhum gene exógeno que codifica uma proteína HPPD, ou do que plantas que contêm um gene compreendendo um DNA que codifica HPPD de referência, por exemplo, um DNA que codifica HPPD de Arabidopsis thaliana, sob o controle do mesmo promotor que o ácido nucleico que codifica a proteína HPPD da invenção. Por conseguinte, o termo “capaz de aumentar a tolerância de uma planta a pelo menos um herbicida que atua na HPPD” denota uma tolerância pela planta que expressa a HPPD da invenção a pelo menos 2x, ou 3x ou 4x ou mais, a dose de campo normal do herbicida inibidor de HPPD em comparação com uma planta expressando apenas o seu HPPD endógeno ou uma planta expressando uma enzima HPPD de referência. A este respeito, o termo “herbicida agindo sobre HPPD” não está limitado a substâncias que são conhecidas e/ ou usadas como herbicidas, mas a quaisquer substâncias que inibem a atividade catalítica de proteínas HPPD.

[057] Alternativamente, ao nível quantitativo, dados como pI50 (valor pI50 significa o valor log da concentração de inibidor necessária para inibir 50% da atividade da enzima em concentração molar) podem ser obtidos para a proteína HPPD da invenção e comparados com uma sequência de HPPD de referência na presença ou ausência de qualquer herbicida inibidor de HPPD respectivo.

[058] Um tipo de ensaio específico, embora não limitativo, que pode ser utilizado para avaliar as sequências de HPPD da invenção é um ensaio colorimétrico. Neste ensaio, um meio de cultura tipo caldo YT com 1% de agarose, 5mM de L-Tirosina e 42mM de Succinato, que contém o agente de seleção para o vetor pSE420 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) ou uma versão modificada de pSE420 (pSE420(RI)NX) é vertida em placas de poços profundos. A cultura de E. coli na fase de crescimento exponencial que contém o vetor pSE420-HPPDx (HPPDx significa qualquer gene codificador para uma enzima/ proteína HPPD putativa) é aplicada a cada poço. Após 16 horas a 37 ºC, os poços que não contêm o meio de cultura, os que foram semeados com uma cultura de E. coli contendo o vetor vazio pSE420 são transparentes, ou os que foram semeados com uma cultura de E. coli contendo um vetor pSE420- HPPDx contendo um gene que codifica para uma HPPD inativa são transparentes, enquanto os poços semeados com uma cultura de E. coli contendo o vetor pSE420-HPPDx que codifica para uma HPPD ativa são castanhos. Foi demonstrado anteriormente que este teste reflete a atividade da HPPD, independentemente da seja a origem dessa atividade, e permite a identificação de atividades da HPPD (US 6 768 044), ou seja, em um nível qualitativo.

B. MÉTODOS DE INTRODUÇÃO DE MUTAÇÕES NAS SEQUÊNCIAS DE HPPD

[059] Na proteína HPPD mutada codificada pelo ácido nucleico da invenção, pelo menos um aminoácido foi substituído como definido acima.

[060] A substituição pode ser efetuada na sequência de ácido nucleico que codifica a HPPD de referência como definida acima por qualquer meio que seja apropriado para substituir, na referida sequência, o códon que codifica o aminoácido a ser substituído com o códon que corresponde ao aminoácido que o substituirá, sendo os referidos códons amplamente descritos na literatura e bem conhecidos do técnico no assunto.

[061] Vários métodos biológicos moleculares podem ser usados para alcançar essa substituição. Um método útil para preparar uma sequência de ácido nucleico mutada de acordo com a invenção e a proteína correspondente compreende a realização de mutagênese sítio-dirigida em códons codificando um ou mais aminoácidos que são previamente selecionados. Os métodos para obter estas mutações sítio-dirigida são bem conhecidos do técnico no assunto e amplamente descritos na literatura (em particular: Directed Mutagenesis: A Practical Approach, 1991, editado por M.J.

McPHERSON, IRL PRESS), ou são métodos para os quais é possível empregar kits comerciais (por exemplo, o kit de mutagênese por clareamento QUIKCHANGE™ da Qiagen). Após a mutagênese sítio-dirigida, é útil selecionar as células que contêm uma HPPD mutada que é menos sensível a um inibidor de HPPD utilizando um auxiliar de triagem apropriado. Métodos de triagem apropriados para conseguir isto foram descritos acima.

[062] Alternativamente, uma sequência de DNA que codifica a HPPD de referência pode ser modificada in silico para codificar uma proteína HPPD com uma ou mais das substituições aqui citadas, e depois sintetizada novamente. A sequência de nucleotídeos que codifica a proteína HPPD mutada pode ser introduzida em uma célula hospedeira como aqui descrito em outra parte.

A. POLINUCLEOTÍDEOS ISOLADOS E VARIANTES E FRAGMENTOS DOS MESMOS

[063] Em algumas formas de realização, a presente invenção compreende polinucleotídeos isolados ou recombinantes. Um polinucleotídeo ou polipeptídeo/ proteína, ou sua porção biologicamente ativa, “isolado” ou “recombinante”, como aqui definido, já não está presente em seu organismo nativo original, tal como quando contido em uma célula hospedeira heteróloga ou em uma célula vegetal, semente ou planta transgênicas. Em uma forma de realização, um polinucleotídeo “isolado” é isento de sequências (por exemplo,

sequências codificadoras ou reguladoras da proteína) que naturalmente flanqueiam o ácido nucleico (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5’ e 3’ do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo do qual o polinucleotídeo é derivado. O termo “recombinante” abrange polinucleotídeos ou polipeptídeos que foram manipulados em relação ao polinucleotídeo ou polipeptídeo nativo, de tal modo que o polinucleotídeo ou polipeptídeo difere (por exemplo, na composição química ou estrutura) do que está ocorrendo na natureza. Em outra forma de realização, um polinucleotídeo “isolado” ou “recombinante” está livre de sequências internas (isto é, íntrons) que ocorrem naturalmente no DNA genômico do organismo do qual o polinucleotídeo é derivado. Um exemplo típico de tal polinucleotídeo é o chamado DNA Complementar (cDNA). Por exemplo, em várias formas de realização, o polinucleotídeo que codifica para tolerância ao herbicida inibidor de HPPD isolado pode conter menos de cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb da sequência de nucleotídeos que flanqueia naturalmente o polinucleotídeo no DNA genômico da célula da qual o polinucleotídeo é derivado. As moléculas de ácido nucleico da invenção incluem aquelas que codificam a HPPD da invenção.

[064] A presente invenção contempla ainda variantes e fragmentos de qualquer sequência de ácido nucleico que codifique as sequências de aminoácidos apresentadas em qualquer uma das SEQ ID NO: 12, 2, 3, 4 ou 5. Um “fragmento” de um polinucleotídeo pode codificar uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo, ou pode ser um fragmento que pode ser usado como sonda de hibridização ou iniciador de PCR, utilizando métodos aqui divulgados em outras partes. Os polinucleotídeos que são fragmentos de um polinucleotídeo compreendem pelo menos cerca de 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, nucleotídeos contíguos, ou até o número de nucleotídeos presentes em um polinucleotídeo completo aqui descrito, dependendo da utilização pretendida (por exemplo, um ácido nucleico de HPPD aqui descrito). Por nucleotídeos “contíguos”, entende-se resíduos de nucleotídeos que são imediatamente adjacentes um ao outro.

[065] Fragmentos dos polinucleotídeos da presente invenção geralmente codificarão fragmentos de polipeptídeos que retêm a atividade biológica da proteína de tolerância a herbicida inibidor de HPPD completa; isto é, atividade de tolerância a herbicida. Por “reter a atividade de tolerância a herbicidas”, entende-se que o fragmento terá pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, pelo menos cerca de 300% ou mais da atividade de tolerância a herbicidas da proteína de tolerância ao herbicida inibidor de HPPD completa aqui revelada como SEQ ID NO: 1. Os métodos para medir a atividade de tolerância a herbicidas são bem conhecidos na técnica e os métodos exemplificativos são aqui descritos. Em um exemplo não limitativo, um fragmento da invenção será tolerante à mesma dose de um herbicida inibidor de HPPD, ou tolerante a doses 2x, 3x, 4x ou mais altas de um herbicida inibidor de HPPD, ou os fragmentos serão tanto quanto ou mais tolerante com base em pI50 ou Ki entre o fragmento e a SEQ ID NO: 1.

[066] Um fragmento de um polinucleotídeo que codifica uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo da invenção codificará pelo menos cerca de 150, 175, 200, 250, 300, 350 aminoácidos contíguos, ou até o número total de aminoácidos presentes em um polipeptídeo completo da invenção. Em um exemplo não limitativo, um fragmento de um polinucleotídeo que codifica uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo da invenção compreende uma ou mais das posições de aminoácidos 264, 268, 270, 335, 336, 337, 339, 340, 344 ou 345 da SEQ ID NO: 1.

[067] A invenção também abrange polinucleotídeos variantes como descrito acima. “Variantes” do polinucleotídeo também incluem aquelas sequências que codificam a HPPD da invenção, mas que diferem moderadamente devido à degenerescência do código genético, bem como aquelas que são suficientemente idênticas. As variantes da presente invenção reterão a atividade da enzima HPPD e a tolerância ao inibidor de herbicida da HPPD. O termo “suficientemente idêntico” significa uma sequência de polipeptídeos ou de polinucleotídeos que tem pelo menos cerca de 60% ou 65% de identidade de sequência, cerca de 70% ou 75% de identidade de sequência, cerca de 80% ou 85% de identidade de sequência, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência em comparação com uma sequência de referência usando um dos programas de alinhamento usando parâmetros padrão. Um técnico no assunto reconhecerá que estes valores podem ser apropriadamente ajustados para determinar a identidade correspondente de polipeptídeos codificados por dois polinucleotídeos, considerando a degenerescência dos códons, a semelhança dos aminoácidos, o posicionamento do quadro de leitura e assim por diante.

[068] Os genes bacterianos possuem, muitas vezes, múltiplos códons de iniciação de metionina nas proximidades do início do quadro de leitura aberto. Muitas vezes, o início da tradução em um ou mais desses códons de iniciação levará à geração de uma proteína funcional. Estes códons de iniciação podem incluir códons ATG. No entanto, bactérias tais como Bacillus sp. também reconhecem o códon GTG como um códon de iniciação e as proteínas que iniciam a tradução nos códons GTG contêm uma metionina no primeiro aminoácido. Além disso, não é frequentemente determinado a priori quais destes códons são utilizados naturalmente na bactéria. Assim, entende- se que o uso de um dos códons alternativos de metionina pode levar à geração de variantes que conferem tolerância ao herbicida. Estas proteínas de tolerância a herbicidas estão abrangidas na presente invenção e podem ser utilizadas nos métodos da presente invenção. Variantes alélicas de ocorrência natural podem ser identificadas com o uso de técnicas bem conhecidas de biologia molecular, tais como reação em cadeia da polimerase (PCR) e técnicas de hibridização, conforme descrito abaixo. Os polinucleotídeos variantes incluem também polinucleotídeos derivados sinteticamente que foram gerados, por exemplo, utilizando estratégias de mutagênese sítio-dirigida ou outras, mas que ainda codificam o polipeptídeo que possui a atividade biológica desejada. Em várias formas de realização, a sequência de nucleotídeos abrangida pela presente invenção é apresentada na SEQ ID NO: 8, 9, 10 e 11, ou são sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma que codificam a mesma sequência de aminoácidos que a sequência de aminoácidos codificada pela SEQ ID NO: 8, 9, 10 ou 11.

[069] O técnico no assunto apreciará ainda que as alterações podem ser introduzidas por mutação adicional dos polinucleotídeos da invenção conduzindo assim a mais alterações na sequência de aminoácidos dos polipeptídeos codificados, sem alterar a atividade biológica dos polipeptídeos. Assim, podem ser criados polinucleotídeos isolados variantes através da introdução de uma ou mais substituições, adições ou deleções de nucleotídeos adicionais no polinucleotídeo correspondente que codifica a HPPD da invenção, de tal modo que 1-5, 1-10 ou 1-15 substituições, adições ou deleções de aminoácidos, ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 substituições, adições ou deleções de aminoácidos, são introduzidas no polipeptídeo codificado. Mutações adicionais podem ser introduzidas por técnicas padrão, tais como mutagênese sítio-dirigida e mutagênese mediada por PCR, ou técnicas de embaralhamento genético. Tais polinucleotídeos variantes estão também abrangidos pela presente invenção.

[070] Os polinucleotídeos variantes podem ser produzidos através da introdução aleatória de mutações ao longo de toda ou parte da sequência codificadora, tal como por mutagênese por saturação ou mutagênese permutacional, e os mutantes resultantes podem ser triados quanto à capacidade de conferir atividade de tolerância a herbicida para identificar mutantes que retêm atividade.

[071] Métodos adicionais para gerar variantes incluem submeter uma célula que expressa uma proteína aqui divulgada (ou sua biblioteca) a uma condição específica que cria um estresse para a atividade da proteína.

Condições específicas podem incluir (mas não estão limitadas a) mudanças na temperatura, alterações no pH e alterações nas concentrações de substratos ou inibidores. A biblioteca de proteínas pode ser submetida a estas condições durante o tempo de expressão proteica (por exemplo, em E. coli ou outro hospedeiro) ou após a criação de um extrato proteico, ou após purificação de proteínas.

[072] A atividade funcional ou enzimática da biblioteca de proteínas que foi submetida a uma condição de estresse pode então ser comparada com a proteína de referência para identificar proteínas com propriedades melhoradas. Esta comparação de atividade pode ser realizada como parte de uma triagem de crescimento ou, alternativamente, como parte de um ensaio enzimático que quantifica a atividade da proteína. As propriedades que podem ser identificadas como melhoradas podem incluir tolerância ao herbicida inibidor de HPPD, alterações nas constantes cinéticas (incluindo Km, Ki, Vmax), estabilidade proteica, termoestabilidade proteica ou temperatura ótima da proteína.

C. PROTEÍNAS E VARIANTES ISOLADAS E FRAGMENTOS DAS MESMAS

[073] Os polipeptídeos de tolerância a herbicidas estão também abrangidos na presente invenção. Um polipeptídeo de tolerância a herbicida inclui preparações de polipeptídeos possuindo menos de cerca de 30%, 20%,

10% ou 5% (em peso seco) de polipeptídeo de tolerância não herbicida (também aqui referido como uma “proteína contaminante”). Na presente invenção, “proteína de tolerância a herbicida” é um polipeptídeo de HPPD aqui divulgado. Fragmentos, porções biologicamente ativas, e suas variantes também são fornecidos e podem ser usados para praticar os métodos da presente invenção.

[074] “Fragmentos” ou “porções biologicamente ativas” incluem fragmentos polipeptídicos compreendendo uma porção de uma sequência de aminoácidos que codifica uma proteína de tolerância a herbicidas e que retém a atividade de tolerância a herbicidas. Uma porção biologicamente ativa de uma proteína de tolerância a herbicida pode ser um polipeptídeo que tem, por exemplo, 10, 25, 50, 100 ou mais aminoácidos de comprimento. Tais porções biologicamente ativas podem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas quanto à atividade de tolerância a herbicidas.

[075] Por “variantes” entende-se proteínas ou polipeptídeos possuindo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 60%, 65%, cerca de 70%, 75%, cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NO: 12, 2, 3, 4 ou 5, em que a referida variante tem atividade enzimática de HPPD e tolerância a herbicida inibidor de HPPD. Um técnico no assunto reconhecerá que estes valores podem ser apropriadamente ajustados para determinar a identidade correspondente dos polipeptídeos codificados por dois polinucleotídeos levando em consideração a degenerescência dos códons, a semelhança dos aminoácidos, o posicionamento do quadro de leitura e assim por diante.

[076] Por exemplo, substituições de aminoácidos conservativas podem ser feitas em um ou mais resíduos de aminoácidos não essenciais. Um resíduo de aminoácido “não essencial” é um resíduo que pode ser alterado a partir da sequência de referência de um polipeptídeo sem alterar a atividade biológica, enquanto um resíduo de aminoácido “essencial” é necessário para a atividade biológica. Uma “substituição de aminoácidos conservativa” é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). As substituições de aminoácidos podem ser feitas em regiões não conservadas que retêm a função. Em geral, tais substituições não seriam feitas para resíduos de aminoácidos conservados, ou para resíduos de aminoácidos que residem dentro de um motivo conservado, onde tais resíduos são essenciais para a atividade polipeptídica. No entanto, um técnico no assunto compreenderá que variantes funcionais podem ter pequenas alterações conservadas ou não conservadas nos resíduos conservados.

[077] Anticorpos para a HPPD da presente invenção, ou para variantes ou fragmentos da mesma, são também abrangidos. Os métodos para a produção de anticorpos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Patente US 4 196 265).

[078] Assim, um aspecto da invenção refere-se a anticorpos, moléculas de ligação ao antígeno de cadeia simples ou outras proteínas que se ligam especificamente a uma ou mais das moléculas proteicas ou peptídicas da invenção e seus homólogos, fusões ou fragmentos. Em uma forma de realização particularmente preferida, o anticorpo liga-se especificamente a uma proteína possuindo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 12, 2, 3, 4 ou 5 ou um fragmento da mesma. Em outra forma de realização, o anticorpo liga-se especificamente a uma proteína de fusão compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 12, 2, 3, 4 ou 5, ou um fragmento da mesma.

[079] Os anticorpos da invenção podem ser utilizados para detectar quantitativa ou qualitativamente as moléculas proteicas ou peptídicas da invenção ou para detectar modificações pós-tradução das proteínas. Como aqui utilizado, um anticorpo ou peptídeo é dito “ligar-se especificamente” a uma molécula proteica ou peptídica da invenção se essa ligação não for competitivamente inibida pela presença de moléculas não relacionadas.

D. EMPILHAMENTO DE GENES

[080] Na produção comercial de culturas, é desejável eliminar plantas indesejáveis (ou seja, “ervas daninhas”) sob gestão pesticida fiável de um campo de plantas de cultura. Um tratamento ideal seria aquele que poderia ser aplicado a um campo inteiro, mas que eliminaria apenas as plantas indesejáveis, deixando inalteradas as plantas de cultura. Um desses sistemas de tratamento envolveria o uso de plantas de cultura que são tolerantes a um herbicida, de modo que quando o herbicida é pulverizado em um campo de plantas de cultura tolerantes a herbicidas, as plantas de cultura continuariam a crescer enquanto as ervas daninhas não tolerantes a herbicidas seriam mortas ou gravemente danificadas. Idealmente, esses sistemas de tratamento tirariam proveito de propriedades herbicidas variadas, de modo que o controle de ervas daninhas pudesse fornecer a melhor combinação possível de flexibilidade e economia. Por exemplo, os herbicidas individuais têm longevidades diferentes no campo, e alguns herbicidas persistem e são eficazes por um tempo relativamente longo após serem aplicados a um campo, enquanto outros herbicidas são rapidamente decompostos em outros compostos e/ ou compostos não ativos. Um sistema de tratamento ideal permitiria o uso de diferentes herbicidas para que os produtores pudessem adaptar a escolha de herbicidas para uma situação particular.

[081] Embora várias plantas de culturas tolerantes a herbicidas estejam atualmente comercialmente disponíveis, um problema que surgiu para muitos herbicidas comerciais e combinações herbicidas/ culturas é que os herbicidas individuais normalmente têm um espectro incompleto de atividade contra espécies comuns de ervas daninhas. Para a maioria dos herbicidas individuais em uso há algum tempo, populações de espécies e biótipos de ervas daninhas resistentes a herbicidas tornaram-se mais prevalentes (ver, por exemplo, Tranel e Wright (2002) Weed Science 50: 700-712; Owen e Zelaya (2005) Pest Manag. Sci. 61: 301-311). As plantas transgênicas que são tolerantes a mais do que um herbicida foram descritas (ver, por exemplo, WO 2005/012515). No entanto, melhorias em todos os aspectos da produção agrícola, opções de controle de ervas daninhas, extensão do controle residual de ervas daninhas e melhoria no rendimento das culturas estão continuamente em demanda.

[082] A sequência de nucleotídeos ou proteína HPPD da invenção é vantajosamente combinada em plantas com outros genes que codificam proteínas ou RNAs que conferem propriedades agronômicas úteis a essas plantas. Entre os genes que codificam proteínas ou RNAs que conferem propriedades agronômicas úteis nas plantas transformadas, pode-se mencionar as sequências de DNA que codificam proteínas que conferem tolerância a um ou mais herbicidas que, de acordo com sua estrutura química, diferem dos herbicidas inibidores de HPPD, e outros que conferem tolerância a certos insetos, aqueles que conferem tolerância a certas doenças, DNAs que codificam RNAs que fornecem controle de nematóides ou insetos, e assim por diante.

[083] Tais genes são descritos, em particular, nos Pedidos de Patente PCT publicados WO 91/02071 e WO 95/06128 e nas Patentes US 7 923 602 e Publicação do Pedido de Patente US 20100166723, cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

[084] Entre as sequências de DNA que codificam proteínas que conferem tolerância a certos herbicidas nas células vegetais e plantas transformadas, pode-se mencionar um gene bar ou PAT ou o gene de Streptomyces coelicolor descrito em WO 2009/152359 que confere tolerância a herbicidas glufosinato, um gene codificando uma EPSPS adequada que confere tolerância aos herbicidas tendo EPSPS como alvo, tal como glifosato e seus sais (US 4 535 060, US 4 769 061, US 5 094 945, US 4 940 835, US 5 188 642, US 4 971 908, US 5 145 783, US 5 310 667, US 5 312 910, US 5 627 061, US 5 633 435), um gene que codifica a glifosato-n-acetiltransferase (por exemplo, US 8 222 489, US 8 088 972, US 8 044 261, US 8 021 857, US 8 008 547, US 7 999 152, US 7 998 703, US 7 863 503, US 7 714 188, US 7 709 702, US 7 666 644, US 7 666 643, US 7 531 339, US 7 527 955 e US 7 405 074), ou um gene que codifica a glifosato oxidoredutase (por exemplo, US 5 463 175).

[085] Entre as sequências de DNA que codificam uma EPSPS adequada que confere tolerância aos herbicidas que têm EPSPS como alvo, será mencionado mais particularmente o gene que codifica a EPSPS de uma planta, em particular a EPSPS de milho, particularmente a EPSPS de milho que compreende duas mutações, particularmente uma mutação na posição de aminoácido 102 e uma mutação na posição de aminoácido 106 (WO 2004/074443), e que está descrito no Pedido de Patente US 6566587, daqui em diante denominada EPSPS de milho duplo mutante ou 2mEPSPS, ou o gene que codifica uma EPSPS isolada de Agrobacterium e que é descrito pela sequência ID NO: 2 e sequência ID NO: 3 da Patente US 5 633 435, também denominada CP4.

[086] Entre as sequências de DNA que codificam uma EPSPS adequada que confere tolerância aos herbicidas que têm EPSPS como alvo, será feita menção mais particularmente ao gene que codifica uma EPSPS GRG23 de Arthrobacter globiformis, mas também aos mutantes GRG23 ACE1, GRG23 ACE2 ou GRG23 ACE3, particularmente os mutantes ou variantes de GRG23 como descrito em WO 2008/100353, como GRG23(ace3)R173K da SEQ ID NO: 29 em WO 2008/100353.

[087] No caso das sequências de DNA que codificam EPSPS, e mais particularmente que codificam os genes acima, a sequência que codifica estas enzimas é vantajosamente precedida por uma sequência que codifica um peptídeo de trânsito, em particular o “peptídeo de trânsito otimizado” descrito na patente US 5 510 471 ou US 5 633 448.

[088] Características de tolerância a herbicidas exemplificativas que podem ser combinadas com a sequência de ácidos nucleicos da invenção incluem ainda pelo menos um inibidor de ALS (acetolactato sintase) (WO 2007/024782); um gene ALS/AHAS de Arabidopsis mutado (Patente US 6 855 533); genes que codificam 2,4-D-monooxigenases que conferem tolerância ao 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) por metabolização (Patente US 6 153 401); e genes que codificam Dicamba monooxigenases conferindo tolerância ao dicamba (ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzóico) por metabolização (US 2008/0119361 e US 2008/0120739).

[089] Em várias formas de realização, a HPPD da invenção é empilhada com um ou mais genes tolerantes a herbicidas, incluindo um ou mais genes tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD adicionais, e/ ou um ou mais genes tolerantes a glifosato e/ ou glufosinato. Em uma forma de realização, a HPPD da invenção é combinada com 2mEPSPS e bar.

[090] Entre as sequências de DNA que codificam proteínas relativas a propriedades de tolerância a insetos, será feita menção mais particularmente às proteínas Bt amplamente descritas na literatura e bem conhecidas dos técnicos no assunto. Também será feita menção a proteínas extraídas de bactérias como Photorhabdus (WO 97/17432 e WO 98/08932).

[091] Entre essas sequências de DNA que codificam proteínas de interesse que conferem novas propriedades de tolerância a insetos, será mencionada mais particularmente as proteínas Bt Cry ou VIP, amplamente descritas na literatura e bem conhecidas dos técnicos no assunto. Estas incluem a proteína Cry1F ou híbridos derivados de uma proteína Cry1F (por exemplo, as proteínas híbridas Cry1A-Cry1F descritas em US 6 326 169; US 6 281 016; US 6 218 188 ou fragmentos tóxicos das mesmas), as proteínas do tipo Cry1A ou fragmentos tóxicos das mesmas, de preferência os proteína Cry1Ac ou híbridos derivados da proteína Cry1AC (por exemplo, a proteína híbrida Cry1Ab-Cry1Ac descrita em US 5 880 275) ou a proteína Cry1Ab ou Bt2 ou fragmentos inseticidas das mesmas, como descrito em EP 451878, as proteínas Cry2Ae, Cry2Af ou Cry2Ag, como descrito em WO 02/057664, ou fragmentos tóxicos das mesmas, a proteína Cry1A.105 descrita no documento WO 2007/140256 (SEQ ID NO: 7) ou um fragmento tóxico da mesma, a proteína VIP3Aa19 de número de acesso NCBI ABG20428, a proteína VIP3Aa20 de número de acesso NCBI ABG20429 (SEQ ID NO: 2 em WO 2007/142840), as proteínas VIP3A produzidas nos eventos de algodoeiro COT202 ou COT203 (WO 2005/054479 e WO 2005/054480, respectivamente), as proteínas Cry como descritas em WO 01/47952, a proteína VIP3Aa ou um fragmento tóxico da mesma como descrito em Estruch et al. (1996), Proc Natl Acad Sci EUA 28; 93(11): 5389-94 e US 6 291 156, as proteínas inseticidas das cepas de espécies de Xenorhabdus (como descrito em WO 98/50427), Serratia (particularmente de S. entomophila) ou Photorhabdus, tais como proteínas Tc de Photorhabdus, como descrito em WO 98/08932 (por exemplo, Waterfield et al., 2001, Appl Environ Microbiol. 67(11):5017-24; Ffrench- Constant e Bowen, 2000, Cell Mol Life Sci.; 57(5): 828-33). Além disso, quaisquer variantes ou mutantes de qualquer uma dessas proteínas que diferem em alguns (1-10, preferencialmente 1-5) aminoácidos de qualquer uma das sequências acima, particularmente a sequência de fragmento tóxico da mesma, ou que são fundidos a um peptídeo de trânsito, tal como um peptídeo de trânsito plastidial ou outra proteína ou peptídeo, está incluído aqui.

[092] Em várias formas de realização, a sequência HPPD da invenção pode ser combinada em plantas com um ou mais genes que conferem uma característica desejável, tal como tolerância a herbicidas, tolerância a insetos, tolerância à seca, controle de nematóides, eficiência no uso de água, eficiência no uso de nitrogênio, valor nutricional aprimorado, resistência a doenças, fotossíntese aprimorada, qualidade de fibra aprimorada, tolerância ao estresse, reprodução aprimorada e assim por diante.

[093] Eventos transgênicos particularmente úteis que podem ser combinados com os genes da presente invenção em plantas da mesma espécie (por exemplo, cruzando ou transformando novamente uma planta contendo outro evento transgênico com um gene quimérico da invenção) incluem o Evento 531/ PV-GHBK04 (algodoeiro, controle de insetos, descrito em WO 2002/040677), Evento 1143-14A (algodoeiro, controle de insetos, não depositado, descrito em WO 06/128569); Evento 1143-51B (algodoeiro, controle de insetos, não depositado, descrito em WO 06/128570); Evento 1445 (algodoeiro, tolerância a herbicida, não depositado, descrito em US-A 2002- 120964 ou WO 02/034946) Evento 17053 (arroz, tolerância a herbicida, depositado como PTA-9843, descrito em WO 10/117737); Evento 17314 (arroz,

tolerância a herbicida, depositado como PTA-9844, descrito em WO

10/117735); Evento 281-24-236 (algodoeiro, controle de insetos - tolerância a herbicida, depositado como PTA-6233, descrito em WO 05/103266 ou US-A

2005-216969); Evento 3006-210-23 (algodoeiro, controle de insetos - tolerância a herbicidas, depositado como PTA-6233, descrito em US-A 2007-143876 ou

WO 05/103266); Evento 3272 (milho, característica de qualidade, depositado como PTA-9972, descrito em WO 06/098952 ou US-A 2006-230473), Evento

33391 (trigo, tolerância a herbicida, depositado como PTA-2347, descrito em

WO 2002/027004), Evento 40416 (milho, controle de insetos - tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-11508, descrito em WO 11/075593);

Evento 43A47 (milho, controle de insetos - tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-11509, descrito em WO 11/075595); Evento 5307 (milho,

controle de insetos, depositado como ATCC PTA-9561, descrito em WO

10/077816); Evento ASR-368 (agrostis, tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-4816, descrito em US-A 2006-162007 ou WO 04/053062);

Evento B16 (milho, tolerância a herbicida, não depositado, descrito em US-A

2003-126634); Evento BPS-CV127-9 (soja, tolerância a herbicida, depositado como NCIMB No. 41603, descrito em WO 10/080829); Evento BLR1 (colza,

restauração da esterilidade macho, depositado como NCIMB 41193, descrito em WO 2005/074671), Evento CE43-67B (algodoeiro, controle de insetos,

depositado como DSM ACC2724, descrito em US-A 2009-217423 ou WO 06/

128573); Evento CE44-69D (algodoeiro, controle de insetos, não depositado,

descrito em US-A 2010-0024077); Evento CE44-69D (algodoeiro, controle de insetos, não depositado, descrito em WO 06/128571); Evento CE46-02A

(algodoeiro, controle de insetos, não depositado, descrito em WO 06/128572);

Evento COT102 (algodoeiro, controle de insetos, não depositado, descrito em US-A 2006-130175 ou WO 04/039986); Evento COT202 (algodoeiro, controle de insetos, não depositado, descrito em US-A 2007-067868 ou WO

05/054479); Evento COT203 (algodoeiro, controle de insetos, não depositado,

descrito em WO 05/054480);); Evento DAS21606-3/ 1606 (soja, tolerância a herbicida, depositado como PTA-11028, descrito em WO 2012/033794), Evento

DAS40278 (milho, tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-10244,

descrito em WO 11/022469); Evento DAS-44406-6/ pDAB8264.44.06.1 (soja,

tolerância a herbicida, depositado como PTA-11336, descrito em WO 2012/

075426), Evento DAS-14536-7/ pDAB8291.45.36.2 (soja, tolerância a herbicida, depositado como PTA-11335, descrito em WO 2012/075429), Evento

DAS-59122-7 (milho, controle de insetos - tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA 11384, descrito em US-A 2006-070139); Evento DAS-59132

(milho, controle de insetos - tolerância a herbicidas, não depositado, descrito em WO 09/100188); Evento DAS68416 (soja, tolerância a herbicida,

depositado como ATCC PTA-10442, descrito em WO 11/066384 ou WO

11/066360); Evento DP-098140-6 (milho, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-8296, descrito em US-A 2009-137395 ou WO 08/112019);

Evento DP-305423-1 (soja, característica de qualidade, não depositado,

descrito em US-A 2008-312082 ou WO 08/054747); Evento DP-32138-1 (milho,

sistema de hibridização, depositado como ATCC PTA-9158, descrito em US-A

2009-0210970 ou WO 09/103049); Evento DP-356043-5 (soja, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-8287, descrito em US-A 2010-0184079 ou WO 08/002872); Evento EE-1 (berinjela, controle de inseto, não depositado,

descrito em WO 07/091277); Evento FI117 (milho, tolerância a herbicidas,

depositado como ATCC 209031, descrito em US-A 2006-059581 ou WO

98/044140); Evento FG72 (soja, tolerância a herbicida, depositado como PTA-

11041, descrito em WO 2011/063413), Evento GA21 (milho, tolerância a herbicida, depositado como ATCC 209033, descrito em US-A 2005-086719 ou WO 98/044140); Evento GG25 (milho, tolerância a herbicidas, depositado como

ATCC 209032, descrito em US-A 2005-188434 ou WO 98/044140); Evento

GHB119 (algodoeiro, controle de insetos - tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-8398, descrito em WO 08/151780); Evento GHB614

(algodoeiro, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-6878, descrito em US-A 2010-050282 ou WO 07/017186); Evento GJ11 (milho, tolerância a herbicidas, depositado como ATCC 209030, descrito em US-A 2005-188434 ou

WO 98/044140); Evento GM RZ13 (beterraba sacarina, resistência a vírus,

depositado como NCIMB-41601, descrito em WO 10/076212); Evento H7-1

(beterraba sacarina, tolerância a herbicida, depositado como NCIMB 41158 ou

NCIMB 41159, descrito em US-A 2004-172669 ou WO 04/074492); Evento

JOPLIN1 (trigo, tolerância a doenças, não depositado, descrito em US-A 2008-

064032); Evento LL27 (soja, tolerância a herbicida, depositado como

NCIMB41658, descrito em WO 06/108674 ou US-A 2008-320616); Evento

LL55 (soja, tolerância a herbicida, depositado como NCIMB 41660, descrito em

WO 06/108675 ou US-A 2008-196127); Evento LLcotton25 (algodoeiro,

tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-3343, descrito em WO

03/013224 ou US-A 2003-097687); Evento LLRICE06 (arroz, tolerância a herbicida, depositado como ATCC 203353, descrito em US 6 468 747 ou WO

00/026345); Evento LLRice62 (arroz, tolerância a herbicida, depositado como

ATCC 203352, descrito em WO 2000/026345), Evento LLRICE601 (arroz,

tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-2600, descrito em US-A

2008-2289060 ou WO 00/026356); Evento LY038 (milho, característica de qualidade, depositado como ATCC PTA-5623, descrito em US-A 2007-028322 ou WO 05/061720); Evento MIR162 (milho, controle de inseto, depositado como PTA-8166, descrito em US-A 2009-300784 ou WO 07/142840); Evento

MIR604 (milho, controle de insetos, não depositado, descrito em US-A 2008-

167456 ou WO 05/103301); Evento MON15985 (algodoeiro, controle de inseto, depositado como ATCC PTA-2516, descrito em US-A 2004-250317 ou WO

02/100163); Evento MON810 (milho, controle de insetos, não depositado,

descrito em US-A 2002-102582); Evento MON863 (milho, controle de inseto,

depositado como ATCC PTA-2605, descrito em WO 04/011601 ou US-A 2006-

095986); Evento MON87427 (milho, controle de polinização, depositado como

ATCC PTA-7899, descrito em WO 11/062904); Evento MON87460 (milho,

tolerância ao estresse, depositado como ATCC PTA-8910, descrito em WO

09/111263 ou US-A 2011-0138504); Evento MON87701 (soja, controle de inseto, depositado como ATCC PTA-8194, descrito em US-A 2009-130071 ou

WO 09/064652); Evento MON87705 (soja, característica de qualidade -

tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-9241, descrito em US-A

2010-0080887 ou WO 10/037016); Evento MON87708 (soja, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-9670, descrito em WO 11/034704);

Evento MON87712 (soja, rendimento, depositado como PTA-10296, descrito em WO 2012/051199), Evento MON87754 (soja, característica de qualidade,

depositado como ATCC PTA-9385, descrito em WO 10/024976); Evento

MON87769 (soja, característica de qualidade, depositado como ATCC PTA-

8911, descrito em US-A 2011-0067141 ou WO 09/102873); Evento MON88017

(milho, controle de insetos - tolerância a herbicidas, depositado como ATCC

PTA-5582, descrito em US-A 2008-028482 ou WO 05/059103); Evento

MON88913 (algodoeiro, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-

4854, descrito em WO 04/072235 ou US-A 2006-059590); Evento MON88302

(colza, tolerância a herbicidas, depositado como PTA-10955, descrito em WO

2011/153186), Evento MON88701 (algodoeiro, tolerância a herbicida,

depositado como PTA-11754, descrito em WO 2012/134808), Evento

MON89034 (milho, controle de insetos, depositado como ATCC PTA-7455,

descrito em WO 07/140256 ou US-A 2008-260932); Evento MON89788 (soja,

tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-6708, descrito em US-A 2006-282915 ou WO 06/130436); Evento MS11 (colza, controle de polinização

- tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-850 ou PTA-2485,

descrito em WO 01/031042); Evento MS8 (colza, controle de polinização -

tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-730, descrito em WO

01/041558 ou US-A 2003-188347); Evento NK603 (milho, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-2478, descrito em US-A 2007-292854);

Evento PE-7 (arroz, controle de inseto, não depositado, descrito em WO

08/114282); Evento RF3 (colza, controle de polinização - tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-730, descrito em WO 01/041558 ou

US-A 2003-188347); Evento RT73 (colza, tolerância a herbicida, não depositado, descrito em WO 02/036831 ou US-A 2008-070260); Evento

SYHT0H2/ SYN-000H2-5 (soja, tolerância a herbicida, depositado como PTA-

11226, descrito em WO 2012/082548), Evento T227-1 (beterraba sacarina,

tolerância a herbicida, não depositado, descrito em WO 02/44407 ou US-A

2009-265817); Evento T25 (milho, tolerância a herbicida, não depositado,

descrito em US-A 2001-029014 ou WO 01/051654); Evento T304-40

(algodoeiro, controle de insetos - tolerância a herbicidas, depositado como

ATCC PTA-8171, descrito em US-A 2010-077501 ou WO 08/122406); Evento

T342-142 (algodoeiro, controle de insetos, não depositado, descrito em WO

06/128568); Evento TC1507 (milho, controle de insetos - tolerância a herbicida,

não depositado, descrito em US-A 2005-039226 ou WO 04/099447); Evento

VIP1034 (milho, controle de insetos - tolerância a herbicida, depositado como

ATCC PTA-3925, descrito em WO 03/052073), Evento 32316 (milho, controle de insetos - tolerância a herbicida, depositado como PTA-11507, descrito em

WO 11/084632), Evento 4114 (milho, controle de insetos - tolerância a herbicida, depositado como PTA-11506, descrito em WO 11/084621), evento

EE-GM3/ FG72 (soja, tolerância a herbicida, número de acesso ATCC PTA-

11041, WO 2011/063413 A2), evento DAS-68416-4 (soja, tolerância a herbicidas, número de acesso ATCC PTA-10442, WO 2011/066360 A1),

evento DAS-68416-4 (soja, tolerância a herbicidas, número de acesso ATCC

PTA-10442, WO 2011/066384 A1), evento DP-040416-8 (milho, controle de inseto, número de acesso ATCC PTA-11508, WO 2011/075593 A1), evento

DP-043A47-3 (milho, controle de insetos, número de acesso ATCC PTA-11509,

WO 2011/075595 A1), evento DP-004114-3 (milho, controle de inseto, número de acesso ATCC PTA-11506, WO 2011/084621 A1), evento DP-032316-8

(milho, controle de inseto, número de acesso ATCC PTA-11507, WO 2011/

084632 A1), evento MON-88302-9 (colza, tolerância a herbicidas, número de acesso ATCC PTA-10955, WO 2011/153186 A1), evento DAS-21606-3 (soja,

tolerância a herbicidas, número de acesso ATCC PTA-11028, WO 2012/

033794 A2), evento MON-87712-4 (soja, característica de qualidade, número de acesso ATCC PTA-10296, WO 2012/051199 A2), evento DAS-44406-6

(soja, tolerância a herbicidas empilhados, número de acesso ATCC PTA-

11336, WO 2012/075426 A1), evento DAS-14536-7 (soja, tolerância a herbicidas empilhados, número de acesso ATCC PTA-11335, WO

2012/075429 A1), evento SYN-000H2-5 (soja, tolerância a herbicida, número de acesso ATCC PTA-11226, WO 2012/082548 A2), evento DP-061061-7

(colza, tolerância a herbicida, nenhum número de depósito disponível, WO

2012071039 A1), evento DP-073496-4 (colza, tolerância a herbicidas, nenhum número de depósito disponível, US 2012131692), evento 8264.44.06.1 (soja tolerância a herbicidas empilhados, número de acesso ATCC PTA-11336, WO

2012075426 A2), evento 8291.45.36.2 (soja, tolerância a herbicidas empilhados, número de acesso PTA-11335, WO 2012075429 A2), evento

SYHT0H2 (soja, número de acesso ATCC PTA-11226, WO 2012/082548 A2),

evento MON88701 (algodoeiro, número de acesso ATCC PTA-11754, WO

2012/134808 A1), evento KK179-2 (alfafa, número de acesso ATCC PTA-

11833, WO 2013003558 A1), evento pDAB8264.42.32.1 (soja, tolerância a herbicidas empilhados, número de acesso ATCC PTA-11993, WO 2013010094

A1), evento MZDT09Y (milho, número de acesso ATCC PTA-13025, WO

2013012775 A1).

E. CONSTRUTOS POLINUCLEOTÍDICOS

[094] Os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos de HPPD da presente invenção podem ser modificados para obter ou melhorar a expressão em células vegetais. Os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos aqui identificados podem ser fornecidos em cassetes de expressão para expressão na planta de interesse. Um “cassete de expressão vegetal” inclui um construto de DNA, incluindo um construto de DNA recombinante, que é capaz de resultar na expressão de um polinucleotídeo em uma célula vegetal. O cassete pode incluir na direção de transcrição 5'-3', uma região de iniciação transcricional (isto é, promotor, particularmente um promotor heterólogo) operacionalmente ligada a um ou mais polinucleotídeos de interesse e/ ou uma região de terminação de tradução e transcrição (isto é, região de terminação) funcional nas plantas. O cassete pode conter adicionalmente pelo menos um polinucleotídeo adicional a ser introduzido no organismo, como um gene marcador selecionável. Alternativamente, o(s) polinucleotídeo(s) adicional(ais) pode(m) ser fornecido(s) em múltiplos cassetes de expressão. Tal cassete de expressão é fornecido com uma pluralidade de sítios de restrição para inserção do(s) polinucleotídeo(s) para estar sob a regulação transcricional das regiões reguladoras.

[095] Em uma outra forma de realização, a presente invenção refere-se a um gene quimérico compreendendo uma sequência codificadora compreendendo o ácido nucleico heterólogo da invenção operacionalmente ligado a um promotor expressável em plantas e opcionalmente uma região de terminação de transcrição e de poliadenilação. “Heterólogo” geralmente se refere ao polinucleotídeo ou polipeptídeo que não é endógeno à célula ou não é endógeno à localização no genoma nativo em que está presente, e foi adicionado à célula por infecção, transfecção, microinjeção, eletroporação,

microprojeção e assim por diante. Por “operacionalmente ligado” entende-se uma ligação funcional entre dois polinucleotídeos. Por exemplo, quando um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência de DNA, a sequência do promotor inicia e medeia a transcrição da sequência de DNA. Reconhece-se que os polinucleotídeos ligados operacionalmente podem ou não ser contíguos e, quando usados para referenciar a união de duas regiões codificadoras de polipeptídeos, os polipeptídeos são expressos no mesmo quadro de leitura.

[096] O promotor pode ser qualquer sequência polinucleotídica que mostre atividade transcricional nas células vegetais, partes de plantas ou plantas escolhidas. O promotor pode ser nativo ou análogo, ou exógeno ou heterólogo, ao hospedeiro vegetal e/ ou à sequência de DNA da invenção.

Quando o promotor é “nativo” ou “análogo” ao hospedeiro vegetal, entende-se que o promotor é encontrado na planta nativa na qual o promotor é introduzido.

Quando o promotor é “exógeno” ou “heterólogo” à sequência de DNA da invenção, entende-se que o promotor não é o promotor nativo ou de ocorrência natural para a sequência de DNA operacionalmente ligada da invenção. O promotor pode ser induzível ou constitutivo. Pode ser de ocorrência natural, pode ser composto por porções de vários promotores de ocorrência natural, ou pode ser parcial ou totalmente sintético. A orientação para o projeto de promotores é proporcionada por estudos de estrutura de promotores, tais como os de Harley e Reynolds (1987) Nucleic Acids Res. 15: 2343-2361. Além disso, a localização do promotor em relação ao início da transcrição pode ser otimizada. Ver, por exemplo, Roberts et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 760-764. Muitos promotores adequados para utilização em plantas são bem conhecidos na técnica.

[097] Por exemplo, promotores constitutivos adequados para utilização em plantas incluem: os promotores de vírus de plantas, tais como o promotor de caulimovírus de listra clorótica do amendoim (PClSV) (Patente US

5 850 019); o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); promotores dos genes da metiltransferase do vírus Chlorella (Patente US 5 563 328) e do promotor transcrito completo do vírus do mosaico da escrofulária (FMV) (Patente US 5 378 619); os promotores de genes como actina de arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171 e Patente US 5 641 876); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol.

12:619-632 e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730 e a Patente US 5 510 474); histona H3 de milho (Lepetit et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 231:276-285 e Atanassova et al. (1992) Plant J.

2(3): 291-300); Brassica napus ALS3 (pedido PCT WO 97/41228); um gene da subunidade pequena de ribulose-bis-carboxilase/ oxigenase (RuBisCO) vegetal; o circovírus (AU 689 311) ou o vírus do mosaico da veia da mandioca (CsVMV, US 7 053 205) ou suas variantes (por exemplo, onde a segunda subunidade é duplicada (Verdaguer et al. (1998) Plant Mol Biol., Aug; 37(6):1055-67) e promotores de vários genes de Agrobacterium (ver Patentes US 4 771 002; US 5 102 796; US 5 182 200; e US 5 428 147).

[098] Promotores induzíveis adequados para utilização em plantas incluem: o promotor do sistema ACE1 que responde ao cobre (Mett et al. (1993) PNAS 90:4567-4571); o promotor do gene In2 do milho que responde aos protetores de fitotoxicidade herbicidas benzenossulfonamida (Hershey et al. (1991) Mol. Gen. Genetics 227:229-237 e Gatz et al. (1994) Mol. Gen.

Genetics 243:32-38); e o promotor do repressor Tet de Tn10 (Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237). Outro promotor induzível para uso em plantas é aquele que responde a um agente indutor ao qual as plantas normalmente não respondem. Um promotor induzível exemplificativo deste tipo é o promotor induzível de um gene do hormônio esteróide, cuja atividade transcricional é induzida por um hormônio glucocorticoesteróide (Schena et al. (1991) Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 88:10421) ou a recente aplicação de um ativador de transcrição quimérico, XVE, para utilização em um sistema de expressão de planta induzível baseado em receptores de estrogênio ativado por estradiol (Zuo et al. (2000) Plant J., 24:265-273). Outros promotores induzíveis para utilização em plantas são descritos em EP 332104, PCT WO 93/21334 e PCT WO 97/06269 que são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

Promotores compostos de porções de outros promotores e promotores parcialmente ou totalmente sintéticos também podem ser usados. Veja, por exemplo, Ni et al. (1995) Plant J. 7:661-676 e PCT WO 95/14098 descrevendo tais promotores para uso em plantas.

[099] Em uma forma de realização desta invenção, uma sequência de promotor específica para regiões ou tecidos particulares de plantas pode ser usada para expressar as proteínas HPPD da invenção, tal como promotores específicos para sementes (Datla, R. et al., 1997, Biotechnology Ann. Rev. 3, 269-296), especialmente o promotor de napina (EP 255 378 A1), o promotor de faseolina, o promotor de glutenina, o promotor de heliantinin (WO 92/17580), o promotor de albumina (WO 98/45460), o promotor de oleosina (WO 98/45461), o promotor SAT1 ou o promotor SAT3 (PCT/ US 98/06978).

[0100] Também se pode usar um promotor induzível escolhido vantajosamente dentre fenilalanina amônia-liase (PAL), HMG-CoA redutase (HMG), quitinase, glucanase, inibidor de proteinase (PI), gene da família PR1, promotores da nopalina sintase (nos) e vspB (US 5 670 349, Tabela 3), o promotor HMG2 (US 5 670 349), o promotor de beta-galactosidase de maçã (ABG1) e o promotor de aminociclopropano-carboxilato sintase de maçã (ACC sintase) (WO 98/45445). Múltiplos promotores podem ser utilizados nos construtos da invenção, incluindo em sucessão.

[0101] O promotor pode incluir, ou ser modificado para incluir, um ou mais elementos intensificadores. Em algumas formas de realização, o promotor pode incluir uma pluralidade de elementos intensificadores. Os promotores que contêm elementos intensificadores proporcionam níveis mais elevados de transcrição em comparação com promotores que não os incluem.

Elementos intensificadores adequados para uso em plantas incluem o elemento intensificador PClSV (Patente US 5 850 019), o elemento intensificador CaMV 35S (Patentes US 5 106 739 e 5 164 316) e o elemento intensificador de FMV (Maiti et al. (1997) Transgenic Res. 6:143-156); o ativador de tradução do vírus do mosaico da planta de fumo (TMV) descrito no Pedido de patente WO 87/07644, ou do vírus do tabaco etch (TEV) descrito por Carrington & Freed 1990, J. Virol. 64: 1590-1597, por exemplo, ou íntrons tais como o íntron adh1 do milho ou íntron 1 da actina de arroz. Ver também PCT WO 96/23898, WO 2012/021794, WO 2012/021797, WO 2011/084370 e WO 2011/028914.

[0102] Muitas vezes, esses construtos podem conter regiões não traduzidas de 5' e 3'. Tais construtos podem conter uma “sequência sinal” ou “sequência líder” para facilitar o transporte co-traducional ou pós-traducional do peptídeo de interesse para certas estruturas intracelulares, como o cloroplasto (ou outro plastídio), retículo endoplasmático ou aparelho de Golgi, ou ser secretado. Por exemplo, o construto pode ser projetado para conter um peptídeo sinal para facilitar a transferência do peptídeo para o retículo endoplasmático. Por “sequência sinal” entende-se uma sequência que é conhecida ou suspeita de resultar no transporte peptídico co-traducional ou pós-traducional através da membrana celular. Nos eucariotos, isso normalmente envolve secreção no aparelho de Golgi, com alguma glicosilação resultante. Por “sequência líder” entende-se qualquer sequência que, quando traduzida, resulta em uma sequência de aminoácidos suficiente para desencadear o transporte co-traducional da cadeia peptídica para uma organela subcelular. Assim, isto inclui sequências líder dirigidas ao transporte e/ ou glicosilação por passagem para o retículo endoplasmático, passagem para vacúolos, plastídios incluindo cloroplastos, mitocôndrias e assim por diante. Também pode ser preferível projetar o cassete de expressão da planta para conter um íntron, de modo que o processamento de mRNA do íntron seja necessário para expressão.

[0103] Por “região 3’ não traduzida” entende-se um polinucleotídeo localizado a jusante de uma sequência de codificação. As sequências sinal de poliadenilação e outras sequências que codificam sinais reguladores capazes de afetar a adição de tratos de ácido poliadenílico à extremidade 3' do precursor de mRNA são regiões 3' não traduzidas. Por “região 5' não traduzida” entende-se um polinucleotídeo localizado a montante de uma sequência de codificação.

[0104] Outros elementos não traduzidos a montante ou a jusante incluem intensificadores. Intensificadores são polinucleotídeos que agem para aumentar a expressão de uma região promotora. Os intensificadores são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados à região intensificadora de SV40 e o elemento intensificador 35S.

[0105] A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação da transcrição, pode ser nativa com a sequência da presente invenção ou pode ser derivada de outra fonte. As regiões de terminação convenientes estão disponíveis no plasmídeo Ti de A. tumefaciens, como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Veja também Guerineau et al. (1991) Mol. Gen Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen et al.

(1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891-7903; Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9627-9639; e Pedido de Patente Europeia EP 0 633 317 A1. Em uma forma de realização, a região de terminação compreende a sequência não traduzida 3' do gene da histona H4 de Arabidopsis thaliana (Chaboute et al., Plant Mol Biol. 1987 Mar; 8(2): 179-91).

[0106] Em um aspecto da invenção, as sequências de DNA sintéticas são projetadas para um dado polipeptídeo, tal como os polipeptídeos da invenção. A expressão do quadro de leitura aberto da sequência de DNA sintética em uma célula resulta na produção do polipeptídeo da invenção. As sequências de DNA sintético podem ser úteis para simplesmente remover sítios de endonucleases de restrição indesejados, facilitar estratégias de clonagem de DNA, alterar ou remover qualquer tendência de códon em potencial, alterar ou melhorar o conteúdo de GC, remover ou alterar quadros de leitura alternados e/ ou alterar ou remover sítios de reconhecimento de união de íntron/ éxon, sítios de poliadenilação, sequências Shine-Delgarno, elementos promotores indesejados e similares que podem estar presentes em uma sequência de DNA nativa. Também é possível que sequências de DNA sintéticas possam ser utilizadas para introduzir outras melhorias em uma sequência de DNA, tal como introdução de uma sequência de íntrons, criação de uma sequência de DNA que expressa como uma fusão de proteínas a sequências de direcionamento de organelas, como peptídeos de trânsito de cloroplastos, peptídeos de direcionamento de apoplastos/ vacuolares ou sequências de peptídeos que resultam na retenção do peptídeo resultante no retículo endoplasmático. Os genes sintéticos também podem ser sintetizados usando códons preferidos por células hospedeiras para melhor expressão, ou podem ser sintetizados usando códons a uma frequência de uso de códons preferida por hospedeiro. Ver, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Plant Physiol. 92: 1-11; Patentes US 6 320 100; US 6 075 185; US 5 380 831; e US 5 436 391, pedidos de patente publicados US 20040005600 e 20010003849, e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, aqui incorporados por referência.

[0107] Em uma forma de realização, os polinucleotídeos de interesse são direcionados para o cloroplasto para expressão. Desta maneira, quando o polinucleotídeo de interesse não for inserido diretamente no cloroplasto, o cassete de expressão conterá adicionalmente um polinucleotídeo que codifica um peptídeo de trânsito para direcionar o nucleotídeo de interesse aos cloroplastos. Tais peptídeos de trânsito são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun.

196:1414-1421; e Shah et al. (1986) Science 233:478-481. Em uma forma de realização, o peptídeo de trânsito de cloroplastos é um derivado de peptídeo de trânsito otimizado (posição 55 alterada para Tyr), contendo a sequência dos genes da subunidade pequena RuBisCO de Zea mays e Helianthus annuus, adaptados ao uso do códon de soja.

[0108] Os polinucleotídeos de interesse a serem direcionados para o cloroplasto podem ser otimizados para expressão no cloroplasto para explicar diferenças no uso de códons entre o núcleo da planta e esta organela.

Deste modo, os polinucleotídeos de interesse podem ser sintetizados utilizando códon preferidos de cloroplastos. Ver, por exemplo, Patente US 5 380 831, aqui incorporada por referência.

[0109] Este cassete de expressão vegetal pode ser inserido em um vetor de transformação de planta. Por “vetor de transformação” entende-se uma molécula de DNA que permite a transformação de uma célula. Tal molécula pode consistir em um ou mais cassetes de expressão, e pode ser organizada em mais de uma molécula de DNA de vetor. Por exemplo, vetores binários são vetores de transformação de plantas que utilizam dois vetores de DNA não contíguos para codificar todas as funções necessárias de ação cis e trans para transformação de células vegetais (Hellens e Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). “Vetor” refere-se a um construto polinucleotídico projetado para transferência entre diferentes células hospedeiras. “Vetor de expressão” refere-se a um vetor que possui a capacidade de incorporar, integrar e expressar sequências de DNA ou fragmentos heterólogos em uma célula exógena.

[0110] O vetor de transformação de plantas compreende um ou mais vetores de DNA para alcançar a transformação da planta. Por exemplo, é uma prática comum na técnica utilizar vetores de transformação de plantas que compreendem mais de um segmento de DNA contíguo. Estes vetores são frequentemente referidos na técnica como vetores binários. Vetores binários bem como vetores com plasmídeos auxiliares são mais frequentemente utilizados para transformação mediada por Agrobacterium, em que o tamanho e complexidade dos segmentos de DNA necessários para conseguir uma transformação eficiente são bastante grandes e é vantajoso separar funções em moléculas de DNA separadas. Os vetores binários tipicamente contêm um vetor plasmídeo que contém as sequências de ação cis necessárias para a transferência de T-DNA (tal como borda esquerda e borda direita), um marcador selecionável que é projetado para ser capaz de expressão em uma célula vegetal e um “polinucleotídeo de interesse” (um polinucleotídeo projetado para ser capaz de expressão em uma célula vegetal para a qual a geração de plantas transgênicas é desejada). Também presentes neste vetor plasmídeo estão sequências necessárias para replicação bacteriana. As sequências de ação cis são dispostas de um modo para permitir uma transferência eficiente para as células vegetais e a expressão nas mesmas. Por exemplo, a sequência do marcador selecionável e a sequência de interesse estão localizadas entre as bordas esquerda e direita. Muitas vezes, um segundo vetor plasmídeo contém os fatores que atuam em trans que medeiam a transferência de T-DNA de Agrobacterium para células vegetais. Este plasmídeo contém frequentemente as funções de virulência (genes Vir) que permitem a infecção de células vegetais por Agrobacterium e transferência de DNA por clivagem em sequências de fronteira e transferência de DNA mediada por vírus, como é entendido na técnica (Hellens e Mullineaux (2000) Trends in Plant Science, 5:446-451). Vários tipos de cepas de Agrobacterium (por exemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) podem ser utilizados para transformação de plantas. O segundo vetor plasmídeo não é necessário para a introdução de polinucleotídeos nas plantas por outros métodos, tais como microprojeção, microinjeção, eletroporação, polietilenoglicol, etc.

F. TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS

[0111] Os métodos da invenção envolvem a introdução de um construto de nucleotídeos em uma planta. Por “introdução” pretende-se apresentar à planta o construto de nucleotídeos de tal maneira que o construto tenha acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos da invenção não requerem a utilização de um método específico para a introdução de um construto de nucleotídeos em uma planta, apenas que o construto de nucleotídeos obtenha acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta.

Os métodos para introduzir construtos de nucleotídeos nas plantas são conhecidos na técnica incluindo, mas não limitados a métodos de transformação estáveis, métodos de transformação transientes e métodos mediados por vírus. Ver, por exemplo, os métodos para transformar células vegetais e plantas em regeneração descritos em: US 4 459 355, US 4 536 475, US 5 464 763, US 5 177 010, US 5 187 073, EP 267 159 A1, EP 604 662 A1, EP 672 752 A1, US 4 945 050, US 5 036 006, US 5 100 792, US 5 371 014, US 5 478 744, US 5 179 022, US 5 565 346, US 5 484 956, US 5 508 468, US 5 538 877, US 5 554 798, US 5 489 520, US 5 510 318, US 5 204 253, US 5 405 765, EP 442 174 A1, EP 486 233 A1, EP 486 234 A1, EP 539 563 A1, EP 674

725 A1, WO 91/02071, WO 95/06128 e WO 2011/ 095460, cada um dos quais é aqui incorporado por referência, particularmente no que diz respeito aos métodos de transformação aqui descritos.

[0112] Em geral, os métodos de transformação de plantas envolvem a transferência de DNA heterólogo em células vegetais alvo (por exemplo, embriões imaturos ou maturos, culturas em suspensão, calos indiferenciados, protoplastos etc.), seguido pela aplicação de um nível limiar máximo de seleção apropriada (dependendo do gene marcador selecionável) para recuperar as células vegetais transformadas de um grupo de massa celular não transformada. Os explantes são tipicamente transferidos para um novo suprimento do mesmo meio e cultivados rotineiramente. Posteriormente, as células transformadas são diferenciadas em brotos após a colocação no meio de regeneração suplementado com um nível limiar máximo de agente de seleção. Os brotos são então transferidos para um meio de enraizamento seletivo para recuperar brotos ou plântulas enraizadas. A plântula transgênica cresce então em plantas maduras e produz sementes férteis (por exemplo, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 745-750). Os explantes são tipicamente transferidos para um novo suprimento do mesmo meio e cultivados rotineiramente. Uma descrição geral das técnicas e métodos para gerar plantas transgênicas é encontrada em Ayres e Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 e Bommineni e Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Uma vez que o material transformado contém muitas células; as células transformadas e as células não transformadas estão presentes em qualquer pedaço de calo ou tecido ou grupo de células alvo sujeitos. A capacidade de matar células não transformadas e permitir a proliferação de células transformadas resulta em culturas de plantas transformadas. Frequentemente, a capacidade de remover células não transformadas é uma limitação à recuperação rápida de células vegetais transformadas e à geração bem-sucedida de plantas transgênicas. Métodos moleculares e bioquímicos podem ser usados para confirmar a presença do gene heterólogo integrado de interesse no genoma da planta transgênica.

[0113] A geração de plantas transgênicas pode ser realizada por um de vários métodos, incluindo, mas não limitados a, introdução de DNA heterólogo por Agrobacterium em células vegetais (transformação mediada por Agrobacterium), bombardeamento de células vegetais com DNA exógeno heterólogo aderido a partículas e vários outros métodos mediados diretamente sem partículas (por exemplo, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750; Ayres e Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239; Bommineni e Jauhar (1997) Maydica 42:107-120) para transferir DNA.

[0114] Métodos para transformação de cloroplastos são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 87:8526-8530; Svab e Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab e Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. O método baseia-se na entrega de armas de partículas de DNA contendo um marcador selecionável e direcionamento do DNA para o genoma plastidial por meio de recombinação homóloga. Além disso, a transformação plastidial pode ser realizada por transativação de um transgene silencioso que possui plastídio por expressão preferida por tecido de uma polimerase de RNA codificada por nuclear e direcionada a plastídio. Tal sistema foi relatado em McBride et al. (1994) Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305.

[0115] As células que foram transformadas podem ser cultivadas em plantas de acordo com formas convencionais. Veja, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas podem então ser cultivadas e polinizadas com a mesma cepa transformada ou com diferentes cepas, e o híbrido resultante tendo expressão constitutiva da característica fenotípica desejada identificada. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada seja mantida e herdada de maneira estável e, em seguida, as sementes colhidas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada tenha sido alcançada. Dessa maneira, a presente invenção fornece sementes transformadas (também denominadas “sementes transgênicas”) com um construto de nucleotídeos da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, incorporado de maneira estável em seu genoma. Em várias formas de realização, a semente pode ser revestida com pelo menos um fungicida e/ ou pelo menos um inseticida, pelo menos um herbicida e/ ou pelo menos um protetor de fitotoxicidade ou qualquer combinação dos mesmos.

G. AVALIAÇÃO DA TRANSFORMAÇÃO VEGETAL

[0116] Após a introdução do DNA exógeno heterólogo nas células vegetais, a transformação ou integração do gene heterólogo no genoma da planta é confirmada por vários métodos, tais como a análise de ácidos nucléicos, proteínas e metabolitos associados ao gene integrado.

[0117] A análise por PCR é um método rápido para fazer a triagem de células, tecidos ou brotos transformados quanto à presença de genes incorporados no estágio anterior antes da transplantação no solo (Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)). A PCR é realizada utilizando iniciadores oligonucleotídicos específicos para o gene de interesse ou base do vetor de Agrobacterium, etc.

[0118] A transformação de plantas pode ser confirmada por análise por Southern blot de DNA genômico (Sambrook e Russell (2001) supra). Em geral, o DNA total é extraído do transformante, digerido com enzimas de restrição apropriadas, fracionado em um gel de agarose e transferido para uma membrana de nitrocelulose ou nylon. A membrana ou

“mancha” pode então ser sondada com, por exemplo, fragmento de DNA alvo radiomarcado com 32P para confirmar a integração do gene introduzido no genoma da planta de acordo com técnicas padrão (Sambrook e Russell, 2001, supra).

[0119] Na análise Northern, o RNA é isolado de tecidos específicos do transformante, fracionado em um gel de formaldeído-agarose e transferido para um filtro de nylon de acordo com procedimentos padrão que são rotineiramente usados na técnica (Sambrook e Russell (2001) supra). A expressão do RNA codificado pelas sequências de nucleotídeos da invenção é então testada por hibridização do filtro a uma sonda radioativa derivada de um GDC por métodos conhecidos na técnica (Sambrook e Russell (2001) supra).

[0120] Western blot, ELISA, testes de fluxo lateral e ensaios bioquímicos e similares podem ser realizados nas plantas transgênicas para determinar a presença de proteína codificada pelo gene de tolerância a herbicidas por procedimentos padrão (Sambrook e Russell (2001) supra) usando anticorpos que se ligam a um ou mais epítopos presentes na proteína de tolerância a herbicidas.

[0121] Em um aspecto da invenção, os genes da HPPD aqui descritos são úteis como marcadores para avaliar a transformação de células bacterianas ou vegetais.

H. USE COMO MARCADOR PARA TRANSFORMAÇÃO

[0122] A invenção também se refere ao uso, em um método para transformar plantas, de um ácido nucleico que codifica uma HPPD de acordo com a invenção como um gene marcador ou como uma sequência de codificação que possibilita conferir à planta a tolerância a herbicidas que são inibidores de HPPD, e ao uso de um ou mais inibidores de HPPD em plantas compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma HPPD de acordo com a invenção. Ver, por exemplo, a Patente US 6 791 014, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[0123] Nesta forma de realização, um inibidor de HPPD pode ser introduzido no meio de cultura das células vegetais competentes, de modo a branquear as referidas células antes da etapa de transformação. As células competentes branqueadas são então transformadas com o gene de tolerância aos inibidores da HPPD, como um marcador de seleção, e as células transformadas que integraram o referido marcador de seleção em seu genoma tornam-se verdes, permitindo sua seleção. Tal processo torna possível diminuir o tempo necessário para selecionar as células transformadas.

[0124] Assim, uma forma de realização da presente invenção consiste em um método para transformar células vegetais por introdução de um gene heterólogo nas referidas células vegetais com um gene para tolerância a inibidores de HPPD como marcadores de seleção, em que o método compreende preparar e cultivar células vegetais competentes capazes de receber o gene heterólogo em um meio adequado e a introduzir uma quantidade adequada de inibidor de HPPD no meio de cultura adequado das células vegetais competentes. As células competentes são então transformadas com o gene heterólogo e o marcador de seleção, e as células transformadas compreendendo o gene heterólogo são cultivadas em um meio adequado e os transformantes selecionados a partir dele. As células transformadas podem então ser regeneradas em uma planta transformada fértil.

I. PLANTAS E PARTES DE PLANTAS

[0125] Por “planta” entende-se plantas inteiras, órgãos vegetais (por exemplo, folhas, caules, raízes etc.), sementes, células vegetais, propágulos, embriões e progênie dos mesmos. As células vegetais podem ser diferenciadas ou indiferenciadas (por exemplo, calos, células de cultura de suspensão, protoplastos, células foliares, células de raiz, células de floema,

pólen). A presente invenção pode ser utilizada para a introdução de polinucleotídeos em qualquer espécie de planta, incluindo, mas não se limitando a monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos de plantas de interesse incluem, mas não estão limitados a milho (maize), sorgo, trigo, girassol, tomateiro, crucíferas, pimenteira, batata, algodoeiro, arroz, soja, beterraba sacarina, cana de açúcar, planta de fumo, cevada e colza, Brassica sp., alfafa, centeio, painço, cártamo, amendoim, batata doce, mandioca, café, coco, abacaxi, árvores cítricas, cacau, arbusto, banana, abacateiro, figueira, goiabeira, mangueira, oliveira, mamoeiro, cajueiro, macadâmia, amendoeira, aveia, hortaliças, plantas ornamentais e coníferas.

[0126] As hortaliças incluem, mas não estão limitadas a tomates, alface, feijões verdes, feijões de lima, ervilhas e membros do gênero Curcumis tais como pepino, cantalupo e melão almiscarado. As plantas ornamentais incluem, mas não estão limitadas a azálea, hortênsia, hibisco, rosas, tulipas, narcisos silvestres, petúnias, cravo, poinsetia e crisântemo. As plantas de culturas também são de interesse, incluindo, por exemplo, milho, sorgo, trigo, girassol, tomateiro, crucíferas, pimenteira, batata, algodoeiro, arroz, soja, beterraba sacarina, cana de açúcar, planta de fumo, cevada, colza etc.

[0127] Esta invenção é adequada para qualquer membro da família de plantas monocotiledôneas incluindo, mas não limitado a milho, arroz, cevada, aveia, trigo, sorgo, centeio, cana de açúcar, abacaxi, inhame, cebola, banana, coco e tâmaras.

J. MÉTODOS PARA AUMENTAR O RENDIMENTO DA PLANTA

[0128] Métodos para aumentar o rendimento da planta são fornecidos. Os métodos compreendem o fornecimento de uma planta compreendendo, ou introduzindo em uma planta ou célula vegetal, um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma HPPD da invenção, cultivando a planta ou uma semente da mesma em um campo e produzindo uma colheita a partir das referidas plantas ou sementes. Conforme aqui definido, o “rendimento” da planta refere-se à qualidade e/ ou quantidade de biomassa produzida pela planta. Por “biomassa” entende-se qualquer produto vegetal medido. Um aumento na produção de biomassa é qualquer melhoria no rendimento do produto vegetal medido. O aumento do rendimento da planta tem várias aplicações comerciais. Por exemplo, o aumento da biomassa das folhas das plantas pode aumentar o rendimento de vegetais folhosos para consumo humano ou animal. Além disso, o aumento da biomassa foliar pode ser usado para aumentar a produção de produtos farmacêuticos ou industriais derivados de plantas. Um aumento no rendimento pode compreender qualquer aumento estatisticamente significativo, incluindo, mas não limitado a, pelo menos um aumento de 1%, pelo menos um aumento de 3%, pelo menos um aumento de 5%, pelo menos um aumento de 10%, pelo menos um aumento de 20%, pelo menos um 30%, pelo menos um 50%, pelo menos um 70%, pelo menos um 100% ou um aumento maior.

[0129] Em métodos específicos, a planta que compreende uma sequência de HPPD da invenção é tratada com uma concentração eficaz de um herbicida HPPD, tal como um ou mais herbicidas inibidores de HPPD selecionados a partir do grupo que consiste em herbicidas inibidores de HPPD da classe de N-(1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamidas, N-(tetrazol-4-il)- ou N-(triazol- 3-il) arilcarboxamidas, tais como 2-cloro-3-etoxi-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H- tetrazol-5-il)benzamida e 2-cloro-3-(metoximetil)-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H- tetrazol-5-il)benzamida, tricetonas, tais como tembotriona, sulcotriona e mesotriona, da classe de isoxazóis, tais como isoxaflutol, ou da classe de pirazolinatos, como pirassulfotol e topramezona, particularmente selecionados a partir de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona, isoxaflutol e mesotriona, onde a aplicação de herbicida resulta em maior rendimento das plantas.

[0130] Métodos para conferir tolerância a herbicidas em uma planta ou parte da planta também são fornecidos. Em tais métodos, uma sequência de nucleotídeos que codifica uma HPPD da invenção é introduzida na planta, em que a expressão do polinucleotídeo resulta em tolerância a herbicida inibidor da HPPD. As plantas produzidas por esse método podem ser tratadas com uma concentração eficaz de um herbicida (tal como um ou mais herbicidas inibidores da HPPD selecionados a partir do grupo que consiste em herbicidas inibidores da HPPD da classe de N-(1,2,5-oxadiazol-3- il)benzamidas, N-(tetrazol-4-il)- ou N-(triazol-3-il) arilcarboxamidas, tais como 2- cloro-3-etoxi-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H- tetrazol-5-il)benzamida e 2-cloro-3- (metoximetil)-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida, tricetonas, tais como tembotriona, sulcotriona e mesotriona, da classe de isoxazóis, tais como isoxaflutol, ou da classe de pirazolinatos, como pirassulfotol e topramezona, particularmente selecionados a partir de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona, isoxaflutol e mesotriona) e exibem uma tolerância aumentada ao herbicida. Uma “concentração eficaz” de um herbicida neste pedido de patente é uma quantidade suficiente para retardar ou interromper o crescimento de plantas ou partes de plantas que não são naturalmente tolerantes ou se tornaram tolerantes ao herbicida.

K. MÉTODOS DE CONTROLE DE ERVAS DANINHAS EM UM CAMPO

[0131] A presente invenção, portanto, refere-se também a um método de controle de plantas indesejadas ou para regular o crescimento de plantas em culturas de plantas compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando uma HPPD de acordo com a invenção, em que um ou mais herbicidas inibidores de HPPD, por exemplo, um ou mais herbicidas inibidores da HPPD selecionados a partir da classe de N-(1,2,5-oxadiazol-3- il)benzamidas, N-(tetrazol-4-il)- ou N-(triazol-3-il) arilcarboxamidas, tais como 2- cloro-3-etoxi-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H- tetrazol-5-il)benzamida e 2-cloro-3-

(metoximetil)-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida, tricetonas,

tais como tembotriona, sulcotriona e mesotriona, da classe de isoxazóis, tais como isoxaflutol, ou da classe de pirazolinatos, como pirassulfotol e topramezona, particularmente selecionados a partir de tembotriona, sulcotriona,

topramezona, biciclopirona, tefuriltriona, isoxaflutol e mesotriona, são aplicados às plantas (por exemplo, plantas daninhas, tais como ervas daninhas monocotiledôneas ou dicotiledôneas ou plantas de cultura indesejadas), às sementes (por exemplo, grãos, sementes ou propágulos vegetativos, tais como tubérculos ou partes do broto com germes) ou à área em que as plantas crescem (por exemplo, a área sob cultivo). Neste contexto, uma concentração eficaz de um ou mais herbicidas inibidores de HPPD, por exemplo, um ou mais herbicidas inibidores de HPPD selecionados a partir do grupo que consiste em herbicidas inibidores de HPPD da classe de N-(1,2,5-oxadiazol-3-

il)benzamidas, N-(tetrazol-4-il)- ou N-(triazol-3-il) arilcarboxamidas, tais como 2-

cloro-3-etoxi-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H- tetrazol-5-il)benzamida e 2-cloro-3-

(metoximetil)-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida, tricetonas,

tais como tembotriona, sulcotriona e mesotriona, da classe de isoxazóis, tais como isoxaflutol, ou da classe de pirazolinatos, como pirassulfotol e topramezona, particularmente selecionados a partir de tembotriona, sulcotriona,

topramezona, biciclopirona, tefuriltriona, isoxaflutol e mesotriona, pode ser aplicada, por exemplo, pré-plantio (se apropriado também por incorporação no solo), pré-emergência ou pós-emergência, e pode ser combinada com a aplicação de outros herbicidas para os quais a cultura é naturalmente tolerante,

ou aos quais é resistente através da expressão de um ou mais outros transgenes de resistência a herbicidas.

Ver, por exemplo, a publicação de pedido de patente US No. 2004/0058427 e publicação de pedido PCT No.

WO 98/20144. Por “concentração eficaz” entende-se a concentração que controla o crescimento ou disseminação de ervas daninhas ou outras plantas não transformadas sem afetar significativamente a planta ou semente de planta tolerante a inibidores de HPPD. Os técnicos no assunto entendem que a aplicação de herbicidas pode assumir muitas formas diferentes e pode ocorrer em muitos momentos diferentes antes e/ ou durante todo o processo de plantio e crescimento das sementes. A aplicação “pré-emergente” refere-se a um herbicida que é aplicado a uma área de interesse (por exemplo, um campo ou área de cultivo) antes de uma planta emergir visivelmente do solo. A aplicação “pós-emergente” refere-se a um herbicida que é aplicado a uma área após uma planta emergir visivelmente do solo. Em alguns casos, os termos “pré- emergente” e “pós-emergente” são usados com referência a uma erva daninha em uma área de interesse e, em alguns casos, esses termos são usados com referência a uma planta de cultura em uma área de interesse. Quando usados com referência a uma erva daninha, esses termos podem se aplicar a um tipo particular de erva daninha ou espécie de erva daninha que está presente ou acredita-se estar presente na área de interesse. “Incorporação pré-planta” de um herbicida envolve a incorporação de compostos no solo antes do plantio.

[0132] Assim, a presente invenção compreende um método de controlar ervas daninhas em um campo compreendendo plantar em um campo uma planta ou uma semente da mesma compreendendo uma HPPD da invenção e aplicar à referida planta, ou à área que circunda a referida planta, uma concentração eficaz de um ou mais herbicidas inibidores de HPPD.

[0133] Em uma forma de realização desta invenção, um campo a ser cultivado com plantas (tais como plantas de soja, algodoeiro, milho ou trigo, por exemplo) contendo uma sequência de nucleotídeos de HPPD da invenção, pode ser tratado com um herbicida inibidor de HPPD, tal como isoxaflutol (IFT), antes de as plantas serem plantadas ou as sementes serem semeadas, o que limpa o campo de ervas daninhas que são mortas pelo inibidor de HPPD, permitindo práticas de plantio direto, seguido de plantio ou semeadura das plantas nesse mesmo campo pré-tratado mais tarde (aplicação de manejo usando um herbicida inibidor de HPPD). A atividade residual de IFT também protegerá as plantas emergentes e em crescimento da competição por ervas daninhas nos primeiros estágios de crescimento. Uma vez que as plantas têm um certo tamanho e as ervas daninhas tendem a reaparecer, glufosinato ou glifosato, ou um inibidor da HPPD ou uma mistura de um inibidor da HPPD com outro herbicida tal como o glifosato, pode ser aplicado como herbicida pós- emergente por cima das plantas, quando tais plantas são tolerantes aos referidos herbicidas.

[0134] Em outra forma de realização desta invenção, um campo em que foram semeadas sementes contendo uma sequência de nucleotídeos de HPPD da invenção, pode ser tratado com um herbicida inibidor de HPPD, tal como IFT, antes de as plantas emergirem mas após as sementes serem semeadas (o campo pode ser tornado sem ervas daninhas antes da semeadura usando outros meios, tipicamente práticas convencionais de lavoura, tal como aração, aração de aiveca ou preparação de cama de semente), onde a atividade residual manterá o campo livre de ervas daninhas mortas pelo herbicida de forma que as plantas emergentes e em crescimento não tenham nenhuma competição por ervas daninhas (aplicação pré- emergência de um herbicida inibidor de HPPD). Uma vez que as plantas têm um certo tamanho e as ervas daninhas tendem a reaparecer, glufosinato ou glifosato, ou um inibidor da HPPD ou uma mistura de um inibidor da HPPD com outro herbicida tal como o glifosato, pode ser aplicado como herbicida pós- emergente por cima das plantas, quando tais plantas são tolerantes aos referidos herbicidas.

[0135] Em outra forma de realização desta invenção, plantas contendo uma sequência de nucleotídeos de HPPD da invenção, podem ser tratadas com um herbicida inibidor de HPPD, por cima das plantas que emergiram das sementes que foram semeadas, o que limpa o campo de ervas daninhas mortas pelo inibidor de HPPD, cuja aplicação pode ser combinada (por exemplo, em uma mistura de tanque de spray), seguido ou precedido por um tratamento com glifosato ou glufosinato como herbicida pós-emergente sobre o topo das plantas (aplicação pós-emergência de um herbicida inibidor de HPPD (com ou sem glifosato)), quando tais plantas são tolerantes a tais herbicidas.

[0136] Exemplos de representantes individuais das ervas daninhas monocotiledôneas e dicotiledôneas que podem ser controladas com um herbicida inibidor de HPPD incluem:

[0137] Plantas daninhas monocotiledôneas dos gêneros: Aegilops, Agropyron, Agrostis, Alopecurus, Apera, Avena, Brachiaria, Bromus, Cenchrus, Commelina, Cynodon, Cyperus, Dactyloctenium, Digitaria, Echinochloa, Eleocharis, Eleusine, Eragrostis, Eriochloa, Festuca, Fimbristylis, Heteranthera, Imperata, Ischaemum, Leptochloa, Lolium, Monochoria, Panicum, Paspalum, Phalaris, Phleum, Poa, Rottboellia, Sagittaria, Scirpus, Setaria, Sorghum.

[0138] Ervas daninhas dicotiledôneas dos gêneros: Abutilon, Amaranthus, Ambrosia, Anoda, Anthemis, Aphanes, Artemisia, Atriplex, Bellis, Bidens, Capsella, Carduus, Cassia, Centaurea, Chenopodium, Cirsium, Convolvulus, Datura, Desmodium, Emex, Erysimum, Euphorbia, Galeopsis, Galinsoga, Galium, Hibiscus, Ipomoea, Kochia, Lamium, Lepidium, Lindernia, Matricaria, Mentha, Mercurialis, Mullugo, Myosotis, Papaver, Pharbitis, Plantago, Polygonum, Portulaca, Ranunculus, Raphanus, Rorippa, Rotala, Rumex, Salsola, Senecio, Sesbania, Sida, Sinapis, Solanum, Sonchus, Sphenoclea, Stellaria, Taraxacum, Thlaspi, Trifolium, Urtica, Veronica, Viola, Xanthium.

[0139] Os herbicidas inibidores de HPPD úteis na presente invenção, incluindo, entre outros, herbicidas inibidores de HPPD da classe de

N-(1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamidas, N-(tetrazol-4-il)- ou N-(triazol-3-il) arilcarboxamidas, tais como 2-cloro-3-etoxi-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H- tetrazol-5-il)benzamida e 2-cloro-3-(metoximetil)-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H- tetrazol-5-il)benzamida, tricetonas, tais como tembotriona, sulcotriona e mesotriona, da classe de isoxazóis, tais como isoxaflutol, ou da classe de pirazolinatos, como pirassulfotol e topramezona, particularmente selecionados a partir de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona, isoxaflutol e mesotriona, podem ser formulados de várias maneiras, dependendo dos parâmetros biológicos e/ ou físico-químicos prevalecentes.

Exemplos de possíveis formulações são: pós molháveis (WP), pós solúveis em água (SP), concentrados solúveis em água, concentrados emulsificáveis (EC), emulsões (EW), tais como emulsões óleo em água e água em óleo, soluções pulverizáveis, concentrados de suspensão (SC), dispersões à base de óleo ou água, soluções miscíveis em óleo, suspensões de cápsulas (CS), poeiras (DP), produtos para tratamento de sementes, grânulos para aplicação por semeadura à mão e no solo, grânulos (GR) na forma de microgrânulos, grânulos de pulverização, grânulos revestidos e grânulos de adsorção, grânulos dispersíveis em água (WG), grânulos solúveis em água (SG), formulações ULV, microcápsulas e ceras.

[0140] Estes tipos individuais de formulação são conhecidos em princípio e são descritos, por exemplo, em: Winnacker Küchler, “Chemische Technologie” [Tecnologia Química], volume 7, C. Hanser Verlag Munich, 4ª Ed.

1986; Wade van Valkenburg, “Pesticide Formulations”, Marcel Dekker, Nova York, 1973; K. Martens, “Spray Drying” Handbook, 3ª Ed. 1979, G. Goodwin Ltd. London.

[0141] Os auxiliares de formulação necessários, tais como materiais inertes, tensoativos, solventes e outros aditivos, também são conhecidos e são descritos, por exemplo, em: Watkins, “Handbook of

Insecticide Dust Diluents and Carriers”, 2ª Ed., Darland Books, Caldwell N.J., H.v. Olphen, “Introduction to Clay Colloid Chemistry”; 2ª Ed., J. Wiley & Sons, N.Y.; C. Marsden, “Solvents Guide”; 2ª Ed., Interscience, N.Y. 1963; “Detergents and Emulsifiers Annual” de McCutcheon, MC Publ. Corp., Ridgewood N.J.; Sisley e Wood, “Encyclopedia of Surface Active Agents”, Chem. Publ. Co. Inc., N.Y. 1964; Schönfeldt, “Grenzflächenaktive Äthylenoxidaddukte” [Adutos de óxido de etileno com interface ativa], Wiss.

Verlagsgesell., Stuttgart, 1976; Winnacker Küchler, “Chemische Technologie” [Tecnologia Química], volume 7, C. Hanser Verlag Munich, 4a Ed. 1986.

[0142] Com base nessas formulações, também é possível preparar combinações com outras substâncias ativas como pesticidas, como, por exemplo, inseticidas, acaricidas, herbicidas, fungicidas e com protetores de fitotoxicidade, fertilizantes e/ ou reguladores de crescimento, por exemplo, na forma de mistura pronta ou uma mistura de tanque.

L. MÉTODOS DE INTRODUÇÃO DE GENE DA INVENÇÃO EM OUTRA PLANTA

[0143] Também são aqui fornecidos métodos para introduzir a sequência de nucleotídeos de HPPD da invenção em outra planta. A sequência de nucleotídeos de HPPD da invenção, ou um fragmento da mesma, pode ser introduzida em uma segunda planta por seleção recorrente, retrocruzamento, seleção genealógica, seleção de linhagem, seleção em massa, seleção por mutação e/ ou seleção aprimorada com marcador genético.

[0144] Assim, em uma forma de realização, os métodos da invenção compreendem cruzar uma primeira planta compreendendo uma sequência de nucleotídeos de HPPD da invenção com uma segunda planta para produzir plantas de progênie de F1 e selecionar plantas de progênie de F1 que são tolerantes a um herbicida inibidor de HPPD ou que compreendem a sequência de nucleotídeos de HPPD da invenção. Os métodos podem compreender ainda o cruzamento das plantas de progênie selecionadas com a primeira planta que compreende a sequência de nucleotídeos HPPD da invenção para produzir plantas de progênies de retrocruzamento e a seleção de plantas de progênies de retrocruzamento que são tolerantes a um herbicida inibidor de HPPD ou que compreendem a sequência de nucleotídeos de HPPD da invenção. Métodos para avaliar a tolerância a herbicida inibidor de HPPD são fornecidos em outras partes deste documento. Os métodos podem ainda compreender a repetição dessas etapas uma ou mais vezes seguidas para produzir segundas ou superiores plantas de progênies de retrocruzamento selecionadas que são tolerantes a um herbicida inibidor de HPPD ou que compreendem a sequência de nucleotídeos de HPPD da invenção.

[0145] Qualquer método de criação envolvendo seleção de plantas para o fenótipo desejado pode ser utilizado no método da presente invenção. Em algumas formas de realização, as plantas F1 podem ser autopolinizadas para produzir uma geração F2 de segregação. Plantas individuais podem então ser selecionadas que representam o fenótipo desejado (por exemplo, tolerância a herbicida inibidor de HPPD) em cada geração (F3, F4, F5, etc.) até que as características sejam homozigotas ou fixadas em uma população de criação.

[0146] A segunda planta pode ser uma planta com uma característica desejada, tal como tolerância a herbicidas, tolerância a insetos, tolerância à seca, controle de nematóides, eficiência no uso de água, eficiência no uso de nitrogênio, valor nutricional aprimorado, resistência a doenças, fotossíntese aprimorada, qualidade de fibra aprimorada, tolerância ao estresse, reprodução aprimorada e assim por diante. A segunda planta pode ser um evento de elite, como descrito em outras partes deste documento.

[0147] Em várias formas de realização, partes de plantas (plantas inteiras, órgãos de plantas (por exemplo, folhas, caules, raízes etc.), sementes, células vegetais, propágulos, embriões e assim por diante) podem ser colhidos a partir do cruzamento resultante e propagadas ou coletadas para uso a jusante (como alimentos, rações, biocombustível, óleo, flor de farinha, farinha etc.).

M. MÉTODOS DE OBTENÇÃO DE UM PRODUTO VEGETAL

[0148] A presente invenção também se refere a um processo para obter um produto de utilidade, compreendendo colher e/ ou moer os grãos de uma cultura compreendendo uma sequência de HPPD da invenção para obter o produto de utilidade. Produtos e/ ou composições de importância agronômica e comercial da matéria, incluindo, entre outros, ração animal, artigos de utilidade e produtos e subprodutos vegetais, que são destinados para uso como alimento para consumo humano ou para uso em composições e produtos de utilidade que são destinados ao consumo humano, particularmente produtos desvitalizados de sementes/ grãos, incluindo produtos (semi-)processados produzidos a partir desses grãos/ sementes, em que o referido produto é ou compreende sementes ou grãos inteiros ou processados, ração animal, flor de farinha de milho ou de soja, farinha de milho ou de soja, milho, amido de milho, farinha de soja, flor de farinha de soja, flocos, concentrado de proteína de soja, isolados de proteína de soja, concentrado de proteína de soja texturizado, cosméticos, produtos para cuidado dos cabelos, manteiga de noz de soja, natto, tempeh, proteína de soja hidrolisada, nata sintética, creme culinário, lecitina, soja integral comestível (crua, torrada ou como edamame), iogurte de soja, queijo de soja, tofu, yuba, bem como grãos cozidos, refinados, cozidos no vapor, assados ou cozidos ligeiramente, e assim por diante, devem estar dentro do escopo da presente invenção se esses produtos e composições de matéria contiverem quantidades detectáveis das sequências de nucleotídeos e/ ou aminoácidos aqui indicadas como sendo diagnósticas para qualquer planta que contenha essas sequências de nucleotídeos.

[0149] Os exemplos a seguir são oferecidos como ilustração e não como limitação.

EXPERIMENTAL EXEMPLO 1. DESENVOLVIMENTO DE VARIANTES APRIMORADAS DA HPPD.

[0150] Bibliotecas de Variantes de Triagem: Para selecionar variantes aprimoradas, bibliotecas de complexidade variável foram construídas na estrutura (backbone) pRANGER. A primeira biblioteca significativa a passar por triagem foi uma biblioteca de saturação multi-sítio, na qual as posições de aminoácidos 338, 339, 340 e 341 foram randomizadas com códons NNK, que usam 32 códons para codificar todos os 20 aminoácidos, para uma complexidade teórica de 1,6 x 10 5 variantes de proteína únicas. Aproximadamente 500.000 variantes foram transformadas e passaram por triagem em um ensaio de competição bacteriana contra 5 mM do Composto e 1 (2-cloro-3-(metilsulfanil)-N-(1-metil- 1H-tetrazol-5-il)-4- (trifluorometil) benzamida), e os clones sobreviventes foram sequenciados.

Após 3 rodadas de sub-cultura, uma única sequência foi encontrada e designada SG1 (Tabela 1). Esta sequência foi utilizada como o gene de base para uma biblioteca de 2ª geração que satura as posições 268, 270, 340 e 345. Similarmente, estas bibliotecas passaram por triagem e o SG10 (Tabela 1) foi obtido a partir do sequenciamento das culturas sobreviventes a altas concentrações do Composto. 1. Para confirmar que as respostas positivas tiveram melhor tolerância em relação ao K610, foi realizado um experimento de competição “HitMix”. Resumidamente, o DNA plasmídico codificando cada variante a competir foram misturados em conjunto em um tubo Eppendorf e depois a mistura de DNA foi transformada e submetida a triagem contra o Composto 1, como descrito anteriormente.

Subsequentemente, SG1 e SG10 foram misturados com as proteínas de referência acima, e SG10 emergiu como a sequência dominante entre todas as variantes testadas.

[0151] Utilizando o SG10 como base, realizou-se mutagênese iterativa para encontrar outras variantes aprimoradas. Na estrutura SG10, uma biblioteca 5-NNK foi criada nas posições 213, 264, 270, 336 e 344, com uma complexidade teórica de 3,2 milhões de variantes. Esta biblioteca foi submetida a triagem usando o ensaio de competição bacteriana contra 5 mM do Composto 1, e após 3 rodadas do ensaio de competição de crescimento, os clones sobreviventes foram sequenciados para determinar o(s) clone(s) de melhor desempenho. Destes, o SG20v02 foi identificado.

Simultaneamente, uma biblioteca 6-NNK com uma complexidade teórica de 64 milhões de variantes foi criada na estrutura SG10 que randomiza as posições 334, 335, 336, 337, 338 e 339. A partir desta biblioteca, o SG22 foi identificado como descrito.

[0152] Confirmação da atividade por Ensaio de Cor Castanha: Para confirmar que as respostas positivas designadas retêm a atividade de HPPD e são tolerantes a inibidores de HPPD, utilizou-se um ensaio colorimétrico baseado em células. As cepas de E. coli do tipo selvagem não possuem a via da HPPD; portanto, expressar uma enzima HPPD na presença do substrato hidroxifenilpiruvato (HPP) leva ao acúmulo do produto homogentisato (HGA). HGA é, por sua vez, auto-oxidado a um pigmento castanho, piomelanina, que pode ser lido a 440 nm. Quando as células são cultivadas na presença de um herbicida, a formação de cor castanha é inibida sem efeito no crescimento celular. O vetor pRANGER é um vetor de ampla gama de hospedeiros de baixa cópia que permite alguma expressão em E. coli. SG1 e SG10 apresentaram formação de cor castanha robusta na presença de 1 mM do Composto 1 e melhorou em relação à HPPD (evo41).

Além disso, essas respostas positivas foram testadas adicionalmente e verificou-se que tinham propriedades cinéticas aprimoradas, especificamente a constante de inibição Ki, em relação ao mutante K610.

TABELA 1. HPPD DE REFERÊNCIA E VARIANTE (MUTAÇÕES CORRESPONDEM A

POSIÇÕES NA SEQ ID NO: 1)

Nome da Aminoácido de Nucleotídeo de Mutações

Variante SEQ ID NO: SEQ ID NO: relevantes

PfHPPD 1 Tipo selvagem

Evo41 6 E335P, G336W,

K339A, A340Q

K610 7 E335P, G336D,

N337S, A340V

SG1 2 8 E335P, G336D,

N337S, K339Y,

A340R

SG10 3 9 P268D, E335P,

G336D, N337S,

K339Y, A340R,

I345M

SG20 4 10 P268D, T270A,

E335P, G336D,

N337S, K339Y,

A340R, S344Q,

I345M

SG22 5 11 P268D, E335N,

G336D, N337S,

A340R, I345M

SG20v2 12 M264L, P268D,

T270A, E335P, G336D, N337S,

Nome da Aminoácido de Nucleotídeo de Mutações Variante SEQ ID NO: SEQ ID NO: relevantes K339Y, A340R, S344Q, I345M EXEMPLO 2. CLONAGEM DE GENES DE HPPD EM UM CASSETE DE EXPRESSÃO DE

PLANTAS

[0153] Para cada um dos genes de HPPD aqui descritos, o quadro de leitura aberto (ORF) pode ser amplificado por PCR a partir de um molde de DNA completo. Os sítios de restrição Hind III podem ser adicionados a cada extremidade dos ORFs durante a PCR. Adicionalmente, a sequência de nucleotídeos ACC pode ser adicionada imediatamente 5' ao códon de iniciação do gene para aumentar a eficiência da tradução (Kozak (1987) Nucleic Acids Research 15:8125-8148; Joshi (1987) Nucleic Acids Research 15:6643-6653).

O produto de PCR pode ser clonado e sequenciado utilizando técnicas bem conhecidas na técnica para assegurar que nenhuma mutação seja introduzida durante a PCR.

[0154] O plasmídeo contendo o produto de PCR pode ser digerido com Hind III e o fragmento contendo o ORF intacto pode ser isolado. Este fragmento pode ser clonado no sítio Hind III de um plasmídeo tal como pAX200, um vetor de expressão de plantas contendo o promotor da actina de arroz (McElroy et al. (1991) Molec. Gen. Genet. 231:150-160) e o terminador PinII (An et al. (1989) The Plant Cell 1:115-122). O fragmento promotor - gene - terminador deste plasmídeo intermediário pode ser então subclonado no plasmídeo pSB11 (Japan Tobacco, Inc.) para formar um plasmídeo final à base de pSB11. Estes plasmídeos à base de pSB11 são tipicamente organizados de modo que o fragmento de DNA contendo a construto do promotor - gene - terminador possa ser extirpado por dupla digestão por enzimas de restrição, tal como Kpn I e Pme I e utilizado para transformação em plantas por injeção de feixes de aerossol. A estrutura dos clones com base em pSB11 resultantes pode ser verificada por digestão por restrição e eletroforese em gel e por sequenciamento através das várias junções de clonagem.

[0155] O plasmídeo pode ser mobilizado para a cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens que também abriga o plasmídeo pSB1 (Japan Tobacco, Inc.), utilizando procedimentos de cruzamento triparentais bem conhecidos na técnica e plaqueamento em meios contendo espectinomicina. O clone de plasmídeo à base de pSB11 possui resistência a espectinomicina, mas é um plasmídeo de gama de hospedeiros estreita e não pode replicar em Agrobacterium. As colônias resistentes à espectinomicina surgem quando os plasmídeos à base de pSB11 se integram no plasmídeo pSB1 de ampla gama de hospedeiros através de recombinação homóloga. O produto co-integrado de pSB1 e o plasmídeo à base de pSB11 podem ser verificados por hibridização Southern. A cepa de Agrobacterium que abriga o co-integrado pode ser utilizada para transformar milho por métodos conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, o método PureIntro (Japan Tobacco).

AVALIAÇÃO DE MUTANTES SG EM APLICAÇÃO DE PULVERIZAÇÃO DE HERBICIDA EM ESTUFA

[0156] SG1, SG10, SG20 e SG22 foram transformados como cassetes de gene único em plantas de soja Thorne e as plantas T0 foram pulverizadas com o Composto 1 para medir a tolerância a herbicidas. Cada iteração de mutante identificada no ensaio de triagem bacteriana apresentou melhor desempenho que a versão anterior (SG20> SG10> SG1). SG22 teve um desempenho similar ao SG1 in planta.

EXEMPLO 3. TRANSFORMAÇÃO DE SOJA

[0157] A transformação da soja é alcançada usando métodos bem conhecidos na técnica, como o descrito usando os explantes de meia semente de soja de transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens usando essencialmente o método descrito por Paz et al. (2006), Plant Cell Rep. 25:

206. Os transformantes foram identificados usando isoxaflutol ou tembotriona como marcador de seleção. O aparecimento de brotos verdes foi observado e documentado como um indicador de tolerância ao herbicida isoxaflutol ou tembotriona. Os brotos transgênicos tolerantes mostrarão enverdecimento normal comparável aos brotos de soja do tipo selvagem não tratados com isoxaflutol ou tembotriona, enquanto os brotos de soja do tipo selvagem tratados com a mesma quantidade de isoxaflutol ou tembotriona serão totalmente branqueados. Isso indica que a presença da proteína HPPD permite a tolerância a herbicidas inibidores da HPPD, como isoxaflutol ou tembotriona.

[0158] Os brotos verdes tolerantes são transferidos para meios de enraizamento ou enxertados. As plântulas enraizadas serão transferidas para a estufa após um período de aclimatação. As plantas contendo o transgene são então pulverizadas com herbicidas inibidores da HPPD, como por exemplo com tembotriona a uma taxa de 100 g de AI/ ha. Dez dias após a aplicação, os sintomas devidos à aplicação do herbicida são avaliados e comparados com os sintomas observados em plantas do tipo selvagem sob as mesmas condições.

EXEMPLO 4: ESTABELECIMENTO E SELEÇÃO DE PLANTAS DE ALGODOEIRO T0

[0159] A transformação do algodoeiro é alcançada utilizando métodos bem conhecidos na técnica, o método especialmente preferido é o descrito na publicação de patente PCT WO 00/71733. As plantas regeneradas são transferidas para a estufa. Após um período de aclimatação, as plantas suficientemente cultivadas são pulverizadas com herbicidas inibidores da HPPD, como por exemplo tembotriona equivalente a 100 g de AI/ha suplementado com sulfato de amônio e éster metílico de colza. Sete dias após a aplicação da pulverização, os sintomas devidos ao tratamento com o herbicida são avaliados e comparados com os sintomas observados em plantas de algodoeiros do tipo selvagem submetidas ao mesmo tratamento sob as mesmas condições.

EXEMPLO 5. TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS VEGETAIS DE MILHO POR

TRANSFORMAÇÃO MEDIADA POR AGROBACTERIUM

[0160] As espigas são melhor coletadas 8 a 12 dias após a polinização. Os embriões são isolados das espigas e os embriões com tamanho de 0,8 a 1,5 mm são preferidos para uso na transformação. Os embriões são plaqueados com o escutelo voltado para cima em um meio de incubação adequado e incubados de um dia para outro a 25 ºC no escuro.

[0161] No entanto, não é necessário, por si só, incubar os embriões de um dia para outro. Os embriões são colocados em contato com uma cepa de Agrobacterium contendo os vetores apropriados que possuem uma sequência de nucleotídeos da presente invenção para transferência mediada por plasmídeo Ti por cerca de 5 a 10 min e depois plaqueados em meios de co-cultivo por cerca de 3 dias (25 ºC no escuro). Após o co-cultivo, os explantes são transferidos para o meio do período de recuperação por cerca de cinco dias (a 25 ºC no escuro). Os explantes são incubados em meios de seleção por até oito semanas, dependendo da natureza e características da seleção específica utilizada. Após o período de seleção, o calo resultante é transferido para o meio de maturação do embrião, até que seja observada a formação de embriões somáticos maturos. Os embriões somáticos maturos resultantes são então colocados sob pouca luz, e o processo de regeneração é iniciado como conhecido na técnica. Os brotos resultantes são deixados para enraizar no meio de enraizamento e as plantas resultantes são transferidas para vasos de sementeira e propagadas como plantas transgênicas.

[0162] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados no relatório descritivo são indicativos do nível de habilidade dos técnicos no assunto aos quais esta invenção se refere. Todas as publicações e pedidos de patente são aqui incorporados por referência na mesma medida como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

[0163] Embora a invenção precedente tenha sido descrita em alguns detalhes a título de ilustração e exemplo para fins de clareza de entendimento, será óbvio que certas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims (29)

REIVINDICAÇÕES

1. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO RECOMBINANTE caracterizada por compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD), em que a referida sequência de nucleotídeos codifica uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 55% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, ou um fragmento da mesma, em que a referida sequência de aminoácidos é selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) uma sequência de aminoácidos que possui as substituições de aminoácidos de: (a) uma leucina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 264 da SEQ ID NO: 1; (b) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1; (c) uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 270 da SEQ ID NO: 1; (d) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1; (e) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (f) uma serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1; (g) uma tirosina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1; (h) uma arginina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (i) uma glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 344 da SEQ ID NO: 1; e

(j) uma metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1;

(ii) uma sequência de aminoácidos que possui as substituições de aminoácidos de:

(a) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1;

(b) uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 270 da SEQ ID NO: 1;

(c) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1;

(d) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1;

(e) uma serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1;

(f) uma tirosina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1;

(g) uma arginina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1;

(h) uma glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 344 da SEQ ID NO: 1; e

(i) uma metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1;

(iii) uma sequência de aminoácidos que possui as substituições de aminoácidos de:

(a) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1; (b) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1;

(c) uma serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1;

(d) uma tirosina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1; e

(e) uma arginina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1;

(iv) uma sequência de aminoácidos que possui as substituições de aminoácidos de:

(a) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1;

(b) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1;

(c) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1;

(d) uma serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1;

(e) uma tirosina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1;

(f) uma arginina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; e

(g) uma metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1; e

(v) uma sequência de aminoácidos que possui as substituições de aminoácidos de:

(a) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1; (b) uma asparagina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1;

(c) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (d) uma serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1; (e) uma arginina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; e (g) uma metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1.

em que a referida enzima HPPD é tolerante a um herbicida inibidor de HPPD.

2. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela referida sequência de nucleotídeos ser selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8, 9, 10 e 11 ou uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8, 9, 10 ou 11.

3. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela referida sequência de nucleotídeos codificar uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 12, 2, 3, 4 ou 5 ou fragmentos das mesmas.

4. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO RECOMBINANTE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 caracterizada pela referida sequência de nucleotídeos ser uma sequência sintética que foi projetada para expressão em uma planta.

5. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO RECOMBINANTE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pela referida sequência de nucleotídeos estar operacionalmente ligada a um promotor capaz de dirigir a expressão da sequência de nucleotídeos em uma célula vegetal.

6. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo referido herbicida inibidor de HPPD ser selecionado a partir do grupo que consiste em uma N-(tetrazol-4-il)- ou N-(triazol-3-il)arilcarboxamida, uma N-(1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamida, tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona, isoxaflutol, pirassulfotol e mesotriona.

7. CASSETE DE EXPRESSÃO, caracterizado por compreender a molécula de ácido nucleico conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 2.

8. CASSETE DE EXPRESSÃO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por compreender ainda uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo heterólogo.

9. CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizada por conter a molécula de ácido nucleico recombinante conforme definida na reivindicação 1.

10. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por ser uma célula hospedeira bacteriana.

11. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por ser uma célula vegetal.

12. PLANTA transgênica, caracterizada por compreender a molécula de ácido nucleico recombinante conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 2.

13. PLANTA, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pela referida planta ser selecionada a partir do grupo que consiste em milho, sorgo, trigo, girassol, tomateiro, crucíferas, pimenteira, batata, algodoeiro, arroz, soja, beterraba sacarina, cana de açúcar, planta de fumo, cevada e colza.

14. SEMENTE TRANSGÊNICA, caracterizada por compreender a molécula de ácido nucleico recombinante conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 2.

15. POLIPEPTÍDEO RECOMBINANTE, caracterizado por compreender uma enzima HPPD, em que a referida enzima HPPD é tolerante a um herbicida inibidor de HPPD e em que o referido polipeptídeo tem pelo menos 55% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 ou um fragmento da mesma e é selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um polipeptídeo que possui as substituições de aminoácidos de: (a) uma leucina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 264 da SEQ ID NO: 1; (b) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1; (c) uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 270 da SEQ ID NO: 1; (d) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1; (e) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (f) uma serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1; (g) uma tirosina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1; (h) uma arginina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (i) uma glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 344 da SEQ ID NO: 1; e (j) uma metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1;

(ii) um polipeptídeo que possui as substituições de aminoácidos de:

(a) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1;

(b) uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 270 da SEQ ID NO: 1;

(c) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1;

(d) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1;

(e) uma serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1;

(f) uma tirosina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1;

(g) uma arginina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1;

(h) uma glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 344 da SEQ ID NO: 1; e

(i) uma metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1;

(iii) um polipeptídeo que possui as substituições de aminoácidos de:

(a) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1;

(b) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1;

(c) uma serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1;

(d) uma tirosina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1; e

(e) uma arginina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1;

(iv) um polipeptídeo que possui as substituições de aminoácidos de:

(a) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1;

(b) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1;

(c) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1;

(d) uma serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1;

(e) uma tirosina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1;

(f) uma arginina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; e

(g) uma metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1; e

(v) um polipeptídeo que possui as substituições de aminoácidos de:

(a) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1;

(b) uma asparagina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1;

(c) um ácido aspártico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (d) uma serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1; (e) uma arginina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; e (g) uma metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1.

16. POLIPEPTÍDEO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela referida sequência de aminoácidos possuir pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 12, 2, 3, 4 ou 5.

17. POLIPEPTÍDEO RECOMBINANTE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 16, caracterizado pela referida sequência de aminoácidos estar apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 12, 2, 3, 4 ou 5.

18. POLIPEPTÍDEO RECOMBINANTE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 16, caracterizado pelo referido herbicida inibidor de HPPD ser selecionado a partir do grupo que consiste em uma N- (tetrazol-4-il)- ou N-(triazol-3-il)arilcarboxamida, uma N-(1,2,5-oxadiazol-3- il)benzamida, tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona, isoxaflutol, pirassulfotol e mesotriona.

19. POLIPEPTÍDEO RECOMBINANTE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 16, caracterizado por compreender ainda uma sequência de aminoácidos heterólogos.

20. MÉTODO PARA CONFERIR TOLERÂNCIA a um herbicida inibidor de hppd em uma planta, caracterizado pelo referido método compreender transformar a referida planta com um construto de DNA, em que o referido construto compreende um promotor que dirige a expressão em uma célula vegetal operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

21. PLANTA, caracterizada por possuir, estavelmente incorporado no seu genoma, um construto de DNA, em que o referido construto compreende um promotor operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

22. PLANTA, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pela referida planta ser selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula vegetal, um tecido vegetal e uma semente vegetal.

23. PLANTA, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pela referida planta ser selecionada a partir do grupo que consiste em milho, sorgo, trigo, girassol, tomateiro, crucíferas, pimenteira, batata, algodoeiro, arroz, soja, beterraba sacarina, cana de açúcar, planta de fumo, cevada e colza.

24. PRODUTO DE UTILIDADE, caracterizado por compreender uma quantidade detectável da molécula de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou da sequência de aminoácidos, conforme definia em qualquer uma das reivindicações 15 a 16.

25. SEMENTE TRANSGÊNICA, caracterizada por ser da planta, conforme definida na reivindicação 21.

26. MÉTODO PARA CONTROLAR ERVAS DANINHAS em um campo, caracterizado por compreender plantar a planta, conforme definida na reivindicação 21, ou uma semente da mesma em um campo e aplicar ao referido campo uma concentração eficaz de um herbicida inibidor de HPPD.

27. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo referido herbicida inibidor de HPPD ser selecionado a partir do grupo que consiste em uma N-(tetrazol-4-il)- ou N-(triazol-3-il)arilcarboxamida, uma N- (1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamida, tembotriona, sulcotriona, topramezona,

biciclopirona, tefuriltriona, isoxaflutol, pirassulfotol e mesotriona.

28. PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizada pela dita planta compreender ainda uma sequência de nucleotídeos que confere tolerância ao glifosato e uma sequência de nucleotídeos que confere tolerância ao glufosinato.

29. USO DA SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ser para tornar uma planta tolerante a um ou mais herbicida(s) inibidor(es) de HPPD.