PL214713B1 - Burak cukrowy odporny na glifosat, nasiono, komórka, tkanka lub czesc takiego buraka cukrowego, sposób identyfikacji buraka cukrowego odpornego na glifosat oraz zestaw testowy do identyfikacji transgenicznego buraka cukrowego odpornego na glifosat - Google Patents

Description

Burak cukrowy odporny na glifosat, nasiono, komórka, tkanka lub część takiego buraka (54) cukrowego, sposób identyfikacji buraka cukrowego odpornego na glifosat oraz zestaw testowy do identyfikacji transgenicznego buraka cukrowego odpornego na glifosat (30) Pierwszeństwo:

20.02.2003, EP, 03003866.5 28.02.2003, US, 10/376,763 (43) Zgłoszenie ogłoszono:

20.02.2006 BUP 04/06 (73) Uprawniony z patentu:

KWS SAAT AG, Einbeck, DE (72) Twórca(y) wynalazku:

JOSEF KRAUS, Einbeck, DE ELKE SAUERBREY, Einbeck, DE REINHARD NEHLS, Einbeck, DE ANDREAS LOOCK, Einbeck, DE RUDOLF JANSEN, Einbeck, DE (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

30.09.2013 WUP 09/13 (74) Pełnomocnik:

rzecz. pat. Sebastian Walkiewicz

PL 214 713 B1

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy buraka cukrowego odpornego na glifosat, jak również nasiona, komórki, tkanki lub części takiego buraka, sposobu identyfikacji buraka cukrowego odpornego na glifosat oraz zestawu testowego do identyfikacji transgenicznego buraka cukrowego odpornego na glifosat.

Burak cukrowy (Beta vulgaris) jest hodowany jako warzywo uprawne w wielu krajach o łącznych plonach przewyższających 240 milionów ton.

N-fosfonometylo-glicyna, powszechnie znana jako glifosat, jest środkiem chwastobójczym o szerokim spektrum działania, który jest szeroko stosowany w związku z jego wysoką skutecznością, biodegradowalnością oraz niską toksycznością w stosunku do zwierząt i ludzi. Glifosat hamuje szlak kwasu szikimowego, który prowadzi do biosyntezy związków aromatycznych włączając aminokwasy i witaminy. Szczegółowo, glifosat hamuje przekształcenie kwasu fosfoenolopirogronowego oraz kwasu 3-fosfoszikimowego do kwasu 5-enolopirogrono-3-fosfoszikimowego poprzez hamowanie enzymu syntazy kwasu 5-enolopirogrono-3-fosfoszikimowego (syntaza EPSP lub EPSPS). Tradycyjne rośliny, poddane działaniu glifosatu, nie mogą wytwarzać aminokwasów aromatycznych (np. fenyloalaniny i tyrozyny) potrzebnych do wzrostu i przeżycia. EPSPS jest obecna we wszystkich roślinach, bakteriach i grzybach. Nie jest obecna u zwierząt, które nie syntetyzują własnych aminokwasów aromatycznych. Ponieważ szlak syntezy aminokwasów aromatycznych nie występuje u ssaków, ptaków i wodnych form życia, glifosat ma niewielki, jeśli jakikolwiek, wpływ toksyczny na te organizmy. Enzym EPSPS jest naturalnie obecny w żywności pochodzącej ze źródeł roślinnych i mikrobiologicznych.

Glifosat jest aktywnym składnikiem środków chwastobójczych takich jak Roundup®, produkowanym przez Monsanto Company, USA. Zazwyczaj stosuje się go w preparatach, jako sól rozpuszczalną w wodzie taką jak sól amonowa, alkiloaminowa, metali alkalicznych lub trójmetylosulfoniowa. Jednym z najbardziej powszechnych preparatów jest sól izopropyloaminowa glifosatu, którą stosuje się w środku chwastobójczym Roundup®.

Pokazano, że rośliny odporne na glifosat mogą być otrzymane poprzez wstawienie do genomu rośliny jednostki zdolnej do produkcji syntazy EPSP, która jest odporna na glifosat np. CP4-EPSPS z Agrobacterium sp. szczepu CP4.

Opis stanu techniki

Burak cukrowy odporny na glifosfat może być wytworzony poprzez transformację z wykorzystaniem Agrobacterium, poprzez wprowadzenie genu kodującego EPSPS odpornego na glifosat takiego jak CP4-EPSPS do genomu rośliny. Takiego buraka cukrowego, wyrażającego CP4-EPSPS, opisano w WO 99/23232. Niemniej jednak, buraki cukrowe, które wyrastają z komórek transformowanych w ten sposób genem CP4-EPSPS szeroko różnią się swoją charakterystyką w związku z faktem, że gen jest wbudowywany do genomu rośliny w przypadkowe miejsce. Wbudowanie szczególnego transgenu w specyficzne miejsce na chromosomie jest często określane mianem „zdarzenia”.

Termin „zdarzenie” stosowany jest także w przypadku różnicowania genetycznie modyfikowanych odmian roślin. Pożądane zdarzenia występują bardzo rzadko. Zdecydowana większość zdarzeń jest odrzucana, ponieważ transgen wbudowany jest w gen rośliny, potrzebny do wzrostu, co powoduje rozbicie genu i brak jego ekspresji albo transgen wbudowany jest w odcinek chromosomu, w którym uniemożliwiona jest ekspresja transgenu lub jego ekspresja jest zbyt niska. Z tego powodu konieczne jest przeszukanie dużej liczby zdarzeń w celu zidentyfikowania zdarzenia, które charakteryzuje się wystarczającą ekspresją wprowadzonego genu. Taka procedura jest bardzo czasochłonna i kosztowna oraz nie gwarantuje ona w żaden sposób, że zostanie znaleziona roślina o satysfakcjonujących własnościach.

Streszczenie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest burak cukrowy odporny na glifosat charakteryzujący się tym, że:

a) fragment DNA z genomowego DNA buraka cukrowego, jego części lub nasion może być namnożony przy wykorzystaniu łańcuchowej reakcji polimerazy z pierwszym starterem posiadającym sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 3 oraz drugim starterem posiadającym sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 4, gdzie fragment DNA wykazuje przynajmniej 95% identyczności z sekwencją nukleotydową Sekw. Nr 6, i/lub;

b) fragment DNA z genomowego DNA buraka cukrowego, jego części lub nasion może być namnożony przy wykorzystaniu łańcuchowej reakcji polimerazy z pierwszym starterem posiadającym sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 9 oraz drugim starterem posiadającym sekwencję nukleotyPL 214 713 B1 dową Sekw. Nr 10, gdzie fragment DNA wykazuje przynajmniej 95% identyczności z sekwencją nukleotydową Sekw. Nr 12, i/lub;

c) fragment DNA z genomowego DNA buraka cukrowego, jego części lub nasion może być namnożony przy wykorzystaniu łańcuchowej reakcji polimerazy z pierwszym starterem posiadającym sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 14 oraz drugim starterem posiadającym sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 16, gdzie fragment DNA wykazuje przynajmniej 95% identyczności z sekwencją nukleotydową Sekw. Nr 17.

Przedmiotem wynalazku jest także, nasiono buraka cukrowego określonego powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka, tkanka lub część buraka cukrowego określonego powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto, sposób identyfikacji buraka cukrowego odpornego na glifosat charakteryzujący się tym, że obejmuje etap (etapy):

a) namnażania fragmentu DNA 3500-3900, korzystnie 3706 pz, z genomowego DNA wspomnianego buraka cukrowego, jego części lub nasion, przy wykorzystaniu łańcuchowej reakcji polimerazy z pierwszym starterem posiadającym sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 3 oraz drugim starterem posiadającym sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 4 i/lub;

b) namnażania fragmentu DNA 710-790 pz, korzystnie 751 pz, z genomowego DNA wspomnianego buraka cukrowego, jego części lub nasion, przy wykorzystaniu łańcuchowej reakcji polimerazy z pierwszym starterem posiadającym sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 9 oraz drugim starterem posiadającym sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 10 i/lub;

c) namnażania fragmentu DNA 990-1100 pz, korzystnie 1042 pz, z genomowego DNA wspomnianego buraka cukrowego, jego części lub nasion, przy wykorzystaniu łańcuchowej reakcji polimerazy z pierwszym starterem posiadającym sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 14 oraz drugim starterem posiadającym sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 16.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zestaw testowy do identyfikacji transgenicznego buraka cukrowego odpornego na glifosat, jego komórek, tkanek lub części, znamienny tym, że zawiera przynajmniej jedną parę starterów, gdzie pierwszy i drugi starter są przeznaczone do łańcuchowej reakcji polimerazy, w której pierwszy starter rozpoznaje sekwencję wewnątrz obcego DNA wbudowanego do genomu omawianego buraka cukrowego, a drugi starter rozpoznaje sekwencję regionów otaczających 3' lub 5' omawianego DNA, przy czym burak cukrowy jest burakiem cukrowym określonym powyżej.

Korzystnie, w zestawie według wynalazku:

a) pierwszy starter posiada sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 9, a drugi starter posiada sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 10 i/lub;

b) pierwszy starter posiada sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 14, a drugi starter posiada sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 16.

Burak cukrowy według wynalazku wykazuje wysoki poziom odporności na glifosat przy braku niekorzystnych cech w odniesieniu do innych ważnych rolniczych własności takich jak wzrost, plony, jakość, odporność na czynniki chorobotwórcze, itd.

Buraka cukrowego odpornego na glifosat według wynalazku można otrzymać z nasion zdeponowanych w NCIMB, Aberdeen (Szkocja, Wielka Brytania) i posiadających numer katalogowy NCIMB 41158 lub NCIMB 41159.

Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) jest dobrze znaną standardową metodą stosowaną do namnażania cząsteczek kwasu nukleinowego (zob. na przykład US 4683202).

Burak cukrowy według wynalazku (poniżej określany jako „zdarzenie H7-1”) wykazuje wysoką odporność na środek chwastobójczy glifosat. Dodatkowo charakterystyka wzrostu oraz inne ważne własności rolnicze zdarzenia H7-1 są nienaruszone przez proces transformacji. Zdarzenie H7-1 posiada wysoki poziom ekspresji genu Agrobacterium-CP4-EPSPS, który jest stabilnie wbudowany w genom rośliny i który nadaje roślinie odporność na glifosat. Roślinę otrzymano przy pomocy technologii transformacji przy pomocy Agrobacterium przy użyciu wektora binarnego PV-BVGT08. Wektor ten pomiędzy prawym i lewym regionem granicznym zawiera następujące sekwencje: region kodujący, złożony z sekwencji kodującej peptyd tranzytowy chloroplastu z Arabidopsis thaiiana EPSPS (oznaczony jako ctp2) połączony z sekwencją kodującą CP4-EPSPS oraz pod kontrolą promotora wirusa mozaiki Figworta (pFMV) oraz sekwencji terminacji transkrypcji E9-3' z Pisum sativum.

W korzystnym wariancie według wynalazku fragmenty DNA o długości 3706 pz, 664 pz, 288 pz, 751 pz oraz 1042 pz wykazują przynajmniej 95%, korzystnie przynajmniej 99%, bardziej korzystnie przynajmniej 99,9% identyczności z odpowiednimi sekwencjami 15 nukleotydowymi Sekw. Nr 6,

PL 214 713 B1

Sekw. Nr 13, Sekw. Nr 11, Sekw. Nr 12 lub Sekw. Nr 17. Na przykład, 95% identyczności oznacza, że 95% nukleotydów danej sekwencji jest identyczna z porównywaną sekwencją. W tym celu sekwencje mogą być porównane przy użyciu programu BLAST (dostępnego na przykład pod adresem http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/b12seq/b12.html). Najkorzystniej, fragment DNA o długości 3706 pz posiada sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 6, fragment DNA o długości 664 pz posiada sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 13, fragment DNA o długości 288 pz posiada sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 11, fragment DNA o długości 751 pz posiada sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 12 i/lub fragment DNA o długości 1042 pz posiada sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 17.

Obecny wynalazek dotyczy także nasion zdeponowanych w NCIMB, Aberdeen (Szkocja, Wielka Brytania) i posiadających numer katalogowy NCIMB 41158 lub NCIMB 41159. Takie nasiona mogą być użyte do otrzymania buraka cukrowego odpornego na glifosat. Nasiona mogą być wysiane i wyhodowana roślina będzie odporna na glifosat.

Sposób według wynalazku pozwala na łatwe wykrycie transgenicznego buraka cukrowego odpornego na glifosat przy pomocy standardowych technik biologii molekularnej.

Krótki opis figur

Następujące figury służą do objaśnienia wynalazku.

Fig. 1 przedstawia mapę wektora binarnego PV-BVGT08.

Fig. 2 przedstawia identyfikację H7-1 przy pomocy analizy PCR. Analizowano próbki DNA z 18 roślin. Negatywna grupa kontrolna: DNA z nietransformowanego buraka cukrowego; pozytywna grupa kontrolna: DNA z oryginalnie transformowanego H7-1.

Fig. 3 przedstawia identyfikację zdarzenia H7-1 przy pomocy MuItipIex-PCR oraz rozróżnienie pomiędzy transgenicznym zdarzeniem H7-1 i nietransgenicznymi roślinami. Analizowano próbki DNA z 54 roślin.

Fig. 4 przedstawia wstawkę pFMV-ctp2-CP4-EPSPS-E9-3' z miejscami trawienia dla enzymów restrykcyjnych HindIII, XbaI, Cial, PstI oraz BamHI.

Fig.5 przedstawia analizę liczby kopii wstawki zdarzenia H7-1. Dla celów analizy „Southern blot” 10 μg genomowego DNA H7-1 trawiono przy użyciu PstI, HindIII, XbaI, CIaI oraz BamHI (linie 3 do 7). Nietransformowane DNA genomowe (jako negatywną grupę kontrolną) trawiono BamHI (linia 8). Plazmid PV-BVGT08 (jako pozytywną grupę kontrolną) trawiono BamHI. W liniach 2 i 9 znajdują się markery wielkości. Membranę inkubowano z sondą zawierającą region kodujący CP4-EPSPS znakowany ³²P. Sonda zawiera wewnętrzną sekwencję genu CP4-EPSPS obejmującą pary zasad 447-1555.

Fig. 6 przedstawia analizę „Southern blot” zdarzenia H7-1 w celu oceny nienaruszenia regionu kodującego ctp2-CP4-EPSPS. 10 μg genomowego DNA H7-1, nietransgeniczny kontrolny DNA oraz nietransgeniczny kontrolny DNA zmieszane z PV-BVGT08 trawiono XbaI oraz Hindlll/BamHI. Mem32 branę inkubowano z sondą CP4-EPSPS-PCR znakowaną ³²P. Sonda zawiera sekwencję PV-BVGT08 obejmującą pary zasad 447-1555,

Fig. 7 przedstawia analizę „Southern blot” zdarzenia H7-1 w celu oceny nienaruszenia regionu promotora. 10 μg genomowego DNA H7-1, nietransgeniczny kontrolny DNA oraz nietransgeniczny kontrolny DNA zmieszane z PV-BVGT08 trawiono HindIII, XbaI oraz Sacl/Xhol. Membranę inkubowano z sondą zawierającą fragment promotora (HindIII)(=PV-BVGT08, sekwencja pz 7972-8583) znakowaną ³²P oraz z całą kasetą promotor-ctp2-CP4-EPSPS-E9-3' (PmeI/XhoI)(=PV-BVGT08, sekwencja pz 7935-2389).

Fig. 8 przedstawia analizę „Southern blot” zdarzenia H7-1 w celu oceny nienaruszenia regionu poliadenylacji. 10 μg genomowego DNA H7-1, nietransgeniczny kontrolny DNA oraz nietransgeniczny kontrolny DNA zmieszane z PV-BVGT08 trawiono EcoRI/PstI, Xba, HindIII oraz PstI. Membranę inkubowano z sondą zawierającą fragment poliadenylacji E9-31' (BamHI/XhoI)(=PV-BVGT08, sekwencja pz 1702-2389) znakowaną ³²P.

Fig. 9 przedstawia fragmenty używane jako sondy do oceny braku szkieletu wektora DNA w zdarzeniu H7-1.

Fig. 10 przedstawia analizę „Southern blot” zdarzenia H7-1 w celu oceny braku szkieletu wektora DNA w zdarzeniu H7-1. 10 μg genomowego DNA H7-1, nietransgeniczny kontrolny DNA oraz nietransgeniczny kontrolny DNA zmieszane z PV-BVGT08 trawiono XbaI. Membranę inkubowano z son32 dą zawierającą cały szkielet wektora PV-BVGT08 (linie 1-4) znakowaną ³²P. Jedną membranę inkubowano ze znakowaną sondą CP4-EPSPS.

Fig. 11 przedstawia porównanie pomiędzy fragmentami PCR i sekwencjami PV-BVGT08 na lewym ramieniu regionu.

PL 214 713 B1

Fig. 12 przedstawia porównanie pomiędzy fragmentami PCR i sekwencjami PV-BVGT08 na prawym ramieniu regionu.

Fig. 13 przedstawia analizę genomowego DNA poza prawym połączeniem wstawki. W przybliżeniu 50 ąg każdego z genomowego DNA zdarzenia H7-1, nietransgenicznego kontrolnego DNA lub wody używano do reakcji PCR z kombinacją starterów P1, w której oba startery są położone poza wstawką oraz P3, w której jeden starter jest położony wewnątrz wstawki, a drugi starter znajduje się poza wstawką.

Fig. 14 przedstawia analizę genomowego DNA poza lewym połączeniem wstawki. W przybliżeniu 50 ąg każdego z genomowego DNA zdarzenia H7-1, nietransgenicznego kontrolnego DNA lub wody używano do reakcji PCR z kombinacją starterów P2, w której oba startery są położone poza wstawką oraz P4, w której jeden starter jest położony wewnątrz wstawki, a drugi starter znajduje się poza wstawką.

Fig. 15 przedstawia mapę potomstwa partii nasion H7-1.

Fig. 16 przedstawia analizę „Southern blot” zdarzenia H7-1 w celu oceny czy wstawione DNA jest stabilnie zintegrowane w genomie. 10 ąg genomowych DNA H7-1 (oryginalnie transformowany H7-1-1995 oraz trzy organizmy potomne H7-1-1996 do 1998), nietransgeniczny kontrolny DNA różnego pochodzenia trawiono BamHI, XbaI oraz HindIII. Membranę inkubowano z sondą CP4-EPSPS z wektora PV-BVGT08 (= pz 447-1555) znakowaną ³²P.

Szczegółowy opis wynalazku

Wynalazek jest ponadto określony, tylko na zasadzie ilustracji, w odniesieniu do następujących przykładów.

Lista stosowanych skrótów jest podana poniżej:

~	w przybliżeniu
°C	stopień Celsjusza
bidest	podwójnie destylowana sterylna woda
pz	pary zasad
CTAB	bromek cetylotrimetyloamoniowy
DNA	kwas dezoksyrybonukleinowy
E.coli	Escherichia coli
EDTA	kwas etylenodiaminotetraoctowy
FIG.	Figura
h	godzina
HCI	kwas chlorowodorowy
kpz	kilo par zasad
kg	kilogram
M, mM	molowy, milimolowy
min	minuty
Na2HPO4/NaH2PO4	fosforan sodu
NaCI	chlorek sodu
NaOH	wodorotlenek sodu
Nt	nukleotyd
PCR	łańcuchowa reakcja polimerazy
Pmol	pikomol
RNaza	nukleaza kwasu rybonukleinowego
Rpm	obroty na minutę
RR	Roundup Ready®
RT	temperatura pokojowa
SDS	dodecylo siarczan sodu
Sec	sekunda
SEVAG	chloroform: alkohol izoamylowy (24:1)
SSC	bufor standardowy cytrynianowy
TE	bufor Tris-EDTA
TRIS	trój(hydroksymetylo)-aminometan

PL 214 713 B1

P r z y k ł a d 1

I Identyfikacja zdarzenia H7-1

Burak cukrowy (Beta vulgaris) o genotypie 3S0057 zmodyfikowano genetycznie w taki sposób, aby uzyskać ekspresję syntazy CP4- kwasu 5-enolopirogrono-3-fosfoszikimowego lub CP4-EPSPS, która nadaje odporność na środek chwastobójczy glifosat oraz jest także używana jako marker selekcyjny. Tę transgeniczną linię otrzymano przy wykorzystaniu technologii transformacji Agrobacterium tumefaciens przy użyciu wektora binarnego PV-BVGT08. T-DNA wektora użytego do transformacji buraka cukrowego zawierało pomiędzy lewym a prawym regionem granicznym następujące sekwencje: region kodujący złożony z sekwencji kodującej chloroplastowego peptydu tranzytowego z Arabidopsis thaliana EPSPS (oznaczoną jako ctp2) połączoną sekwencją kodującą CP4-EPSPS pod kontrolą promotora 35S wirusa mozaiki Figworta (pFMV) oraz sekwencji terminacji transkrypcji genu rbcS-E9-3' z Pisum sativum.

Użyto następujących metod:

II Izolacja DNA Metoda 1

Pobierano świeże liście lub inne tkanki (20 do 100 mg w 1,5 ml probówce) i dodawano 400 μΙ buforu do izolacji (zob. poniżej). Tkanka była rozcierana przy pomocy małego homogenizatora. Mieszaninę wytrząsano przez 5 s oraz inkubowano 30 do 60 min w temperaturze pokojowej. Następnie przeprowadzano etap wirowania przy 13000 obr./min. przez 1 min. Supernatant zawierający DNA przenoszono do nowej probówki 1,5 ml i mieszano z 320 μΙ izopropanolu. Mieszaninę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 min. DNA strącano poprzez dodanie etanolu. Po wirowaniu przy 13000 obr./min. przez 5 min etanol zlewano. Próbkę suszono. Osad rozpuszczano w 400 μΙ H2O lub buforu TE (zob. poniżej).

Bufor do izolacji (100 ml):

ml 1 M Tris (pH 7,5) ml 5 M NaCl ml 0,5 M EDTA

2.5 ml 20% SDS

67.5 ml H2O

Bufor TE:

mM Tris-HCl (pH 8,0) mM EDTA

Metoda 2

Pobierano świeży materiał roślinny (20 do 100 mg) do 1,5 ml probówki Eppendorf i dodawano 500 μΙ buforu CTAB (65°C) (zob. poniżej). Mieszaninę inkubowano od 1 do 1,5 h w 65°C, a następnie wirowano przez 5 s. Dodawano 5 μΙ Rnazy A (10 mg/ml). Mieszaninę inkubowano 30 min w 37 °C, a następnie wirowano 5 s. Dodawano 200 μΙ SEVAG. Po wytrząsaniu i wirowaniu przy 13000 obr./min. przez 10 min supernatant przenoszono do nowej 1,5 ml probówki. 1 objętość izopropanolu (około 400 μΙ) mieszano ostrożnie z supernatantem. Następnie przeprowadzono etap wirowania przy 13000 obr./min. przez 10 min. Dodawano 600 μΙ 70% etanolu. Osad przemywano kilka razy przez odwracanie probówki.

Ponownie mieszaninę wirowano przy 13000 rpm przez 2 min. Etanol ostrożnie zlewano. Probówkę odwracano i odsączano na czystym papierze. Próbkę suszono przez 15 min. Osad rozpuszczano w 50 μΙ H2O (zob. poniżej).

Bufor CTAB:

1,4 M NaCI mM EDTA

100 mM Tris-HCI

2% (wag./obj.) CTAB

SEVAG:

Chloroform: alkohol izoamylowy (24:1)

Bufor do RNazy:

mM Tris mM NaCI pH 7,5

PL 214 713 B1

RNazaA:

mg RNazy/ml buforu do RNazy (5 ml bidest + 50 mg RNazy A, równe ilości w 1,5 ml probówkach, zagotować probówki przez 30 min w 100 °C, przechowywać w -20 °C)

Zazwyczaj używano Metody 1. Przy użyciu tej metody możliwa jest izolacja dużej liczby próbek DNA na dzień, a jakość DNA jest akceptowalna. Metody 2 używano, gdy materiał z liści był starszy lub gdy były problemy z uzyskaniem dobrej jakości DNA. Metoda 2 jest bardziej złożona i wymaga więcej czasu oraz uzyskuje się niższe stężenie DNA, ale o wyższej jakości. Zazwyczaj nie oznaczano ilości DNA i do reakcji PCR zazwyczaj używano od 0,5 do 1 μΙ wyizolowanego roztworu DNA.

Reakcja PCR:

Do reakcji PCR przygotowywano 10x stężoną mieszaninę buforu i dNTP. Procedura była następująca:

Roztwór stężony	Objętość	Stęż. w buforze 10x	Końcowe stęż. w reakcji PCR
1 M Tris-HCl, pH 8,3	100 ml	0,1 M	10 mM Tris-HCl, pH 8,3
1M KCl	500 ml	0,5 M	50 mM KCl
100 m M dATP	20 μΙ	2 mM	0,2 mM dATP
100 mM dCTP	20 μΙ	2 mM	0,2 mM dCTP
100 mM dTTP	20 μΙ	2 mM	0,2 mM dTTP
100 mM dGTP	20 μΙ	2 mM	0,2 mM dGTP
100 mM MgCI2	150 μΙ	15 mM	1,5 mM MgCI2
Woda HPLC 170 μΙ 1000 μΙ całkowita objętość

Reakcja PCR (25 μΙ):
DNA	0,5 μΙ
Starter 1	1 μΙ (20 pmol)
Starter 2	1 μΙ (20 pmol)
Polimeraza Taq 1	0,2 μΙ (1 U, z Oncor Appligene S.A., Heidelberg, Niemcy)
Bufor 10x stęż. 2,5 μΙ
Woda	18,8 μΙ

III Identyfikacja H7-1 przy pomocy PCR

Identyfikację H7-1 przeprowadzono przy pomocy PCR przy użyciu starterów specyficznych dla zdarzenia:

Wyższy starter (Sekw. Nr 1):

H7-207U30: 5' TTA ATT TTT GCA GGC GAT GGT GGC TGT TAT 3'

Niższy starter (Sekw. Nr 2):

H7-841L30: 5' CAT ACG CAT TAG TGA GTG GGC TGT CAG GAC 3'

Wyższy starter położony jest poza wstawką oraz jest częścią DNA genomowego buraka cukrowego. Niższy starter jest położony wewnątrz wbudowanego genu CP4-EPSPS.

Warunki PCR:

94°C 4 min 95°C 30 s 55°C 30 s 72°C 2 min 72°C 5 min 4°C przez noc

ETAP 1 ETAP 2a ETAP 2b ETAP 2c ETAP 3 ETAP 4 reakcja zakończona

PL 214 713 B1

Etapy 2a-c powtarzano 34 razy.

Oczekiwany produkt PCR to fragment DNA 664 pz (Sekw. Nr 13, zob. FIG. 2)

IV Identyfikacja H7-1 przy pomocy MuItipIex-PCR

W celu rozróżnienia nietransgenicznych i transgenicznych roślin oraz homozygotyczności lub hemi/heterozygotyczności przygotowano reakcję MuItipIex-PCR z trzema różnymi starterami. Użyto następujących starterów:

H72 (Sekw. Nr 14): 5' GCTCTGACACAACCGGTAAATGCATTGGCC 3'

H7S2 (Sekw. Nr 15): 5' GACCCATAGTTTGATTTTAAGCACGACATG 3'

H7R2 (Sekw. Nr 16): 5' GCAGATTCTGCTAACTTGCGCCATCGGAG 3'

Warunki PCR:

94°C 2 min 94°C 1 s

60°C 45 s

72°C 90 s 72°C 5 min 4°C przez noc

ETAP 1

ETAP 2a

ETAP 2b

ETAP 2c

ETAP 3 ETAP 4 reakcja zakończona

Etapy 2a-c powtarzano 34 razy.

W nietransgenicznych roślinach obserwowano tylko jeden fragment PCR o około 350 pz. W homozygotycznych transgenicznych roślinach obserwowano jeden fragment o około 1042 pz. W heterozygotycznych roślinach obserwowano oba fragmenty (zob. FIG. 3).

P r z y k ł a d 2

I Charakterystyka zdarzenia H7-1

Analiza molekularna została przeprowadzona w celu charakteryzacji zintegrowanego DNA obecnego w zdarzeniu H7-1. Szczegółowo, oznaczono liczbę wstawek (liczbę miejsc integracji w genomie buraka cukrowego), liczbę kopii (liczbę fragmentów DNA w jednym locus), integralność wbudowanego regionu kodującego i elementów regulatorowych, sekwencji promotora pFMV i sekwencji terminacji transkrypcji E9-3', braku sekwencji szkieletowych wektora użytego do transformacji oraz oznaczano stabilne dziedziczenie wstawki. Ponadto identyfikowano sekwencje otaczające wstawkę DNA.

Wbudowane DNA w zdarzeniu H7-1 po transformacji buraka cukrowego charakteryzowano przy użyciu technik „Southern blot”, PCR oraz odwrotnego PCR. Używano pozytywnych i negatywnych grup kontrolnych (PV-BVGT08, DNA z nietransgenicznej rośliny) i traktowano w ten sam sposób jak testowaną substancję (H7-1).

DNA izolowano z roślin zdarzenia H7-1 o numerze serii 74903H rosnących w 1997. Ponadto, DNA izolowano z oryginalnie transformowanej rośliny H7- 1 /3S0057 (=6401VH) w 1995 oraz dodatkowo z trzech roślin potomnych otrzymanych w 1996, 1997 i 1998 roku. ^7-1/64801^ H7-1/74922H oraz H7-1/83002S).

Nietransgeniczna linia buraka cukrowego 3S0057 służyła jako grupa kontrolna. Dodatkowo trzy linie buraka cukrowego 5R7150, 8K1180 i 6S0085 używano jako negatywną grupę kontrolną. Linie te są zwyczajnymi liniami nietransgenicznymi używanymi do hodowli tradycyjnego buraka cukrowego.

Substancje referencyjne odpowiadały plazmidowi PV-BVGT08 użytym do transformacji. DNA z plazmidu i DNA z kontrolnej linii buraka cukrowego mieszano razem, trawiono enzymami restrykcyjnymi i rozdzielano elektroforetycznie w żelu agarozowym równoległe do testowanych substancji. Plazmid służył jako marker wielkości dla oczekiwanego fragmentu i jako pozytywna grupa kontrolna do hybrydyzacji. DNA plazmidu mieszano z DNA genomowym rośliny w stężeniu odpowiadającym mniej niż jednej kopii elementu analizowanego w celu pokazania czułości metody „Southern blot” (~10 μg genomowego DNA i ~28 pg DNA PV- BVGT08).

Do oszacowania wielkości używano markera wielkości molekularnej RAOUL™ (ONCOR/Appligene, Nr katalogowy #160673).

II Izolacja DNA

Tkankę roślinną (od 1 do 3 mokrej masy) ze zdarzenia H7-1 numer serii 74903H rozcierano w ciekłym azocie na drobny proszek przy użyciu homogenizatora. Proszek przenoszono do 50 ml proPL 214 713 B1 bówki Oakridge i dodawano 7,5 ml wstępnie ogrzanego (60°C) buforu CTAB (2% CTAB, 100 mM TrisHCI, 20 mM EDTA pH 8,0, 1,4 M NaCI oraz 0,2% merkaptoetanol). Próbki inkubowano w 65°C przez w przybliżeniu 30 min sporadycznie mieszając. Do próbek dodawano równą objętość (8 ml) mieszaniny chloroform: alkohol izoamylowy (24:1 obj/obj) w RT. Zawiesinę mieszano poprzez odwracanie, a dwie fazy rozdzielano poprzez wirowanie (10 min, 9000 obr./min.). Fazę wodną przenoszono do nowej 50 ml probówki Oakridge, a następnie wytrącano DNA przez dodanie 5 ml izopropanolu. DNA wirowano (2 min, 9000 obr./min.), a supernatant usuwano. Strącone DNA inkubowano z roztworem przemywającym 76% etanolu i 10 mM octanu amonu przez około 20 min. Po wirowaniu i zlaniu supernatantu DNA suszono próżniowo i zawieszano w TE o pH 8,0 w 4°C przez noc.

W alternatywnej metodzie DNA izolowano przy pomocy zestawu Dneasy Plant Maxi Kit z Qiagen (Diisseldorf, Niemcy, Nr katalogowy 68163). Izolacje DNA przeprowadzano zgodnie z instrukcją producenta.

Dodatkowo stosowano alternatywną metodę izolacji DNA przy pomocy zestawu Dneasy Plant Mini Kit z Qiagen (Diisseldorf, Niemcy, Nr katalogowy 69103). Izolacje DNA przeprowadzano zgodnie z instrukcją producenta.

Oznaczanie ilości DNA i trawienie enzymami restrykcyjnymi:

Oznaczanie ilości DNA przeprowadzano przy użyciu spektrofotometru LKB Biochrom UV/widzialne (Amersham Pharmacia, Freiburg, Niemcy) lub alternatywnie DNA oznaczano ilościowo w elektroforetycznym żelu agarozowym przy pomocy skanowania DNA z użyciem programu RFLPscan (MWG-Biotech , Ebersberg, Niemcy). Jako standardu do kalibracji używano DNA Mass Ladder z Gibco/Life Technologies (Karlsruhe, Niemcy) (Nr katalogowy # 1 0496-016). Enzymy restrykcyjne pozyskano z Boehringer Mannheim (Monachium, Niemcy),

Stratagene (Amsterdam, Holandia) lub New England Biolabs (Frankfurt, Niemcy) i używano zgodnie z instrukcjami producenta.

Przygotowanie sond DNA:

DNA PV-BVGT08 izolowano z hodowli E.coli. Matryce sond homologiczne do regionu kodującego CP4-EPSPS, promotora 35S, regionu poliadenylacji E9-3', kasety 35S-ctp2-CP4- EPSPS-E9-3' oraz regionów szkieletu przygotowywano poprzez trawienie odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi, a następnie rozdzielano elektroforetycznie w żelu agarozowym albo poprzez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR). Produkty oczyszczano przy użyciu zestawu Gene Clean II z BIO 101 (La Jolla, Kalifor32 32 nia). Znakowanie sond (25 pg) ³²P-dCTP lub ³²P-dATP przeprowadzono przy pomocy systemu do znakowania DNA Megaprime™ z Amersham Pharmacia Biotech Europe (Freiburg, Niemcy).

Analizy „Southern blot”:

Próbki DNA traktowane enzymami restrykcyjnymi rozdzielano elektroforetycznie w żelu agarozowym przez ~15 godzin przy ~35 V. Po sfotografowaniu żelu DNA pozbawiano puryn poprzez zanurzenie żelu na 15 min w 0,25 M roztworze HCI, denaturowano poprzez inkubację żelu przez 30 min w roztworze denaturującym 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCI przy stałym delikatnym mieszaniu oraz ostatecznie neutralizowano przez zanurzenie na 2 godziny w kilku objętościach roztworu 2 M NaCI i 1 M Tris-HCI, pH 5,5. DNA z żelów agarozowych transferowano na membrany nylonowe Hybond-N™ (Amersham Pharmacia Biotech Europe, Freiburg, Niemcy) przy użyciu aparatu PosiBIot Pressure Blotter z Stratagene zgodnie z instrukcjami producenta. Po zanurzeniu filtru na 15 min w 2xSSPE (20xSSPE: 3,6 M NaCI, 20 mM EDTA, 0,2 M NaH2PO4/Na2HPO4 pH 7,4) DNA wiązano z membraną przez naświetlanie światłem UV (Transiluminator Pharmacia, Freiburg, Niemcy) przez 0,1 min oraz przez zapiekanie przez 1 godzinę w 80°C w piecu próżniowym. Membrany były prehybrydyzowane przez 4 godziny w wodnym roztworze 50% formamidu, 5xSSC, 0,1% laurylosarkozyny, 0,02% SDS oraz 2% czynnika blokującego (Boerhinger Mannheim, Niemcy, Nr katalogowy 1096176). Hybrydyzację ze znakowaną sondą przeprowadzono w świeżym roztworze prehybrydyzacyjnym przez 16-18 godzin w 42°C. Po hybrydyzacji membrany płukano przez 5 min w 2xSSC w 42°C, przez 20 min w 2xSSC, 1% SDS w 65°C i dwa razy po 15 min w 0,2xSSC, 0,1% SDS w 68 °C. Obrazy autoradiograficzne membran otrzymywano przez ekspozycję membran przy użyciu filmu Kodak Biomax MST™ w połączeniu z ekranem wzmacniającym Kodak Biomax MS™.

Identyfikacja genomowych sekwencji otaczających 5' i 3':

Połączenia w genomowym DNA transgen-roślina identyfikowano przy użyciu techniki odwrotnego-PCR. Genomowe DNA oczyszczano w sposób opisany powyżej. W przybliżeniu 1 μg DNA trawiono w oddzielnych reakcjach nukleazami restrykcyjnymi TaqI, AIuI, NdeIII lub RsaI. Strawione fragmenty DNA były ponownie łączone przy pomocy Iigazy T4 przez noc, a następnie przeprowadzano reakcję

PL 214 713 B1

PCR. Różne odwrotne kombinacje starterów otrzymano przy użyciu oprogramowania do analizy starterów OLIGO® z NBI (National Biosciences, Inc., Plymouth, Michigen).

Fragmenty powstałe po namnażaniu w odwrotnym-PCR rozdzielano w żelu elektroforetycznym, wycinano z żelu i oczyszczano przy użyciu zestawu Gene Clean II™. Oczyszczone fragmenty wklonowano do wektora pCR®2.1 przy użyciu zestawu do klonowania TOPO™TA z Invitrogen (Griningen, Holandia). Wstawki poddano sekwencjonowaniu w MWG Biotech (Ebersberg, Niemcy). Analizę otrzymanych danych sekwencyjnych przeprowadzono przy użyciu oprogramowania do analizy DNA Mac Molly® (Soft Gene GmbH, Bochold, Niemcy).

Analiza PCR:

Genomowe DNA przygotowywano przy pomocy zestawu Plant DNaesy Plant Mini Kit (Qiagen, Dϋsseldorf, Niemcy) zgodnie z instrukcjami producenta. W przybliżeniu 50 ng genomowego DNA używano do PCR. Reakcję przeprowadzano w 95°C przez 30 s, 55°C przez 30 s i 72°C przez 2 min w 35 cyklach. PCR wykonywano w cyklerze PTC200 (Biozym, Oldendorf, Niemcy). Produkty PCR analizowano elektroforetycznie w żelu agarozowym.

Liczba wstawek:

Liczbę wstawek czyli liczbę miejsc integracji transgenicznego DNA w genomie buraka cukrowego oceniano w H7-1. W celu oznaczenia liczby wstawek genomowe DNA trawiono enzymami restrykcyjnymi HindIII, XbaI oraz BamHI. Jako negatywnej grupy kontrolnej używano DNA z nietransformowanej rośliny, reprezentującej to samo podłoże genetyczne, które trawiono HindIII. Jako pozytywnej grupy kontrolnej używano wektor DNA do transformacji (PV-BVGT08).

Enzymy XbaI i BamHI tną tylko raz w PV-BVGT08 i nie posiadają miejsca cięcia w użytej znakowanej sondzie CP4-EPSPS (zob. FIG. 4). HindIII trawi trzy razy w PV-BVGT08, ale wszystkie trzy miejsca są położone poza sondą po tej samej stronie, 5', w stosunku do sondy. W ten sposób po cięciu każdym z enzymów powinien powstawać pojedynczy fragment DNA, hybrydyzujący z sondą CP4EPSPS, który powinien zawierać część wstawionego DNA i przylegające DNA genomowe rośliny. Liczba wykrywanych fragmentów wskazuje na liczbę wstawek obecnych w zdarzeniu. Wyniki pokazano na FIG. 5.

Po trawieniu odpowiednio enzymami HindIII, XbaI lub BamHI, znaleziono tylko pojedynczy hybrydyzujący fragment. Fragmenty o długości 5,2 kpz z trawienia HindIII (linia 4), 4 kpz z trawienia XbaI (linia 5) oraz w przybliżeniu 11 kpz z trawienia BamHI (linia 7) pokazały, że transformowana roślina H7-1 zawiera pojedyncze miejsce integracji transgenu (FIG. 4). Silny sygnał w linii 1 pochodzi z liniowego plazmidu PV-BVGT08. Dodatkowe słabe sygnały pochodzą z niestrawionego PV-BVGT08 lub z niespecyficznych sygnałów hybrydyzacji tła.

Liczba kopii:

Teoretycznie, w jednym miejscu integracji powinna się znajdować więcej niż jedna kopia wstawionego DNA. Ale z powodu wielkości fragmentów w analizie restrykcyjnej pokazanej powyżej nie jest to możliwe. Jeśli byłaby obecna więcej niż jedna kopia wstawionego DNA w H7-1, powinny być wykrywane dodatkowe fragmenty. Udowodniono to także poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym PstI. PstI trawi w dwóch miejscach w sekwencji lewego i prawego regionu granicznego. Jedno z miejsc restrykcyjnych znajduje się wewnątrz regionu kodującego CP4-EPSPS, tak więc po trawieniu można oczekiwać dwóch fragmentów hybrydyzujących z sondą CP4-EPSPS. Jeden oczekiwany fragment odpowiada fragmentowi wewnętrznemu o wielkości 1,2 kpz. Drugi fragment powinien być fragmentem końcowym. Ponownie, gdyby istniała więcej niż jedna kopia powinny być wykrywane dodatkowe fragmenty. Wyniki pokazały jednak, że PstI tnie DNA w sposób oczekiwany.

Wykryto wewnętrzny fragment 1,2 kpz i tylko jeden dodatkowy fragment o wielkości około 4,9 kpz (FIG. 5: linia 3, FIG. 4).

Jako dodatkową wewnętrzną grupę kontrolną DNA trawiono CIaI (FIG. 5: linia 6, FIG. 4). Jak oczekiwano hybrydyzował pojedynczy fragment o wielkości 2,4 kpz, ponieważ CIaI trawi dwa razy, ale w miejscach położonych poza lewym i prawym ramieniem używanego fragmentu CP4-EPSPS. Wynik ten jest także dowodem na nienaruszenie zintegrowanego fragmentu DNA i jest zgodny z otrzymanymi wynikami.

Hybrydyzacja plazmidu PV-BVGT08 z fragmentem CP4-EPSPS powoduje powstanie sygnału na wysokości 8,6 kpz (linia 1) tak jak oczekiwano (PV-BVGT08=8590 pz). Drugi mniejszy, bardzo słaby prążek wynika z niecałkowitego strawienia PV=BVGT08.

Podsumowując, doświadczenia wykazały, że transformowany burak cukrowy linii H7-1 zawiera pojedynczą zintegrowaną kopię T-DNA z PV-BVGT08 w genomie rośliny.

PL 214 713 B1

III Nienaruszenie regionu kodującego

Integralność kasety genu CP4-EPSPS, w odniesieniu do indywidualnych elementów (promotor P-FMV, region kodujący ctp2-CP4-EPSPS oraz region nie ulegający translacji E9-3'), wyznaczano poprzez trawienie enzymami HindIII dla P-FMV, HindIII i BamHI dla ctp2-CP4- EPSPS oraz EcoRI i PstI dla regionu nie ulegającego translacji E9 3'. Dodatkowe doświadczenia przeprowadzono z enzymami SacI i XhoI dla regionu P-FMV-ctp2-CP4 EPSPS i dla regionu E9 3'. DNA plazmidowe mieszano z DNA z nietransgenicznego buraka cukrowego oraz samo DNA z nietransgenicznego buraka cukrowego trawiono tymi samymi enzymami, jak odpowiednie pozytywne i negatywne grupy kontrolne.

Enzymy te trawią wewnątrz wstawki DNA, pomiędzy lewą i prawą granicą T-DNA (zob. mapę plazmidu na FIG. 1) w ten sposób, że jeśli odpowiednie elementy są nienaruszone, rozmiar fragmentów hybrydyzujących powinien być identyczny w DNA H7-1 i DNA PV-BVGT08. Jako dodatkową grupę kontrolną DNA trawiono XbaI. XbaI trawi w jednym miejscu pomiędzy promotorem i regionem kodującym ctp2-CP4-EPSPS. Dlatego można oczekiwać fragmentu o wielkości 8,6 kpz w przypadku DNA plazmidu PV-BVGT08 oraz w przypadku H7-1 fragmentu zawierającego DNA graniczne, który różni się rozmiarem w porównaniu do fragmentu PV- BVGT08. Wyniki pokazano na FIG. 6, 7 oraz 8.

FIG. 6: Trawienie HindIII i BamHI spowodowało powstanie fragmentu z genem CP4- EPSPS i membrana była hybrydyzowana z fragmentem CP4-EPSPS wytworzonym w reakcji PCR. W negatywnej grupie kontrolnej (linia 6) nie wykryto żadnego prążka hybrydyzacyjnego. Zarówno genomowe DNA ze zdarzenia H7-1 jak i plazmid PV-BVGT08 zmieszany z nietransgenicznym DNA wykazały fragment w przybliżeniu 1,7 kpz, odpowiadający oczekiwanemu rozmiarowi. Trawienie XbaI powodowało powstanie oczekiwanego fragmentu 8,6 kpz liniowego PV-BVGT08. W przypadku zdarzenia H7-1 trawienie powodowało powstanie fragmentu granicznego o wielkości w przybliżeniu 4,0 kpz (zob. także FIG. 4 oraz 5). Ponownie w negatywnej grupie kontrolnej nie obserwowano żadnego sygnału.

FIG. 7: Trawienie HindIII spowodowało powstanie fragmentu z promotorem wirusa mozaiki Figworta i membrana była hybrydyzowana z fragmentem promotora wytworzonym w reakcji PCR. W kontroli negatywnej (linia 5) nie wykryto żadnego sygnału hybrydyzacyjnego. Zarówno genomowe DNA ze zdarzenia H7-1 jak i plazmid PV-BVGT08 zmieszany z nietransgenicznym DNA wykazały fragment hybrydyzacyjny w przybliżeniu 0,6 kpz. Fragment ten odpowiada oczekiwanemu rozmiarowi promotora (linia 4 oraz 6).

Trawienie XbaI powodowało powstanie oczekiwanego fragmentu 8,6 kpz liniowego PV- BVGT08 oraz w przybliżeniu 1,3 kpz lewego fragmentu granicznego ze zdarzenia H7-1 (linia 1 oraz 3). Fragment 1,3 kpz jest także dodatkowym dowodem na to, że zdarzenie H7-1 zawiera jedynie pojedynczą kopię transgenu. Ponownie w kontroli negatywnej nie wykryto żadnego sygnału (linia 2).

Trawienie Sacl/Xhol powodowało powstanie fragmentu promotora razem z regionem kodującym CP4-EPSPS i regionem poliadenylacji. Hybrydyzacja z całkowitą kasetą promotor-ctp2-CP4-EPSPSsygnał poliadenylacji (fragment Pmel/Xhol) pokazała oczekiwane fragmenty 2,3 kpz promotor-ctp2CP4-EPSPS oraz 0,7 kpz sygnał poliadenylacji zarówno w przypadku DNA PV-BVGT08 zmieszanego z nietransgenicznym DNA jak i w przypadku genomowego DNA H7-1 (linia 9 oraz 11).

FIG. 8: Trawienie PstI i EcoRI powodowało powstanie fragmentu z sygnałem poliadenylacji E9 3' i membrana była hybrydyzowana z fragmentem sygnału poliadenylacji. W negatywnej grupie kontrolnej (linia 3) nie wykryto żadnego prążka hybrydyzacyjnego.

Zarówno DNA plazmidu PV-BVGT08 zmieszane z nietransgenicznym DNA jak i genomowe DNA ze zdarzenia H7-1 wykazały fragment w przybliżeniu 0,6 kpz, odpowiadający oczekiwanemu rozmiarowi. Trawienie XbaI powodowało powstanie oczekiwanego fragmentu 8,6 kpz liniowego PV-BVGT08 i w przypadku zdarzenia H7-1 fragmentu granicznego o wielkości w przybliżeniu 4,0 kpz.

Trawienie PstI powodowało powstanie fragmentu z sygnałem poliadenylacji E9 3' połączonego z 0,5 kpz części 3' regionu kodującego CP4-EPSPS. Powstały fragment 1,2 kpz wykrywano, jak oczekiwano, zarówno w genomowym DNA H7-1 jak i w DNA PV-BVGT08. Trawienie HindIII powodowało powstanie fragmentu 8,0 kpz liniowego PV-BVGT08 bez fragmentu promotora (linia 13) oraz fragment graniczny 5,2 kpz (linia 11) w H7-1. Pojedynczy fragment 5,2 kpz po trawieniu HindIII oraz pojedynczy fragment 4,0 kpz po trawieniu XbaI są także dodatkowym dowodem na to, że zdarzenie H7-1 zawiera tylko jedną kopię wstawionego DNA. Ponownie w negatywnej grupie kontrolnej nie obserwowano żadnego sygnału.

PL 214 713 B1

Podsumowując, wyniki powyższych hybrydyzacji dowodzą, że wszystkie elementy transferowanego DNA są nienaruszone oraz że zdarzenie H7-1 zawiera pojedynczy nienaruszony region kodujący CTP2-CP4-EPSPS wraz z jego elementami regulatorowymi, promotorem pFMV i sekwencją terminacji transkrypcji E9 3'.

IV Analiza w celu wykrycia fragmentów szkieletowych

Region szkieletowy plazmidu Ti definiuje się jako region poza T-DNA zawartym pomiędzy lewą i prawą sekwencję graniczną, który zawiera sekwencje ori i geny selekcyjne do replikacji bakteryjnej i selekcji bakterii i który normalnie nie jest transferowany do genomu rośliny podczas transformacji przy pomocy Agrobacterium. W celu potwierdzenia braku szkieletowego DNA wektora w zdarzeniu H7-1, genomowe DNA z H7-1 w nietransformowanej grupie kontrolnej oraz genomowe DNA z H7-1 zmieszane z DNA PV-BVGT08 trawiono enzymem restrykcyjnym i hybrydyzowano trzema nakładającymi się sondami wytworzonymi przy pomocy PCR, pokrywającymi całą sekwencję szkieletową. Czwarta sonda obejmowała cały szkielet w jednym fragmencie.

Użyte sondy odpowiadają sekwencji szkieletu (zob. FIG. 9):

1: pz 2730-5370

2: pz 5278-6419

3: pz 6302-7851

4: pz 2730-7851

Na FIG. 10 pokazano wyniki analizy „Southern blot. Linie 6, 10, 14 oraz 18: trawione DNA genomowego H7-1 hybrydyzowane z fragmentami szkieletu nie wykazały żadnego prążka hybrydyzującego. Jedynie w liniach 4, 8, 12, 16 oraz 20: genomowe DNA H7-1 zmieszane z DNA PV-BVGT08 wykazano prążki na wysokości 8,6 kpz, jak oczekiwano. Prążki odpowiadają liniowemu DNA PV-BVGT08.

Linie 2 oraz 4: genomowe DNA z H7-1 oraz genomowe DNA zmieszane z PV-BVGT08, hybrydyzowane z fragmentem CP4-EPSPS pokazało sygnał hybrydyzacyjny. Prążek 4 kpz w linii 2 odpowiada prawemu fragmentowi granicznemu, a dwa prążki w linii 4 odpowiadają ponownie 4,0 kpz prawemu fragmentowi granicznemu oraz 8,6 kpz liniowemu plazmidowi PV-BVGT08. Oba prążki posiadały taką samą intensywność. Jest to jasna wskazówka, że stężenie dodawanego DNA PV-BVGT08 jest porównywalne ze stężeniem elementu CP4-EPSPS w DNA H7-1. Stężenie użytego plazmidowego DNA stanowi równoważnik 0,5 kopii. Jeśli sekwencje szkieletowe byłyby zintegrowane w genomie H7-1 powinien zostać wykryty wyraźny sygnał. Wyniki te dowodzą, że H7-1 nie zawiera żadnej wykrywalnej sekwencji szkieletowej plazmidu użytego do transformacji. Wynik ten wspiera także dane analizy genomowych regionów otaczających 5' i 3' (zob. poniżej).

V Identyfikacja genomowych sekwencji otaczających 5' i 3'

Transformacja przy pomocy Agrobacterium prowadzi normalnie do integracji wszystkich sekwencji pomiędzy lewym i prawym regionem granicznym do genomu rośliny. Końce 5' i 3' zintegrowanego plazmidowego DNA powinny być wewnątrz lub blisko odpowiednio lewej lub prawej sekwencji granicznej. Dlatego też technika odwrotnego PCR została zastosowana do zidentyfikowania tych regionów. Sklonowane produkty PCR zostały zsekwencjonowane, a dane sekwencyjne zostały porównane z sekwencją PV-BVGT08.

Na FIG. 11 pokazano porównanie sekwencji sklonowanego fragmentu z odwrotnego PCR (D1U.RPT) (=genom H7-1, sekwencja wyżej), otrzymanego przy użyciu starterów do analizy lewego regionu granicznego w stosunku do sekwencji PV-BVGT08 (sekwencja niżej).

Porównanie obu sekwencji wykazało, że homologia kończy się dokładnie z sekwencją graniczną.

Na FIG. 12 pokazano porównanie sekwencji sklonowanego fragmentu z odwrotnego PCR (B3UNI.RPT) (=genom H7-1, sekwencja wyżej), otrzymanego przy użyciu starterów do analizy prawego regionu granicznego w stosunku do sekwencji PV-BVGT08 (sekwencja niżej). Porównanie obu sekwencji wykazało, że homologia kończy się już po 18 nukleotydach z przodu sekwencji granicznej.

Powyższe dane są jasną wskazówką, że sekwencja pomiędzy lewym i prawym regionem granicznym plazmidu Ti PV-BVGT08 jest zintegrowana poprawnie. Sekwencja zatrzymuje się wraz lub niedaleko z przodu sekwencji granicznej. Dane te wspierają wyniki otrzymane z analizy sekwencji szkieletowej pokazujące, że żadne sekwencje szkieletowe leżące poza regionami granicznymi nie są zintegrowane do genomu H7-1.

PL 214 713 B1

W celu określenia czy sekwencje otaczające z prawej lub lewej strony wstawki zdarzenia H7-1 buraka cukrowego są nienaruszonymi sekwencjami genomowymi rośliny przeprowadzono analizę za pomocą odwrotnego PCR z użyciem kombinacji starterów P1, P2, P3 oraz P4.

Startery z kombinacji starterów P1 oraz P2 są położone poza wstawką. Jeśli DNA w miejscu integracji w zdarzeniu H7-1 jest identyczne z DNA nietransformowanej grupy kontrolnej, to wynikiem reakcji PCR powinny być dwa fragmenty PCR odpowiadające syntezie z dwóch kombinacji starterów. Startery z kombinacji starterów P3 oraz P4 są zaprojektowane w ten sposób, że jeden ze starterów jest położony wewnątrz wstawki CP4-EPSPS, a drugi starter jest położony poza wstawką w genomowym DNA rośliny. W ten sposób w reakcji PCR powinny powstać fragmenty pochodzące jedynie z DNA zdarzenia H7-1.

Sekwencja pochodząca z techniki odwrotnego PCR połączona z sekwencją wektora PV-25 BVGT08 tworzy sekwencję, która obejmuje wstawkę H7-1 (sekwencja PV-BVGT08), lewy i prawy region łączący oraz dodatkowe genomowe DNA buraka cukrowego (Sekw. Nr 5).

W celu identyfikacji genomowych połączeń DNA transgen-roślina (identyfikacja specyficzności zdarzenia) oraz genomowych regionów DNA położonych z lewej i prawej strony wstawki użyto następujących kombinacji starterów:

Kombinacja P1 (startery do analizy genomowego DNA poza prawym regionem granicznym):

Starter wyższy: 5' CGG TAA ATG CAT TGG CCT TTG TT

Starter niższy: 5' CAC CCA GAT CCC AAT AAA ACC GTA AT

Spodziewany produkt PCR 241 pz.

Kombinacja P2 (startery do analizy genomowego DNA poza lewym regionem granicznym):

Starter wyższy: 5' AAA TGG TTG TAG ATA AAT AAG GAA ATC A

Starter niższy: 5' ACA TGT TTG AGC ACT CTT CTT GT

Spodziewany produkt PCR 377 pz.

Kombinacja P3 (startery do analizy połączenia genomowego DNA transgen-roślina, Sekw. Nr 7, Sekw. Nr 8):

Starter wyższy: 5' ATG CAT TGG CTT TTG TTT TTG AT

Starter niższy: 5' TGT CGT TTC CCG CCT TCA G

Spodziewany produkt PCR 288 pz (Sekw. Nr 11).

Kombinacja P4 (startery do analizy połączenia genomowego DNA transgen-roślina, Sekw. Nr 9, Sekw. Nr 10):

Starter wyższy: 5' CGC TGC GGA CAT CTA CAT TTT TGA AT

Starter niższy: 5' AGT TAA CTT TCC ACT TAT CGG GGC ACT G

Spodziewany produkt PCR 751 pz (Sekw. Nr 12).

W doświadczeniach PCR z DNA zdarzenia H7-1 oraz z DNA nietransgenicznej rośliny kontrolnej przy użyciu kombinacji starterów P3, w której jeden starter jest położony wewnątrz wstawki H7-1, otrzymano fragment jedynie w DNA ze zdarzenia H7-1. Przeciwnie do tego, w doświadczeniach PCR przy użyciu kombinacji starterów P1, homologicznych do sekwencji położonych poza wstawką, otrzymano fragmenty zarówno z DNA zdarzenia H7-1 jak i nietransgenicznej grupy kontrolnej. Wyniki te przedstawiono na FIG. 13.

Wyniki wskazują, że sekwencja położona obok prawego połączenia wstawki jest obecna w DNA transgenicznego zdarzenia H7-1 oraz w DNA z roślin nietransgenicznych. Można wyciągnąć wniosek, że to DNA położone na zewnątrz wstawki zdarzenia H7-1 jest nietransgenicznym DNA genomowym.

W doświadczeniach PCR z DNA zdarzenia H7-1 oraz z DNA nietransgenicznej rośliny kontrolnej przy użyciu kombinacji starterów P4, w której jeden starter jest położony wewnątrz wstawki CP4EPSPS, otrzymano fragment jedynie w DNA ze zdarzenia H7-1. Przeciwnie do tego, w doświadczeniach PCR przy użyciu kombinacji starterów P2, homologicznych do sekwencji położonych poza wstawką, otrzymano fragmenty zarówno z DNA zdarzenia H7-1 oraz nietransgenicznej grupy kontrolnej. Wyniki te przedstawiono na FIG. 14.

Wyniki wskazują, że sekwencja położona obok lewego połączenia wstawki jest obecna w DNA transgenicznego zdarzenia H7-1 oraz w DNA z roślin nietransgenicznych. Można wyciągnąć wniosek, że to DNA położone na zewnątrz lewego połączenia jest nietransgenicznym DNA genomowym.

PL 214 713 B1

Podsumowując można stwierdzić, że sekwencje położone na zewnątrz wstawki zdarzenia H7-1 buraka cukrowego są identyczne z sekwencjami obecnymi w roślinach nietransgenicznych. Można wyciągnąć wniosek, że sekwencje te są genomowymi sekwencjami rośliny obecnymi w macierzystej linii użytej do transformacji oraz w innych konwencjonalnych liniach buraka cukrowego.

VI Stabilność przez pokolenia

W celu pokazania stabilności zintegrowanego DNA porównano oryginalnie transformowane zdarzenie H7-1 z trzema roślinami potomnymi (64801H, 74922H oraz 83002S; zobacz FIG. 15 tej linii, powstałymi poprzez samozapylenie z nietransgenicznym! liniami buraka cukrowego. Oryginalnie transformowana linia oraz linie potomne były otrzymane w 1995, 1996, 1997 oraz 1998. Cztery różne nietransgeniczne linie buraka cukrowego analizowano jako grupy kontrolne (3S0057, 5R7150, 8K1180, 6S0085). Wszystkie DNA trawiono XbaI, HindIII i BamHI oraz hybrydyzowano ze znakowanym fragmentem CP4- EPSPS. W celu pokazania, że T-DNA jest stabilnie zintegrowane do genomu rośliny wszystkie potomne linie H7-1 trawione tymi samymi enzymami restrykcyjnymi powinny wykazać prążek o dokładnie takim samym rozmiarze.

W DNA potomstwa H7-1 (linie 3 do 6) obserwowano obecność oczekiwanych fragmentów: DNA trawione BamHI powodowało powstanie prążków w przybliżeniu 11 kpz, trawione XbaI powodowało powstanie fragmentów 4,0 kpz oraz trawienie HindIII powodowało powstanie prążków 5,2 kpz. Wielkość wszystkich prążków z tego samego trawienia, ale z różnych lat była identyczna. We wszystkich liniach nietransgenicznych nie obserwowano żadnego sygnału (FIG. 16).

Wyniki te pokazują, że wprowadzona sekwencja jest stabilnie zintegrowana z genomowym DNA oraz stabilnie dziedziczona.

Protokół sekwencji - wolny tekst

Sekw. Nr 5 <223> : wstawione DNA z sekwencjami otaczającymi 3' i 5'

Sekw. Nr 6 <223> Produkt PCR

Sekw. Nr 11 <223> Produkt PCR

Sekw. Nr 12 <223> Produkt PCR

Sekw. Nr 13 <223> Produkt PCR

Sekw. Nr 17 <223> Produkt PCR

PL 214 713 B1

Lista sekwencji <110> KWS SAAT AG < 12 o > Burak cukrowy odporny na glifosat <130> PCT 0079 <150> EP 03003366.5 <151; .3003-02-20 <350; US 1.0/376763 <151> 2003 02-28 <160; 21 < 17 o > w ersj a Patentln 3.1 <210> i <211> 30 <212> DNA <213^> _sztuczna sekwencja <22Q>

<223 > starter <400> 1 ttaafcttttg caggcgatgg tggctgttat <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223 > starter

PL 214 713 B1 <400> 2 catacgcatt agtgagtggg ctgtcaggac 30 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213 > sztuczna sekwencja <220>

<223 > starter <400> 3 atgttatctt taccacagtt 20 <210> 4 <211> 24 *212 > DNA.

<213> sztuczna sekwencja <220>

<22 3 > starter <400> 4 gtccctaaat gaaatacgta aaac ²⁴ <210> 5 <211> 3'778 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> wstawione DNA z sekwencjami otaczającymi 3’ i 5’ <400> 5 ctcgagcggc cgccagtgtg atggatatct gcagaattcg ccctfcatgtt atctttacca 60 cagtttgttg ctctgacaca accggtaaat gcattggcct ttgtttttga tggcatcaac 120 tttggagcat ctgattttgc atattcagcc ttttccatgg taattctttt acaagaattt 180 tcafctctttc ttaagtataa acacttagct tgggacaaac ttctgatcct atttcttaat 240

PL 214 713 B1

ttfctgcaggt	gatggtggct	gttatgagca	ttttgtgttt	gatgtttctt	tcttctcatt	300
acggttttat	tgggatctgg	gtggctctaa	ctatttacat	gagcctccgc	gcgtttgctg	360
aaggcgggaa	acgacaatct	gatccccatc	aagcttgagc	tcaggattta	gcagcattcc	420
agattgggtt	caatcaacaa	ggtacgagcc	atatcacttt	attcaaattg	gtatcgccaa	480
aaccaagaag	gaactcccat	cctcaaaggt	ttgtaaggaa	gaattctcag	tccaaagcct	540
caacaaggtc	agggtacaga	gtctccaaac	cattagccaa	aagctacagg	agatcaatga	600
agaatcfctca	atcaaagtaa	actactgttc	cagcacatgc	atcatggtca	gtaagtttca	660
gaaaaagaca	tccaccgaag	acttaaagtt	agtgggcatc	tttgaaagta	atcttgtcaa	720
catcgagcag	ctggcttgtg	gggaccagac	aaaaaaggaa	tggtgcagaa	ttgttaggcg	780
cacctaccaa	aagcatcttt	gcctttattg	caaagataaa	gcagattcct	ctagtacaag	840
tggggaacaa	aataacgtgg	aaaagagctg	tcctgacagc	ccactcacta	atgcgtatga	.900
cgaacgcagt	gacgaccaca	aaagaattcc	ctctatataa	gaaggcattc	attcccattt	960
gaaggatcat	cagafcactca	accaatcctt	ctagaagatc	fcaagcttatc	gataagcttg	1020
atgtaattgg	aggaagatca	aaattttcaa	tccccattct	tcgattgctt	caattgaagt	1080
ttctccgatg	gcgcaagtta	gcagaatctg	caatggtgtg	cagaacccat	ctcttatctc	1140
caatctctcg	aaatccagtc	aacgcaaatc	tcccttatcg	gtttctctga	agacgcagca	1200
gcatccacga	gcttatccga	tttcgtcgtc	gtggggattg	aagaagagtg	ggatgacgtt	1260
aafctggctct	gagcttcgtc	ctcttaaggt	catgtcttcfc	gtttccacgg	cgtgcatgct	1320
tcacggtgca	agcagccgtc	cagcaactgc	tcgtaagtcc	tctggtcttt	ctggaaccgt	1380
ccgtattcca	ggtgacaagt	ctatctccca	caggtccttc	atgtttggag	gtctcgctag	1440
cggtgaaacc	cgtatcaccg	gtcttttgga	aggtgaagat	gttatcaaca	ctggtaaggc	1500
tatgcaagct	atgggtgcca	gaatccgtaa	ggaaggtgat	acttggatca	ttgatggtgt	1560
tggtaacggt	ggactccttg	ctcctgaggc	tcctctcgat	tfccggtaacg	ctgcaactgg	162 0
ttgccgtttg	actatgggtc	ttgttggtgt	ttacgatttc	gatagcactt	tcattggtga	1680
cgcttctctc	actaagcgtc	caatgggtcg	tgfcgttgaac	ccacttcgcg	aaatgggtgt	174 0
gcaggtgaag	tctgaagacg	gtgatcgtct	tccagttacc	ttgcgtggac	caaagactcc	1800
aacgccaatc	acctacaggg	tacctatggc	ttccgctcaa	gtgaagtccg	ctgfcfcctgct	1860
tgctggtctc	aacaccccag	gtatcaccac	tgttatcgag	ccaatcatga	ctcgtgacca	192-0
cactgaaaag	atgcttcaag	gttttggtgc	taaocttacc	gttgagactg	atgctgacgg	1980

PL 214 713 B1

tgtgcgtacc	atccgtcttg	aaggtcgtgg taagctcacc	ggtcaagtga	ttgatgttcc	2040
aggtgatcca	tccfcctactg	ctttcccafct ggttgctgcc	ttgcttgttc	. caggttccga	2100
cgtcaccatc	cttaacgttt	tgatgaaccc aacccgtact	ggtctcatct	tgactctgca	2160
ggaaatgggt	gccgacatcg	aagtgatcaa cccacgtctt	gctggtggag	aagacgtggc	2220
tgacttgcgt	gttcgttctt	ctactttgaa gggtgttact	gttccagaag	accgtgctcc	2280
ttctatgatc	gacgagtatc	caattctcgc tgttgcagct	gcattcgctg	aaggtgctąc	2340
cgttatgaac	ggtttggaag	aactccgtgt. taaggaaagc	gaccgtcttt	ctgctgtcgc	2400
aaacggtctc	aagctcaacg	gtgttgattg cgatgaaggt	gagacttctc	tcgtcgtgcg	2460
tggtcgtcct	gacggtaagg	gtctcggtaa cgcttctgga	gcagctgtcg	ctacccacct	2520
cgatcaccgfc	atcgctatga	gcttccbcgt tatgggtctc	gtttctgaaa	accctgttac	2380
tgttgatgat	gctactatga	t.cgctactag ettcccagag	ttcatggatt	tgatggctgg	2640
tcttggagct	aagatcgaac	tctccgacac fcaaggctgct	tgatgagctc	aagaattcga	2700
gctcggtacc	ggatcctcta	gctagagctfc tcgttcgtat	catcggtttc	gacaacgttc	2760
gtcaagttca	atgcatcagt	ttcattgcgc acacaccaga	atcctactga	gtttgagtat	2820
tatggcattg	ggaaaactgt	ttttcttgta ccatttgttg	tgcttgtaat	ttactgtgtt	2880
ttttattcgg	ttttcgctat	cgaactgtga aatggaaatg	gatggagaag	agttaatgaa	2940
Łgatatggtc	cttttgttca	ttcfccaaatt aatattattt	gttttttctc	ttatttgttg	3000
tgtgttgaat	ttgaaattat	aagagatatg caaacatttt	gttttgagta	aaaatgtgtc	3060
aaatcgtggc	ctctaatgac	cgaagttaat atgaggagta	aaacacttgt	agttgtacca	3120
ttatgcttat	tcactaggca	acaaatafcat tttcagacct	agaaaagctg	caaatgttac	3180
tgaatacaag	tatgtcctct	tgtgttttag acatttatga	actttccttt	atgtaatttt	3240
ccagaatcct	tgtcagattc	taatcattgc tttataatta	tagttatact	catggatttg	3300
tagttgagta	tgaaaatatt	ttttaatgca ttttatgact	tgccaattga	ttgacaacat	3360
gcatcaatcg	acctgcagcc	actcgaagcg gccgccactc	gagtggtggc	cgcatcgatc	3420
gtgaagtttc	tcatctaagc	ccccatttgg acgtgaatgt	agacacgtcg	aaataaagat	3480
ttccgaatta	gaataatttg	tttattgctt tcgcctataa	atacgacgga	tcgtaatttg	3540
tcgtfcttatc	aaaatgtact	ttcattttat aataacgctg	cggacatcta	catttttgaa	3600
ttgaaaaaaa	ttggtaatta	ctctttcttt ttctccatat	tgaccatcat	actcattgct	3660
gatccatgta	gattfccccgg	acatgaagcc atttacaatt	gaatatatcc	taagtaaaac	3720

PL 214 713 B1 ctcataggtt ttacgtattt catttaggga caagggcgaa ttccagcaca ctggcggc 3778

<210>	6
<211>	3706
<212>	DNA
<213>	sztuczna sekwencja
<220>
<223>	produkt PCR
<400>	6

atgttatctt	taccacagtt	tgttgctctg	acacaaccgg	taaatgcatt	ggcctttgfct	60
tttgatggca	tcaactttgg	agcatctgat	tttgcatatt	cagcctfcttc	catggtaatt	12 0
ettttacaag	aattttcatfc	ctttcttaag	tataaacact	tagcttggga	caaacttctg	180
atcctatttc	ttaatttttg	caggtgatgg	tggctgttat	gagcattttg	tgtttgat.gt	240
ttctttcttc	tcattacggt	tttattggga	tctgggtggc	tctaactatt	tacatgagcc	300
tccgcgcgtt	tgctgaagge	gggaaacgac	aatctgatcc	ccatcaagct	tgagctcagg	360
atttagcagc	afctccagatt	gggttcaato	aacaaggtac	gagccatatc	actttattca	420
aattggtatc	gccaaaacca	agaaggaact	cccatcctca	aaggtttgta	aggaagaatt	480
ctcagtccaa	agcctcaaca	aggtcagggt	acagagtctc	caaaccatta	gccaaaagct	540
acaggagatc	aatgaagaat	cttcaatcaa	agtaaactac	tgttccagca	catgcatcat	600
ggtcagtaag	tttcagaaaa	agacatccac	cgaagactta	aagttagtgg	gcatctttga	660
aagtaatctt	gtcaacatcg	agcagctggc	ttgtggggac	cagacaaaaa	aggaatggtg	720
cagaattgtt	aggcgcacct	accaaaagca	tctttgcctt	tattgcaaag	ataaagcaga	780
ttcctctagt	acaagtgggg	aacaaaataa	cgtggaaaag agctgtcctg	acagcccact	840
cactaatgcg	tatgacgaac	gcagtgacga	ccacaaaaga	attccctCta	tataagaagg	900
cattcattcc	catttgaagg	atcatcagat	actcaaccaa	fccctfcctaga	agatctaagc	960
ttatcgataa	gcttgatgta	attggaggaa	gatcaaaatt	ttcaatcccc	attcttcgat	1020
tgcttcaafct	gaagtttctc	egatggcgca	agttagcaga	atctgcaatg	gtgtgcagaa	1080
cccatctctt	atctccaatc	tctcgaaato	cagtcaacgc	aaatctccct	tatcggtttc	1140
Łctgaagacg	cagcagcatc	cacgagctta	tccgatttcg	tcgtcgtggg	gafctgaagaa	1200
gagtgggatg	acgttaattg	gctctgagct	tcgtcctctt	aaggtcatgt	cttctgtttc	1260

PL 214 713 B1

cacggcgtgc atgcttcacg	gtgcaagcąg	ccgtccagca	actgctcgta	agtcctctgg	1320
tctttctgga accgtccgta	ttccaggtga	caagtctatc	tcccacaggt	ccttcatgtt	1380
tggaggtctc	gctagcggtg	aa&cccgtat	caccggtctt	ttggaaggtg	aagatgttat	1440
caacactggt	aaggctafcgc	aagctatggg	tgccagaatc	cgtaaggaag	gtgatacttg	1500
gatcattgat	ggtgttggta	acggtggact	ccttgctcct	gaggctcctc	tcgatttcgg	1560
taacgctgca	actggttgcc	gtttgactat	gggtcttgtt	ggtgtttacg	atttcgatag	1620
cactttcatt	ggtgacgctt	ctctcactaa	gcgtccaatg	ggtcgtgtgt	tgaacccact	16Θ0
tcgcgaaatg	ggtgtgcagg	tgaagtctga	agacggtgat	cgtcttccag	ttaccttgcg	1740
tggaccaaag	actccaacgc	caatcaccta	cagggtacct	atggcttccg	ctcaagtgaa	1800
gtccgctgtt	ctgctt.gctg	gtctcaacac	cccaggtatc	accactgtta	tcgagccaat	1860
catgactcgt	gaccacactg	aaaagatgct	tcaaggtttt	ggtgctąacc	fctaccgttga	1920
gactgatgct	gacggtgtgc	gtaccatccg	tcttgaaggt	egtggtaagc	fccaccggtca	1980
agtgattgat	gttccaggtg	atccatccfcc	tacfcgctttc	ccattggttg	ctgccttgct	2040
tgt. tccaggt	tccgacgtca	ccatcctfcaa	cgtt.ttgatg	aacccaaccc	gtactggtct	2100
catcttgact	ctgcaggaaa	tgggtgccga	catcgaagtg	atcaacccac	gtcttgctgg	2160
tggagaagac	gtggctgact	tgcgtgttcg	ttcttctact	ttgaagggtg	ttactgttcc	2220
agaagaccgt	gctccttcta	tgatcgacga	gtatccaatt	ctcgctgttg	cagctgcatt	2280
cgctgaaggt	gctaccgtta	fcgaacggttt	ggaagaactc	cgtgttaagg	aaagcgaccg	2340
tctttctgct	gtcgcaaacg	gtctcaagct	caacggtgtt	gattgcgatg	aaggtgagac	2400
ttctctcgtc	gtgcgtggtc	gtcctgacgg	taagggtctc	ggtaacgett	ctggagcagc	2460
tgtcgctacc	cacctcgatc	accgtatcgc	tatgagcttc	ctcgttatgg	gtctcgtttc	2520
tgaaaaccct	gttactgttg	atgatgctac	tatgatcgct	actagcttcc	cagagttcat	2580
ggatttgatg	gctggtcttg	gagctaagat	cgaactctcc	gacactaagg	ctgcttgatg	2640
agctcaagaa	ttcgagctcg	gtaccggatc	ctctagctag	agctttcgtt	cgtatcatcg	2700
gtttcgacaa	cgttcgtcaa	gttcaatgca	tcagtttcat	tgcgcacaca	ccagaatcct	2760
actgagtttg	agtattatgg	cafctgggaaa	actgtttttc	ttgtaccatt	tgttgtgctt	2820
gtaatttact	gtgtttttta	ttcggttttc	gctatcgaac	tgtgaaatgg	aaatggatgg	2880
agaagagtta	atgaatgata	tggtcctttt	gttcattctc	aaattaatat	tatttgtttt	29^0
ttctcttatt	tgttgtgtgt	tgaatttgaa	attataagag	atatgcaaac	attttgtttt	3000

PL 214 713 B1

gagtaaaaat	gtgtcaaatc	gtggcctcta	atgaccgaag	ttaatatgag	gagtaaaaca	3060
cttgtagttg	taccattatg	cttattcact	aggcaacaaa	tatattttca	gacctagaaa	3120
agctgcaaat	gttactgaat	acaagtatgt	cctcttgtgt	tttagacatt	tatgaacttt	3180
cctttatgta	attttccaga	atccttgfcca	gattctaatc	attgctttat	aafctatagtt	3240
atactcatgg	atttgtagtt	gagtatgaaa	atafcttttta	atgcatttta	tgacttgcca	3300
attgattgac	aacatgcatc	aatcgacctg	cagccactcg	aagcggccgc	cactcgagtg	3360
gtggccgcat	cgatcgtgaa	gtttctcatc	taagccccca	tfctggacgtg	aatgtagaca	3420
cgtcgaaata	aagatttccg	aattagaata	atttgtttat	tgctttcgcc	tataaatacg	3480
acggatcgta	atttgtcgtt	ttatcaaaat	gtactttcat	tttataataa	cgcfcgcggac	3S40
atctacattt	ttgaattgaa	aaaaattggt	aatt.actctt	tctttttctc	catattgacc	3600
atcatactca	ttgctgatcc	atgtagattt	cccggacatg	aagccattta	caattgaata	3660
tatcctaagt	aaaacctcat	aggttttacg	tatttcattt	agggac		3706

<210i 7 <211> 23 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> starter <400> 7 atgcattggc ctttgttttt gat <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213 > sztuczna sekwencj a <220>

<223 > starter <400> 8 tgtcgtttcc cgccttcag

PL 214 713 B1 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> starter <400> 9

cgctgcggac atctacattt ttgaat	26
<210> 10 <211> 28 <212> DNA <2i3> sztuczna sekwencja <220> <223> Starter <400> 10 agttaacttt ccacttatcg gggcacfcg <210> 11 <211> 288 <212> DNA <213 > sztuczna sekwencj a <220> <22 3 > produkt PCR	28
<400> 11
atgcattggc ctttgttttt gatggcatca actttggagc atctgatttt gcatattcag	60
ccttttccat ggtaattctt ttacaagaat tttcattctt tcttaagtat aaacacttag	120
cttgggacaa actfcctgatc ctatttctta atttttgcag gcgatggtgg ctgttatgag	180
cattttgtgt ttgatgtttc tctcttctca ttacggtttt attgggatct gggtggctct	240
aactatttac atgagcctcc gcgcgtttgc tgaaggcggg aaacgaca	288

PL 214 713 B1

<210>	12
<211>	751
<212>	DNA
<213>	sztuczna sekwencja
<220>
<223>	produkt PCR
<400>	12

cgctgcggac	atctacattt	ttgaattgaa	aaaaaattgg	taattactct	ttctttttct	60
ccatattgac	catcatactc	attgctgatc	catgtagatt	tcccggacat	gaagccattt	120
acaattgaat	atatcctaag	taaaacctca	taggttttac	gtatttcatt	ta99gactaa	ISO
aa.tggtttag	gataattact	ttagctaaca	taagataata	aataaataaa	taaataaaaa	240
taaaatggtt	gtagataaat	aaggaaatca	ataatgaata	tgagtgtgag	tgataggacg	300
ggaatgggaa	acttttacae	tactttaacg	ctattgaacg	agtatgagta	tgttataaac	360
gfcaaaatgtt	ttatgtgtta	gacaatggcc	tcaagtgaaa	gtgaccctat	taatggagga	420
aatgcaaacc	acgagtctga	ggtcacgctc	gaagaaatga	gggcaaggat	cgacgcattg	480
cgtagcgacc	ctgtttttgg	agatgccacg	ggagatgcta	gtgataaccg	aatggattta	540
atgaggttga	tgatgatgga	gcttttacaa	ggaaatcgac	aaaggcctag	aactgaacaa	600
gaagagtgct	caaacatgtt	caagaggttt	tcggctcata	agcccccaac	ttatgatgga	660
aagccagacc	ccactgagtt	tgaagaatgg	ctcaacggca	tggaaaaatt	gttcgatgcc	720
acccagtgcc	ccgataagtg	gaaagttaac	t			751

<210>	13
<211>	664
<212>	DNA
<213>	sztuczna sekwencja
<220>
<223>	produkt PCR
<400>	13

ttaatttttg caggcgatgg tggctgttat gagcattttg tgtttgatgt ttctctcttc 60 tcattacggt tttattggga tctgggtggc tctaactatt tacatgagcc tccgcgcgtt 120

PL 214 713 B1

tgctgaaggc	gggaaacgac	aatctgatcc	ccatcaagct	tgagctcagg	atttagcagc	180
attccagatt	gggttcaatc	aacaaggtac	gagccatatc	actttattca	aattggtatc	240
gccaaaacca	agaaggaact	cccatcctca	aaggtttgta	aggaagaatt	ctcagfcccaa	300
agcctcaaca	aggtcagggt	acagagtctc	caaaccatta	gccaaaagct	acaggagatc	360
aatgaagaat	cttcaatcaa	agtaaactac	tgttccagca	catgcatcat	ggtcagtaag	420
tttcagaaaa	agacatccac	cgaagactta	aagttagtgg	gcatctttga	aagtaatctt	480
gtcaacatcg	agcagctggc	ttgtggggac	cagacaaaaa	aggaatggtg	cagaattgtt	540
aggcgcacct	aecaaaagca	tctttgcctt	tattgcaaag	ataaagcaga	ttcctctagt	600
acaagtgggg	aacaaaataa	cgtggaaaag	agctgtcctg	acagcccacfc	cactaatgcg	660

tatg ¢¢4 <210> 14 <211> 30 <212> DNA ^{< 213 >} sztuczna sekwencj a <220>

<223 > starter <400> 14 gctctgacac aaccggtaaa tgcattggcc 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213 > sztuczna sekwencj a <220>

<22 3 > starter <400> 15 gacccatagt ttgattttaa gcacgacatg 30

<210>	16
<211>	29
<212>	DNA

PL 214 713 B1 <213 > sztuczna sekwencj a <220>

<223 > starter <400> 16 gcagattctg ctaacttgcg ccatcggag <210> 17 <211> 1042 <212> DNA <213 > sztuczna sekwencj a <220>

< 2 2 3 > produkt PCR <220>

< 2 21 > brak innych cech <22 3 > produkt PCR <400> 17

gctctgacac	aaccggtaaa	tgcattggcc	tttgtttttg	atggcatcaa	ctttggagca	60
tctgattttg	catattcagc	cttttccatg	gtaattcttt	tacaagaatt	ttcattcttt	120
cttaagtata	aacacttagc	ttgggacaaa	cttctgatcc	tatttcttaa	tttttgcagg	180
cgatggtggc	tgttatgagc	attttgtgtt	tgatgtttct	ctcttctcat	tacggtttta	240
ttgggatctg	ggtggctcta	actatttaca	tgageetceg	cgcgtttgct	gaaggcggga	300
aacgacaatc	tgatccccat	caagcttgag	ctcaggattt	agcagcattc	cagattgggt	360
tcaatcaaca	aggtacgagc	catatcactt	tattcaaatt	ggtatcgcca	aaaccaagaa	420
ggaactccca	tcctcaaagg	.tttgtaagga	agaattctca	gtccaaagcc	tcaacaaggt	480
cagggtacag	agtctccaaa	ccattagcca	aaagctacag	gagatcaatg	aagaatcttc	540
aatcaaagta	aactactgtt	ccagcacatg	catcatggtc	agtaagtttc	agaaaaagac	600
atccaccgaa	gacttaaagt	tagtgggcafc	ctttgaaagt	aatcttgtca	acatcgagca	660
gctggcttgt	ggggaccaga	caaaaaagga	atggtgcaga	attgttaggc	gcacctacca	720
aaagcatctt	tgcctttatt	gcaaagataa	agcagattcc	tctagtacaa	gtggggaaca	780

PL 214 713 B1 aaataacgtg gaaaagagct gtcctgacag cccactćact aatgcgtatg acgaacgcag 840 tgacgaccac aaaagaattc cctctatata agaaggcatt cattcccatt tgaaggatca 900 tcagatactg aaccaatcct tctagaagat ctaagcttat cgataagctt gatgtaattg 960 gaggaagatc aaaattttca atccccattc ttcgattgct tcaattgaag tfctctccgat 1020 ggcgcaagtt agcagaatct gc

1042 <210> 18 <211> 23 <212> DNA * ^{213 >} sztuczna sekwencj a <220>

<223> starter <400> 18 cgg( aaatgc attggccttt gtt 23 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213 > sztuczna sekwencj a <220>

<223> starter <400>

cacccagatc ccaataaaac cgtaat <210>

<211>

<212>

DNA sztuczna sekwencja <223>

starter <213>

<220>

PL 214 713 B1 <400> 20 aaatggttgt agataaataa ggaaatca 28 <210> 21 <211> 23 <212> DNA * ^{213 >} sztuczna s ekwencj a <220>

<22 3 > starter <400> 21 acatgtttga gcactcttct. tgt 23

Claims (6)

1. Burak cukrowy odporny na glifosat, znamienny tym, że:

a) fragment DNA z genomowego DNA buraka cukrowego, jego części lub nasion może być namnożony przy wykorzystaniu łańcuchowej reakcji polimerazy z pierwszym starterem posiadającym sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 3 oraz drugim starterem posiadającym sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 4, gdzie fragment DNA wykazuje przynajmniej 95% identyczności z sekwencją nukleotydową Sekw. Nr 6, i/lub;

b) fragment DNA z genomowego DNA buraka cukrowego, jego części lub nasion może być namnożony przy wykorzystaniu łańcuchowej reakcji polimerazy z pierwszym starterem posiadającym sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 9 oraz drugim starterem posiadającym sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 10, gdzie fragment DNA wykazuje przynajmniej 95% identyczności z sekwencją nukleotydową Sekw. Nr 12, i/lub;

c) fragment DNA z genomowego DNA buraka cukrowego, jego części lub nasion może być namnożony przy wykorzystaniu łańcuchowej reakcji polimerazy z pierwszym starterem posiadającym sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 14 oraz drugim starterem posiadającym sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 16, gdzie fragment DNA wykazuje przynajmniej 95% identyczności z sekwencją nukleotydową Sekw. Nr 17.

2. Nasiono buraka cukrowego określonego w zastrzeżeniu 1.

3. Komórka, tkanka lub część buraka cukrowego określonego w zastrzeżeniu 1.

4. Sposób identyfikacji buraka cukrowego odpornego na glifosat, znamienny tym, że obejmuje etap (etapy)

a) namnażania fragmentu DNA 3500-3900, korzystnie 3706 pz, z genomowego DNA wspomnianego buraka cukrowego, jego części lub nasion, przy wykorzystaniu łańcuchowej reakcji polimerazy z pierwszym starterem posiadającym sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 3 oraz drugim starterem posiadającym sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 4 i/lub;

b) namnażania fragmentu DNA 710-790 pz, korzystnie 751 pz, z genomowego DNA wspomnianego buraka cukrowego, jego części lub nasion, przy wykorzystaniu łańcuchowej reakcji polimerazy z pierwszym starterem posiadającym sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 9 oraz drugim starterem posiadającym sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 10 i/lub;

c) namnażania fragmentu DNA 990-1100 pz, korzystnie 1042 pz, z genomowego DNA wspomnianego buraka cukrowego, jego części lub nasion, przy wykorzystaniu łańcuchowej reakcji

PL 214 713 B1 polimerazy z pierwszym starterem posiadającym sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 14 oraz drugim starterem posiadającym sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 16.

5. Zestaw testowy do identyfikacji transgenicznego buraka cukrowego odpornego na glifosat, jego komórek, tkanek lub części, znamienny tym, że zawiera przynajmniej jedną parę starterów, gdzie pierwszy i drugi starter są przeznaczone do łańcuchowej reakcji polimerazy, w której pierwszy starter rozpoznaje sekwencję wewnątrz obcego DNA wbudowanego do genomu omawianego buraka cukrowego, a drugi starter rozpoznaje sekwencję regionów otaczających 3' lub 5' omawianego DNA, przy czym burak cukrowy jest burakiem cukrowym określonym w zastrz. 1.

6. Zestaw według zastrz. 5, znamienny tym, że:

a) pierwszy starter posiada sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 9, a drugi starter posiada sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 10 i/lub;

b) pierwszy starter posiada sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 14, a drugi starter posiada sekwencję nukleotydową Sekw. Nr 16.