BR112019014727A2

BR112019014727A2 - molécula de ácido nucleico, vector, célula, planta, semente, polipeptídeo, composição, métodos para o controle de uma população de pragas, para matar uma praga, para produzir um polipeptídeo, para proteger uma planta e para aumentar o rendimento em uma planta, uso do ácido nucleico e produto de base

Info

Publication number: BR112019014727A2
Application number: BR112019014727A
Authority: BR
Inventors: Debrecht Andrew; Vaknin Daniel; Lehtinen Duane; Dunn Ethan; Miller Gabriel; Doroghazi James; Giebel Jonathan; Pitcher Kathleen; Schouten Laura; Zheng Xunhai
Original assignee: BASF Agricultural Solutions Seed US LLC
Priority date: 2017-01-18
Filing date: 2018-01-18
Publication date: 2020-04-07
Also published as: CN110431234A; US20200123564A1; CN110431234B; WO2018136604A1; AR126609A2; US20220389444A1; AR110757A1; EP3571303A1; ZA201905339B; US11279946B2; UY37571A; CA3049775A1

Abstract

são proporcionadas composições e métodos para conferir atividade pesticida a bactérias, plantas, células vegetais, tecidos e sementes. são proporcionadas composições compreendendo uma sequência de codificação para um polipeptídeo de toxina. as sequências de codificação podem ser usadas em construtos de dna ou cassetes de expressão para transformação e expressão em plantas e bactérias. as composições também compreendem bactérias, plantas, células vegetais, tecidos e sementes transformados. em particular, são proporcionadas moléculas de ácido nucleico de toxina isolada. adicionalmente, estão englobadas sequências de aminoácidos correspondentes aos polinucleotídeos e anticorpos que se ligam especificamente a essas sequências de aminoácidos. em particular, a presente invenção proporciona moléculas de ácido nucleico isoladas compreendendo sequências nucleotídicas que codificam a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das seq id no: 1-40, 42, 43, 45-48, 50, 51, 52, 54, 56, 58-64, 66 ou 67, ou a sequência nucleotídica definida em qualquer uma das seq id no 69-106, bem como variantes e fragmentos das mesmas.

Description

“MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, VECTOR, CÉLULA, PLANTA, SEMENTE, POLIPEPTÍDEO, COMPOSIÇÃO, MÉTODOS PARA O CONTROLE DE UMA POPULAÇÃO DE PRAGAS, PARA MATAR UMA PRAGA, PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO, PARA PROTEGER UMA PLANTA E PARA AUMENTAR O RENDIMENTO EM UMA PLANTA, USO DO ÁCIDO NUCLEICO E PRODUTO DE BASE”

Referência Cruzada A Pedido Relacionado [0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos E.U.A. N^Q de série 62/447,592, depositado em 18 de janeiro de 2017, cujos conteúdos são incorporados na sua totalidade no presente documento para referência.

Referência À Listagem De Sequências Submetida Eletronicamente [0002] A cópia oficial da listagem de sequências é submetida eletronicamente via EFS-Web como uma listagem de sequências formatada ASCII com um ficheiro chamado APA176001 SEQLIST_ST25.txt, criado em 16 de janeiro de 2018, e tendo um tamanho de 100 kilobytes e é depositado simultaneamente com a especificação. A listagem de sequências contidas nesse documento ASCII formatado é parte da especificação e é incorporada na sua totalidade no presente documento por uma questão de referência.

Âmbito Da Invenção [0003] Esta invenção se destina ao campo da biologia molecular. São conferidos novos genes que codificam proteínas pesticidas. Estas proteínas e as sequências de ácidos nucleicos que codificam as mesmas são úteis na preparação de formulações pesticidas e na produção de plantas transgênicas resistentes às pragas.

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Antecedentes Da Invenção [0004] As pragas de insetos são uma das principais causas de danos nas culturas agrícolas mundiais comercialmente importantes. As atuais estratégias que pretendem reduzir as perdas de colheitas dependem principalmente de pesticidas químicos. O desenvolvimento e o cultivo de culturas transgênicas revolucionaram a agricultura em todo o mundo. Em 2014, o cultivo global de culturas protegidas contra insetos foi estimado em 78,8 M ha. A primeira geração de plantas transgênicas resistentes a insetos se baseia em proteínas inseticidas a partir de Bacillus thuringiensis (Bt). Uma segunda geração de plantas resistentes a insetos em desenvolvimento inclui tanto proteínas Bt como não Bt com novos modelos de ação e diferentes espectros de atividade contra pragas de insetos. Além disso, insetos perfurantes/sugadores, que geralmente são resistentes a proteínas Bt inseticidas, surgiram como pragas principais desde a introdução de culturas transgênicas expressando tais toxinas. As culturas expressando as proteínas Bt inseticidas fornecem excelente controle de importantes pragas de coleópteros e lepidópteros, mas não são eficazes no controle de pragas de hemípteros.

[0005] Devido à devastação que os insetos podem conferir, e à melhoria no rendimento no controle das pragas de insetos, existe uma necessidade contínua para encontrar novas formas de toxinas pesticidas.

Sumário Da Invenção [0006] São fornecidas composições e métodos para conferir atividade pesticida a bactérias, plantas, células vegetais, tecidos e sementes. As composições incluem moléculas de ácidos nucleicos codificando sequências de polipeptídeos de pesticidas e inseticidas, vetores compreendendo essas moléculas de ácido nucleico e células hospedeiras compreendendo os vetores. As composições também incluem as sequências de polipeptídeos pesticidas e os

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3/94 anticorpos para esses polipeptídeos. As sequências de nucleotídeos podem ser usadas em construtos de DNA ou em cassetes de expressão para a transformação e expressão em organismos, incluindo micro-organismos e plantas. As sequências de nucleotídeos ou de aminoácidos podem ser sequências sintéticas, que foram concebidas para expressão em um organismo, incluindo, mas não limitado a, um micro-organismo ou uma planta. As composições também compreendem bactérias, plantas, células vegetais, tecidos e sementes compreendendo a sequência de nucleotídeos da invenção.

[0007] Em particular, são conferidas moléculas de ácido nucleico isolado, recombinante e quimérico que codificam uma proteína pesticida. Adicionalmente, estão incluídas as sequências de aminoácidos correspondentes à proteína pesticida. Em particular, a presente invenção confere para uma molécula de ácido nucleico isolado, recombinante e quimérico compreendendo uma sequência nucleotídica codificando a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NO:1 -40, 42, 43, 45-48, 50, 51,52, 54, 56, 58-64, 66, ou 67 ou uma sequência nucleotídica descrita nas SEQ ID NO:69-106, bem como variantes e fragmentos biologicamente ativos das mesmas. As sequências nucleotídicas que são complementares a uma sequência nucleotídica da invenção ou que se hibridam com uma sequência da invenção ou com um complemento da mesma, também estão englobadas. Também são conferidos vetores, células hospedeiras, plantas e sementes compreendendo as sequências nucleotídicas da invenção, ou sequências nucleotídicas codificando as sequências de aminoácidos da invenção, bem como as variantes e fragmentos biologicamente ativos dos mesmos.

[0008] São conferidos métodos para a produção dos polipeptídeos da invenção, e para o uso desses polipeptídeos para o controle ou exterminação de

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4/94 uma praga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nematódeos, ou dípteros. Também estão incluídos os métodos e conjuntos para a detecção dos ácidos nucleicos e polipeptídeos da invenção em uma amostra.

[0009] As composições e métodos da invenção são úteis para a produção de organismos com uma melhorada resistência ou tolerância às pragas. Esses organismos e composições compreendendo os organismos são desejáveis para finalidades agrícolas. As composições da invenção também são úteis para geração de proteínas alteradas ou melhoradas que têm atividade pesticida, ou para a detecção da presença de proteínas pesticidas ou de ácidos nucleicos em produtos ou organismos.

Descrição Detalhada [0010] A presente invenção se destina a composições e métodos para regulação da resistência ou tolerância da praga em organismos, particularmente plantas ou células vegetais. Por resistência se entende que a praga (por exemplo, insetos) é exterminada depois da ingestão ou outro contato com os polipeptídeos da invenção. Por tolerância se entende uma diminuição ou redução no movimento, alimentação, reprodução, ou outras funções da praga. Os métodos envolvem a transformação de organismos com uma sequência nucleotídica codificando uma proteína pesticida da invenção. Em particular, as sequências nucleotídicas da invenção são úteis para a preparação de plantas e micro-organismos que possuam atividade pesticida. Desse modo, são conferidas bactérias, plantas, células vegetais, tecidos vegetais e sementes transformados. As composições são os ácidos nucleicos e proteínas pesticidas de Bacillus ou outras espécies. As sequências podem ser utilizadas na construção de vetores de expressão para a transformação subsequente em organismos de interesse, tais como sondas para o isolamento de outros genes

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5/94 homólogos (ou parcialmente homólogos), e para a geração de proteínas pesticidas alteradas por métodos conhecidos na técnica, tais como a troca de domínio ou mistura de DNA. As proteínas podem ser utilizadas no controle e exterminação das populações de pragas de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, dípteros, e nematódeos e para a produção de composições com atividade pesticida.

[0011] Por toxina pesticida, ou proteína pesticida se entende uma toxina que tem atividade tóxica contra uma ou mais pragas, incluindo, mas não se limitando a, membros das ordens Lepidoptera, Diptera, Hemiptera, e Coleoptera, ou do filo Nematoda, ou uma proteína que tem homologia com essa proteína. Têm sido isoladas proteínas pesticidas a partir de organismos incluindo, por exemplo, Bacillus sp., Clostridium bifermentans e Paenibacillus popilliae. As proteínas pesticidas incluem sequências de aminoácidos deduzidas a partir das sequências nucleotídicas de comprimento total descritas neste documento, e as sequências de aminoácidos que são mais curtas do que as sequências de comprimento total, tanto devido à utilização de um local de início alternativo a jusante, como ao processamento que produz uma proteína mais curta tendo atividade pesticida. O processamento pode ocorrer no organismo no qual a proteína é expressa, ou na praga após a ingestão da proteína.

[0012] Desse modo, neste documento são conferidas novas sequências nucleotídicas isoladas, recombinantes ou quiméricas que conferem atividade pesticida. Também são conferidas as sequências de aminoácidos das proteínas pesticidas. A proteína resultante da tradução deste gene permite que as células controlem ou exterminem as pragas que a ingerem.

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Moléculas De Ácido Nucleico Isoladas, E Variantes E Fragmentos Das Mesmas [0013] Um aspeto da invenção se refere a moléculas de ácido nucleico isoladas, recombinantes ou quiméricas, compreendendo sequências nucleotídicas codificando proteínas pesticidas e polipeptídeos ou porções biologicamente ativas dos mesmos, bem como moléculas de ácido nucleico suficientes para uso como sondas de hibridização de forma a identificar as moléculas de ácidos nucleicos codificando proteínas com regiões de homologia de sequência. Também estão englobadas neste documento as sequências nucleotídicas capazes de hibridizar com as sequências nucleotídicas da invenção, sob condições rigorosas, conforme definido noutra localização deste documento. Conforme usado neste documento, o termo molécula de ácido nucleico pretende incluir moléculas de DNA (por exemplo, DNA recombinante, cDNA ou DNA genômico) e moléculas de RNA (por exemplo, mRNA) e análogos de DNA ou RNA gerados usando análogos de nucleotídeos. A molécula de ácido nucleico pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla, mas de preferência é DNA de cadeia dupla. O termo recombinante engloba polinucleotídeos ou polipeptídeos que foram manipulados em relação ao polinucleotídeo ou polipeptídeo nativo, de tal modo que o polinucleotídeo ou polipeptídeo difere (por exemplo, na composição química ou em estrutura) do que está a ocorrer na natureza. Em outra modalidade, um polinucleotídeo recombinante é livre de sequências internas (isto é, intróns) que ocorrem naturalmente no DNA genômico do organismo a partir do qual o polinucleotídeo é derivado. Um exemplo típico de tal polinucleotídeo é o denominado DNA Complementar (cDNA).

[0014] Um ácido nucleico (ou DNA) isolado, recombinante, ou quimérico é usado neste documento de forma a se referir a um ácido nucleico (ou

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DNA) que já não está no seu ambiente natural, por exemplo, in vitro ou em uma bactéria recombinante ou célula vegetal hospedeira. Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado, recombinante, ou quimérico, está livre de sequências (de preferência, sequências de codificação de proteínas), que naturalmente flanqueiam o ácido nucleico (ou seja, sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo a partir do qual o ácido nucleico é derivado. Para os fins da invenção, o termo “isolado” quando usado para se referir a moléculas de ácido nucleico exclui cromossomas isolados. Por exemplo, em várias modalidades, a molécula de ácido nucleico de bp005 isolado pode conter menos do que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ou 0,1 kb das sequências nucleotídicas que flanqueiam naturalmente a molécula de ácido nucleico no DNA genômico da célula a partir da qual o ácido nucleico é derivado. Em várias modalidades, uma proteína BP005 que é substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteínas tendo menos do que cerca de 30%, 20%, 10%, ou 5% (em peso seco) de proteína não-BP005 (também referida neste documento como uma proteína contaminante). Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante da invenção compreende uma ou mais substituições de nucleotídeos em relação a qualquer uma das SEQ ID NO: 69-106, ou uma variante ou fragmento das mesmas.

[0015] As sequências nucleotídicas que codificam as proteínas da presente invenção incluem a sequência descrita em qualquer uma das SEQ ID NO: 69-106 e variantes, fragmentos e complementos da mesma. Por “complemento” se entende uma sequência nucleotídica que é suficientemente complementar com uma determinada sequência nucleotídica de tal modo que pode hibridar com a referida sequência nucleotídica para desse modo formar uma ligação dupla estável. As sequências de aminoácidos correspondentes para as proteínas pesticidas

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8/94 codificadas por estas sequências nucleotídicas são as descritas em qualquer uma das SEQ ID NO:1 -40, 42, 43, 45-48, 50, 51,52, 54, 56, 58-64, 66, ou 67.

[0016] As moléculas de ácido nucleico que são fragmentos destas sequências nucleotídicas codificando proteínas pesticidas também estão abrangidas pela presente invenção. Por fragmento se entende uma porção da sequência nucleotídica codificando uma proteína pesticida. Um fragmento de uma sequência nucleotídica pode codificar uma parte biologicamente ativa de uma proteína pesticida, ou pode ser um fragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridização ou um iniciador de PCR usando os métodos descritos abaixo. As moléculas de ácido nucleico que são fragmentos de uma sequência nucleotídica codificando uma proteína pesticida compreendem pelo menos cerca de 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1350, 1400 nucleotídeos contíguos, ou até ao número de nucleotídeos presentes em uma sequência nucleotídica de comprimento total codificando uma proteína pesticida divulgada neste documento, dependendo do uso desejado. Por nucleotídeos “contíguos” se entendem os resíduos de nucleotídeos que estão imediatamente adjacentes uns aos outros. Os fragmentos das sequências nucleotídicas da presente invenção irão codificar fragmentos de proteínas que retêm a atividade biológica da proteína pesticida e, desse modo, retêm a atividade pesticida. Desse modo, os fragmentos biologicamente ativos dos polipeptídeos divulgados neste documento também estão englobados. Por retém a atividade se entende que o fragmento terá, pelo menos, cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, 80%, 90%, 95% ou mais da atividade pesticida da proteína pesticida. Em uma modalidade, a atividade pesticida é atividade coleoptericida. Em outra modalidade, a atividade pesticida é atividade lepidoptericida. Em outra modalidade, a atividade pesticida é atividade nematocida. Em outra modalidade, a atividade

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9/94 pesticida é atividade diptericida. Em outra modalidade, a atividade pesticida é atividade hemiptericida. Os métodos para medição da atividade pesticida são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews etal. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone etal. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; e Patente dos E.U.A. No. 5,743,477, a totalidade dos quais é incorporada na sua totalidade neste documento para referência.

[0017] Um fragmento de uma sequência nucleotídica codificando uma proteína pesticida que codifica uma porção biologicamente ativa de uma proteína da invenção irá codificar, pelo menos, cerca de 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 aminoácidos contíguos, ou até ao número total de aminoácidos presentes em uma proteína pesticida de comprimento total da invenção. Em algumas modalidades, o fragmento é um fragmento de divagem proteolítica. Por exemplo, o fragmento de divagem proteolítica pode ter uma truncagem no terminal N ou no terminal C de pelo menos cerca de 100 aminoácidos, cerca de 120, cerca de 130, cerca de 140, cerca de 150, ou cerca de 160 aminoácidos em relação a qualquer uma das SEQ ID NO:1-40, 42, 43, 45-48, 50, 51, 52, 54, 56, 58-64, 66, ou 67 Em algumas modalidades, os fragmentos englobados neste documento resultam da remoção do domínio de cristalização do terminal C, por exemplo, por proteólise ou pela inserção de um códon de terminação na sequência de codificação.

[0018] Em várias modalidades, o ácido nucleico da invenção compreende um ácido nucleico degenerado de qualquer uma das SEQ ID NO:69106, em que a referida sequência nucleotídica degenerada codifica a mesma sequência de aminoácidos que qualquer uma das SEQ ID NO:1-40, 42, 43, 45-48, 50,51,52, 54, 56, 58-64, 66, ou 67.

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10/94 [0019] As proteínas pesticidas preferidas da presente invenção são codificadas por uma sequência nucleotídica suficientemente idêntica à sequência nucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NO:69-106, ou as proteínas pesticidas são suficientemente idênticas à sequência de aminoácidos definidas em qualquer uma das SEQ ID NO:1 -40, 42, 43, 45-48, 50, 51,52, 54, 56, 58-64, 66, ou 67. Por suficientemente idêntica se entende uma sequência de aminoácidos ou de nucleotídeos que tem pelo menos cerca de 60% ou 65% de identidade de sequência, cerca de 70% ou 75% de identidade de sequência, cerca de 80% ou 85% de identidade de sequência, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência comparativamente com uma sequência de referência, usando um dos programas de alinhamento descritos neste documento usando parâmetros padrão. Um perito na técnica vai reconhecer que esses valores podem ser adequadamente ajustados de forma a determinar a identidade correspondente das proteínas codificadas por duas sequências nucleotídicas, tendo em conta a degeneração dos códons, a semelhança dos aminoácidos, o posicionamento do quadro de leitura e semelhantes.

[0020] De modo a determinar a percentagem de identidade de duas sequências de aminoácidos ou de dois ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para fins de comparação ótima. A percentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências (isto é, percentagem de identidade = número de posições idênticas / número total de posições (por exemplo, posições que se sobrepõe) x 100). Em uma modalidade, as duas sequências têm o mesmo comprimento. Em uma outra modalidade, a percentagem de identidade é calculada ao longo da totalidade da sequência de referência (isto é, a sequência divulgada neste documento como qualquer uma das SEQ ID NO: 1-40, 42, 43, 45-48, 50, 51,52, 54, 56, 58-64, 66,

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67, ou 69-106). A percentagem de identidade entre duas sequências pode ser determinada usando técnicas semelhantes àquelas abaixo descritas, permitindo, ou não, falhas. No cálculo da percentagem de identidade, tipicamente são contadas correspondências exatas. Uma falha, isto é, uma posição em um alinhamento quando está presente um resíduo em uma sequência, mas não na outra, é considerada como uma posição com resíduos não idênticos.

[0021] A determinação da percentagem de identidade entre duas sequências pode ser conseguida usando um algoritmo matemático. Um exemplo não limitative de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 87:2264, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 90:5873-5877. Tal algoritmo é incorporado nos programas BLASTN e BLASTX de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. As pesquisas de nucleotídeos BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTN, valor = 100, comprimento de palavra = 12, de forma a obter sequências de nucleotídeos homólogas para as moléculas de ácido nucleico do tipo pesticida da invenção. As pesquisas de proteínas BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTX, valor = 50, comprimento da palavra = 3, de forma a obter sequências de aminoácidos homólogas às moléculas da proteína pesticida da invenção. De forma a obter alinhamentos com falhas para propósitos de comparação, pode ser utilizado Gapped BLAST (em BLAST 2,0) conforme descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, pode ser usado PSI-Blast para efetuar uma procura iterada que detecta relações distantes entre moléculas. Ver Altschul et al. (1997) supra. Quando se utilizam os programas BLAST, Gapped BLAST, e PSIBlast, podem ser usados os parâmetros padrão dos respetivos programas (por ex.,

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BLASTX e BLASTN). 0 alinhamento também pode ser efetuado manualmente, por inspeção.

[0022] Outro exemplo não limitative de um algoritmo matemático utilizado para a comparação das sequências é o algoritmo de ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalW compara sequências e alinha a totalidade da sequência de aminoácidos ou de DNA, e desse modo, pode fornecer dados sobre a conservação da sequência da totalidade da sequência de aminoácidos. O algoritmo ClustalW é usado em vários pacotes de software de análise de DNA/aminoácido disponíveis no mercado, tal como o módulo ALIGNX do Vector NTI Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Após o alinhamento das sequências de aminoácidos com ClustalW, pode ser avaliada a percentagem de identidade de aminoácidos. Um exemplo não limitative de um programa de software útil para a análise dos alinhamentos ClustalW é o GENEDOC™. O GENEDOC™ (Karl Nicholas) permite a avaliação da similaridade e identidade de aminoácidos (ou DNA) entre múltiplas proteínas. Outro exemplo não limitative de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Tal algoritmo está incorporado no programa ALIGN (versão 2,0), que faz parte do Pacote de Software GCG da Wisconsin Genetics, Versão 10 (disponível a partir de Accelrys Inc., 9685 Scranton Rd., São Diego, CA, E.U.A.). Quando se utiliza o programa ALIGN para comparação de sequências de aminoácidos, podem ser usadas, uma tabela de peso de resíduos PAM120, uma penalidade de comprimento de falha de 12 e uma penalidade de falha de 4.

[0023] Salvo indicação em contrário, o GAP Versão 10, que usa o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453, será usado de modo a determinar a identidade ou similaridade de sequência usando os

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13/94 seguintes parâmetros: % de identidade e % de similaridade para uma sequência de nucleotídeos usando Peso GAP de 50 e Peso Comprimento de 3, e a matriz de classificação nwsgapdna.cmp; % de identidade ou % de similaridade para a sequência de aminoácidos usando peso GAP de 8 e peso comprimento de 2, e o programa de classificação BLOSUM62. Também podem ser usados programas equivalentes. Por “programa equivalente” se entende qualquer programa de comparação de sequência que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento tendo idênticas correspondências de resíduos de nucleotídeo e uma percentagem idêntica de identidade de sequência quando comparada com o correspondente alinhamento gerado por GAP Versão 10.

[0024] A invenção também engloba moléculas de ácido nucleico variante. Variantes das sequências de nucleotídeos que codificam a proteína pesticida incluem as sequências que codificam as proteínas pesticidas divulgadas neste documento, mas que diferem de forma conservadora por causa da degenerescência do código genético, bem como aquelas que são suficientemente idênticas, conforme acima discutido. Variantes alélicas que ocorrem naturalmente podem ser identificadas com o uso de técnicas de biologia molecular bem conhecidas, tais como a reação em cadeia da polimerase (POR) e técnicas de hibridização, conforme realçado abaixo. Sequências de nucleotídeos variantes também incluem sequências de nucleotídeos sinteticamente derivadas que tenham sido geradas, por exemplo, pelo uso de mutagênese dirigida ao local, mas que ainda codificam as proteínas antifúngicas descritas na presente invenção, conforme discutido abaixo. Proteínas variantes englobadas pela presente invenção são biologicamente ativas, isto é, continuam a possuir a desejada atividade biológica da proteína nativa, ou seja, atividade pesticida. Por retém a atividade se entende que a variante terá, pelo menos, cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos

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14/94 cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 80% da atividade pesticida da proteína nativa. Os métodos para medição da atividade pesticida são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone etal. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; e Patente dos E.U.A. No. 5,743,477, a totalidade dos quais é incorporada na sua totalidade neste documento para referência.

[0025] O perito na técnica também irá apreciar que podem ser introduzidas alterações por mutação das sequências nucleotídicas da invenção, conduzindo desse modo a alterações na sequência de aminoácidos das proteínas pesticidas codificadas, sem alterar a atividade biológica das proteínas. Desse modo, podem ser criadas moléculas de ácido nucleico isolado variante através da introdução de uma ou mais substituições, adições ou eliminações de nucleotídeos na correspondente sequência de nucleotídeos divulgada neste documento, de tal modo que são introduzidas substituições, adições ou eliminações de um ou mais aminoácidos, na proteína codificada. Podem ser introduzidas mutações por técnicas padrão, como mutagênese dirigida ao sítio e mutagênese mediada por PCR. Tais sequências nucleotídicas variantes também são englobadas pela presente invenção.

[0026] Por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos podem ser efetuadas em um ou mais resíduos de aminoácidos, preditos, não essenciais. Um resíduo de aminoácido não essencial é um resíduo que pode ser alterado a partir da sequência de tipo selvagem de uma proteína pesticida sem alterar a atividade biológica, enquanto um resíduo de aminoácido essencial é necessário para a atividade biológica. Uma substituição conservative de aminoácidos é uma em que um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de

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15/94 aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por ex., lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por ex., ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por ex., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por ex., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais betaramificadas (por ex., treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por ex., tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).

[0027] As substituições de aminoácidos podem ser feitas em regiões não conservadas que retêm a função. Em geral, tais substituições não seriam feitas para resíduos de aminoácidos conservados, ou para resíduos de aminoácidos que residam em um motivo conservado, onde tais resíduos são essenciais para a atividade da proteína. Exemplos de resíduos que são conservados e que podem ser essenciais para a atividade da proteína incluem, por exemplo, resíduos que são idênticos entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de toxinas semelhantes ou relacionadas com as sequências da invenção (por exemplo, resíduos que são idênticos em um alinhamento de proteínas homólogas). Exemplos de resíduos que são conservados, mas que podem permitir substituições conservatives do aminoácido e mesmo assim manter a atividade incluem, por exemplo, resíduos que têm apenas substituições conservatives entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de toxinas semelhantes ou relacionadas com as sequências da invenção (por exemplo, resíduos que têm apenas substituições conservativas entre todas as proteínas contidas nas proteínas homólogas de alinhamento). No entanto, um perito na técnica entenderá que as variantes funcionais podem ter pequenas alterações conservadas ou não conservadas nos resíduos conservados.

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16/94 [0028] Alternativamente, as sequências nucleotídicas variantes podem ser feitas através da introdução aleatória de mutações ao longo da totalidade ou parte da sequência de codificação, tal como, por mutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser rastreados para a capacidade de modo a conferir atividade pesticida para identificar mutantes que mantêm atividade. Depois da mutagênese, a proteína codificada pode ser expressa de forma recombinante e a atividade da proteína pode ser determinada usando técnicas de ensaio convencionais.

[0029] Usando métodos tais como PCR, hibridização e semelhantes, se podem identificar sequências pesticidas correspondentes, tendo tais sequências identidade substancial com as sequências da invenção (por ex., pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais de identidade de sequência ao longo da totalidade da sequência de referência) e tendo ou conferindo atividade pesticida. Ver, por exemplo, Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nl) e Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nl).

[0030] Em um método de hibridização, pode ser usada a totalidade ou parte da sequência de nucleotídeos pesticida de forma a rastrear bibliotecas de cDNA ou genômicas. Os métodos para construção de tais bibliotecas de cDNA e genômicas são geralmente conhecidas na técnica e são divulgadas em Sambrook e Russell, 2001, supra. As chamadas sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotídeos e podem ser marcadas com um grupo detectável, tal como ³²P, ou qualquer outro marcador detectável, tal como outros radioisotopes, um composto fluorescente, uma enzima, ou um cofator de enzima. As sondas para hibridização

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17/94 podem ser efetuadas através da marcação de oligonucleotídeos sintéticos com base na conhecida sequência de nucleotídeos de codificação da proteína pesticida divulgada neste documento. Adicionalmente, podem ser usados os iniciadores degenerados concebidos com base nos nucleotídeos conservados ou nos resíduos de aminoácidos na sequência nucleotídicas, ou na sequência de aminoácidos codificada. A sonda compreende normalmente uma região de sequência nucleotídicas que híbrida sob condições rigorosas com, pelo menos, cerca de 12, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 50, 75, 100, 125, 150, 175, ou 200 nucleotídeos consecutivos da sequência nucleotídicas codificando uma proteína pesticida da invenção ou um fragmento ou variante da mesma. Os métodos para a preparação das sondas para hibridização são geralmente conhecidos na técnica e são divulgados em Sambrook e Russell, 2001, supra incorporado neste documento para referência.

[0031] Por exemplo, uma sequência de pesticida total divulgada neste documento, ou uma ou mais porções da mesma, podem ser usadas como uma sonda capaz de hibridizar especificamente com sequências do tipo de proteínas pesticidas correspondentes, e RNAs de mensageiros. De modo a conseguir hibridização específica em uma variedade de condições, tais sondas incluem sequências que são únicas e têm, de preferência, pelo menos cerca de 10 nucleotídeos de comprimento, ou pelo menos cerca de 20 nucleotídeos de comprimento. Tais sondas podem ser usadas de modo a amplificar as correspondentes sequências pesticidas a partir de um organismo ou amostra escolhido por PCR. Essa técnica pode ser usada de modo a isolar as sequências de codificação adicionais a partir de um organismo desejado, ou como um ensaio de diagnóstico de forma a determinar a presença de sequências de codificação de um organismo. As técnicas de hibridização incluem triagem de hibridização de

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18/94 bibliotecas de DNA em placas (tanto placas ou colônias, ver, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2- ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

[0032] Assim, a presente invenção engloba as sondas para hibridização, bem como sequências nucleotídicas capazes de hibridizar com a totalidade ou uma porção de uma sequência nucleotídica da invenção (por exemplo, pelo menos cerca de 10, 25, 50,100,150, 200, 250, 300, 350,400,450, 500, ou até ao comprimento total de uma sequência nucleotídicas divulgada neste documento). A hibridização de tais sequências pode ser efetuada sob condições rigorosas. Por “condições rigorosas” ou “condições de hibridização rigorosas” se entendem as condições sob as quais uma sonda irá hibridizar com a sua sequência alvo em um grau detectavelmente maior que outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes sobre o fundo). Condições rigorosas são dependentes de sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Através do controle das condições rigorosas de hibridação e/ou lavagem, podem ser identificadas as sequências alvo que são 100% complementares da sonda (sondagem homóloga). Em alternativa, as condições rigorosas podem ser ajustadas de forma a permitirem algumas inadequações nas sequências de modo a que graus mais baixos de semelhança sejam detectados (sondagem heteróloga). Geralmente, uma sonda é menor do que cerca de 1,000 nucleotídeos de comprimento, de preferência menor do que 500 nucleotídeos de comprimento.

[0033] Tipicamente, condições rigorosas serão aquelas nas quais a concentração de sal é inferior do que cerca de 1,5 M íons de Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íons de Na (ou outros sais) a pH de 7,0 a 8,3 e a temperatura é de, pelo menos, cerca de 30 °C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e, pelo menos, cerca de 60 °C para sondas longas (por

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19/94 exemplo, maiores do que 50 nucleotídeos). As condições rigorosas também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizadores tais como formamida. Exemplos de condições de baixo rigor incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, NaCI a 1 M, 1% de SDS (dodecilsulfato de sódio) a 37 °C, e uma lavagem em 1X a 2X de SSC (20X SSC = NaCI a 3,0 M/ citrato trissódico a 0,3 M), de 50 a 55 °C. Exemplos de condições de rigor moderado incluem hibridização em 40 a 45% de formamida, NaCI a 1,0 M, 1% de SDS a 37 °C, e uma lavagem em 0,5 X a 1X de SSC, a 55 a 60 °C. Exemplos de condições de elevado rigor incluem hibridização em formamida a 50%, NaCI a 1 M, 1 % de SDS a 37 °C, e uma lavagem em 0,1 X SSC a 60 a 65 °C. Opcionalmente, tampões de lavagem podem compreender cerca de 0,1% a cerca de 1% de SDS. A duração de hibridização é, geralmente, inferior a cerca de 24 horas, normalmente cerca de 4 a cerca de 12 horas.

[0034] A especificidade é tipicamente a função das lavagens póshibridização, sendo os fatores críticos a resistência iônica e a temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos DNA-DNA, a Tm pode ser aproximada a partir da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm =

81,5 °C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% forma) - 500/L; em que M é a molaridade dos cátions monovalentes, % GC é a percentagem de nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % forma é a percentagem de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do híbrido em pares de bases. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) à qual 50% de uma sequência alvo complementar se híbrida com uma sonda perfeitamente compatível. A Tm é reduzida em cerca de 1 °C por cada 1% de incompatibilidade; por consequência, a Tm, a hibridização, e/ou as condições de lavagem podem ser ajustadas de modo a hibridarem com sequências da identidade desejada. Por exemplo, se são

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20/94 procuradas sequências com > 90% de identidade, a Tm pode ser reduzida 10 °C. Geralmente, as condições rigorosas são selecionadas de forma a serem cerca de 5 °C inferiores ao ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência específica e seu complemento, a uma força iônica e pH definidos. No entanto, várias condições severamente rigorosas podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1,2, 3, ou 4 °C mais baixos do que o ponto de fusão térmico (Tm); condições moderadamente rigorosas podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9, ou 10 °C mais baixos do que o ponto de fusão térmico (Tm); condições de baixa severidade podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15, ou 20 °C mais baixos do que o ponto térmico de fusão (Tm). Usando a equação, as composições de hibridização e de lavagem, e a Tm desejada, os peritos entenderão que variações no rigor de hibridização e/ou nas soluções de lavagem estão inerentemente descritas. Se o desejado grau de incompatibilidade resulta em uma Tm inferior a 45 °C (solução aquosa) ou a 32 °C (solução de formamida), é preferível aumentar a concentração de SSC de modo que possa ser usada uma temperatura mais elevada. Um guia extenso para a hibridização dos ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular BiologyHybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nova Iorque); e Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-lnterscience, Nova Iorque). Ver Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2- ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

Proteínas Isoladas E Variantes E Fragmentos Das Mesmas [0035] As proteínas pesticidas também estão englobadas no âmbito da presente invenção. Por proteína antifúngica se entende uma proteína tendo a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO:1 -40,42,

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43,45-48,50,51,52, 54, 56,58-64,66, ou 67. Fragmentos, porções biologicamente ativas, e variantes dos mesmos também são conferidos, e podem ser usados para a prática dos métodos da presente invenção. Uma proteína isolada ou uma proteína recombinante é usada de forma a se referir a uma proteína que já não está no seu ambiente natural, por exemplo, in vitro ou em uma bactéria recombinante ou célula vegetal hospedeira. Em algumas modalidades, a proteína recombinante é uma variante de qualquer uma das SEQ ID NO:1 -40, 42,43, 45-48, 50, 51, 52, 54, 56, 58-64, 66, ou 67, em que a variante compreende pelo menos uma substituição, deleção ou inserção de aminoácido relativamente a qualquer uma das SEQ ID NO:1 -40, 42, 43, 45-48, 50, 51,52, 54, 56, 58-64, 66, ou 67.

[0036] “Fragmentos ou porções biologicamente ativas incluem fragmentos de polipeptídeos compreendendo sequências de aminoácidos suficientemente idênticas com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO:1 -40, 42, 43, 45-48, 50, 51,52, 54, 56, 58-64, 66, ou 67, e que apresentam atividade pesticida. Uma porção biologicamente ativa de uma proteína pesticida pode ser um polipeptídeo que tem, por exemplo, 10, 25, 50,100, 150, 200, 250, ou mais aminoácidos de comprimento. Tais porções biologicamente ativas podem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas quanto à atividade pesticida. Os métodos para medição da atividade pesticida são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews etal. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone etal. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; e Patente dos E.U.A. No. 5,743,477, a totalidade dos quais é incorporada na sua totalidade neste documento para referência. Conforme usado neste documento, um fragmento compreende, pelo menos, 8 aminoácidos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NO:1 -40,42,43,4548, 50, 51,52, 54, 56, 58-64, 66, ou 67. A invenção engloba outros fragmentos, no

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22/94 entanto, tal como em qualquer fragmento na proteína maior do que cerca de 10, 20, 30, 50,100,150, 200, 250 ou mais aminoácidos de comprimento.

[0037] Por variantes se entendem as proteínas ou polipeptídeos tendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 60%, 65%, cerca de 70%, 75%, cerca de 80%, 85%, cerca de about 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de qualquer uma das of SEQ ID NO:1 -40, 42, 43, 45-48, 50, 51,52, 54, 56, 58-64, 66, ou 67. As variantes também incluem polipeptídeos codificados por uma molécula de ácido nucleico que híbrida com a molécula de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NO:69-106, ou um complemento das mesmas, sob condições rigorosas. As variantes incluem polipeptídeos que diferem na sequência de aminoácidos, devido à mutagênese. Proteínas variantes englobadas pela presente invenção são biologicamente ativas, isto é, continuam a possuir a desejada atividade biológica da proteína nativa, ou seja, retêm a atividade pesticida. Em algumas modalidades, as variantes têm atividade melhorada em relação à proteína nativa. Os métodos para medição da atividade pesticida são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; e Patente dos E.U.A. No. 5,743,477, a totalidade dos quais é incorporada na sua totalidade neste documento para referência.

[0038] Genes bacterianos, tais como os genes desta invenção, muitas vezes possuem vários códons de iniciação da metionina na proximidade do início da estrutura de leitura aberta. Muitas vezes, a iniciação da tradução de um ou mais destes códons de iniciação conduzirá à geração de uma proteína funcional. Estes códons de iniciação podem incluir códons ATG. No entanto, bactérias tais como Bacillus sp. também reconhecem o códon GTG como o códon de iniciação, e

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23/94 as proteínas que iniciam a tradução nos códons GTG contêm uma metionina no primeiro aminoácido. Em raras ocasiões, a tradução em sistemas bacterianos pode iniciar em um códon TTG, embora neste caso o TTG codifique uma metionina. Além disso, não é muitas vezes determinado a priori quais destes códons são naturalmente usados na bactéria. Assim, é entendido que o uso de um dos códons de metionina alternativos também pode conduzir à geração de proteínas pesticidas. Estas proteínas pesticidas são englobadas na presente invenção e podem ser usadas nos métodos da presente invenção. Será entendido que, quando expresso em plantas, será necessário alterar o códon de iniciação alternativo para ATG para tradução adequada.

[0039] Em várias modalidades da presente invenção, as proteínas pesticidas incluem sequências de aminoácidos deduzidas a partir de sequências nucleotídicas de comprimento total descritas neste documento, e as sequências de aminoácidos que são mais curtas do que as sequências de tamanho total devido ao uso de um local de início alternativo a jusante. Desse modo, a sequência nucleotídica da invenção e/ou os vetores, as células hospedeiras, e as plantas compreendendo a sequência nucleotídica da invenção (e os métodos para produção e uso da sequência nucleotídica da invenção) podem compreender uma sequência nucleotídica codificando uma sequência de aminoácidos que corresponde a qualquer uma das SEQ ID NO:1-40, 42, 43, 45-48, 50, 51, 52, 54, 56, 58-64, 66, ou 67.

[0040] Os anticorpos para os polipeptídeos da presente invenção, ou para as variantes ou fragmentos dos mesmos, também estão englobados. Os métodos para a produção de anticorpos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NI; Patente dos E.U.A. No. 4,196,265).

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24/94 [0041 ] Desse modo, um aspeto da invenção diz respeito a anticorpos, moléculas de ligação de antigênios de cadeia única, ou outras proteínas que se ligam especificamente a uma ou mais das moléculas de proteínas ou peptídeos da invenção e aos seus homólogos, fusões ou fragmentos. Em uma modalidade particularmente preferida, o anticorpo se liga especificamente a uma proteína tendo a sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NO:1 -40, 42, 43, 45-48, 50, 51,52, 54, 56, 58-64, 66, ou 67 ou um fragmento das mesmas. Em outra modalidade, o anticorpo se liga especificamente a uma proteína de fusão compreendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NO:1-40, 42, 43, 45-48, 50, 51, 52, 54, 56, 58-64, 66, ou 67 ou um fragmento das mesmas. Em várias modalidades, o anticorpo que se liga especificamente à proteína da invenção ou a uma proteína de fusão compreendendo a proteína da invenção é um anticorpo que não ocorre naturalmente.

[0042] Os anticorpos da invenção podem ser usados para detectar quantitativamente ou qualitativamente as moléculas de proteínas ou peptídeos da invenção, ou para detectar as modificações pós-traducionais das proteínas. Conforme usado neste documento, um anticorpo ou peptídeo é referido como se ligando especificamente a uma molécula de proteína ou peptídeo da invenção, se tal ligação não for competitivamente inibida pela presença de moléculas não relacionadas.

[0043] Os anticorpos da invenção podem estar contidos dentro de um kit útil para a detecção da molécula de proteína ou peptídeo da invenção. A invenção adicionalmente compreende um método de detecção da molécula de proteína ou peptídeo da invenção (particularmente uma proteína codificada pela sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NQ:1-40, 42, 43, 45-48,

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50, 51,52, 54, 56, 58-64, 66, ou 67, incluindo variantes ou fragmentos das mesmas que são capazes de se ligar especificamente ao anticorpo da invenção) compreendendo o contato de uma amostra com o anticorpo da invenção e a determinação se a amostra contém a molécula de proteína ou peptídeo da invenção. Os métodos para utilizar anticorpos para a detecção de uma proteína ou peptídeo de interesse são conhecidos na técnica.

Variantes Alteradas Ou Melhoradas [0044] Se reconhece que as sequências de DNA de uma proteína pesticida podem ser alteradas por vários métodos, e que essas alterações podem resultar em sequências de DNA que codificam proteínas com sequências de aminoácidos diferentes do que aquelas codificadas por uma proteína pesticida da presente invenção. Essa proteína pode ser alterada de diversas formas incluindo substituições, eliminações, truncagens e inserções de aminoácidos de um ou mais aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO:1 -40, 42, 43, 45-48, 50, 51,52, 54, 56, 58-64, 66, ou 67, incluindo até cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 15, cerca de 20, cerca de 25, cerca de 30, cerca de 35, cerca de 40, cerca de 45, cerca de 50, cerca de 55, cerca de 60, cerca de 65, cerca de 70, cerca de 75, cerca de 80, cerca de 85, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 105, cerca de 110, cerca de 115, cerca de 120, cerca de 125, cerca de 130, cerca de 135, cerca de 140, cerca de 145, cerca de 150, cerca de 155, ou mais substituições, eliminações ou inserções de aminoácidos. Os métodos para essas manipulações são geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, as variantes da sequência de aminoácidos de uma proteína pesticida podem ser preparadas por mutações no DNA. Isso também pode ser conseguido por uma de várias formas de mutagênese e/ou na evolução direcionada. Em alguns aspetos, as alterações codificadas na sequência de aminoácidos não

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26/94 afetarão substancialmente a função da proteína. Tais variantes irão possuir a desejada atividade pesticida. No entanto, é entendido que a capacidade de uma proteína pesticida para conferir atividade pesticida pode ser melhorada através do uso de tais técnicas sobre as composições desta invenção. Por exemplo, se pode expressar uma proteína pesticida em células hospedeiras que exibem elevadas taxas de incorreta incorporação de base durante a replicação do DNA, tal como XL1 Red (Stratagene, La Jolla, CA). Após a propagação de tais estirpes, se pode isolar o DNA (por exemplo por preparação de DNA plasmídeo, ou por amplificação por PCR e clonando o fragmento de PCR resultante em um vetor), fazer cultura das mutações da proteína pesticida em uma estirpe não mutagênica, e identificar os genes mutados com atividade pesticida, por exemplo através da realização de um ensaio de forma a testar a atividade pesticida. Geralmente, a proteína é misturada e usada em ensaios de alimentação ou a toxina é exposta diretamente ao inseto. Ver, por exemplo Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293 e Cira etal. (2017) J Pest Sei 90:1257-1268. Tais ensaios podem incluir o contato de plantas com uma ou mais pragas e determinar a capacidade da planta para sobreviver e/ou provocar a exterminação das pragas. Exemplos de mutações que resultam em uma toxicidade aumentada são encontrados em Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806.

[0045] Em alternativa, as alterações podem ser feitas para a sequência de proteína de muitas proteínas no terminal amino ou carboxi, sem afetar substancialmente a atividade. Isso pode incluir inserções, eliminações ou alterações introduzidas por métodos moleculares modernos, tais como PCR, incluindo amplificações PCR que alteram ou prolongam a sequência de codificação da proteína em virtude da inclusão de sequências codificantes de aminoácidos nos oligonucleotídeos utilizados na amplificação PCR. Alternativamente, as sequências

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27/94 de proteína adicionadas podem incluir sequências codificantes de proteínas inteiras, tais como aquelas normalmente usadas na técnica de forma a gerar fusões de proteínas. Tais proteínas de fusão são muitas vezes usadas para (1) aumentar a expressão de uma proteína de interesse (2) introduzir um domínio de ligação, atividade enzimática, ou epítopo de forma a facilitar tanto a purificação das proteínas, a detecção das proteínas, ou para outros usos experimentais conhecidos na técnica (3) secreção ou tradução alvo de uma proteína para uma organela subcelular, tal como o espaço periplasmático das bactérias Gram-negativas, ou o retículo endoplasmático das células eucariontes, o último dos quais, resulta muitas vezes na glicosilação da proteína.

[0046] As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos variantes da presente invenção também englobam as sequências derivadas de procedimentos mutagênicos e recombinogênicos tais como mistura de DNA. Com um tal procedimento, podem ser usadas uma ou mais diferentes regiões codificadoras de proteínas pesticidas, de forma a criar uma nova proteína pesticida possuindo as propriedades desejadas. Desta forma, as bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de polinucleotídeos de sequências relacionados compreendendo regiões de sequências que têm identidade de sequência substancial e podem ser homologamente recombinadas in vitro ou in vivo. Por exemplo, usando essa abordagem, os motivos de sequências codificando um domínio de interesse podem ser misturados entre o gene pesticida da invenção e outros genes pesticidas conhecidos de forma a se obter um novo gene codificando para uma proteína com uma propriedade de interesse melhorada, tal como uma atividade inseticida aumentada. As estratégias para essa mistura de DNA são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri

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28/94 etal. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore etal. (1997) J. Mol. Biol. 272:336347; Zhang etal. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 94:4504-4509; Crameri etal. (1998) Nature 391:288-291; e as Patentes dos E.U.A. Nos. 5,605,793 e 5,837,458.

[0047] A troca ou mistura de domínio é outro mecanismo para geração de proteínas pesticidas alteradas. Os domínios podem ser trocados entre as proteínas pesticidas, resultando em toxinas híbridas ou quiméricas com melhor atividade pesticida ou espetro alvo. Os métodos para geração de proteínas recombinantes e teste das mesmas quanto à atividade pesticida, são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd etal. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:15371543; Ge etal. (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf etal. (1990,) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:29182925).

[0048] Ainda em outra modalidade, sequências nucleotídicas e/ou de aminoácidos variantes podem ser obtidas usando uma ou mais PCR propensa a erros, mutagênese dirigida por oligonucleotídeos, PCR de montagem, mutagênese por PCR sexual, mutagênese in vivo, mutagênese por cassete, mutagênese por conjuntos recursivos, mutagênese exponencial por conjunto, mutagênese específica de sítio, recomposição de genes, mutagênese por saturação de sítio gênico, mutagênese permutacional, recomposição de ligação sintética (SLR), recombinação, recombinação de sequência recursiva, mutagênese de DNA modificada por fosfotioato, mutagênese por molde contendo uracila, mutagênese duplex com falha, mutagênese de reparação de incompatibilidade de ponto, mutagênese de estirpe hospedeira deficiente em reparação, mutagênese química, mutagênese radiogênica, mutagênese por eliminação, mutagênese por seleção de restrição, mutagênese por purificação de restrição, síntese de gene artificial,

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29/94 mutagênese de conjunto, criação multímera de ácido nucleico químico e semelhantes.

Vetores [0049] Uma sequência pesticida da invenção pode ser conferida em um cassete de expressão para a expressão em uma célula hospedeira de interesse, por ex., uma célula vegetal ou um micróbio. Por cassete de expressão vegetal se entende um construto de DNA que é capaz de resultar na expressão de uma proteína a partir de uma estrutura de leitura aberta em uma célula vegetal. Tipicamente, esse contém um promotor e uma sequência de codificação. Frequentemente, esses construtos também irão conter uma região 3' não traduzida. Tais construtos podem conter uma sequência de sinal ou sequência líder de forma a facilitar o transporte co-translacional ou pós-translacional do peptídeo para certas estruturas intracelulares tal como o cloroplasto (ou outro plastídeo), retículo endoplasmático, ou no aparelho de Golgi.

[0050] Por sequência de sinal se entende uma sequência que se sabe ou se suspeita que resulta no transporte co-translacional ou pós-translacional do peptídeo através da membrana celular. Nos eucariontes, isso envolve tipicamente a secreção para o aparelho de Golgi, com alguma glicosilação resultante. As toxinas inseticidas de bactérias são frequentemente sintetizadas como protoxinas que são protoliticamente ativadas no intestino da praga alvo (Chang (1987) Methods Enzymol. 153:507-516). Em algumas modalidades da presente invenção, a sequência de sinal está localizada na sequência nativa, ou pode ser derivada a partir de uma sequência da invenção. Por sequência líder se entende qualquer sequência que, quando traduzida, resulta em uma sequência de aminoácidos suficiente para desencadear o transporte co-translacional da cadeia de peptídeo para uma organela sub-celular. Desse modo, isso inclui as sequências

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30/94 líderes que desencadeiam o transporte e/ou a glicosilação por passagem para o retículo endoplasmático, a passagem para vacúolos, plastídeos incluindo cloroplastos, mitocôndrias e semelhantes. Desse modo, é adicionalmente proporcionado neste documento um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos da presente invenção que está operativamente ligada a uma sequência líder heteróloga ou de sinal.

[0051] Por vetor de transformação vegetal se entende uma molécula de DNA que é necessária para a transformação eficiente de uma célula vegetal. Tal molécula pode ser constituída por um ou mais cassetes de expressão vegetal, e pode ser organizada em mais do que um vetor de molécula de DNA. Por exemplo, os vetores binários são vetores de transformação vegetal que utilizam dois vetores de DNA não contíguos para codificarem todas as funções de atuação cis e trans requeridas para a transformação de células vegetais (Hellens e Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Vetor se refere a um construto de ácido nucleico concebido para transferência entre diferentes células hospedeiras. Vetor de expressão se refere a um vetor que tem a capacidade para incorporar, integrar e expressar sequências ou fragmentos de DNA heterólogo em uma célula estranha. O cassete irá incluir sequências reguladoras 5' e/ou 3' ligadas de modo operacional a uma sequência da invenção. Por ligado de modo operacional” se entende uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda sequência, em que a sequência promotora inicia e medeia a transcrição da sequência de DNA correspondente à segunda sequência. Geralmente, ligado de modo operacional significa que as sequências de ácidos nucleicos a serem ligadas são contíguas e, quando necessário unem duas regiões codificadoras de proteínas, contíguas e no mesmo quadro de leitura. Em algumas modalidades, a sequência nucleotídica está ligada de modo operacional a um promotor heterólogo capaz de

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31/94 dirigir a expressão da referida sequência nucleotídica em uma célula hospedeira, tal como uma célula hospedeira microbiana ou uma célula hospedeira vegetal. O cassete pode adicionalmente conter, pelo menos, um gene adicional para ser cotransformado dentro do organismo. Alternativamente, o(s) gene(s) adicional(ais) pode(m) ser conferido(s) em vários cassetes de expressão.

[0052] Em várias modalidades, a sequência nucleotídica da invenção está ligada de modo operacional a um promotor heterólogo capaz de dirigir a expressão da sequência nucleotídica em uma célula, por ex., em uma célula vegetal ou um micróbio. Promotor se refere a uma sequência de ácido nucleico que funciona de forma a dirigir a transcrição de uma sequência de codificação a jusante. O promotor, conjuntamente com outras sequências reguladoras da transcrição e tradução do ácido nucleico (também denominadas sequências de controle) são necessários para a expressão de uma sequência de DNA de interesse.

[0053] Tal cassete de expressão é conferido com uma pluralidade de locais de restrição para inserção da sequência de pesticida de modo a estar sob a regulação transcricional das regiões reguladoras.

[0054] O cassete de expressão irá incluir, na direção de transcrição 5'-3', uma região de iniciação da transcrição e da tradução (isto é, um promotor), uma sequência de DNA da invenção, e uma região de terminação da tradução e da transcrição (isto é, a região de terminação) funcional em plantas. O promotor pode ser nativo ou análogo, ou estranho ou heterólogo, para a planta hospedeira e/ou para a sequência de DNA da invenção. Adicionalmente, o promotor pode ser a sequência natural ou, alternativamente, uma sequência sintética. Quando o promotor é nativo ou homólogo para o hospedeiro vegetal, se entende que o promotor se encontra na planta nativa na qual o promotor é introduzido. Quando o promotor é estranho ou heterólogo à sequência de DNA da invenção, se entende

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32/94 que o promotor não é o promotor nativo ou de ocorrência natural para a sequência de DNA ligada de modo operacional da invenção. O promotor pode ser indutível ou constitutivo. Esse pode ser de ocorrência natural, pode ser composto por porções de vários promotores de ocorrência natural, ou pode ser parcialmente ou totalmente sintético. A orientação para a concepção de promotores é proporcionada por estudos de estrutura de promotores, tais como os de Harley e Reynolds (1987) Nucleic Acids Res. 15:2343-2361. Além disso, a localização do promotor em relação ao início da transcrição pode ser otimizada. Ver, por ex., Roberts etal. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A., 76:760-764. Muitos promotores adequados para uso em plantas são bem conhecidos na técnica.

[0055] Por exemplo, promotores constitutivos adequados para uso em plantas incluem: os promotores a partir de vírus vegetais, tais como o promotor de caulimovírus de cadeia clorídica do amendoim (PCISV) (Patente dos E.U.A. No. 5,850,019); o promotor 35S a partir do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); o promotor 35S descrito em Kay et al. (1987) Science 236: 1299-1302; promotores dos genes da metiltransferase do vírus Chlorella (Patente dos E.U.A. No. 5,563,328) e o promotor do transcrito de comprimento total do vírus do mosaico da figueira (FMV) (Patente dos E.U.A. No. 5,378,619); os promotores a partir de genes tais como actina do arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171 e Patente dos E.U.A. 5,641,876); ubiquitina (Christensen etal. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen etal. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689) e Grefen et a/.(2010) Plant J, 64:355-365; pEMU (Last etal. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten etal. (1984) EMBO J. 3:2723-2730 e Patente dos E.U.A. 5,510,474); histona H3 do maiz (Lepetit et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 231:276-285 e Atanassova etal. (1992) Plant J. 2(3):291300); Brassica napus ALS3 (pedido PCT WO97/41228); um gene de subunidade

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33/94 pequena de ribulose-biscarboxilase/oxigenase (RuBisCO); o circovírus (AU 689 311) ou o vírus do mosaico da veia da mandíbula (CsVMV, US 7,053,205); promotores a partir de soja (Pbdc6 ou Pbdc7, descritos em WO/2014/150449 ou promotor de ubiquitina 3 descrito na Patente dos E.U.A. No. 7393948 e na Patente dos E.U.A. No. 8395021); promotores de vários genes de Agrobacterium (ver a Pat. dos E.U.A, Nos. 4,771,002; 5,102,796; 5,182,200; e 5,428,147).

[0056] Promotores indutíveis adequados para uso em plantas incluem: o promotor a partir do sistema ACE1 que responde ao cobre (Mett et al. (1993) PNAS 90:4567-4571); o promotor do gene In2 do maíz que responde aos fitoprotetores herbicidas benzenossulfonamida (Hershey et al. (1991) Mol. Gen. Genetics 227:229-237 e Gatz et al. (1994) Mol. Gen. Genetics 243:32-38); e o promotor do repressor Tet a partir de Tn10 (Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237). Outro promotor indutível para uso em plantas é aquele que responde a um agente indutor ao qual as plantas normalmente não respondem. Um promotor indutível exemplificativo deste tipo é o promotor indutível a partir de um gene de hormona esteroide, cuja atividade transcricional é induzida por uma hormona glucocorticosteróide (Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 88:10421) ou a recente aplicação de um ativador de transcrição quimérica, XVE, para uso em um sistema de expressão indutível baseado em receptores de estrogênio ativado por estradiol (Zuo etal. (2000) Plant J., 24:265-273). Outros promotores indutíveis para uso em plantas são descritos em EP 332104, PCT WO 93/21334 e PCT WO 97/06269 que são incorporados no presente documento por referência na sua totalidade. Os promotores compostos por porções de outros promotores e promotores parcialmente ou totalmente sintéticos também podem ser usados. Ver, por ex., Ni et al. (1995) Plant J. 7:661-676 e PCT WO 95/14098 descrevendo tais promotores para uso em plantas.

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34/94 [0057] Em uma modalidade desta invenção, uma sequência promotora específica para determinadas regiões ou tecidos de plantas pode ser usada para expressar as proteínas pesticidas da invenção, tais como promotores específicos para sementes (Datla, R. et al., 1997, Biotechnology Ann. Rev. 3, 269296), especialmente o promotor de napina (EP 255 378 A1), o promotor de faseolina, o promotor de glutenina, o promotor de heliantimina (WO92/17580), o promotor de albumina (WO98/45460), o promotor de oleosina (WO98/45461), o promotor SAT1 ou o promotor SAT3 (PCT/US98/06978).

[0058] Também pode ser feito uso de um promotor indutível vantajosamente escolhido entre a fenilalanina amônia liase (PAL), HMG-CoA redutase (HMG), quitinase, glucanase, inibidor de proteinase (PI), gene da família PR1, nopalina sintase (nos) e promotores vspB (US 5 670 349, Tabela 3), o promotor HMG2 (US 5 670 349), o promotor de beta-galactosidase de maçã (ABG1) e o promotor de aminociclopropano carboxilato sintase de maçã (ACC sintase) (WO98/45445). Podem ser usados múltiplos promotores nos construtos da invenção, incluindo em sucessão.

[0059] O promotor pode incluir, ou ser modificado de modo a incluir, um ou mais elementos potenciadores. Em algumas modalidades, o promotor pode incluir uma pluralidade de elementos potenciadores. Os promotores contendo elementos potenciadores proporcionam níveis mais elevados de transcrição em comparação com promotores que não os incluem. Elementos potenciadores adequados para uso em plantas incluem o elemento potenciador PCISV (Patente dos E.U.A. No. 5,850,019), o elemento potenciador CaMV 35S (Patentes dos E.U.A. Nos. 5,106,739 e 5,164,316) e o elemento potenciador FMV (Maiti et al. (1997) Transgenic Res. 6:143-156); o ativador de tradução do vírus do mosaico do tabaco (TMV) descrito no Pedido WO87/07644, ou do vírus da etching do tabaco (TEV)

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35/94 descrito por Carrington & Freed 1990, J. Virol. 64: 1590-1597, por exemplo, ou introns tais como o intron adh1 do maíz ou o íntron 1 da actina do arroz. Ver também os documentos PCT WO96/23898, WO2012/021794, WO2012/021797, WO2011 /084370 e WO2011 /028914.

[0060] Frequentemente, esses construtos podem conter regiões 5’ e 3' não traduzidas. Tais construtos podem conter uma sequência de sinal ou sequência líder de forma a facilitar o transporte co-translacional ou póstranslacional do peptídeo de interesse para certas estruturas intracelulares tal como o cloroplasto (ou outro plastídeo), retículo endoplasmático, ou aparelho de Golgi, ou para ser secretado. Por exemplo, o construto pode ser modificado de forma a conter um peptídeo sinal a fim de facilitar a transferência do peptídeo para o retículo endoplasmático. Por sequência de sinal se entende uma sequência que se sabe ou se suspeita que resulta no transporte co-translacional ou pós-translacional do peptídeo através da membrana celular. Nos eucariontes, isso envolve tipicamente a secreção para o aparelho de Golgi, com alguma glicosilação resultante. Por sequência líder se entende qualquer sequência que, quando traduzida, resulta em uma sequência de aminoácidos suficiente para desencadear o transporte cotranslacional da cadeia de peptídeo para uma organela sub-celular. Desse modo, isso inclui as sequências líderes que desencadeiam o transporte e/ou a glicosilação por passagem para o retículo endoplasmático, a passagem para vacúolos, plastídeos incluindo cloroplastos, mitocôndrias e semelhantes. Também pode ser preferível projetar o cassete de expressão da planta de forma a conter um íntron, de tal modo que é necessário o processamento do mRNA do íntron para a expressão.

[0061] Por região 3’ não traduzida” se entende um polinucleotídeo localizado a jusante de uma sequência de codificação. As sequências de sinal de

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36/94 poliadenilação e outras sequências codificando sinais reguladores capazes de afetar a adição de tratos de ácido poliadenílico para a extremidade 3’ do precursor de mRNA são regiões 3' não traduzidas. Por região 5’ não traduzida” se entende um polinucleotídeo localizado a montante de uma sequência de codificação.

[0062] Outros elementos não traduzidos a montante ou a jusante incluem potenciadores. Os potenciadores são polinucleotídeos que agem de modo a aumentar a expressão de uma região promotora. Os potenciadores são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados, à região potenciadora SV40 e ao elemento potenciador 35S.

[0063] A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação da transcrição, pode ser nativa com a sequência de DNA de interesse ligada de modo operacional, pode ser nativa com a planta hospedeira, ou pode ser derivada a partir de outra fonte (ou seja, estranha ou heteróloga relativamente ao promotor, a sequência de DNA de interesse, a planta hospedeira, ou qualquer combinação desses). Regiões de terminação convenientes estão disponíveis a partir do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tais como as regiões de terminação da octopina sintetase e nopalina sintetase. Ver também Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Ce//64:671-674; Sanfacon etal. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Ce//2:1261-1272; Munroe etal. (1990) Gene 91:151 -158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; e Joshi etal. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

[0064] Quando apropriado, o(s) gene(s) podem ser optimizados para expressão aumentada na célula hospedeira transformada (sequência de DNA sintética). Ou seja, os genes podem ser sintetizados usando códons preferidos da célula hospedeira para expressão melhorada, ou podem ser sintetizados utilizando códons a uma frequência de utilização dos códons preferidos do hospedeiro. A

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37/94 expressão do quadro de leitura aberta da sequência de DNA sintética em uma célula resulta na produção do polipeptídeo da invenção. As sequências de DNA sintéticas podem ser úteis de modo a simplesmente remover locais de endonuclease de restrição indesejados, de modo a facilitar estratégias de clonagem de DNA, a alterar ou remover qualquer enviesamento potencial de códon, a alterar ou melhorar o conteúdo de GC, a remover ou alterar quadros de leitura alternativos e/ou a alterar ou remover os locais de reconhecimento de junção íntron/éxon, locais de poliadenilação, sequências Shine-Delgarno, elementos promotores indesejados e semelhantes que podem estar presentes em uma sequência de DNA nativa. Geralmente, o conteúdo em GC do gene será aumentado. Ver, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1 -11 para uma discussão sobre o uso de códon preferido pelo hospedeiro. Estão disponíveis métodos na técnica para a síntese de genes preferidos pelas plantas. Ver, por exemplo, as Patentes dos E.U.A. Nos. 5,380,831, e 5,436,391, a Publicação da Patente dos E.U.A. No. 20090137409, e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporadas no presente documento por referência.

[0065] Também é possível que sequências de DNA sintéticas possam ser utilizadas para introduzir outras melhorias em uma sequência de DNA, tais como a introdução de uma sequência intrónica, criação de uma sequência de DNA que é expressa como uma fusão proteica a sequências direcionadas a organelas, tais como peptídeos de trânsito de cloroplastos, peptídeos de direcionamento apoplastos/vacuolares ou sequências peptídicas que resultam na retenção do peptídeo resultante no retículo endoplasmático. Desse modo, em uma modalidade, a proteína pesticida é direcionada para o cloroplasto para expressão. Desta forma, onde a proteína pesticida não está diretamente inserida no cloroplasto, o cassete de expressão irá conter, adicionalmente, um ácido nucleico codificando

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38/94 um peptídeo de trânsito de forma a dirigir a proteína pesticida para os cloroplastos. Tais peptídeos de trânsito são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; e Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

[0066] O gene pesticida a ser direcionado para o cloroplasto pode ser otimizado para expressão no cloroplasto, para ter em consideração as diferenças no uso de códons entre o núcleo da planta e essa organela. Desse modo, os ácidos nucleicos de interesse podem ser sintetizados usando códons preferidos por cloroplastos. Ver, por exemplo, a Patente dos E.U.A. N^Q. 5,380,831, incorporada neste documento para referência.

Transformação Vegetal [0067] Os métodos da invenção envolvem a introdução de um construto de nucleotídeo em uma planta. Por introdução se pretende apresentar à planta o construto de nucleotídeos de tal maneira que o construto ganha acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos da invenção não requerem que seja usado um método em particular para a introdução de um construto de um nucleotídeo em uma planta, mas apenas que o construto ganhe acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Métodos para introdução de construtos de nucleotídeos em plantas são conhecidos na técnica incluindo, mas não se limitando a, métodos de transformação estável, métodos de transformação transiente, e métodos mediados por vírus.

[0068] Por planta se entende plantas inteiras, órgãos vegetais (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes, células vegetais, propágulos, embriões e descendência das mesmas. As células vegetais podem ser

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39/94 diferenciadas ou indiferenciadas (por exemplo, caules, células de cultura de suspensão, protoplastos, células da folha, células da raiz, células do floema, pólen).

[0069] Plantas transgênicas ou plantas transformadas ou plantas ou células ou tecidos transformados de forma estável” se referem a plantas que tenham incorporado ou integrado sequências de ácidos nucleicos exógenos ou fragmentos de DNA na célula vegetal. Essas sequências de ácidos nucleicos incluem aquelas que são exógenas, ou não estão presentes na célula vegetal não transformada, bem como aquelas que podem ser endógenas, ou presentes na célula vegetal não transformada. Heterólogo geralmente se refere a sequências de ácidos nucleicos que não são endógenas da célula ou da parte do genoma nativo na qual estão presentes, e foram adicionadas à célula por infeção, transfeção, microinjeção, eletroporação, microprojeção ou semelhantes.

[0070] As plantas transgênicas da invenção expressam uma ou mais das novas sequências de toxina divulgadas neste documento. Em algumas modalidades, a proteína ou sequência nucleotídica da invenção é vantajosamente combinada em plantas com outros genes que codificam proteínas ou RNAs que conferem propriedades agronômicas úteis para essas plantas. Entre os genes que codificam proteínas ou RNAs que conferem propriedades agronômicas úteis nas plantas transformadas, se podem mencionar as sequências de DNA codificando proteínas que conferem tolerância a um ou mais herbicidas, e outras que conferem tolerância a certos insetos, aquelas que conferem tolerância a certas doenças, DNAs que codificam RNAs que fornecem controle de nematídeos ou insetos e semelhantes. Tais genes são em particular descritos nos Pedidos de Patente PCT WO91/02071 e WO95/06128 publicados e nas Patentes dos E.U.A. 7,923,602 e na Publicação do Pedido de Patente dos E.U.A. 20100166723, cada um dos quais é incorporado no presente documento na sua totalidade por referência.

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40/94 [0071] Entre as sequências de DNA codificando proteínas que conferem tolerância a certos herbicidas nas células vegetais e plantas transformadas, se pode mencionar um gene em barra ou PAT ou o gene Streptomyces coelicolor descrito em W02009/152359 que confere tolerância a herbicidas de glufosinato, um gene codificando EPSPS adequado que confere tolerância a herbicidas tendo EPSPS como alvo, tal como glifosato e sais do mesmo (US 4,535,060, US 4,769,061, US 5,094,945, US 4,940,835, US 5,188,642, US

4,971,908, US 5,145,783, US 5,310,667, US 5,312,910, US 5,627,061,US

5,633,435), um gene codificando a glifosato-n-acetiltransferase (por exemplo, US 8,222,489, US 8,088,972, US 8,044,261, US 8,021,857, US 8,008,547,US

7,999,152, US 7,998,703, US 7,863,503, US 7,714,188, US 7,709,702,US

7,666,644, US 7,666,643, US 7,531,339, US 7,527,955, e US 7,405,074), um gene codificando a oxidoleredutase de glifosato (por exemplo, US 5,463,175), ou um gene codificando uma proteína tolerante ao inibidor de HPPD (por exemplo, os genes de tolerância ao inibidor de HPPD descritos em WO 2004/055191, WO 199638567, US 6791014, WO2011/068567, WO2011/076345, WO2011/085221, WO2011/094205, WO2011/068567, WO2011/094199, WO2011/094205, WO2011/145015,

WO2012/056401 e WO2014/043435).

[0072] Entre as sequências de DNA codificando uma EPSPS adequada que confere tolerância aos herbicidas que têm EPSPS como um alvo, será mencionado mais particularmente o gene que codifica uma EPSPS vegetal, em particular EPSPS de maíz, particularmente um EPSPS de maíz que compreende duas mutações, particularmente uma mutação na posição de aminoácido 102 e uma mutação na posição de aminoácido 106 (W02004/074443), e que é descrita no Pedido de Patente dos E.U.A. 6566587, daqui em diante denominada EPSPS de maíz mutante duplo ou 2mEPSPS, ou o gene que codifica uma EPSPS isolada de

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41/94 a partir Agrobacterium e que é descrita pela sequência ID No. 2 e sequência ID No. 3 da Patente dos E.U.A. 5,633,435, também denominada CP4.

[0073] Entre as sequências de DNA codificando uma EPSPS adequada que confere tolerância aos herbicidas que têm EPSPS como alvo, será mais particularmente mencionado o gene que codifica um EPSPS GRG23 a partir de Arthrobacter globiformis, mas também os mutantes GRG23 ACE1, GRG23 ACE2 ou GRG23 ACE3, particularmente os mutantes ou variantes de GRG23 conforme descrito no documento W02008/100353, tal como GRG23 (ace3) R173K da SEQ ID No. 29 no documento W02008/100353.

[0074] No caso das sequências de DNA codificando EPSPS, e mais particularmente codificando os genes acima, a sequência codificando essas enzimas é vantajosamente precedida por uma sequência codificando um peptídeo de trânsito, em particular opeptídeo de trânsito optimizado” descrito na Patente dos E.U.A. 5,510,471 ou 5,633,448.

[0075] Traços de tolerância a herbicidas exemplares que podem ser combinados com a sequência de ácido nucleico da invenção incluem ainda pelo menos um inibidor de ALS (acetolactato sintase) (W02007/024782); um gene ALS/AHAS de Arabidopsis mutado (Patente dos E.U.A. 6,855,533); genes codificando 2,4-D-monoxigenases conferindo tolerância ao 2,4-D (ácido 2,4diclorofenoxiacético) por metabolização (Patente dos E.U.A. 6,153,401); e genes codificando monooxigenases de Dicamba conferindo tolerância a dicamba (ácido

3,6-dicloro-2-metoxibenzóico) por metabolização (US 2008/0119361 e US 2008/0120739).

[0076] Em várias modalidades, o ácido nucleico da invenção é empilhado com um ou mais genes tolerantes a herbicidas, incluindo um ou mais

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42/94 genes tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD, e/ou um ou mais genes tolerantes a glifosato e/ou glufosinato.

[0077] Entre as sequências de DNA codificando proteínas respeitantes a propriedades de tolerância a insetos, serão mencionadas mais particularmente as proteínas Bt amplamente descritas na literatura e bem conhecidas dos peritos na técnica. Serão também mencionadas as proteínas extraídas a partir de bactérias tais como Photorhabdus (WO97/17432 & WO98/08932).

[0078] Entre tais sequências de DNA codificando proteínas de interesse que conferem novas propriedades de tolerância a insetos, serão mencionadas mais particularmente as proteínas Bt Cry ou VIP amplamente descritas na literatura e bem conhecidas dos peritos na técnica. Essas incluem a proteína Cry 1F ou híbridos derivados de uma proteína Cry 1F (por exemplo, as proteínas Cry1A-Cry1F híbridas descritas nos documentos US 6,326,169; US 6,281,016; US 6,218,188, ou fragmentos tóxicos das mesmas), as proteínas do tipo Cry1 A ou fragmentos tóxicos das mesmas, preferencialmente a Proteína Cry1 Ac ou híbridos derivados da proteína CrylAc (por ex., a proteína Cry1 Ab-Cry1 Ac híbrida descrita no documento US 5,880,275) ou a proteína CrylAb ou Bt2 ou fragmentos inseticidas das mesmas conforme descrito no documento EP451878, as proteínas Cry2Ae, Cry2Af ou Cry2Ag conforme descrito no documento W02002/057664 ou fragmentos tóxicos das mesmas, a proteína Cry1 A. 105 descrita no documento WO 2007/140256 (SEQ ID No.7) ou um fragmento tóxico da mesma, a proteína VIP3Aa19 de acesso ao NCBIABG20428, a proteína VIP3Aa20 de acesso ao NCBI ABG20429 (SEQ ID No.2 no documento WO 2007/142840), as proteínas VIP3A produzidas nos eventos de algodão COT202 ou COT203 (W02005/054479 e WQ2005/054480, respectivamente), as proteínas Cry conforme descrito no

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43/94 documento W02001/47952, a proteína VIP3Aa ou um fragmento tóxico da mesma conforme descrito em Estruch et al. (1996), Proc Natl Acad Sei E.U.A. 28;93(11):5389-94 e US 6,291,156, as proteínas inseticidas a partir de estirpes de espécies Xenorhabdus (conforme descrito no documento WO98/50427), Serratia (particularmente a partir de S. entomophila) ou Photorhabdus, tais como proteínas Tea partir de Photorhabdus conforme descrito no documento WO98/08932 (por ex., Waterfield et al., 2001, Appl Environ Microbiol. 67(11):5017-24; Ffrench-Constant e Bowen, 2000, Cell Mol Life Sci.; 57(5):828-33). Também quaisquer variantes ou mutantes de qualquer uma dessas proteínas diferindo em alguns (1-10, preferencialmente 1-5) aminoácidos a partir de qualquer uma das sequências acima, particularmente a sequência do seu fragmento tóxico, ou que estão fundidos a um peptídeo de trânsito, tal como um peptídeo de trânsito de plastídeo, ou outra proteína ou peptídeo, são incluídos no presente documento.

[0079] Em várias modalidades, o ácido nucleico da invenção pode ser combinado em plantas com um ou mais genes conferindo um traço desejável, tais como tolerância a herbicidas, tolerância a insetos, tolerância à seca, controle de nematídeos, eficiência de uso de água, eficiência de uso de nitrogênio, valor nutricional melhorado, resistência a doenças, fotossíntese melhorada, qualidade da fibra melhorada, tolerância ao estresse, reprodução melhorada e semelhantes.

[0080] Eventos transgênicos particularmente úteis que podem ser combinados com os genes da presente invenção em plantas das mesmas espécies (por exemplo, cruzando ou re-transformando uma planta contendo outro evento transgênico com um gene quimérico da invenção), incluem o Evento 531/PVGHBK04 (algodão, controle de insetos, descrito no documento W02002/040677), Evento 1143-14A (algodão, controle de insetos, não depositado, descrito no documento W02006/128569); Evento 1143-51B (algodão, controle de insetos, não

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44/94 depositado, descrito no documento W02006/128570); Evento 1445 (algodão, tolerância a herbicidas, não depositado, descrito no documento US-A 2002-120964 ou W02002/034946); Evento 17053 (arroz, tolerância a herbicidas, depositado como PTA-9843, descrito no documento WO2010/117737); Evento 17314 (arroz, tolerância a herbicidas, depositado como PTA-9844, descrito no documento WO2010/117735); Evento 281-24-236 (algodão, controle de insetos - tolerância a herbicidas, depositado como PTA-6233, descrito no documento W02005/103266 ou US-A 2005-216969); Evento 3006-210-23 (algodão, controle de insetos tolerância a herbicidas, depositado como PTA-6233, descrito no documento US-A 2007-143876 ou W02005/103266); Evento 3272 (milho, traço de qualidade, depositado como PTA-9972, descrito no documento W02006/098952 ou US-A 2006-230473), Evento 33391 (trigo, tolerância a herbicidas, depositado como PTA2347, descrito no documento W02002/027004), Evento 40416 (milho, controle de insetos - tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-11508, descrito no documento WO 11/075593): Evento 43A47 (milho, controle de insetos - tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-11509, descrito no documento WO2011/075595); Evento 5307 (milho, controle de insetos, depositado como ATCC PTA-9561, descrito no documento WO2010/077816); Evento ASR-368 (grama curvada, tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-4816, descrito no documento US-A 2006-162007 ou W02004/053062); Evento B16 (milho, tolerância a herbicidas, não depositado, descrito no documento US-A 2003-126634); Evento BPS-CV127-9 (soja, tolerância a herbicidas, depositado como NCIMB No. 41603, descrito no documento WO2010/080829); Evento BLR1 (colza oleaginosa, restauro da esterilidade masculina, depositado como NCIMB 41193, descrito no documento W02005/074671), Evento CE43-67B (algodão, controle de insetos, depositado como DSM ACC2724, descrito no documento US-A 2009-217423 ou

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W02006/128573); Evento CE44-69D (algodão, controle de insetos, não depositado, descrito no documento US-A 2010-0024077); Evento CE44-69D (algodão, controle de insetos, não depositado, descrito no documento W02006/128571); Evento CE46-02A (algodão, controle de insetos, não depositado, descrito no documento W02006/128572); Evento COT102 (algodão, controle de insetos, não depositado, descrito no documento US-A 2006-130175 ou W02004/039986); Evento COT202 (algodão, controle de insetos, não depositado, descrito no documento US-A 2007067868 ou W02005/054479); Evento COT203 (algodão, controle de insetos, não depositado, descrito no documento W02005/054480);); Evento DAS21606-3/1606 (soja, tolerância a herbicidas, depositado como PTA-11028, descrito no documento WO2012/033794), Evento DAS40278 (milho, tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-10244, descrito no documento WO2011/022469); Evento DAS44406-6/pDAB8264.44.06.1 (soja, tolerância a herbicidas, depositado como PTA11336, descrito no documento WO2012/075426), Evento DAS-145367/pDAB8291.45.36.2 (soja, tolerância a herbicidas, depositado como PTA-11335, descrito no documento WO2012/075429), Evento DAS-59122-7 (milho, controle de insetos - tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA 11384, descrito no documento US-A 2006-070139); Evento DAS-59132 (milho, controle de insetos tolerância a herbicidas, não depositado, descrito no documento W02009/100188); Evento DAS68416 (soja, tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA10442, descrito no documento WO2011/066384 ou WO2011/066360); Evento DP098140-6 (milho, tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-8296, descrito no documento US-A 2009-137395 ou WO 08/112019); Evento DP-3054231 (soja, traço de qualidade, não depositado, descrito no documento US-A 2008312082 ou W02008/054747); Evento DP-32138-1 (milho, sistema de hibridação, depositado como ATCC PTA-9158, descrito no documento US-A 2009-0210970 ou

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W02009/103049); Evento DP-356043-5 (soja, tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-8287, descrito no documento US-A 2010-0184079 ou W02008/002872); Evento EE-1 (berinjela, controle de insetos, não depositado, descrito no documento WO 07/091277); Evento FI117 (milho, tolerância a herbicidas, depositado como ATCC 209031, descrito no documento US-A 2006059581 ou WO 98/044140); Evento FG72 (soja, tolerância a herbicidas, depositado como PTA-11041, descrito no documento WO2011/063413), Evento GA21 (milho, tolerância a herbicidas, depositado como ATCC 209033, descrito no documento USA 2005-086719 ou WO 98/044140); Evento GG25 (milho, tolerância a herbicidas, depositado como ATCC 209032, descrito no documento US-A 2005-188434 ou WO 98/044140); Evento GHB119 (algodão, controle de insetos - tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-8398, descrito no documento W02008/151780); Evento GHB614 (algodão, tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA6878, descrito no documento US-A 2010-050282 ou W02007/017186); Evento GJ11 (milho, tolerância a herbicidas, depositado como ATCC 209030, descrito no documento US-A 2005-188434 ou W098/044140); Evento GM RZ13 (beterraba sacarina, resistência a vírus, depositado como NCIMB-41601, descrito no documento WO2010/076212); Evento H7-1 (beterraba sacarina, tolerância a herbicidas, depositado como NCIMB 41158 ou NCIMB 41159, descrito no documento US-A 2004-172669 ou WO 2004/074492); Evento JOPLIN1 (trigo, tolerância a doenças, não depositado, descrito no documento US-A 2008-064032); Evento LL27 (soja, tolerância a herbicidas, depositado como NCIMB41658, descrito no documento W02006/108674 ou US-A 2008-320616); Evento LL55 (soja, tolerância a herbicidas, depositado como NCIMB 41660, descrito no documento WO 2006/108675 ou US-A 2008-196127); Evento LLcotton25 (algodão, tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-3343, descrito no documento

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W02003/013224 ou US-A 2003-097687); Evento LLRICE06 (arroz, tolerância a herbicidas, depositado como ATCC 203353, descrito no documento US 6,468,747 ou W02000/026345); Evento LLRice62 (arroz, tolerância a herbicidas, depositado como ATCC 203352, descrito no documento W02000/026345), Evento LLRICE601 (arroz, tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-2600, descrito no documento US-A 2008-2289060 ou W02000/026356); Evento LY038 (milho, traço de qualidade, depositado como ATCC PTA-5623, descrito no documento US-A 2007-028322 ou W02005/061720); Evento MIR162 (milho, controle de insetos, depositado como PTA-8166, descrito no documento US-A 2009-300784 ou W02007/142840); Evento MIR604 (milho, controle de insetos, não depositado, descrito no documento US-A 2008-167456 ou W02005/103301); Evento MON15985 (algodão, controle de insetos, depositado como ATCC PTA-2516, descrito no documento US-A 2004-250317 ou W02002/100163); Evento MON810 (milho, controle de insetos, não depositado, descrito no documento US-A 2002102582); Evento MON863 (milho, controle de insetos, depositado como ATCC PTA2605, descrito no documento W02004/011601 ou US-A 2006-095986); Evento MON87427 (milho, controle de polinização, depositado como ATCC PTA-7899, descrito no documento WO2011/062904); Evento MON87460 (milho, tolerância ao estresse, depositado como ATCC PTA-8910, descrito no documento W02009/111263 ou US-A 2011-0138504); Evento MON87701 (soja, controle de insetos, depositado como ATCC PTA-8194, descrito no documento US-A 2009130071 ou W02009/064652); Evento MON87705 (soja, traço de qualidade tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-9241, descrito no documento US-A 2010-0080887 ou WO2010/037016); Evento MON87708 (soja, tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-9670, descrito no documento WO2011/034704); Evento MON87712 (soja, rendimento, depositado como PTA

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10296, descrito no documento WO2012/051199), Evento MON87754 (soja, traço de qualidade, depositado como ATCC PTA-9385, descrito no documento WO2010/024976); Evento MON87769 (soja, traço de qualidade, depositado como ATCC PTA-8911, descrito no documento US-A 2011-0067141 ou W02009/102873); Evento MON88017 (milho, controle de insetos - tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-5582, descrito no documento US-A 2008028482 ou W02005/059103); Evento MON88913 (algodão, tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-4854, descrito no documento W02004/072235 ou USA 2006-059590); Evento MON88302 (colza oleaginosa, tolerância a herbicidas, depositado como PTA-10955, descrito no documento WO2011/153186), Evento MON88701 (algodão, tolerância a herbicidas, depositado como PTA-11754, descrito no documento WO2012/134808), Evento MON89034 (milho, controle de insetos, depositado como ATCC PTA-7455, descrito no documento WO 07/140256 ou US-A 2008-260932); Evento MON89788 (soja, tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-6708, descrito no documento US-A 2006-282915 ou W02006/130436); Evento MS11 (colza oleaginosa, controle de polinização tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-850 ou PTA-2485, descrito no documento W02001/031042); Evento MS8 (colza oleaginosa, controle de polinização - tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-730, descrito no documento W02001/041558 ou US-A 2003-188347); Evento NK603 (milho, tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-2478, descrito no documento US-A 2007-292854); Evento PE-7 (arroz, controle de insetos, não depositado, descrito no documento W02008/114282); Evento RF3 (colza oleaginosa, controle de polinização - tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-730, descrito no documento W02001/041558 ou US-A 2003-188347); Evento RT73 (colza oleaginosa, tolerância a herbicidas, não depositado, descrito no documento

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W02002/036831 ou US-A 2008-070260); Evento SYHT0H2/SYN-000H2-5 (soja, tolerância a herbicidas, depositado como PTA-11226, descrito no documento WO2012/082548), Evento T227-1 (beterraba sacarina, tolerância a herbicidas, não depositado, descrito no documento W02002/44407 ou US-A 2009-265817); Evento T25 (milho, tolerância a herbicidas, não depositado, descrito no documento US-A 2001-029014 ou W02001 /051654); Evento T304-40 (algodão, controle de insetos tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-8171, descrito no documento US-A 2010-077501 ou W02008/122406); Evento T342-142 (algodão, controle de insetos, não depositado, descrito no documento W02006/128568); Evento TC1507 (milho, controle de insetos - tolerância a herbicidas, não depositado, descrito no documento US-A 2005-039226 ou W02004/099447); Evento VIP1034 (milho, controle de insetos - tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-3925, descrito no documento W02003/052073), Evento 32316 (milho, controle de insetos - tolerância a herbicidas, depositado como PTA-11507, descrito no documento WO2011/084632), Evento 4114 (milho, controle de insetos - tolerância a herbicidas, depositado como PTA-11506, descrito no documento WO2011/084621), evento EEGM3/FG72 (soja, tolerância a herbicidas, N^Q de Acesso de ATCC PTA-11041) opcionalmente empilhado com evento EE- GM1/LL27 ou evento EE-GM2/LL55 (WO2011/063413A2), evento DAS-68416-4 (soja, tolerância a herbicidas, N^Q de Acesso de ATCC PTA-10442, WO2011/066360A1), evento DAS-68416-4 (soja, tolerância a herbicidas, N^Q de Acesso de ATCC PTA-10442, WO2011/066384A1), evento DP-040416-8 (milho, controle de insetos, N^Q de Acesso de ATCC PTA11508, WO2011/075593A1), evento DP-043A47-3 (milho, controle de insetos, N^Qde Acesso de ATCC PTA-11509, WO2011/075595A1), evento DP-004114-3 (milho, controle de insetos, N^Q de Acesso de ATCC PTA-11506, WO2011/084621A1), evento DP-032316-8 (milho, controle de insetos, N^Q de Acesso de ATCC PTA

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11507, WO2011/084632A1), evento MON-88302-9 (colza oleaginosa, tolerância a herbicidas, N^Qde Acesso de ATCC PTA-10955, WO2011/153186A1), evento DAS21606-3 (soja, tolerância a herbicidas, N^Q de Acesso de ATCC PTA-11028, WO2012/033794A2), evento MON-87712-4 (soja, traço de qualidade, N^Q de Acesso de ATCC PTA-10296, WO2012/051199A2), evento DAS-44406-6 (soja, tolerância a herbicidas empilhados, N^Q de Acesso de ATCC PTA-11336, WO2012/075426A1), evento DAS-14536-7 (soja, tolerância a herbicidas empilhados, N^Q de Acesso de ATCC PTA-11335, WO2012/075429A1), evento SYN-000H2-5 (soja, tolerância a herbicidas, N^Q de Acesso de ATCC PTA-11226, WO2012/082548A2), evento DP061061 -7 (colza oleaginosa, tolerância a herbicidas, sem N^Q de depósito disponível, W02012071039A1), evento DP-073496-4 (colza oleaginosa, tolerância a herbicidas, sem N^Q de depósito disponível, US2012131692), evento 8264.44.06.1 (soja, tolerância a herbicidas empilhados, N.^Q de Acesso PTA-11336, WO2012075426A2), evento 8291.45.36.2 (soja, tolerância a herbicidas empilhados, N.^Q de Acesso PTA-11335, WO2012075429A2), evento SYHT0H2 (soja, N^Q de Acesso de ATCC PTA-11226, WO2012/082548A2), evento MON88701 (algodão, N^Q de Acesso de ATCC PTA-11754, WO2012/134808A1), evento KK179-2 (alfafa, N^Q de Acesso de ATCC PTA-11833, W02013/003558A1), evento pDAB8264.42.32.1 (soja, tolerância a herbicidas empilhados, N^Q de Acesso de ATCC PTA-11993, WO2013/010094A1), evento MZDT09Y (milho, N^Q de Acesso de ATCC PTA-13025, WO2013/012775A1).

[0081] A transformação de células vegetais pode ser efetuada por uma de várias técnicas conhecidas na técnica. O gene pesticida da invenção pode ser modificado de modo a se obter ou aumentar a expressão em células vegetais. Tipicamente, um construto que expressa uma tal proteína irá conter um promotor para conduzir a transcrição do gene, bem como uma região não traduzida 3' de

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51/94 modo a permitir a terminação da transcrição e a poliadenilação. A organização de tais construtos é bem conhecida na técnica. Em alguns casos, pode ser útil projetar o gene de tal modo que é segregado o peptídeo resultante, ou de outro modo atingido dentro da célula vegetal. Por exemplo, o gene pode ser modificado de forma a conter um peptídeo de sinal a fim de facilitar a transferência do peptídeo para o retículo endoplasmático. Também pode ser preferível projetar o cassete de expressão da planta de forma a conter um íntron, de tal modo que é necessário o processamento do mRNA do íntron para a expressão.

[0082] Tipicamente esse cassete de expressão vegetal será inserido em um vetor de transformação vegetal. Esse vetor de transformação vegetal pode ser composto por um ou mais vetores de DNA necessários para alcançar a transformação vegetal. Por exemplo, é uma prática comum na técnica a utilização de vetores de transformação vegetal que são compostos por mais do que um segmento de DNA contíguos. Esses vetores são frequentemente referidos na técnica como vetores binários. Os vetores binários, bem como os vetores com plasmídeos auxiliares são mais frequentemente usados para a transformação mediada por Agrobacterium, em que a dimensão e complexidade dos segmentos de DNA necessários para atingirem transformação eficiente são bastante grandes, e é vantajoso separar as funções para as moléculas de DNA separadas. Os vetores binários contêm tipicamente um vetor de plasmídeo que contém as necessárias sequências de atuação cis para a transferência do T-DNA (tais como limite esquerdo e limite direito), um marcador selecionável que é concebido de modo a ser capaz da expressão em uma célula vegetal e um gene de interesse (um gene concebido de modo ser capaz da expressão em uma célula vegetal para a qual é desejada a geração de plantas transgênicas). Também estão presentes nesse vetor de plasmídeo as sequências necessárias para a replicação bacteriana. As sequências

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52/94 de atuação cis são dispostas de uma forma de modo a permitirem a eficiente transferência em células vegetais e de expressão das mesmas. Por exemplo, o gene marcador selecionável e o gene pesticida estão localizados entre os limites esquerdo e direito. Muitas vezes um segundo vetor plasmídeo contém os fatores de atuação trans que medeiam a transferência do T-DNA da Agrobacterium para células vegetais. Esse plasmídeo contém frequentemente as funções de virulência (genes Vir) que permitem a infeção das células vegetais por Agrobacterium, e a transferência de DNA por divagem em sequências de limite e transferência de DNA mediado por vir, conforme é entendido na técnica (Hellens e Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Podem ser usados vários tipos de estirpes de Agrobacterium (por ex. LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) para a transformação vegetal. O segundo vetor plasmídeo não é necessário para a transformação vegetal através de outros métodos, tais como microprojeção, microinjeção, eletroporação, polietilenoglicol, etc.

[0083] Em geral, os métodos de transformação vegetal envolvem a transferência de DNA heterólogo para células da planta alvo (por ex., embriões imaturos ou maduros, culturas em suspensão, calos indiferenciados, protoplastos, etc.), seguido pela aplicação de um nível limiar máximo de seleção apropriada (dependendo do gene marcador selecionável) de forma a recuperar as células vegetais transformadas a partir de um grupo de massa de células não transformadas. Os explantes são tipicamente transferidos para um novo fornecimento do mesmo meio e cultivados de forma rotineira. Subsequentemente, as células transformadas são diferenciadas em rebentos após a colocação em meio de regeneração suplementado com um nível limiar máximo de agente de seleção. Os rebentos são então transferidos para um meio de enraizamento seletivo de modo a recuperar rebentos ou plântulas enraizadas. A plântula transgênica cresce então

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53/94 para uma planta madura e produz sementes férteis (por ex. Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida etal. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Os explantes são tipicamente transferidos para um novo fornecimento do mesmo meio e cultivados de forma rotineira. Uma descrição geral das técnicas e métodos para a geração de plantas transgênicas é encontrada em Ayres e Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 e Bommineni e Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Uma vez que o material transformado contém muitas células; tanto as células transformadas como as não transformadas, estão presentes em qualquer parte do calo ou tecido ou grupo de células alvo. A capacidade para exterminar células não transformadas e permitir que as células transformadas proliferem resulta em culturas vegetais transformadas. Muitas vezes, a capacidade de remover as células não-transformadas é uma limitação para a rápida recuperação das células vegetais transformadas e para a geração com sucesso de plantas transgênicas.

[0084] Os protocolos de transformação bem como os protocolos para introdução de sequências de nucleotídeos em plantas podem variar dependendo do tipo de planta ou de célula vegetal, i. e., monocotiledônea ou dicotiledônea, direcionadas para transformação. A geração de plantas transgênicas pode ser efetuada por um de vários métodos, incluindo, mas não limitado a, microinjeção, eletroporação, transferência genética direta, introdução de DNA heterólogo por Agrobacterium nas células vegetais (transformação mediada por Agrobacterium), bombardeamento de células vegetais com DNA heterólogo estranho aderido às partículas, aceleração de partículas balísticas, transformação por feixe de aerossol (Pedido Publicado dos E.U.A. N^Q. 20010026941; Patente dos E.U.A. N^Q. 4,945,050; Publicação Internacional N°. WO 91/00915; Pedido Publicado dos E.U.A. N^Q. 2002015066), transformação Led, e vários outros métodos de mediação-direção de não-partículas para a transferência de DNA.

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54/94 [0085] Os métodos para a transformação de cloroplastos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Svab etal. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 87:8526-8530; Svab e Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 90:913917; Svab e Maliga (1993) EMBO J. 12:601 -606. O método se apoia na entrega por uma arma de partículas de DNA contendo um marcador selecionável e desencadeamento do DNA para o genoma do plastídeo através da recombinação homóloga. Adicionalmente, a transformação dos plastídeos pode ser efetuada por transativação de um transgene silencioso transportado por plastídio através da expressão preferível do tecido, de uma polimerase de RNA codificada no núcleo e direcionada para o plastídio. Esse sistema foi relatado em McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 91:7301-7305.

[0086] Após a integração do DNA heterólogo estranho nas células vegetais, em seguida, se aplica um nível limiar máximo de adequada seleção ao meio para exterminar as células não transformadas e separar e proliferar as células putativamente transformadas que sobrevivem desse tratamento de seleção através da transferência regular para um meio fresco. Através da passagem contínua e desafio com a seleção apropriada, se identificam e proliferam as células que são transformadas com o vetor de plasmídeo. Podem então ser usados métodos moleculares e bioquímicos de modo a confirmar a presença do gene heterólogo integrado de interesse no genoma da planta transgênica.

[0087] As células que foram transformadas podem ser cultivadas em plantas, de acordo com formas convencionais. Ver, por exemplo McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Essas plantas podem então ser cultivadas, e também polinizadas com a mesma estirpe transformada ou com diferentes estirpes, e o híbrido resultante tendo expressão constitutiva da caraterística fenotípica identificada desejada. Podem ser cultivadas duas ou mais gerações para assegurar

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55/94 que a expressão da característica fenotípica desejada é estavelmente mantida e herdada e depois as sementes colhidas para assegurar que a expressão da característica fenotípica desejada foi alcançada. Desse modo, a presente invenção confere semente transformada (também referida como semente transgênica) tendo um construto de nucleotídeos da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, incorporado de forma estável no seu genoma.

Avaliação da Transformação Vegetal [0088] Após a introdução do DNA heterólogo estranho nas células vegetais, a transformação ou a integração do gene heterólogo no genoma vegetal é confirmada através de vários métodos, tais como a análise dos ácidos nucleicos, proteínas e metabolites associados com o gene integrado.

[0089] A Análise de PCR é um método rápido para pesquisar células transformadas, tecidos ou rebentos, para a presença do gene incorporado na fase anterior antes do transplante para o solo (Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NI). A PCR é efetuada usando iniciadores oligonucleotídicos específicos para o gene de interesse ou vetor de fundo de Agrobacterium, etc.

[0090] A transformação vegetal pode ser confirmada por análise de transferência Southern Blot do DNA genômico (Sambrook e Russell, 2001, supra). Em geral, o DNA total é extraído a partir do transformante, digerido com as enzimas de restrição apropriadas, fracionado em um gel de agarose e transferido para uma membrana de nitrocelulose ou de nylon. A membrana ou blot é então sondada com, por exemplo, fragmento de DNA alvo radioativamente marcado com ³²P de modo a confirmar a integração do gene introduzido no genoma vegetal de acordo com técnicas padrão (Sambrook e Russell, 2001, supra).

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56/94 [0091] Na análise de Northern Blot, o RNA é isolado a partir de tecidos específicos do transformante, fracionado em um gel de agarose de formaldeído, e transferido para um filtro de nylon de acordo com os procedimentos padrão que são rotineiramente usados na técnica (Sambrook e Russell, 2001, supra). A expressão de RNA codificada pelo gene pesticida é então testada por hibridização do filtro com uma sonda radioativa derivada a partir de um gene pesticida, por métodos conhecidos na técnica (Sambrook e Russell, 2001, supra).

[0092] A Western blot, os ensaios bioquímicos e semelhantes podem ser efetuados em plantas transgênicas de forma a confirmar a presença da proteína codificada pelo gene pesticida através de procedimentos padrão (Sambrook e Russell, 2001, supra) usando anticorpos que se ligam a um ou mais epítopos presentes na proteína pesticida.

Atividade Pesticida Em Plantas [0093] Em outro aspeto da invenção, se podem gerar plantas transgênicas expressando uma proteína pesticida, que tem atividade pesticida. Os métodos acima descritos por meio de exemplo podem ser utilizados de modo a gerar plantas transgênicas, mas a maneira na qual as células vegetais transgênicas são geradas não é crítica para esta invenção. Métodos conhecidos ou descritos na técnica tais como a transformação mediada por Agrobacterium, a transformação biolística, e os métodos mediados por não partículas podem ser usados ao gosto do experimentador. As plantas que expressam uma proteína pesticida podem ser isoladas por meio de métodos comuns descritos na técnica, por exemplo por transformação do calo, seleção de calo transformado, e regeneração de plantas férteis a partir desse calo transgênico. Em tal processo, se pode usar qualquer gene como marcador selecionável, desde que a sua expressão em células vegetais confira a capacidade de identificar ou selecionar as células transformadas.

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57/94 [0094] Foi desenvolvido um número de marcadores para uso com células vegetais, tais como resistência a cloranfenicol, o aminoglicosídeo G418, higromicina ou semelhantes. Outros genes que codificam um produto envolvido no metabolismo dos cloroplastos também podem ser usados como marcadores selecionáveis. Por exemplo, genes que conferem resistência a herbicidas vegetais tais como glifosato, bromoxinila ou imidazolinona podem encontrar uso particular. Tais genes foram relatados (Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (gene nitrilase da resistência a bromoxinila); e Sathasivan etal. (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188 (gene da resistência a AHAS imidazolinona). Adicionalmente, os genes divulgados neste documento, são úteis como marcadores para avaliar a transformação de células bacterianas ou vegetais. Os métodos para detectar a presença de um transgene em uma planta, órgão vegetal (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes, célula vegetal, propágulo, embrião ou progenitura do mesmo são bem conhecidos na técnica. Em uma modalidade, a presença do transgene é detectada por meio de testes de atividade pesticida.

[0095] Plantas férteis expressando uma proteína pesticida podem ser testadas quanto à atividade pesticida, e as plantas apresentando uma atividade ótima selecionadas para reprodução adicional. Na técnica estão disponíveis métodos para testar a atividade das pragas. Geralmente, a proteína é misturada e usada em testes de alimentação. Ver, por exemplo Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293.

[0096] A presente invenção pode ser usada para a transformação de quaisquer espécies vegetais, incluindo, mas não se limitando a, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos de plantas de interesse incluem, mas não estão limitadas a, milho (maíz), sorgo, trigo, girassol, tomate, crucíferas, pimentas, batata, algodão, arroz, soja, beterraba sacarina, cana-de-açúcar, tabaco, cevada, e colza

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58/94 oleaginosa, Brassica sp., alfafa, centeio, painço, cártamo, amendoim, batata-doce, mandioca, café, coco, abacaxi, citrinos, cacau, chá, banana, abacate, figo, goiaba, manga, azeitona, papaia, caju, macadâmia, amêndoa, aveia, legumes, ornamentais e coníferas.

[0097] Os legumes incluem, mas não estão limitados a, tomate, alface, feijão verde, feijão, ervilhas, e membros do gênero Curcumis tais como pepino, melão e meloa. As ornamentais incluem, mas não estão limitados a, azálea, hortênsia, hibiscos, rosas, tulipas, narcisos, petúnias, cravos, poinséttia e crisântemo. De preferência, as plantas da presente invenção são plantas de cultivo (por exemplo, maíz, sorgo, trigo, girassol, tomate, crucíferas, pimentas, batata, algodão, arroz, soja, beterraba sacarina, cana-de-açúcar, tabaco, cevada, colza oleaginosa, etc.).

Uso No Controle Pesticida [0098] Os métodos gerais para utilização das estirpes compreendendo uma sequência nucleotídica da presente invenção, ou uma variante da mesma, no controle de pragas ou no desenvolvimento de outros organismos como agentes pesticidas são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, a Patente dos E.U.A. N^Q. 5,039,523 e EP 0480762A2.

[0099] As estirpes Bacillus contendo uma sequência nucleotídica da presente invenção, ou uma variante da mesma, ou os microrganismos que foram geneticamente alterados de modo a conterem o gene pesticida da invenção e a proteína podem ser usados de modo a protegerem as culturas agrícolas e os produtos das pragas. Em um aspeto da invenção, a totalidade, ou seja, as células não lisadas de um organismo produtor de toxina (pesticida), são tratadas com reagentes que prolongam a atividade da toxina produzida na célula quando a célula é aplicada ao ambiente da(s) praga(s) alvo.

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59/94 [0100] Alternativamente, o pesticida é produzido através da introdução de um gene pesticida em um hospedeiro celular. A expressão do gene pesticida resulta, direta ou indiretamente, na produção e manutenção do pesticida intracelular. Em um aspeto desta invenção, essas células são então tratadas sob condições que prolongam a atividade da toxina produzida na célula quando a célula é aplicada ao ambiente da(s) praga(s) alvo. O produto resultante retém a toxicidade da toxina. Esses pesticidas naturalmente encapsulados podem ser formulados de acordo com as técnicas convencionais para aplicação no ambiente hospedeiro de uma praga alvo, por exemplo, solo, água e folhagem das plantas. Ver, por exemplo EPA 0192319 e as referências citadas no mesmo. Alternativamente, se pode formular as células expressando um gene desta invenção, de modo a permitir a aplicação do material resultante, como um pesticida.

[0101 ] Os ingredientes ativos da presente invenção são normalmente aplicados na forma de composições e podem ser aplicados à área da cultura ou à planta a ser tratada, simultaneamente ou em sucessão, com outros compostos. Esses compostos podem ser fertilizantes, herbicidas, crioprotetores, surfatantes, detergentes, sabões pesticidas, óleos dormentes, polímeros, e/ou tempo de liberação, ou formulações de transportadores biodegradáveis que permitam a administração a longo prazo de uma área alvo seguida de uma única aplicação da formulação. Esses também podem ser herbicidas seletivos, inseticidas químicos, virucidas, microbicidas, amoebicidas, pesticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, moluscicidas ou misturas de várias dessas preparações, se desejado, em conjunto com outros veículos agricolamente aceitáveis, surfatantes ou adjuvantes promotores da aplicação habitualmente empregues na técnica da formulação. Adjuvantes e transportadores adequados podem ser sólidos ou líquidos e correspondem às substâncias comumente empregues na tecnologia da

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60/94 formulação, por exemplo, substâncias minerais regeneradas ou naturais, solventes, dispersantes, agentes umidificadores, agentes de pegajosidade, aglutinantes ou fertilizantes. Da mesma forma, as formulações podem ser preparadas em iscos comestíveis ou preparadas em armadilhas de pragas de forma a permitirem a alimentação ou a ingestão por uma praga alvo da formulação pesticida.

[0102] Os métodos de aplicação de um ingrediente ativo da presente invenção ou uma composição agroquímica da presente invenção, que contém pelo menos uma das proteínas pesticidas produzidas pelas estirpes bacterianas da presente invenção incluem a aplicação nas folhas, o revestimento da semente e a aplicação no solo. O número de aplicações e a taxa de aplicação dependem da intensidade da infestação pela praga correspondente.

[0103] A composição pode ser formulada como um pó, poeira, pélete, grânulo, pulverização, emulsão, coloide, solução, ou semelhantes, e pode ser preparada por meios convencionais tais como dessecação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação, ou concentração de uma cultura de células compreendendo o polipeptídeo. Em todas essas composições que contêm, pelo menos, um tal polipeptídeo pesticida, o polipeptídeo pode estar presente em uma concentração desde cerca de 1% a cerca de 99% em peso.

[0104] As pragas de lepidópteros, hemípteros, dípteros, ou coleópteros podem ser exterminadas ou reduzidas em número em uma determinada área através dos métodos da invenção, ou podem ser profilaticamente aplicados a uma área do meio ambiente de modo a evitar a infestação de uma praga susceptível. De preferência, a praga ingere, ou é colocada em contato com, uma quantidade eficaz de modo pesticida do polipeptídeo. Por quantidade eficaz de modo pesticida se entende uma quantidade de pesticida que é capaz de provocar

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61/94 a morte de pelo menos uma das pragas, ou de reduzir visivelmente o crescimento, alimentação, ou desenvolvimento fisiológico normal das pragas. Por exemplo, o pesticida pode resultar na redução da eclosão dos ovos, mortalidade em qualquer estágio do desenvolvimento do inseto, redução da muda e/ou redução da alimentação da praga em organismos alvo (por ex., número reduzido de locais de alimentação de uma planta ou célula vegetal e/ou danos reduzidos a uma planta ou célula vegetal). Esta quantidade irá variar dependendo de fatores tais como, por exemplo, as pragas-alvo específicas a serem controladas, o ambiente específico, localização, planta, culturas, ou local agrícola a ser tratado, as condições ambientais, e o método, velocidade, concentração, estabilidade, e quantidade da aplicação da composição de polipeptídeo eficaz de modo pesticida. As formulações também podem variar em relação às condições climáticas, considerações ambientais, e/ou frequência de aplicação e/ou a gravidade da infestação das pragas.

[0105] As composições pesticidas descritas podem ser feitas através da formulação quer das células bacterianas, do cristal e/ou da suspensão de esporos, ou do componente isolado da proteína com o desejado transportador agricolamente aceitável. As composições podem ser formuladas antes da administração em meios apropriados tal como liofilizadas, secas por congelação, dessecadas, ou em um transportador aquoso, meio ou diluente adequado, tal como soro fisiológico ou outro tampão. As composições formuladas podem estar na forma de uma poeira ou material granuloso, ou uma suspensão em óleo (vegetal ou mineral), ou água ou emulsões de óleo/água, ou como um pó umectante, ou em combinação com qualquer outro material transportador adequado para aplicação agrícola. Os transportadores agrícolas adequados podem ser sólidos ou líquidos e são bem conhecidos na técnica. O termo transportador agricolamente aceitável

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62/94 cobre todos os adjuvantes, componentes inertes, dispersantes, surfatantes, agentes de pegajosidade, aglutinantes, etc., que são normalmente usados na tecnologia da formulação de pesticidas; esses são bem conhecidos dos peritos na formulação pesticida. As formulações podem ser misturadas com um ou mais adjuvantes sólidos ou líquidos e preparadas por vários meios, por ex., misturando homogeneamente, mesclando e/ou moendo a composição pesticida com adjuvantes adequados usando técnicas de formulação convencionais. As formulações adequadas e os métodos de aplicação são descritos na Patente dos E.U.A. N^Q. 6,468,523, incorporada neste documento para referência.

[0106] Pragas inclui, mas não estão limitadas a, insetos, fungos, bactérias, nematódeos, ácaros, carrapatos e semelhantes. As pragas de insetos incluem insetos selecionados a partir das ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Coleoptera, Lepidoptera, e Diptera.

[0107] A ordem Coleoptera inclui as subordens Adéfaga e Polífaga. A subordem Adefaga inclui as superfamílias Caraboidea e Girinoidea, enquanto a subordem Polifaga inclui as superfamílias Hidrofiloidea, Stafilinoidea, Cantaroidea, Cleroidea, Elateroidea, Dasciloidea, Driopoidea, Birroidea, Cucujoidea, Meloidea, Mordeloidea, Tenebrionoidea, Bostricoidea, Scarabaeoidea, Cerambicoidea, Crisomeloidea e Curculionoidea. A superfamília Caraboidea inclui as famílias Cicindelidae, Carabidae e Ditiscidae. A superfamília Girinoidea inclui a família Girinidae. A superfamília Hydrofiloidea inclui a família Hydrofilidae. A superfamília Staflinoidea inclui as famílias Silfidae e Stafilinidae. A superfamília Cantaroidea inclui as famílias Cantharidae e Lampyridae. A superfamília Cleroidea inclui as famílias Cleridae e Dermestidae. A superfamília Elateroidea inclui as famílias

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Elateridae e Buprestidae. A superfamília Cucujoidea inclui a família Cocinellidae. A superfamília Meloidea inclui a família Meloidae. A superfamília Tenebrionoidea inclui a família Tenebrionidae. A superfamília Scarabaeoidea inclui as famílias Passalidae e Scarabaeidae. A superfamília Cerambicoidea inclui a família Cerambicidae. A superfamília Crisomeloidea inclui a família Crisomelidae. A superfamília Curculionoidea inclui as famílias Curculionidae and Scolytidae.

[0108] A ordem Diptera inclui as subordens Nematocera, Bracicera e Ciclorrafa. A subordem Nematocera inclui as famílias Tipulidae, Psicodidae, Culicidae, Ceratopogonidae, Cironomidae, Simulidae, Bibionidae e Cecidomiidae. A subordem Bracicera inclui as famílias Stratiomidae, Tabanidae, Therevidae, Asilidae, Mididae, Bombilidae e Dolicopodidae. A subordem Ciclorrafa inclui as divisões Asciza e Asciza. A divisão Asciza inclui as famílias Phoridae, Sirfidae e Conopidae. A divisão Asciza inclui as famílias Acaliptratae e Caliptratae. A seção Acaliptratae inclui as famílias Otitidae, Tefritidae, Agromizidae e Drosofilidae. A seção Caliptratae inclui as famílias Hipoboscidae, Oestridae, Tacinidae, Antomiidae, Muscidae, Califoridae e Sarcofagidae.

[0109] A ordem Lepidóptera inclui as famílias Papilionidae, Pieridae, Licaenidae, Nimfalidae, Danaidae, Satiridae, Hesperidae, Sfingidae, Saturnidae, Geometridae, Arctidae, Noctuidae, Limantridae, Sesidae e Tineidae.

[0110] Os nematídeos incluem nematídeos parasitas tais como os nematídeos dos nódulos radiculares, cisto e nematoides das lesões, incluindo Heterodera spp., Meloidogyne spp., e Globodera spp.; particularmente membros dos nematoides cista, nematoide, incluindo, mas não se limitando a, Heterodera glycines (nematoide de Cisto da Soja.); Heterodera schachtii (nematoide dourado da beterraba); Heterodera avenae ( nematideo do cisto dos cereais); e Globodera

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64/94 rostochiensis Globodera pailida (nematideo do cisto da batata). Nematideos das lesões incluem Pratylenchus spp.

[0111] Pragas de hemipteras (que incluem espécies que são designadas como Hemiptera, Homoptera ou Heteroptera) incluem, mas não se limitam a, Lygus spp., tais como o inseto da planta manchado ocidental (Lygus hesperus), o inseto manchado da planta (Lygus lineolaris), inseto das plantas verdes (Lygus elisus); afídeos,tais como o afídeo do pêssego verde (Myzus persicae), afídeo do algodão (Aphis gossypii), afídeo das cerejas ou afídeo das ginjas (Myzus cerasi), afídeo da soja (Aphis glycines Matsumura); cigarrinha marrom do arroz (Nilaparvata lugens), e gafanhoto verde do arroz (Nephotettix spp.); e percevejos tais como o percevejo verde (Acrosternum hilare), percevejo-fedorento (Halyomorpha halys), percevejo-da-soja (Nezara viridula), percevejo do arroz (Oebalus pugnax), escudo vermelho (Pentatoma rufipes), percevejo europeu (Rhaphigaster nebulosa), e o inseto de escudo Troilus luridus.

[0112] As pragas de insetos da invenção para as culturas principais incluem: Maíz: Ostrinia nubilalis, praga quarentenária; Agrotis ipsilon, lagarta rosca; Helicoverpa zea, lagarta-da-espiga; Spodoptera frugiperda, lagarta-do-cartucho; Diatraea grandiosella, broca grande da cana-de-açúcar; Elasmopalpus lignosellus, lagarta elasmo; Diatraea saccharalis, broca-do-colmo; Diabrotica virgiferayeme da raiz do milho ocidental; Diabrotica longicornis barberi, verme da raiz do milho do norte; Diabrotica undecimpunctata howardi, verme da raiz do milho do sul; Melanotus spp., larva-arame; Cyclocephala borealis, besouro mascarado do norte (besouro branco); Cyclocephala immaculata, besouro mascarado do sul (besouro branco); Popillia japonica, besouro japonês; Chaetocnema pulicaria, pulginha do milho e do arroz; Sphenophorus maidis, gorgulho-da-cana; Rhopalosiphum maidis, pulgão do milho; Anuraphis maidiradicis, pulgão da raiz do milho; Blissus

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65/94 leucopterus leucopterus, percevejo-das-gramineas; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de perna vermelha; Melanoplus sanguinipes, gafanhoto migratório; Hylemya platura, mosca das leguminosas; Agromyza parvicornis, mineiros das folhas do milho; Anaphothrips obscrurus, tripes da grama; Solenopsis milesta, formiga ladrão; Tetranychus urticae, ácaro rajado; Sorgo: Chilo partellus, broca do milho; Spodoptera frugiperda, lagarta-do-cartucho; Spodoptera cosmioides; Spodoptera eridania; Helicoverpa zea, lagarta da espiga; Elasmopalpus lignosellus, lagarta elasmo; Feltia subterrânea, lagarta “rosca” do fumo; Phyllophaga crinita,escaravelho branco; Eleodes, Conoderus, e Aeolus spp., besouros; Oulema melanopus, besouro da folha do cereal; Chaetocnema pulicaria, pulginha do milho e do arroz; Sphenophorus maidis, gorgulho-da-cana; Rhopalosiphum maidis; pulgão do milho; Sipha fiava, pulgão amarelo da cana; Blissus leucopterus leucopterus, percevejo-das-gramineas; Contarinia sorghicola, mosca do sorgo; Tetranychus cinnabarinus, aranhiço-vermelho-comum; Tetranychus urticae, Ácaro rajado; Trigo: Pseudaletia unipunctata, lagarta militar; Spodoptera frugiperda, lagarta-docartucho; Elasmopalpus lignosellus, lagarta elasmo; Agrotis orthogonia, lagarta rosca do oeste; Elasmopalpus lignosellus, lagarta elasmo; Oulema melanopus, besouro da folha do cereal; Hypera punctata, gorgulho do trevo; Diabrotica undecimpunctata howardi, verme da raiz do milho do sul; pulgão russo do trigo; Schizaphis graminum, pulgão-verde-dos-cereais; Macrosiphum avenae, Pulgão-daespiga; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de perna vermelha; Melanoplus differentialis, gafanhoto diferencial; Melanoplus sanguinipes, gafanhoto migratório; Mayetiola destructor, mosca de hessian; Sitodiplosis mosellana, mosquito do trigo; Meromyza americana, verme do caule do trigo; Hylemya coarctata, mosca do bolbo do trigo; Frankliniella fusca, tripes do tabaco; Cephus cinctus, mosca do caule do trigo; Aceria tulipae, ácaro do chochamento do alho; Girassol: Suleima helianthana,

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66/94 traça broto de girassol; Homoeosoma electellum, traça do girassol; Zygogramma exclamationis, souro de girassol; Bothyrus gibbosus, besouro da cenoura; Neolasioptera murtfeldtiana, mosca da semente do girassol; Algodão: Heliothis virescens, lagarta da maçã; Helicoverpa zea, lagarta-da-espiga; Spodoptera exigua, borboleta noturna; Pectinophora gossypiella, lagarta-rosada; Anthonomus grandis, bicudo-do-algodoeiro; Aphis gossypii, pulgão-do-algodoeiro; Pseudatomoscelis seriatus, pulgão do algodão; Trialeurodes abutilonea, mosca branca; Lygus lineolaris, percevejo lygus; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de perna vermelha; Melanoplus differentialis, gafanhoto diferencial; Thrips tabaci, tripes-do-fumo; Frankliniella fusca, tripés; Tetranychus cinnabarinus, aranhiço-vermelho-comum; Tetranychus urticae, ácaro rajado; Arroz: Diatraea saccharalis, broca-do-colmo; Spodoptera frugiperda, lagarta-do-cartucho; Spodoptera cosmioides; Spodoptera eridania; Helicoverpa zea, colaspis do arroz; Lissorhoptrus oryzophilus, bicheira-daraiz-norte-americana; Sitophilus oryzae, gorgulho do arroz; Nephotettix nigropictus, cigarrinha do arroz; Blissus leucopterus leucopterus, percevejo-das-gramíneas; Acrosternum hilare, percevejo-acrosterno; Chilu suppressalis, broca do arroz asiática; Soja: Pseudoplusia includens, lagarta falsa-medideira; Anticarsia gemmatalis, lagarta-da-soja; Plathypena scabra, cloverworm verde; Ostrinia nubilalis praga quarentenária; Agrotis ipsilon, lagarta rosca; Spodoptera exigua, borboleta noturna; Spodoptera cosmioides; Spodoptera eridania; Heliothis virescens,lagarta do algodão; Helicoverpa zea, lagarta-da-espiga; Epilachna varivestis, besouro do feijão mexicano; Myzus persicae, pulgão-verde-dopessegueiro; Empoasca fabae, cigarrinha da batata; Acrosternum hilare, percevejoacrosterno; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de perna vermelha; Melanoplus differentialis, Gafanhoto diferencial; Hylemya platura, mosca das leguminosas; Sericothrips variabilis, tripés da soja; Thrips tabaci, tripes-do-fumo; Tetranychus

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67/94 turkestani, ácaro dos morangos; Tetranychus urticae, ácaro rajado; Cevada: Ostrinia nubilalis, praga quarentenária; Agrotis ipsilon, lagarta rosca; Schizaphis graminum, pulgão-verde-dos-cereais; Blissus leucopterus leucopterus, percevejodas-gramineas; Acrosternum hilare, percevejo-acrosterno; Euschistus servus, percevejo marrom neártico; Euschistus heros, percevejo marrom neártico neotropical; Delia platura, mosca das sementes; Mayetiola destructor, mosca de Hessian; Petrobia latens, ácaro marron do trigo; Colza Oleaginosa: Brevicoryne brassicae, piolho-da-couve; Phyllotreta cruciferae, besouro-pulga; Mamestra configurata, lagarta; Plutella xylostella, traça das crucíferas; Delia ssp., larva das raízes.

Métodos Para Aumentar O Rendimento Vegetal [0113] São conferidos métodos para aumentar o rendimento vegetal. Os métodos compreendem o conferir de uma planta ou célula vegetal expressando um polinucleótido codificando a sequência polipeptídica pesticida divulgada neste documento, e crescer a planta ou uma semente da mesma em um campo infestado (ou suscetível de ser infestado) por uma praga contra a qual o referido polipeptídeo possui atividade pesticida. Em algumas modalidades, o polipeptídeo possui atividade pesticida contra uma praga de lepidópteros, coleópteros, dípteros, hemípteros ou nematídeos, e o dito campo é infestado por uma praga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, dípteros ou nematídeos. Tal como definido no presente documento, o rendimento de uma planta se refere à qualidade e/ou quantidade de biomassa produzida pela planta. Por biomassa se entende qualquer produto medido da planta. Um aumento na produção de biomassa é qualquer melhoria no rendimento do produto da planta medido. O aumento do rendimento da planta tem várias aplicações comerciais. Por exemplo, o aumento da biomassa da folha da planta pode aumentar o rendimento dos vegetais folhosos para consumo

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68/94 humano ou animal. Além disso, o aumento da biomassa da folha pode ser usado para aumentar a produção de produtos farmacêuticos ou industriais derivados da planta. Um aumento no rendimento pode compreender qualquer aumento estatisticamente significativo incluindo, mas não limitado a, pelo menos um aumento de 1%, pelo menos um aumento de 3%, pelo menos um aumento de 5%, pelo menos um aumento de 10%, pelo menos um aumento de 20%, de pelo menos de 30%, de pelo menos 50%, de pelo menos 70%, de pelo menos de 100% ou superior no rendimento em comparação com uma planta que não expressa a sequência pesticida. Em métodos específicos, o rendimento da planta é aumentado como um resultado de uma melhoria na resistência a pragas da planta que expressa uma proteína pesticida divulgada neste documento. A expressão da proteína pesticida resulta em uma capacidade reduzida de uma praga em infestar ou se alimentar a partir da planta.

[0114] As plantas também podem ser tratadas com uma ou mais composições químicas, incluindo um ou mais herbicidas, inseticidas ou fungicidas. Exemplos de composições químicas incluem: Herbicidas para Frutos/Lequmes e Hortaliças: Atrazina, Bromacila, Diurão, Glifosato, Linurão, Metribuzina, Simazina, Trifluralina, Fluazifope, Glufosinato, Halosulfurão Gowan, Paraquato, Propizamida, Setoxidime, Butafenacila, Halosulfurão, Indaziflame; Inseticidas para Frutos/Lequmes e Hortaliças: Aldicarbe, Bacillus thuringiensis, Carbarila, Carbofurano, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Abamectina, Ciflutrina/betaciflutrina, Esfenvalerato, Lambda-cialotrina, Acequinocila, Bifenazato, Metoxifenozida, Novalurão, Cromafenozida, Tiaclopride, Dinotefurão, Fluacripirim, Espirodiclofena, Gama-cialotrina, Espiromesifena, Espinosade, Rinaxipir, Ciazipir, Triflumurão, Espirotetramate, Imidaclopride, Flubendiamida, Tiodicarbe, Metaflumizona, Sulfoxaflor, Ciflumetofena, Cianopirafena, Clotianidina,

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Tiametoxame, Espinotorame, Tiodicarbe, Flonicamida, Metiocarbe, Benzoato de Emamectina, Indoxacarbe, Fenamifos, Piriproxifeno, Óxido de fenbutatina; Fungicidas para Frutos/Legumes e Hortaliças: Ametotradina, Azoxistrobina, Bentiavalicarbe, Boscalid, Captano, Carbendazima, Clorotalonila, Cobre, Ciazofamida, Ciflufenamida, Cimoxanila, Ciproconazol, Ciprodinila, Difenoconazol, Dimetomorfe, Ditianona, Fenamidona, Fenexamida, Fluaziname, Fludioxonila, Fluopicolide, Fluopirame, Fluoxastrobina, Fluxapiroxade, Folpet, Fosetila, Iprodiona, Iprovalicarbe, Isopirazam, Cresoxima-metila, Mancozebe, Mandipropamida, Metalaxila/mefenoxame, Metirame, Metrafenona, Miclobutanila, Penconazol, Pentiopirade, Picoxistrobina, Propamocarbe, Propiconazol, Propinebe, Proquinazida, Protioconazol, Piraclostrobina, Pirimetanila, Quinoxifena, Espiroxamina, Enxofre, Tebuconazol, Tiofanato-metila, Trifloxistrobina; Herbicidas para Cereais: 2,4-D, Amidosulfurão, Bromoxinila, Carfentrazona-E, Clorotolurão, Clorsulfurão, Clodinafope-P, Clopiralida, Dicamba, Diclofope-M, Diflufenicano, Fenoxaprope, Florasulame, Flucarbazona-NA, Flufenacete, Flupirosulfurão-M, Fluroxipire, Flurtamona, Glifosato, lodosulfurona, loxinila, Isoproturão, MCPA, Mesosulfurão, Metsulfurão, Pendimetalina, Pinoxadeno, Propoxicarbazona, Prosulfocarbe, Piroxsulame, Sulfosulfurona, Tifensulfurona, Tralcoxidima, Triasulfurona, Tribenurona, Trifluralina, Tritosulfurona; Fungicidas para Cereais:

Azoxistrobina, Bixafeno, Boscalide, Carbendazima, Clorotalonila, Ciflufenamida,

Ciproconazol, Ciprodinila, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fenpropidina, Fenpropimorfe, Fluopirame, Fluoxastrobina, Fluquinconazol, Fluxapiroxade, Isopirazame, Cresoxima-metila, Metconazol, Metrafenona, Pentiopirade,

Picoxistrobina,	Procloraze, Propiconazol, Proquinazida, Protioconazol,
Piraclostrobina,	Quinoxifeno, Espiroxamina, Tebuconazol, Tiofanate-metila,
Trifloxistrobina;	Inseticidas para Cereais: D i m etoato, Lam bda-ci altri n a,

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Deltametrina, alfa-Cipermetrina, B-ciflutrina, Bifentrina, Imidaclopride, Clotianidina, Tiametoxame, Tiaclopride, Acetamipride, Dinetofurão, Clorfirifos, Pirimicarbe, Metiocarbe, Sulfoxaflore; Herbicidas para Milho: Atrazina, Alacloro, Bromoxinila, Acetocloro, Dicamba, Clopiralida, (S-)Dimetenamida, Glufosinato, Glifosato, Isoxaflutol, (S-)Metolacloro, Mesotriona, Nicosulfurão, Primisulfurão, Rimsulfurão, Sulcotriona, Foramsulfurão, Topramezona, Tembotriona, Saflufenacila, Tiencarbazona, Flufenacete, Piroxasulfona; Inseticidas para Milho: Carbofurão, Clorpirifos, Bifentrina, Fipronila, Imidaclopride, Lambda-Ci-halotrina, Teflutrina, Terbufos, Tiametoxame, Clotianidina, Espiromesifeno, Flubendiamida, Triflumurão, Rinaxipir, Deltametrina, Tiodicarbe, B-Ciflutrina, Cipermetrina, Bifentrina, Lufenurão, Tebupirimfos, Etiprol, Ciazipir, Tiaclopride, Acetamipride, Dinetofurano,

Avermectina; Fungicidas para Milho: Azoxistrobina. Bixafenr, Boscalida, Ciproconazol, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fenitropano, Fluopirame,

Fluoxastrobina, Fluxapiroxade, Isopirazame, Metconazol, Pentiopirade,

Picoxistrobina, Propiconazol, Protioconazol, Piraclostrobina, Tebuconazol, Trifloxistrobina; Herbicidas para Arroz: Butacloro. Propanila, Azimsulfurão, Bensulfurão, Cialofope, Daimurão, Fentrazamida, Imazosulfurão, Mefenacete, Oxaziclomefona, Pirazosulfurão, Piributicarbe, Quincloraque, Tiobencarbe, Indanofane, Flufenacete, Fentrazamida, Halosulfurão, Oxaziclomefona, Benzobiciclona, Piriftalide, Penoxsulame, Bispiribac, Oxadiargila, Etoxisulfurão, Pretilacloro, Mesotriona, Tefuriltriona, Oxadiazona, Fenoxaprope, Pirimisulfano; Inseticidas para Arroz: Diazinona. Fenobucarbe, Benfuracarbe, Buprofezina, Dinotefurane, Fipronila, Imidaclopride, Isoprocarbe, Tiaclopride, Cromafenozide, Clotianidine, Etiprol, Flubendiamide, Rinaxipire, Deltametrina, Acetamipride, Tiametoxame, Ciazipire, Espinosade, Espinotorame, Emamectina-Benzoato, Cipermetrina, Clorpirifos, Etofenprox, Carbofurane, Benfuracarbe, Sulfoxaflor;

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Fungicidas para Arroz: Azoxistrobina, Carbendazime, Carpropamide, Diclocimete, Difenoconazol, Edifenfos, Ferimzona, Gentamicina, Hexaconazol, Himexazol, Iprobenfos (IBP), Isoprotiolane, Isotianila, Casugamicina, Mancozebe, Metominostrobina, Orisastrobina, Pencicurão, Probenazol, Propiconazol, Propinebe, Piroquilona, Tebuconazol, Tiofanato-metila, Tiadinila, Triciclazol, Trifloxistrobina, Validamicina; Herbicidas para algodão: Diurão. Fluometurão, MSMA, Oxifluorfeno, Prometrina, Trifluralina, Carfentrazona, Cletodime, Fluazifopbutila, Glifosato, Norflurazona, Pendimetalina, Piritiobac-sódio, Trifloxisulfurão, Tepraloxidime, Glufosinato, Flumioxazina, Tidiazurão; Inseticidas para Algodão: Acetato, Aldicarbe, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Abamectina, Acetamipride, Benzoato de Emamectina, Imidaclopride, Indoxacarbe, LambdaCialotrina, Espinosade, Tiocarbe, Gama-cialotrina, Espiromesifeno, Piridalila, Flonicamida, Flubendiamida, Triflumurão, Rinaxipir, Beta-ciflutrina, Espirotetramato, Clotianidina, Tiametoxame, Tiaclopride, Dinetofurano, Flubendiamida, Ciazipir, Espinosade, Espinotorame, gama Cialotrina, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il)metil](2,2difluoroetil)amino]furan-2(5H)-ona, Tiocarbe, Avermectina, Flonicamida, Piridalila, Espiromesifeno, Sulfoxaflor; Fungicidas para algodão: Azoxistrobina, Bixafeno, Boscalide, Carbendazime, Clorotalonila, Cobre, Ciproconazol, Difenoconazol, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fenamidona, Fluaziname, Fluopirame, Fluoxastrobina, Fluxapiroxade, Iprodiona, Isopirazame, Isotianila, Mancozebe, Manebe, Metominostrobina, Pentiopirade, Picoxistrobina, Propinebe, Protioconazol, Piraclostrobina, Quintozene, Tebuconazol, Tetraconazol, Tiofanato-metila, Trifloxistrobina; Herbicidas para soja: Alacloro, Bentazona, Trifluralina, ClorimurãoEtila, Cloransulame-Metila, Fenoxaprope, Fomesafeno, Fluazifope, Glifosato, Imazamox, Imazaquina, Imazetapir, (S-)Metolacloro, Metribuzina, Pendimetalina, Tepraloxidima, Glufosinato; Inseticidas para soja: Lambda-cialotrina. Metomila,

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Imidaclopride, Clotianidina, Tiametoxame, Tiaclopride, Acetamipride, Dinetofurano, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, Espinosade, Espinotorame, Benzoate de Emamectina, Fipronila, Etiprol, Deltametrina, B-Ciflutrina, gamae lambda Cialotrina,

4-[[(6-Cloropiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Espirotetramato, Espinodiclofeno, Triflumurão, Flonicamida, Tiodicarbe, beta-Ciflutrina; Fungicidas para Sola: Azoxistrobina. Bixafeno, Boscalide, Carbendazime, Clorotalonila, Cobre, Ciproconazol, Difenoconazol, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fluaziname, Fluopirame, Fluoxastrobina, Flutriafol, Fluxapiroxade, Isopirazame, Iprodiona, Isotianila, Mancozebe, Manebe, Metconazol, Metominostrobina, Miclobutanila, Pentiopirade, Picoxistrobina, Propiconazol, Propinebe, Protioconazol, Piraclostrobina, Tebuconazol, Tetraconazol, Tiofanato-metila, Trifloxistrobina; Herbicidas para sola: Cloridazona. Desmedifame, Etofumesato, Fenmedifame, Trialato, Clopiralida, Fluazifope, Lenacila, Metamitrão, Quinmeraque, Cicloxidime, Triflusulfurão, Tepraloxidime, Quizalofope; Inseticidas de Beterraba: Imidaclopride. Clotianidina, Tiametoxame, Tiaclopride, Acetamipride, Dinetofurano, Deltametrina, B-Ciflutrina, gamma/lambda Cialotrina, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il)metil](2,2difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Teflutrina, Rinaxipir, Ciaxipir, Fipronila, Carbofurão; Herbicidas para Canola: Clopiralid. Diclofope, Fluazifope, Glufosinate, Glifosato, Metazacloro, Trifluralina Etametsulfurão, Quinmeraque, Quizalofope, Cletodime, Tepraloxidime; Fungicidas para Canola: Azoxistrobina. Bixafen, Boscalide, Carbendazime, Clorotalonila, Cobre, Ciproconazol, Difenoconazol, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fluaziname, Fluopirame, Fluoxastrobina, Flusilazol, Fluxapiroxade, Iprodiona, Iprodiona, Isopirazam, cloreto de Mepiquato, Metconazol, Metominostrobina, Paclobutrazol, Pentiopirade, Picoxistrobina, Procloraze, Protioconazol, Piraclostrobina, Tebuconazol, Tiiofanato-metila, Trifloxistrobina, Vinclozolina; Inseticidas para Canola: Carbofurano. Tiaclopride, Deltametrina,

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Imidaclopride, Clotianidina, Tiametoxame, Acetamipride, Dinetofurano, B-Ciflutrina, gamma e lambda Cialotrina, tau-Fluvaleriato, Etiprol, Espinosade, Espinotorame, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il)metil](2,2difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona.

Métodos De Introdução Do Gene Da Invenção Em Outra Planta [0115] No presente documento também são fornecidos métodos de introdução do ácido nucleico da invenção em outra planta. O ácido nucleico da invenção, ou um fragmento do mesmo, pode ser introduzido na segunda planta por seleção recorrente, cruzamento cruzado, reprodução de linhagem, seleção de linha, seleção de massa, reprodução de mutação e/ou seleção melhorada de marcadores genéticos.

[0116] Assim, em uma modalidade, os métodos da invenção compreendem o cruzamento de uma primeira planta compreendendo um ácido nucleico da invenção com uma segunda planta de modo a produzir plantas de descendência F1 e selecionar plantas de descendência F1 que compreendem o ácido nucleico da invenção. Os métodos adicionalmente podem compreender o cruzamento das plantas descendentes selecionadas com a primeira planta compreendendo o ácido nucleico da invenção de modo a produzir plantas descendentes de cruzamento cruzado e a selecionar plantas descendentes de cruzamento cruzado que compreendem o ácido nucleico da invenção. Os métodos para avaliar a atividade pesticida são fornecidos noutro local deste documento. Os métodos adicionalmente podem compreender repetir esses passos uma ou mais vezes em sucessão de modo a produzir plantas descendentes de segundo cruzamento cruzado ou superior selecionadas que compreendem o ácido nucleico da invenção.

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74/94 [0117] Qualquer método de reprodução envolvendo seleção de plantas para o fenótipo desejado pode ser usado no método da presente invenção. Em algumas modalidades, as plantas F1 podem ser auto-polinizadas de forma a produzir uma geração F2 segregante. Plantas individuais podem então ser selecionadas que representam o fenótipo desejado (por exemplo, atividade pesticida) em cada geração (F3, F4, F5, etc.) até que os traços sejam homozigóticos ou fixos dentro de uma população reprodutora.

[0118] A segunda planta pode ser uma planta com um traço desejado, tal como tolerância a herbicidas, tolerância a insetos, controle de nematídeos, eficiência de uso de água, eficiência de uso de nitrogênio, valor nutricional melhorado, resistência a doenças, fotossíntese melhorada, qualidade da fibra melhorada, tolerância ao estresse, reprodução melhorada e semelhantes. A segunda planta pode ser um evento de elite, conforme descrito noutro local do presente documento.

[0119] Em várias modalidades, as partes vegetais (plantas inteiras, órgãos vegetais (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes, células vegetais, propágulos, embriões e semelhantes) podem ser colhidas a partir do cruzamento resultante e tanto propagadas como coletadas para uso a jusante (tal como alimentos, ração, biocombustível, óleo, farinha, farelo, etc).

Métodos De Obtenção De Um Produto Vegetal [0120] A presente invenção também se refere a um processo para obtenção de um produto de base, compreendendo a colheita e/ou moagem dos grãos de uma colheita compreendendo um ácido nucleico da invenção de forma a obter o produto de base. Produtos agronômicos e comercialmente importantes e/ou composições de matéria, incluindo mas não limitados a alimentos para animais, produtos de base e produtos e subprodutos vegetais que se destinam a ser usados

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75/94 como alimentos para consumo humano ou para uso em composições e produtos de base que se destinam ao consumo humano, particularmente produtos de sementes/grãos desvitalizados, incluindo produtos (semi) processados produzidos a partir desses grãos/sementes, em que o referido produto é ou compreende sementes ou grãos inteiros ou processados, alimento animal, farelo de milho ou soja, farinha de milho ou soja, milho, amido de milho, farelo de soja, farinha de soja, flocos, concentrado de proteína de soja, isolados de proteína de soja, concentrado de proteína de soja texturizada, cosméticos, produtos capilares, manteiga de amendoim de soja, natto, tempeh, proteína de soja hidrolisada, cobertura batida, encurtamento, lecitina, soja integral comestível (crua, torrada ou como edamame), iogurte de soja, queijo de soja, tofu, yuba, bem como grãos cozidos, polidos, cozidos no vapor, estufados ou parboilizados e semelhantes devem estar dentro do âmbito da presente invenção se esses produtos e composições de matéria contiverem quantidades detectáveis das sequências de nucleotídeos e/ou aminoácidos definidas no presente documento como sendo diagnóstico para qualquer planta contendo tais sequências nucleotídicas.

[0121] Os seguintes exemplos são apresentados para efeitos de ilustração e não como modo de limitação.

Exemplos Experimentais

Exemplo 1. Descoberta de novos genes pesticidas [0122] Novos genes pesticidas foram identificados a partir de uma estirpe de Bacillus cereus usando os seguintes passos:

- Sequenciamento do DNA fragmentado por métodos de pirosequenciamento de elevado rendimento.

- Identificação dos genes de toxinas putativas através de homologia e/ou de outras análises computacionais.

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Tabela 1. genes b	p005 identificados
Nome do gene	Peso Molecular (kD)	Homólogo mais próximo	SEQ ID NO do nucleotídeo	SEQ ID NO do aminoácido
bp005 bp005(trun) bp005v04 bp005v06	19,7	99% YvgO	69 70 71	1 2 3 4

[0123] O bp005 foi sintetizado e clonado no vetor marcado com His de modo a criar o plasmídeo pGHis-bp005.0 clone foi confirmado por sequenciação e o pGHis-bp005 foi transformado em células competentes para BI21. Uma única colônia foi inoculada em meio de LB e cultivada a 37 °C até à fase log, e induzida com IPTG a 0,5 mM a 20 °C por 16 horas. Ο BP005 purificado foi submetido a bioensaio versus pragas de hemípteros selecionadas de acordo com protocolo padrão. O bp005 era ativo contra Nezara viridula (75% de mortalidade).

[0124] Homólogos de bp005 foram identificados a partir das estirpes bacterianas listadas na Tabela 2. Os homólogos também foram submetidos a bioensaio vs. Nezara viridula de acordo com protocolos padrão. Os resultados dos bioensaios são mostrados na Tabela 2.

Tabela 2. Atividade de homólogos de bp005 contra Nezara viridula

Nome do gene	Espécies de Estirpe de Origem	SEQ ID NO de AA	SEQ ID NO do Nt	Homologia (% de identidade) relativa a bp005v04 (SEQ ID NO: 4)	Percentagem de Mortalidade contra Nezara viridula	Percentagem de Muda
Axmi2042(v02)	Bacillus cereus	6	73	87	97%	0%
Axmi2054(v02)	Bacillus cereus	8	75	86	59%	0%
Axmi2147(v01)	Bacillus cytotoxicus	9	76	91	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
Axmi2148(v01)	Bacillus cereus	10	77	92	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo

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Nome do gene	Espécies de Estirpe de Origem	SEQ ID NO de AA	SEQ ID NO do Nt	Homologia (% de identidade) relativa a bp005v04 (SEQ ID NO: 4)	Percentagem de Mortalidade contra Nezara viridula	Percentagem de Muda
Axmi2149(v01)	Bacillus cytotoxicus	11	78	91	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
Axmi2150(v01)	Bacillus pumilus	12	79	95	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
Axmi2151(v01)	Bacillus thuringiensis	13	80	93	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
Axmi2152(v01)	Bacillus cytotoxicus	14	81	92	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
Axmi2153(v01)	Bacillus thuringiensis	15	82	92	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
Axmi2154(v01)	Bacillus thuringiensis	16	83	91	71%	0%
Axmi2155(v01)	Bacillus weihenstephanensis	17	84	88	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
Axmi2156(v01)	Bacillus thuringiensis	18	85	91	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
Axmi2157(v01)	Bacillus cytotoxicus	19	86	92	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
Axmi2158(v01)	Bacillus cytotoxicus	20	87	93	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
Axmi2159(v01)	Bacillus thuringiensis	21	88	95	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
Axmi2160(v01)	Bacillus weihenstephanensis	22	89	92	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
Axmi2161(v01)	Bacillus weihenstephanensis	23	90	91	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
Axmi2162(v01)	Bacillus cereus	24	91	85	50%	0%
Axmi2163(v01)	Bacillus thuringiensis	25	92	91	50%	0%
Axmi2164(v01)	Bacillus thuringiensis	26	93	93	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
Axmi2165(v01)	Bacillus thuringiensis	27	94	90	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
Axmi2166(v01)	Bacillus thuringiensis	28	95	92	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
Axmi2167(v01)	Bacillus thuringiensis	29	96	93	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
Axmi2168(v01)	Bacillus cereus	30	97	86	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo

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Nome do gene	Espécies de Estirpe de Origem	SEQ ID NO de AA	SEQ ID NO do Nt	Homologia (% de identidade) relativa a bp005v04 (SEQ ID NO: 4)	Percentagem de Mortalidade contra Nezara viridula	Percentagem de Muda
Axmi2169(v01)	Bacillus thuringiensis	31	98	94	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
Axmi2170(v01)	Bacillus thuringiensis	32	99	90	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
Axmi2171(v01)	Bacillus thuringiensis	33	100	89	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
Axmi2172(v01)	Bacillus cytotoxicus	34	101	91	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
Axmi2173(v01)	Bacillus thuringiensis	35	102	95	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
Axmi2174(v01)	Bacillus thuringiensis	36	103	95	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
Axmi2175(v01)	Bacillus thuringiensis	37	104	91	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
Axmi2176(v01)	Bacillus pumilus	38	105	90	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo

[0125] Para elucidar potenciais resíduos de aminoácidos que podem ser críticos para a função de bp005, foi feita uma série de mutações em bp005v04 (SEQ ID NO: 3) e testada contra Nezara viridula. Os resultados do bioensaio são mostrados na Tabela 3.

Tabela 3. Atividade de mutantes de bpC	)05 contra Nezara viridula
ID do Mutante	SEQ ID NO do aminoácido	Percentagem de Mortalidade contra Nezara viridula	Percentagem de Muda
bp004v04 (controle)	3	17%	0%
A15G	39	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
D6S	40	29%	0%
D74H	41	Não ativo	Não ativo
D85S	42	25%	0%
Dec (L5F, S29P, V35M, R46K, N55A, R61H, N63R, Y73L, I97D, H111Y)	43	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
E87Q	44	Não ativo	Não ativo
H111Y	45	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo

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ID do Mutante	SEQ ID NO do aminoácido	Percentagem de Mortalidade contra Nezara viridula	Percentagem de Muda
I97D	46	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
K113E	47	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
L5F	48	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
N23K	49	Não ativo	Não ativo
N55A	50	46%	0%
N57G	51	50%	0%
N63R	52	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
Oct (D6S, A15G, V35C, N57G, V72N, D74H, D85S, E87Q)	53	Não ativo	Não ativo
Quad (R19A, N23K, T26Q, K113E)	54	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
Quadl (L5F, V35M, Y73L, I97D)	55	Não ativo	Não ativo
Quad2 (S29P, R46K, N55A, H111Y)	56	88%	0%
Quint (D6S, A15G, V35C, D74H, D85S)	57	Não ativo	Não ativo
R19A	58	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
R46K	59	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
R61H	60	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
S29P	61	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
T26Q	62	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
Tri (N57G, V72N, E87Q)	63	58%	0%
V35C	64	Não testado ou inconclusivo	Não testado ou inconclusivo
V35M	65	Não ativo	Não ativo
V72N	66	58%	0%
Y73L	67	42%	4%

Exemplo 2. Análise da composição de aminoácido de homólogos e variantes de bp005 [0126] Uma análise computacional foi realizada de forma a identificar motivos potencialmente críticos que podem ser capazes de distinguir homólogos de

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80/94 bp005 ativos de inativos. As sequências ativas e inativas confirmadas foram inicialmente alinhadas usando MEGA. As sequências foram então divididas em trigramas de aminoácidos (isto é, uma janela deslizante de grupos de três aminoácidos), e depois codificadas em índices. As sequências codificadas e as suas informações de atividade foram então usadas para construir um classificador de árvore de decisão. As posições de sequência identificadas pelo classificador como as mais significativas na classificação foram então listadas, e os trigramas críticos que aparecem nesses locais foram identificados. O trigrama mais significativo nessa análise foi o trigrama correspondente às posições 35-37 do bp005v04.

[0127] Foi realizada uma comparação das sequências de aminoácidos de todos os homólogos que eram ativos contra Nezara viridula e os resíduos que aparecem em 95% dos homólogos possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com bp005v04 estão indicados na Tabela 4. Um X na coluna 2 da Tabela 4 sugere que o aminoácido nessa posição é variável entre os homólogos.

Tabela 4. Composição de homólogos de bpOO	5
Posição do aminoácido em relação a bp005v04	Aminoácido
1	M
2	S
3	A
4	N
5	L
6	X
7	V
8	X

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Posição do aminoácido em relação a bp005v04	Aminoácido
9	X
10	D
11	V
12	L
13	G
14	I
15	A
16	N
17	X
18	I
19	R
20	B
21	A
22	I
23	N
24	X
25	Q
26	T
27	N
28	R
29	X
30	G
31	F
32	V

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Posição do aminoácido em relação a bp005v04	Aminoácido
33	K
34	G
35	V
36	M
37	E
38	S
39	T
40	F
41	Y
42	X
43	A
44	G
45	Q
46	X
47	Y
48	N
49	V
50	M
51	V
52	F
53	N
54	L
55	X
56	Q

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MM

Posição do aminoácido em relação a bp005v04	Aminoácido
57	X
58	Y
59	Z
60	D
61	R
62	F
63	N
64	G
65	V
66	K
67	F
68	F
69	G
70	T
71	T
72	X
73	X
74	D
75	G
76	I
77	T
78	F
79	G
80	I

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Posição do aminoácido em relação a bp005v04	Aminoácido
81	W
82	V
83	F
84	E
85	X
86	G
87	Z
88	F
89	T
90	N
91	X
92	G
93	D
94	G
95	G
96	W
97	I
98	N
99	W
100	A
101	F
102	R
103	G
104	W

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Posição do aminoácido em relação a bp005v04	Aminoácido
105	F
106	D
107	R
108	B
109	G
110	G
111	X
112	V
113	K
114	F
115	Y
116	R
117	X

Exemplo 3. Ensaios de Atividade Pesticida [0128] As sequências nucleotídicas da invenção podem ser testadas para a sua capacidade de produzir proteínas pesticidas. A capacidade de uma proteína pesticida atuar como pesticida numa praga é muitas vezes avaliada de vários modos. Um modo bem conhecido na técnica é realizar um teste de ingestão. Num destes testes de ingestão, a praga é exposta a uma amostra contendo quer compostos a serem testados, ou amostras de controle. Isto é frequentemente realizado colocando o material a ser testado, ou uma diluição adequada de tal material num material que a praga irá ingerir, tal como uma dieta artificial. O material a ser testado pode ser composto por um líquido, um sólido ou uma suspensão. O material a ser testado pode ser colocado sobre a superfície e depois permitir que

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86/94 seque. Alternativamente, o material a ser testado pode ser misturado com uma dieta artificial derretida, e depois dispensado para a câmara de teste. A câmara de teste pode ser, por exemplo, uma taça, um prato, ou um poço de uma microplaca.

[0129] Testes para pragas sugadoras (por exemplo afídeos) podem envolver a separação do material a testar do inseto por intermédio de uma partição, idealmente uma porção que pode ser perfurada pelas partes sugadoras da boca do inseto sugador, para permitir a ingestão do material a testar. O material a testar é frequentemente misturado com um estimulador da ingestão, tal como sacarose, para promover a ingestão do composto a testar.

[0130] Outros tipos de ensaios podem incluir a micro-injeção do material a testar na boca, ou no intestino da praga, bem como o desenvolvimento de plantas transgênicas, seguido por um teste para a capacidade da praga em se alimentar da planta transgênica. O teste da planta pode envolver o isolamento das partes das plantas normalmente consumidas, por exemplo, pequenas gaiolas presas a uma folha, ou o isolamento de plantas inteiras em gaiolas contendo insetos.

[0131] Outros métodos e abordagens para testar pragas são conhecidos na técnica, e podem ser encontrados, por exemplo, em Robertson e Preisler, eds. (1992) Pesticide bioassays with arthropods, CRC, Boca Raton, FL. Alternativamente, os ensaios são comumente descritos nas revistas Arthropod Management Tests e Journal of Economic Entomology ou discutidos por membros da Entomological Society of America (ESA).

[0132] Em algumas modalidades, as regiões de DNA codificando a região da toxina das proteínas pesticidas divulgadas neste documento são clonadas no vetor de expressão E. coli pMAL-C4x atrás do gene malE codificando a a

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87/94 proteína de ligação à maltose (MBP). Essas fusões, que estão na mesma fase de leitura, resultam na expressão de proteínas de fusão MBP-bp005 em E. coli.

[0133] Para a expressão em E.coli, BL21*DE3 são transformados com plasmídeos individuais. Colônias isoladas são inoculadas em LB suplementado com carbenicilina e glicose, e crescidas durante a noite a 37 ^QC. No dia seguinte, se inocula meio fresco com 1% da cultura crescida durante a noite e cresce a 37 ^QC até atingir a fase logarítmica. Subsequentemente, as culturas são induzidas com IPTG a 0,3 mM durante a noite a 20°C. Cada pélete de células é suspenso em tampão Tris-CI a 20 mM, pH 7,4 + NaCI a 200 mM + DTT a 1 mM + inibidores de protease, e sonicado. A análise por meio de SDS-PAGE pode ser usada para confirmar a expressão das proteínas de fusão.

[0134] Os extratos totais livres de células são passados por uma coluna de amilose ligada a cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) para purificação por afinidade das proteínas de fusão MBP-bp005. As proteínas de fusão ligadas são eluidas a partir da resina com solução de maltose a 10 mM. As proteínas de fusão purificadas são então clivadas tanto com fator Xa como com tripsina para remover o marcador amino terminal MBP da proteína BP005. A divagem e solubilidade das proteínas podem ser determinadas por SDS-PAGE.

Exemplo 4. Colocação dos Genes em um Vetor para Expressão Vegetal [0135] As regiões codificantes da invenção estão ligadas com sequências promotoras e terminadoras apropriadas para expressão em plantas. Tais sequências são bem conhecidas na técnica e podem incluir o promotor da actina do arroz ou o promotor da ubiquitina do maíz para expressão em monocotiledôneas, o promotor UBQ3 ou o promotor CaMV 35S de Arabidopsis para expressão em dicotiledôneas, e os terminadores nos ou Pinll. Técnicas para a

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88/94 produção e a confirmação de construtos promotor-gene-terminador também são bem conhecidas na técnica.

[0136] Em um aspeto da invenção, são desenhadas e geradas sequências de DNA sintéticas. Essas sequências sintéticas têm uma sequência nucleotídica alterada relativamente à sequência parental, mas codificam proteínas que são essencialmente idênticas à sequência parental.

[0137] Em outro aspeto da invenção, são desenhadas versões modificadas dos genes sintéticos de tal modo que o peptídeo resultante é direcionado para uma organela de planta, tal como o retículo endoplasmático ou o apoplasto. As sequências de peptídeos que se sabe resultarem no direcionamento das proteínas de fusão para organelos de plantas são conhecidas na técnica. Por exemplo, a região do terminal N do gene da fosfatase ácida a partir do tremoço branco Lupinus albus (GENBANK® ID Gl:14276838, Miller et al. (2001) Plant Physiology 127:594-606) é conhecida na técnica por resultar no direcionamento de proteínas heterólogas direcionadas para o retículo endoplasmático. Se a proteína de fusão resultante também contém uma sequência de retenção no retículo endoplasmático compreendendo o peptídeo de terminal N lisina-ácido aspárticoácido glutâmico-leucina (ou seja, o motivo KDEL, SEQ ID NO: 68) no terminal C, a proteína de fusão será direcionada para o retículo endoplasmático. Se a proteína de fusão não possui uma sequência de direcionamento para o retículo endoplasmático no terminal C, a proteína será direcionada para o retículo endoplasmático, mas acabará por ser sequestrada no apoplasto.

[0138] Assim, esse gene codifica uma proteína de fusão que contém os trinta e um aminoácidos de terminal N do gene da fosfatase ácida do Tremoço Branco Lupinus albus (GENBANK® ID Gl: 14276838, Miller et al., 2001, supra) fundidos com o terminal N da sequência de aminoácidos da invenção, bem como a

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89/94 sequência KDEL (SEQ ID NO:68) no terminal C. Assim, se prevê que a proteína resultante se direcione para o retículo endoplasmático da planta aquando da expressão em uma célula vegetal.

[0139] Os cassetes de expressão vegetais acima descritos são combinados com um marcador de seleção vegetal apropriado para ajudar na seleção de células transformadas e tecidos, e ligados em vetores de transformação vegetal. Esses podem incluir vetores binários de transformação mediados por Agrobacterium ou vetores plasmídicos simples para transformação por aerossol ou biolística.

Exemplo 5· Transformação de soja [0140] A transformação de soja é conseguida usando métodos bem conhecidos na técnica, tais como aquele descrito usando os explantes de meia semente de soja de transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens usando essencialmente o método descrito por Paz et al. (2006), Plant Cell Rep 25:206. Os transformantes são identificados usando tembotriona como marcador de seleção. O aparecimento de brotos verdes foi observado e documentado como um indicador de tolerância ao herbicida isoxaflutol ou tembotriona. Os rebentos transgênicos tolerantes apresentarão um esverdeado normal, comparável com os rebentos de soja de tipo selvagem não tratados com isoxaflutol ou tembotriona, enquanto os rebentos de soja de tipo selvagem tratados com a mesma quantidade de isoxaflutol ou tembotriona serão inteiramente branqueados. Isso indica que a presença da proteína HPPD permite a tolerância aos herbicidas inibidores de HPPD, tais como isoxaflutol ou tembotriona.

[0141 ] Os rebentos verdes tolerantes são transferidos para meios de enraizamento ou enxertados. As plântulas enraizadas são transferidas para a estufa após um período de aclimatação. As plantas contendo o transgene são então

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90/94 pulverizadas com herbicidas inibidores de HPPD, tal como, por exemplo, com tembotriona a uma taxa de 100 g de I.A./ha ou com mesotriona a uma taxa de 300 g de I.A./ha suplementado com óleo de colza de éster metílico de sulfato de amônio. Dez dias após a aplicação, os sintomas devidos à aplicação do herbicida são avaliados e comparados com os sintomas observados em plantas de tipo selvagem nas mesmas condições.

Exemplo 6: Estabelecimento e seleção de plantas de algodão TO.

[0142] A transformação do algodão é conseguida usando métodos bem conhecidos na técnica, especialmente o método preferido é aquele descrito na publicação da patente PCT WO 00/71733. As plantas regeneradas são transferidas para a estufa. Após um período de aclimatização, as plantas suficientemente crescidas são pulverizadas com herbicidas inibidores de HPPD, tal como por exemplo, tembotriona equivalente a 100 ou 200 g de I.A./ha suplementada com sulfato de amônio e óleo de colza de éster metílico. Sete dias após a aplicação da pulverização, os sintomas devidos ao tratamento com o herbicida são avaliados e comparados com os sintomas observados em plantas de algodão de tipo selvagem submetidas ao mesmo tratamento nas mesmas condições.

Exemplo 1. Transformação de Células de Maíz com os genes de proteína pesticida descritos neste documento [0143] 8-12 dias após a polinização são recolhidas espigas de maíz. São isolados embriões a partir das espigas, e aqueles embriões com um tamanho de 0,8-1,5 mm são preferidos para uso para transformação. Os embriões são plaqueados com o escutelo virado para cima em um meio de incubação adequado, tal como meio DN62A5S (3,98 g/L Sais N6; 1 mL/L (de 1,000x Solução mãe) Vitaminas N6; 800 mg/L L-Asparagina; 100 mg/L Mio-inositol; 1,4 g/L L-Prolina; 100 mg/L Casaminoácidos; 50 g/L sacarose; 1 mL/L (de 1 mg/mL Solução mãe) 2,4-D).

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No entanto, os meios e os sais diferentes de DN62A5S são adequados e são conhecidos na técnica. Os embriões são incubados durante a noite a 25 °C no escuro. No entanto, não é necessário perse incubar os embriões durante a noite.

[0144] Os explantes resultantes são transferidos para quadrados de uma rede (30-40 por placa), transferidos para meio osmótico durante cerca de 3045 minutos, depois transferidos para uma placa de bombardeamento (ver, por exemplo, Publicação PCT No. WO/0138514 e a Patente dos E.U.A. No. 5,240,842).

[0145] Os construtos de DNA concebidos para os genes da invenção em células vegetais são acelerados para o tecido vegetal usando um acelerador de feixes de aerossol, usando condições essencialmente conforme descrito na Publicação PCT No. WO/0138514. Após irradiação, os embriões foram incubados durante cerca de 30 min em meio osmótico, e colocados no meio de incubação durante a noite a 25 °C no escuro. Para evitar danificar indevidamente explantes bombardeados, esses são incubados durante pelo menos 24 horas antes da transferência para meio de recuperação. Os embriões são então espalhados em um meio de período de recuperação, durante cerca de 5 dias, a 25 ^QC no escuro, e depois transferidos para um meio de seleção. Os explantes são incubados em meio de seleção durante até oito semanas, dependendo da natureza e características da seleção particular utilizada. Após o período de seleção, o calo resultante é transferido para o meio de maturação do embrião, até se observar a formação de embriões somáticos maduros. Os embriões somáticos maduros resultantes são então colocados sob uma luz de baixa intensidade, e o processo de regeneração é iniciado através de métodos conhecido na técnica. Se permite que os brotos resultantes enraizem em meio de enraizamento, e as plantas resultantes são transferidas para potes de viveiros e propagadas como plantas transgênicas.

Materiais

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Meio DN62A5S

Componentes	Por litro	Fonte
Mistura de Sais Basal N6 de Chu (Prod. No. C 416)	3,98 g/L	Phytotechnology Labs
Solução de vitaminas N6 de Chu (Prod. N.^QC149)	1 mL/L (de solução mãe 1,000x)	Phytotechnology Labs
L-Asparagina	800 mg/L	Phytotechnology Labs
Mio-inositol	100 mg/L	Sigma
L-Prolina	1,4 g/L	Phytotechnology Labs
Casaminoácidos	100 mg/L	Fisher Scientific
Sacarose	50 g/L	Phytotechnology Labs
2,4-D (Prod. No. D-7299)	1 mL/L (de solução mãe a 1 mg/mL)	Sigma

[0146] O pH da solução é ajustado para pH 5,8 com KOH a 1N/KCI a 1N, é adicionado Gelrite (Sigma) a uma concentração até 3 g/L, e o meio é autoclavado. Após arrefecimento para 50 ^QC, são adicionados 2 mL/L de uma solução mãe a 5 mg/mL de nitrato de prata (Phytotechnology Labs).

Exemplo 8· Transformação de genes da invenção em Células Vegetais por Transformação Mediada por Agrobacterium [0147] As espigas são melhor recolhidas 8-12 dias após a polinização. São isolados embriões a partir das espigas, e aqueles embriões com um tamanho de 0,8-1,5 mm são preferidos para uso para transformação. Os embriões são plaqueados com o escutelo virado para cima em um meio de incubação adequado, e são incubados durante a noite a 25 ^QC no escuro. No entanto, não é necessário perse incubar os embriões durante a noite. Os embriões

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93/94 são contatados com uma estirpe de Agrobacterium contendo os vetores apropriados para transferência mediada pelo plasmídeo Ti durante cerca de 5-10 min, e depois plaqueados em meio de co-cultivo durante cerca de 3 dias (22 ^QC no escuro). Após co-cultivo, os explantes são transferidos para um meio de período de recuperação durante 5-10 dias (a 25 ^QC no escuro). Os explantes são incubados em meio de seleção durante até oito semanas, dependendo da natureza e características da seleção particular utilizada. Após o período de seleção, o calo resultante é transferido para o meio de maturação do embrião, até se observar a formação de embriões somáticos maduros. Os embriões somáticos maduros resultantes são então colocados sob uma luz de baixa intensidade, e o processo de regeneração é iniciado conforme conhecido na técnica.

Exemplo 9· Transformação de Arroz [0148] Sementes imaturas de arroz, contendo embriões no estágio de desenvolvimento correto, são coletadas a partir de plantas doadoras cultivadas sob condições bem controladas na estufa. Após a esterilização das sementes, os embriões imaturos são excisados e pré-induzidos em meio sólido por 3 dias. Após a pré-indução, os embriões são imersos por vários minutos em uma suspensão de Agrobacterium contendo os vetores desejados. Em seguida, os embriões são cocultivados em um meio sólido contendo acetosiringona e incubados no escuro por 4 dias. Os explantes são então transferidos para um primeiro meio seletivo contendo fosfinotricina como agente seletivo. Após aproximadamente 3 semanas, a escutela com desenvolvimento de calos foi cortada em vários pedaços menores e transferida para o mesmo meio seletivo. As subcultures subsequentes são realizadas aproximadamente a cada 2 semanas. Em cada subculture, os calos em crescimento ativo são cortados em pedaços menores e incubados em um segundo meio seletivo. Após várias semanas, os calos claramente resistentes à fosfinotricina são

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94/94 transferidos para um meio de regeneração seletivo. As plântulas geradas são cultivadas em MS de meia força para o alongamento total. As plantas são eventualmente transferidas para o solo e cultivadas na estufa.

[0149] Todas as publicações e requerimentos de patente mencionados na especificação são indicativos do nível de técnica dos peritos na técnica a que pertence a presente invenção. Todas as publicações e pedidos de patente são incorporados neste documento por referência na mesma medida como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

[0150] Apesar de a invenção anterior ter sido descrita em algum detalhe a título ilustrativo e exemplificativo, por motivos de clareza do entendimento, será óbvio que certas alterações e modificações podem ser praticadas no âmbito das reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO recombinante caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência nucleotídica codificando uma sequência de aminoácidos possuindo atividade pesticida, em que a referida sequência nucleotídica é selecionada a partir do grupo consistindo em:

a) a sequência nucleotídica definida em qualquer uma das SEQ ID NO:

71,69, 70 e 72-106;

b) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 4, 1 -3, 5-40, 42, 43, 45-48, 50, 51,52, 54, 56, 58-64, 66 ou 67;

c) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85 % de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 4,1 -3, 5-40, 42, 43, 45-48, 50, 51,52, 54, 56, 58-64, 66 ou 67 e em que a referida sequência nucleotídica está ligada de modo operacional a um promotor heterólogo.
2. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida sequência nucleotídica é uma sequência sintética que foi concebida para expressão em uma planta.
3. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido promotor heterólogo é capaz de direcionar a expressão da referida sequência nucleotídica em uma célula vegetal.
4. VECTOR caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico recombinante, conforme definida na reivindicação 1.

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5. VECTOR, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptideo heterólogo.
6. CÉLULA hospedeira caracterizada pelo fato de que contém o ácido nucleico recombinante, conforme definido na reivindicação 1.
7. CÉLULA hospedeira, de acordo com a reivindicação6, caracterizada pelo fato de que é uma célula hospedeira bacteriana.
8. CÉLULA hospedeira, de acordo com a reivindicação6, caracterizada pelo fato de que é uma célula vegetal.
9. PLANTA transgênica caracterizada pelo fato de que compreende a célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 8.
10. PLANTA transgênica, de acordo com a reivindicação9, caracterizada pelo fato de que a referida planta é selecionada a partir do grupo consistindo em milho, sorgo, trigo, repolho, girassol, tomate, crucíferas, pimentas, batata, algodão, arroz, soja, beterraba sacarina, cana de açúcar, tabaco, cevada e colza oleaginosa.
11. SEMENTE transgênica caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, conforme definida na reivindicação 1.
12. POLIPEPTIDEO recombinante com atividade pesticida, caracterizado por ser selecionado a partir do grupo consistindo em:

a) um polipeptideo compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 4, 1-3, 5-40, 42, 43, 45-48, 50, 51, 52, 54, 56, 5864, 66 ou 67; e

b) um polipeptideo compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 4,1-3, 5-40, 42, 43, 45-48, 50, 51,

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52, 54, 56, 58-64, 66 ou 67.
13. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente sequências de aminoácidos heterólogos.
14. COMPOSIÇÃO caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo, conforme definido na reivindicação 12.
15. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a referida composição é selecionada a partir do grupo consistindo em um pó, poeira, pélete, granulado, pulverização, emulsão, coloide e solução.
16. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a referida composição é preparada por dessecação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma cultura de células bacterianas.
17. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que compreende desde cerca de 1% a cerca de 99% em peso do referido polipeptídeo.
18. MÉTODO PARA O CONTROLE DE UMA POPULAÇÃO DE PRAGAS de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nematoides ou dípteros caracterizado pelo fato de que compreende o contato da referida população com uma quantidade pesticidamente eficaz do polipeptídeo, conforme definido na reivindicação 12.
19. MÉTODO PARA MATAR UMA PRAGA de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nematoides ou dípteros caracterizado pelo fato de que compreende fazer contatar a referida praga, ou alimentar a referida praga, com uma quantidade pesticidamente eficaz do polipeptídeo, conforme definido na

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4/6 reivindicação 12.
20. MÉTODO PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO com atividade pesticida, caracterizado pelo fato de que compreende a cultura da célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 6, sob condições nas quais a molécula de ácido nucleico codificando o polipeptídeo é expressa.
21. PLANTA ou célula de planta tendo estavelmente incorporada no seu genoma um construto de DNA caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína possuindo atividade pesticida, em que a referida sequência nucleotídica é selecionada a partir do grupo consistindo em:

a) a sequência nucleotídica definida em qualquer uma das SEQ ID NO:

71,69, 70 e 72-106;

b) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 4, 1 -3, 5-40, 42, 43, 45-48, 50, 51,52, 54, 56, 58-64, 66 ou 67; e

c) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 4, 1 -3, 5-40, 42, 43, 45-48, 50, 51,52, 54, 56, 58-64, 66 ou 67.
22. MÉTODO PARA PROTEGER UMA PLANTA de uma praga, caracterizado pelo fato de que compreende a expressão em uma planta ou célula da mesma de uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo pesticida, em que a referida sequência nucleotídica é selecionada a partir do grupo consistindo em:

a) a sequência nucleotídica definida em qualquer uma das SEQ ID NO:

71,69, 70 e 72-106;

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b) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 4, 1 -3, 5-40, 42, 43, 45-48, 50, 51,52, 54, 56, 58-64, 66 ou 67; e

c) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 4, 1 -3, 5-40, 42, 43, 45-48, 50, 51,52, 54, 56, 58-64, 66 ou 67.
23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a referida planta produz um polipeptídeo pesticida possuindo atividade pesticida contra uma praga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nematoides ou dípteros.
24. MÉTODO PARA AUMENTAR O RENDIMENTO EM UMA PLANTA caracterizado pelo fato de que compreende o cultivo em um campo de uma planta ou uma semente da mesma tendo estavelmente incorporada no seu genoma um construto de DNA compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína tendo atividade pesticida, em que a referida sequência nucleotídica é selecionada a partir do grupo consistindo em:

a) a sequência nucleotídica definida em qualquer uma das SEQ ID NO:

71,69, 70 e 72-106;

b) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 4, 1 -3, 5-40, 42, 43, 45-48, 50, 51,52, 54, 56, 58-64, 66 ou 67; e

c) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 4,1 -3, 5-40, 42, 43, 45-48, 50, 51,52, 54, 56, 58-64, 66 ou 67;

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6/6 em que o referido campo está infestado com uma praga contra a qual o referido polipeptídeo tem atividade pesticida.
25. USO DO ÁCIDO NUCLEICO, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado para proteger uma planta de uma praga contra a qual o aminoácido codificado pelo referido ácido nucleico tem atividade pesticida.
26. PRODUTO DE BASE caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, conforme definida na reivindicação 1, ou uma proteína assim codificada, em que o referido produto é selecionado a partir do grupo consistindo em sementes ou grãos inteiros ou processados, ração animal, farelo de milho ou soja, farinha de milho ou soja, amido de milho, farelo de soja, farinha de soja, flocos, concentrado de proteína de soja, isolados de proteína de soja, concentrado de proteína de soja texturizada, cosméticos, produtos capilares, manteiga de amendoim de soja, natto, tempeh, proteína hidrolisada de soja, cobertura batida, gordura, lecitina, soja integral, iogurte de soja, queijo de soja, tofu, yuba e grãos cozidos, polidos, vaporizados, assados ou estufados.