PT1597373E - Beterraba açucareira tolerante a glifosato - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

BETERRABA AÇUCAREIRA TOLERANTE A GLIFOSATO A invenção diz respeito a plantas da beterraba açucareira tolerantes ao glifosato, material da planta e sementes, bem como a um método e um kit de ensaio para a identificação de uma planta da beterraba açucareira tolerante ao glifosato. A beterraba açucareira (Beta vulgaris) é cultivada em muitos paises para uso comercial, com uma produção total superior a 240 milhões de toneladas métricas. N—(fosfonometil) glicina, comummente designada como glifosato, é um herbicida de largo espectro amplamente utilizado devido à sua grande eficácia, biodegradabilidade e pouca toxidade para animais e humanos. O glifosato inibe a via do ácido chiquímico que conduz à síntese das ligações aromáticas, inclusive aminoácidos e vitaminas. Em especial, o glifosato inibe a conversão do ácido fosfoenolpirúvico e do chiquimato-3-fosfato em 5-enolpiruvil-chimitato-3-fosfato, mediante inibição da enzima 5-enolpiruvil-chiquimato-3-fostafo-sintase (EPSP-sintase ou EPSPS). Quando se tratam plantas convencionais com glifosato, estas não conseguem produzir os aminoácidos aromáticos necessários para crescer e sobreviver (por exemplo, fenilanina e tirosina). EPSPS está presente em todas as plantas, bactérias e fungos. Não ocorre em animais, incapazes de sintetizar aminoácidos aromáticos. Por não existir uma via biossintética para aminoácidos aromáticos nos mamíferos, aves e formas de vida aquáticas, o glifosato não oferece nenhuma ou pouca toxidade para esses organismos. A enzima 1 ΕΡ1597373Β1 EPSPS ocorre naturalmente nos alimentos de origem vegetal ou microbiana. 0 glifosato é o componente ativo de herbicidas como por exemplo Roundup®, um produto da Monsanto Company, EUA. 0 produto é comummente formulado como sal, por exemplo, sal de amónio, alquilamina, metal alcalino ou trimetilsulfónio. Uma das fórmulas mais utilizadas é o sal de isopropilamina de glifosato, que é a forma empregada no herbicida Roundup®.

Mostrou-se que é possível produzir plantas tolerantes ao glifosato ao introduzir no genoma da planta a capacidade de formar uma EPSP-sintase tolerante ao glifosato, por ex., a CP4-EPSPS do Agrobacterium sp da cepa CP4AcO. É possível produzir uma planta tolerante ao glifosato pela transformação via agrobacterium, para a qual se introduz no genoma da planta um gene que codifica uma EPSPS tolerante ao glifosato, como a CP4-EPSPS. No documento WO 99/23232 descreve-se uma planta da beterraba açucareira desse gênero que expressa a CP4-EPSPS. Plantas da beterraba açucareira cultivadas a partir de células transformadas com o gene da CP4-EPSPS diferenciam-se quanto às suas propriedades, o que se deve ao facto de o gene ser introduzido num ponto aleatório do genoma da planta. É comum designar-se por "evento" a inserção de um determinado transgene em um ponto determinado de um cromossomo. Utiliza-se o termo "evento" também para diferenciar variedades de plantas geneticamente modificadas. Raríssimos são os eventos desejados. A maior parte dos eventos é desprezada, quer seja porque a inserção do transgene em um gene importante para o crescimento da planta acarreta a interrupção e a não-expressão deste, quer seja porque a 2 ΕΡ1597373Β1 inserção ocorre numa parte do cromossomo que não permite a expressão ou apenas uma expressão insuficiente. Em razão disso, é necessário verificar um grande número de eventos, a fim de identificar algum que se caracterize por uma expressão suficiente do gene inserido. Esse processo é muito demorado e caro, sem qualquer garantia de encontrar alguma planta com caracteristicas satisfatórias.

Por isso, o objectivo da presente invenção é disponibilizar uma planta da beterraba açucareira que apresente um bom nível de tolerância ao glifosato, mas sem as desvantagens relacionadas com outras importantes caracteristicas agronómicas como, por exemplo, crescimento, rendimento, qualidade, resistência a patógenos, etc. A planta da beterraba açucareira de acordo com o invento é por isso caracterizada por a) ser possível amplificar um fragmento de ADN do ADN genómico da planta da beterraba açucareira, partes ou sementes dela, pela reação em cadeia da polimerase com um primeiro primer que contenha a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 3, e com um segundo primer contendo a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 4, em que o fragmento de ADN tenha pelo menos 95% de identidade com a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 6, e/ou b) ser possível amplificar um fragmento de ADN do ADN genómico da planta da beterraba açucareira, partes ou sementes dela, pela reação em cadeia da polimerase com um primeiro primer que contenha a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 9, e com um segundo primer contendo a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 10, em que o 3 ΕΡ1597373Β1 fragmento de ADN tenha pelo menos 95% de identidade com a sequência nucleotidica da SEQ ID NO: 12, e/ou c) ser possível amplificar um fragmento de ADN do ADN genómico da planta da beterraba açucareira, partes ou sementes dela, pela reação em cadeia da polimerase com um primeiro primer que contenha a sequência nucleotidica da SEQ ID NO: 14, e com um segundo primer contendo a sequência nucleotidica da SEQ ID NO: 16, em que o fragmento de ADN tenha pelo menos 95% de identidade com a sequência nucleotidica da SEQ ID NO: 17. A reação em cadeia da polimerase (PCR) é um método padrão bem conhecido que se utiliza para amplificar moléculas de ácido nucleico (vide por exemplo US 4,683,202). A planta da beterraba açucareira da invenção (doravante designada por "evento H7-1") apresenta grande tolerância a herbicidas com glifosato. Além disso, o processo de transformação não interfere negativamente nas características de crescimento e outros aspectos agronómicos do evento H7-1. O evento H7-1 expressa em alto nível o gene agrobacterium-CP4-EPSPS integrado de forma estável no genoma da planta, dando a esta a tolerância ao glifosato. A planta foi produzida pela técnica de transformação via Agrobacterium, utilizando o vector binário PV-BVGT08. Esse vector apresentava, entre as regiões limítrofes esquerda e direito, as seguintes sequências: uma região codificante, composta por uma sequência que codifica um péptido de trânsito cloroplástico da EPSPS de Arabidopsis thaliana (designada por ctp2), juntada à sequência codificante da CP4-EPSPS e regulada pelo promotor do vírus do mosaico da escrofulária, em inglês denominado figwort mosaic vírus, 4 ΕΡ1597373Β1 (pFMV), mais a sequência de transcrição do terminador E9-3' de Pisum sativum.

Numa forma de realização preferida da invenção, os fragmentos de ADN 3706-bp, 751-bp e 1042-bp apresentam pelo menos 95% de identidade com as sequências nucleotidicas SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 17, de preferência pelo menos 99%, melhor ainda 99,9%. 95% de identidade significa, por exemplo, que 95% dos nucleótidos de uma dada sequência são idênticos aos da sequência comparada. Para isso, é possível organizar e comparar as sequências com a ajuda do programa BLAST (disponível, por exemplo, em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html). Optimamente, o fragmento de ADN 3706-bp contém a sequência nucleotídica SEQ ID NO: 6, o fragmento de ADN 751-bp contém a sequência nucleotídica SEQ ID NO: 12 e/ou o fragmento de ADN 1042-bp contém a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 17 . A presente invenção refere-se também a sementes, depositadas junto à NCIMB, Aberdeen (Escócia, Reino Unido) sob o número de acesso NCIMB 41158 ou NCIMB 41159. Essas sementes podem ser utilizadas para obter uma planta da beterraba açucareira tolerante ao glifosato. A semente pode ser plantada e a planta irá crescer tolerante ao glifosato. A invenção refere-se também a uma célula, tecido ou partes de uma planta da beterraba açucareira tolerante ao glifosato.

Outro aspecto da presente invenção consiste em um método para a identificação de uma planta da beterraba açucareira 5 ΕΡ1597373Β1 resistente ao glifosato, caracterizado pelo facto de compreender o(s) passo (s): a) amplificar um fragmento de ADN de 3500-3900 bp, de preferência 3706 bp do ADN genómico da planta da beterraba açucareira, partes ou sementes dela, pela reação em cadeia da polimerase com um primeiro primer que contenha a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 3, e com um segundo primer contendo a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 4, e/ou b) amplificar um fragmento de ADN de 710-790 bp, de preferência 751 bp do ADN genómico da planta da beterraba açucareira, partes ou sementes dela, pela reação em cadeia da polimerase com um primeiro primer que contenha a sequência nucleotídica SEQ ID NO: 9, e com um segundo primer contendo a sequência nucleotídica SEQ ID NO: 10, e/ou c) amplificar um fragmento de ADN de 990-1100 bp, de preferência 1042 bp do ADN genómico da planta da beterraba açucareira pela reação em cadeia da polimerase com um primeiro primer que contenha a sequência nucleotídica SEQ ID NO: 14, e com um segundo primer contendo a sequência nucleotídica SEQ ID NO: 16. O método permite a detecção de uma planta da beterraba açucareira tolerante ao glifosato com a ajuda de métodos padrão da biologia molecular.

Além disso, a invenção refere-se a um kit de teste para a identificação de uma planta da beterraba açucareira transgênica tolerante ao glifosato, cujas células, tecido ou 6 ΕΡ1597373Β1 partes, compreendendo pelo menos um par de primers com um primeiro e um segundo primer para a reação em cadeia da polimerase, onde o primeiro primer reconhece um sequência dentro de um ADN estranho inserido no genoma da planta, e o segundo primer reconhece uma sequência dentro das regiões 3' ou 5' do ADN, planta esta definida na reivindicação 1.

Numa variante preferida da invenção, o kit de teste caracteriza-se pelo facto de que: a) o primeiro primer contém a sequência nucleotidica SEQ ID NO: 9 e o segundo primer a sequência nucleotidica SEQ ID NO: 10, e/ou b) o primeiro primer contém a sequência nucleotidica SEQ ID NO: 14 e o segundo primer a sequência nucleotidica SEQ ID NO: 16.

De preferência, o primeiro primer tem a sequência nucleotidica SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 14, e o segundo primer tem a sequência nucleotidica SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 16.

As seguintes figuras servem para exemplificar a invenção e mostram:

Figura 1 - um mapa do vector binário e PV-BVGT08.

Figura 2 - a identificação de H7-1 através de análise por PCR. Analisaram-se amostras do ADN de 18 plantas. Controlo neg. = ADN de beterraba açucareira não transformada; controlo pos. = ADN dos transformantes do original H7-1. 7 ΕΡ1597373Β1

Figura 3 - a identificação do evento H7-1 por PCR multiplex e diferenciação entre o evento H7-1 transgênico e plantas não-transgênicas. Analisaram-se amostras do ADN de 54 plantas.

Figura 4 - o inserto pFMV-ctp2-CP4-EPSPS-E9-3' com interfaces dos enzimas de restrição HindIII, Xbal, Ciai, PstI e BamHI.

Figura 5 - análise inserto/número de cópias do evento H7-1. Para a análise de Southern Blot fez-se a digestão

de 10 pg do ADN genómico de H7-1 com PstI, HindIII, Xbal, Ciai e BamHI (pistas 3 a 7) . Para controlo negativo fez-se a digestão do ADN genómico com BamHI (pista 8) . Fez-se a digestão do plasmídeo PV-BVGTO8 como controlo positivo com BamHI. As pistas 2 e 9 representam marcadores de tamanho. 0 blot foi sondado com uma região codificante de CP4-EPSPS marcada com 32P. A sonda é uma sequência interna do gene CP4-EPSPS, compreendendo os pares de bases 447 e 1555.

Figura 6 - análise de H7-1 com Southern blot para verificar a integridade da região codificante da ctp2-CP4-EPSPS. 10 pg do ADN do H7-1, ADN de controlo não-transgênico e ADN de controlo não-transgênico, misturados com PV-BVGT08 foram digeridos com Xbal e HindiII/BamHI. Sondou-se o blot com um fragmento de CP4-EPSPS-PCR marcado com 32P.

Figura 7 - análise do evento H7-1 por Southern blot para determinar a integridade da região do promotor. 10 pg do ADN do H7-1, ADN de controlo não-transgênico e ADN de controlo não-transgênico, misturados com PV-BVGT08 foram 8 ΕΡ1597373Β1 digeridos com HindIII, Xbal e Sacl/Xhol. 0 blot foi sondado com um fragmento de promotor marcado com 32P (HindIII)(=sequência PV-BVGT08, Bp 7972-8583) ou com o cassete inteiro Promotor-ctp2-CP4-EPSPS-E9-3' (Pmel/Xhol) ( = sequência Pmel/Xhol) (=PV-BVGT08, Bp 7935-2389).

Figura 8 - análise do evento H7-1 por Southern blot para determinar a integridade da região poliadenilada (poli-A). 10 pg do ADN do H7-1, ADN de controlo não-transgênico e ADN de controlo não-transgênico, misturados com PV-BVGT08, foram digeridos com EcoRI/PstI, Xbal, HindIII e PstI. O blot foi sondado com um fragmento poli-A (BamHI/Xhol)(=sequência PV-BVGT08, Bp 1702-2389) marcado com 32P.

Figura 9 - fragmentos utilizados como sondas para a verificação da ausência da "espinha dorsal" do ADN do vector no evento H7-1.

Figura 10 - análise do evento H7-1 por Southern blot para determinar a ausência do ADN "espinha dorsal" nele. 10 pg do ADN genómico do H7-1, ADN de controlo não-transgênico e ADN de controlo não-transgênico, misturados com PV-BVGT08, foram digeridos com Xbal. O blot foi sondado com um fragmento marcado com 32P que compreende a "espinha dorsal" inteira de PV-BVGT08 (sondas 1-4).

Figura 11 - comparação entre os fragmentos da PCR e as sequências PV-BVGT08 na região limítrofe esquerda (left border, LB). 9 ΕΡ1597373Β1

Figura 12 - comparação entre os fragmentos da PCR e as sequências PV-BVGT08 na região limítrofe direita (right border, RB).

Figura 13 - análise do ADN genómico fora da ponto de ligação direito do inserto. Aproximadamente 50 ng do ADN genómico do H7-1, do ADN de controlo não-transgênico ou água foram utilizados, uma vez, para as reações PCR com as combinações do primer Pl, onde ambos os primers estão localizados fora do inserto, e, outra vez, com P3, onde um primer está localizado dentro do inserto e o outro primer está fora do inserto.

Figura 14 - análise do ADN genómico fora da junção esquerda do inserto. Aproximadamente 50 ng do ADN genómico do H7-1, do ADN de controlo não-transgênico ou água foram utilizados para as reações PCR com as combinações de primers P2, onde ambos os primers estão localizados fora do inserto, e P4, onde um primer está localizado dentro do inserto e o outro primer está fora do inserto.

Figura 15 - Quadro da progénie dos lotes de sementes do H7-1.

Figura 16 - Análise por Southern blot do evento H7-1 para determinar se o ADN inserido está integrado de maneira estável no genoma. 10 pg do ADN genómico de H7-1 (o transformante original H-7-1-1995 e três progénies, H7-1-1996 a 1998) e ADNs de controlo não-transgênicas de diferentes origens foram digeridos com BamHI, Xbal und HindIII. O blot foi examinado com uma sonda CP4-EPSPS de PV-BVGTO8 (= Bp 447-1555) marcada com 32P. 10 ΕΡ1597373Β1

Explicar-se-á a invenção, a seguir, com mais detalhes, utilizando exemplos seleccionados.

Lista de abreviaturas: °c aproximadamente grau Celsius bidest água esterilizada duplamente destilada bp par (es) de bases CTAB brometo de cetiltrimetilamónio ADN ácido desoxirribonucleico E. coli Escherichia coli EDTA ácido etilenodiaminotetracético Fig. figura h hora HC1 ácido hidroclórico kb par(es) de quilobases kg quilograma M, mM, molar, milimorar min minutos

Na2HP04/NaH2PC>4 fosfato de sódio

NaCl cloreto de sódio NaOH hidróxido de sódio nt nucleótido PCR reação em cadeia da polimerase pmol picomol RNase nucleasse do ácido ribonucleico RPA rotações por minuto RR Roundup Ready® TA temperatura ambiente SDS dodecil sulfato de sódio sec segundo SEVAG clorofórmio : álcool isoamílico (24 : 1) 11 ΕΡ1597373Β1

ΕΡ1597373Β1 SSC TE TRIS citrato solução salina padrão tampão tris-EDTA tris(hidroximetil)-aminometano EXEMPLO 1: Identificação do evento H7-1 A beterraba açucareira (Beta vulgaris) do genótipo 3S0057 foi modificada geneticamente de forma a expressar uma sintase CP4-5-enolpirovilchiquimato-3-fosfato ou CP4-EPSPS que confere tolerância ao herbicida glifosato e se utiliza também como marcador seleccionável. Essa linha transgênica foi produzida pela tecnologia de transformação via Agrobacterium tumefaciens, utilizando o vector binário PV-BVGT08. 0 T-ADN do vector utilizado para a transformação da beterraba açucareira continha as seguintes sequências, entre as regiões limítrofes esquerda e direita: uma região codificante composta por uma sequência codificante de um péptido de trânsito cloroplástico a partir da EPSPS de Arabidopsis thaliana (designada por ctp2), juntada à sequência codificante de CP4-EPSPS e regulada pelo promotor 35S do vírus do mosaico da escrofulária, em inglês denominado figwort mosaic vírus, (pFMVj, mais a sequência de transcrição do terminador do gene rbcS-E9 de Pisum sativum.

Utilizaram-se os seguintes métodos: I. Extração do ADN: Método 1:

Coletou-se folha fresca ou outro tecido (20 a 100 mg em um tubo de ensaio de 1,5 ml) e juntaram-se 400 μΐ de tampão 12 ΕΡ1597373Β1 de extração (vide abaixo) . Moeu-se o tecido com um pequeno pilão. A mistura foi agitada durante 5 seg e incubada em temperatura ambiente durante 30 min a 60 min. Seguiu-se um passo de centrifugação a 13.000 RPM durante 1 min. O sobrenadante contendo o ADN foi transferido para um novo tubo de ensaio de 1,5 ml e misturado com 120 μΐ de isopropanol. Incubou-se a mistura por 2 min em temperatura ambiente. Forma-se um precipitado após a adição de etanol. Após centrifugação a 13.000 RPM por 5 minutos, decantou-se o etanol. Deixou-se a amostra secar ao ar. Tornou-se a suspender o precipitado em 400 μΐ H20 ou tampão TE (vide abaixo) .

Tampão de extração (100 ml). 2 0 ml 1 M Tris (pH 7,5) 5 ml 5 M NaCl 5 ml 0, 5 M EDTA 2,5 ml 20 i% SDS 67,5 ml h2 0

Tampão TE 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)

1 mM EDTA Método 2:

Coletou-se material fresco da planta (20 a 100 mg) em um tubo de Eppendorf de 1,5 ml e juntaram-se 500 μΐ de tampão CTAB (65°C) (vide abaixo). A mistura foi incubada durante 1 a 1,5 h a 65°C e em seguida centrifugada durante 5 seg. Juntaram-se 5 μΐ de RNase (10 mg/ml) . A mistura foi incubada 13 ΕΡ1597373Β1 durante 30 min a 37 °C e em seguida centrifugada durante 5 seg. Adicionaram-se 200 μΐ de SEVAG. Após misturar e centrifugar a 13.000 RPM durante 10 min, transferiu-se o sobrenadante para um novo tubo de ensaio de 1,5 ml. Misturou-se cuidadosamente um volume de isopropanol (aproximadamente 400 μΐ) com o sobrenadante. Seguiu-se um passo de centrifugação a 13.000 RPM durante 10 min. Juntaram-se 600 μΐ de etanol a 70%. Lavou-se o precipitado várias vezes mediante inversão do tubo de ensaio. Tornou-se a lavar a mistura a 13.000 RPM durante 2 min. Descartou-se cuidadosamente 0 etanol Inverteu-se o tubo de ensaio e colocou-se para drenar sobre papel limpo. Deixou-se a amostra secar ao ar durante 15 min. Tornou-se a dissolver o precipitado em 50 μΐ H20 (vide abaixo).

Tampão CTAB.

1,4 M NaCl 20 mM EDTA 100 mM Tris-HCl 2% (w/v) CTAB SEVAG: clorofórmio : álcool isoamilico (24 : 1)

Tampão RNase. 10 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 7,5 RNase A: 14 ΕΡ1597373Β1 10 mg RNase/ml tampão RNase (5 ml bidest + 50 mg RNase A, alíquotas em tubos de ensaio de 1,5 ml, ferva os tubos durante 30 min a 100°C, armazenagem a -20°C).

Normalmente utilizou-se o método 1. Com esse método é possível extrair um grande número de amostras de ADN por dia, e a qualidade do ADN é aceitável. Utilizou-se o método 2 caso o material da folha fosse mais velho ou surgissem problemas com a qualidade do ADN. O método 2 é mais complexo, exigem mais tempo e rende menos ADN, mas é superior em qualidade.

Normalmente não se realiza uma quantificação do ADN e, tipicamente, em um processo PCR utiliza-se de 0,5 a 1 μΐ da solução do ADN extraído. II. Reação PCR:

Para a reação PCR preparou-se uma mistura de tampão diluído dez vezes + dNTPs. O método é o seguinte: volumes Cone. lOx- tampão 100 μΐ 0, 1 Μ 500 μΐ 0, 5 Μ 20 μΐ 2 mM 20 μΐ 2 mM 20 μΐ 2 mM 20 μΐ 2 mM 150 μΐ 15 ι mM 170 μΐ 1000 μΐ total

Solução padrão 1 M Tris-HCl, pH 8,3 1 M KC1

100 mM dATP

100 mM dCTP

100 mM dTTP

100 mM dGTP 100 mM MgCl2 HPLC-água conc. final PCR-reação 10 mM Tris-HCl, pH 8,3 50 mM KC1 0,2 mM dATP 0,2 mM dCTP 0,2 mM dTTP 0,2 mM dGTP 1,5 mM MgCl2 15 ΕΡ1597373Β1

Reação PCR (25 μΐ): ΕΡ1597373Β1 Oncor Appligene S.A., ADN Primer 1 Primer 2 Taq-polimerase 1 Tampão conc. lOx água III. Identificação

0,5 μΐ 1 μΐ(20 pmol) 1 μΐ(20 pmol) 0,2 μΐ (1 U, de Heidelberg, Alemanha) 2,5 μΐ 18,8 μΐ do H7-1 por PCR A identificação do H7-1 efectuou-se por PCR utilizando primers específicos do evento:

Primer superior (SEQ ID NO: 1): H7-207U30: 5' TTA ATT TTT GCA GGC GAT GGT GGC TGT TAT 3' Primer inferior (SEQ ID NO: 2): H7-841L30: 5' CAT ACG CAT TAG TGA GTG GGC TGT CAG GAC 3' O primer superior localiza-se fora do inserto e faz parte do ADN genómico da beterraba açucareira. O primer inferior localiza-se dentro do gene CP4-EPSPS inserido.

Condições da PCR: O 0 4 min PASSO 1 95°C 30 sec PASSO 2a 55°C 30 sec PASSO 2b 72°C 2 min PASSO 2c 72°C 5 min PASSO 3 0 O uma noite PASSO 4

Reação concluída 16 ΕΡ1597373Β1

Os passos 2a-c foram repetidos 34 vezes. 0 produto que se espera da PCR é um fragmento de ADN de 664 (SEQ ID NO: 13, vide Fig. 2). IV. Identificação do H7-1 por PCR multiplex

Para distinguir entre plantas não-transgênicas e plantas transgênicas, se homozigótias ou heterozigóticas, efectuou-se uma PCR multiplex com três primers diferentes. Utilizaram-se os seguintes primers: H72 (SEQ ID NO: 14): 5' GCTCTGACACAACCGGTAAATGCATTGGCC 3' H7S2 (SEQ ID NO: 15): 5' GACCCATAGTTTGATTTTAAGCACGACATG 3' H7R2 (SEQ ID NO: 16): 5' GCAGATTCTGCTAACTTGCGCCATCGGAG 3'

Condições da PCR: 94 °C 2 min 94°C 1 sec 60°C 45 sec 72 °C 90 sec 72°C 5 min 4°C uma noite PASSO 1 PASSO 2a PASSO 2b PASSO 2c PASSO 3 PASSO 4

Reação concluída

Os passos 2a-c foram repetidos 34 vezes.

As plantas não-transgênicas apresentaram somente um fragmento de PCR de aproximadamente 350 bp. As plantas transgênicas homozigóticas apresentaram um fragmento de aproximadamente 1.042 kb. As plantas heterozigóticas apresentaram ambos os fragmentos (vide Figura 3). 17 ΕΡ1597373Β1 EXEMPLO 2: Caracterização do evento H7-1

Realizou-se uma análise molecular para a caracterização do ADN integrado presente no H7-1. Em especial, determinaram-se o número dos insertos (número das junções de integração dentro do genoma da beterraba açucareira), o número de cópias (o número de fragmentos de ADN dentro de uma localização), a integridade da região codificante inserida e os seus elementos reguladores, o promotor pFMV e a sequência do terminador de transcrição E9-3', a ausência de sequências "espinha dorsal" do vector utilizado para a transformação e a estabilidade da transmissão hereditária do inserto. Além disso, identificaram-se as sequências que flanqueiam o inserto do ADN. 0 ADN inserido do evento H7-1 de transformação da beterraba açucareira foi caracterizado por meio de Southern Blot, PCR e técnicas de PCR inversa. Incluíram-se no exame controlos positivos e negativos (PV-BVGT08, ADN de plantas não-transgênicas), tratados do mesmo modo que a substância do ensaio (H7-1). 0 ADN foi isolado do lote número 74903H de plantas do evento H7-1 cultivadas no ano de 1997. Também isolou-se o ADN dos transformantes originais H7-1/3S0057 (= 6401VH) de 1995 e de mais três progénies cultivadas nos anos de 1996, 1997 e 1998 (H7-1/64801H, H7-1/74922H e H7-1/83002S). A linhagem de beterraba açucareira não-transgênica 3S0057 serviu de controlo. Além disso, utilizaram-se as linhagens de beterraba açucareira 5R7150, 8K1180 e 6S0085, como controlo negativo. Essas linhagens são linhagens 18 ΕΡ1597373Β1 comuns, não-transgênicas, utilizadas no cultivo convencional da beterraba açucareira.

As substâncias de referência correspondiam ao plasmídeo PV-BVGT08 utilizado para a transformação. 0 ADN do plasmídeo e o ADN das linhagens de beterraba açucareira de controlo foram misturados, digeridos com enzimas de restrição e separados por eletroforese em géis de agarose, paralelamente às substâncias de ensaio. 0 plasmídeo serviu como marcador de tamanho para o fragmento esperado e como controlo positivo de hibridização. 0 ADN plasmídico foi misturado com o ADN genómico da planta em uma concentração que representa menos do que uma cópia do elemento a ser analisado, para demonstrar o grau de sensibilidade do método Southern blot (~10 pg do ADN genómico e ~28 pg PV-BVGTO8-ADN) . Para as avaliações de tamanho utilizou-se o marcador de tamanho molecular RAOUL™ (ONCOR/Appligene, catálogo #160673).

Isolamento do ADN:

Moeu-se tecido da planta (1 a 3 g peso húmido) do lote número 74903H do evento H7-1, em nitrogénio líquido, utilizando almofariz e pilão, até convertê-lo em pó fino. Transferiu-se o pó para um tubo oak ridge de 50 ml, juntando-se 7,5 ml de tampão CTAB pré-aquecido (2% CTAB, 100 mM Tris-HCl, 20 mM EDTA pH 8,0, 1,4 M NaCl e 0,2% de mercaptoetanol) . As amostras foram incubadas durante aproximadamente 30 min a 65°C e misturadas em intermitente. Juntou-se às amostras um volume igual (8 ml) de uma mistura de clorofórmio : álcool isoamílico (24:1 v/v), RT. Misturou-se a suspensão por inversão e separaram-se as duas fases por centrifugação (10 min, 9000 RPM). Transferiu-se a solução aquosa para um novo tubo oak ridge de 50 ml, seguido da 19 ΕΡ1597373Β1 precipitação do ADN mediante adição de 5 ml de isopropanol. Mediante centrifugação (2 min, 9000 RPM) obteve-se o pellet do ADN, removendo-se o sobrenadante. O ADN precipitado foi incubado durante aproximadamente 20 min com uma solução de lavagem de 7 6% de etanol e 10 mM de acetado de amónio. Após a centrifugação e a decantação do sobrenadante, o ADN foi seco em vácuo e ressuspendido em TE, pH 8,0 a 4°C durante uma noite.

Em alternativa, isolou-se o ADN, utilizando o Kit DNeasy Plant Maxi da empresa Qiagen (Dusseldorf, Alemanha, catálogo #68163) . O isolamento do ADN foi efectuado de acordo com as instruções do fabricante.

Em outro método alternativo, isolou-se o ADN, utilizando o Kit DNeasy Plant Maxi da empresa Qiagen (Dusseldorf, Alemanha, catálogo #69103). O isolamento do ADN foi efectuado de acordo com as instruções do fabricante.

Quantificação do ADN e digestão por enzima de restrição: A quantificação do ADN foi efectuada utilizando um espectroftómetro LKB Biochrom UV/visible (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemanha) ou, em alternativa, por varredura do ADN com o programa RFLPscan (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemanha) por eletroforese em gel de agarose. Como padrão de calibração utilizou-se o High ADN Mass Ladder da Gibco/Life Technologies (Karlsruhe, Alemanha). As enzimas de restrição foram adquiridas das empresas Boehringer Mannheim (Mannheim, Alemanha), Stratagene (Amsterdã, Países Baixos) ou New England Biolabs (Frankfurt, Alemanha), e utilizadas de acordo com as indicações dos fabricantes. 20 ΕΡ1597373Β1

Produção de sondas de ADN:

Isolou-se ADN PV-BVGT08 de culturas de E. coli. Matrizes de sondas homólogas à região codificante da CP4-EPSPS, ao promotor 35S, à região E9-3'-poli-A, à cassete 35S-ctp2-CP4-EPSPS-E9-3' e às regiões "espinha dorsal" foram produzidas mediante digestão com as enzimas de restrição correspondentes, seguida de separação por eletroforese em gel de agarose ou por reação em cadeia da polimerase (PCR).

Purificaram-se os produtos por meio do Gene Clean II Kit da empresa BIO 101 (La Jolla, CA). A marcação das sondas (25 pg) com 32P-dCTP ou 32P-dATP foi feita com a aplicação do sistema de marcação de NA Megaprime™ da empresa Amersham-

Pharmacia Biotech Europe (Freiburg, Alemanha).

Análise por Southern blot

As sondas de ADN tratadas com as enzimas de restrição foram separadas por eletroforese em gel com agarose durante ~15 horas a ~35 volts. Depois de fotografar o gel, o ADN foi depurinado, colocando o gel de molho durante 15 min em uma solução de HC1 a 0,25 M, desnaturado mediante incubação do gel durante 30 min em uma solução desnaturante de 0,5 M NaOH, 1,5 M de NaCl, sob movimentação suave e constante, e finalmente neutralizado mediante colocação de molho durante 2 horas em diferentes volumes de uma solução de 2 M NaCl e 1 M Tris-HCl, pH 5,5. Os ADNs dos géis de agarose foram transferidos para uma membrana de nylon Hybond-N™ (Amersham Pharmacia Biotech Europe, Freiburg, Alemanha), utilizando um Pressure Blotter da empresa Stratagene de acordo com as instruções do fabricante. Após imersão dos filtros durante 15 min em 20 x SSPE (20 x SSPE: 3,6 M NaCl, 20 mM EDTA, 0,2 M NaH2P04/Na2HP04 pH 7,4), o ADN foi fixado na membrana 21 ΕΡ1597373Β1 mediante exposição a luz UV (Transilluminator Pharmacia, Freiburg, Alemanha) durante 1 min e mediante aquecimento a 80°C durante 1 hora em um forno de vácuo. Os blots foram submetidos a pré-hibridização durante 4 horas em uma solução aquosa de 50% de formamida, 5 x SSC, 0,1% de lauroilsarcosina, 0,02% SDS e 2% de reagente de bloqueio (Boehringer Mannheim, Alemanha, catálogo # 109617 6) . A hibridização com a sonda marcada radioactivamente foi efectuada em solução de pré-hibridização fresca durante 16-18 horas a 42°C. Após a hibridização lavaram-se as membranas durante 5 min em 2 x SSC a 42°C, durante 20 min em 2 x SSC, 1% SDS a 65°C e por dois períodos de 15 min em 0,2 x SSC, 0,1% SDS a 68°C. Obtiveram-se imagens autorradiográficas dos blots mediante a sua exposição, utilizando um filme Biomax-MS™ em combinação com a película de reforço Kodak Biomax MS™.

Identificação de sequências dos genomas 5' e 3': A junção entre o ADN transgênico e da planta foi identificada mediante aplicação da técnica de PCR revertida. O ADN genómico foi purificado conforme descrito acima. Digeriu-se aproximadamente 1 yg do ADN em reações separadas pelas endonucleases de restrição Taql, Alui, NdelII ou Rsal. Os fragmentos de ADN digeridos foram religados por ligase T4 durante uma noite, seguido da reação PCR. As diferentes combinações de primers por inversão foram obtidas mediante utilização do software de análise OLIGO® da NBI (National Biosciences, Inc., Plymouth, Michigan).

Os fragmentos obtidos com a amplificação invertida da PCR foram separados por eletroforese em gel, excisados do gel e purificados utilizando o Kit Gene Clean II™. Os 22 ΕΡ1597373Β1 fragmentos purificados foram clonados para dentro do vector pCR®2.1 utilizando o Kit TOPO™TA cloning® da Invitrogen (Groningen, Paises Baixos). Os insertos foram encaminhados à MWG-Biotech (Ebersberg, Alemanha) para o seu sequenciamento. A análise dos dados das sequências obtidos foi efectuada utilizando o software de análise de ADN Mac Molly® Tetra (Soft Gene GmbH, Bochold, Alemanha).

Análise da PCR: 0 ADN genómico foi produzido com o ADNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Dusseldorf, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Para a análise da PCR utilizaram-se aproximadamente 50 ng de ADN genómico. As reações foram submetidas a 95°C por 30 seg, 55°C por 30 seg e 72°C por 2 min, para 35 ciclos. A PCR foi feita num PTC200-Cycler (Biozym, Oldendorf, Alemanha). Os produtos da PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose. 1. Número de insertos:

Determinou-se a quantidade dos insertos, o número de locais de integração do ADN transgênico ao genoma da beterraba açucareira, para ο H7-1. Para determinar o número de insertos, o ADN genómico foi digerido com as enzimas de restrição HindIII, Xbal e BamHI. Como controlo negativo, foi digerido o ADN de uma planta não transformada, representando o mesmo fundo genético, com Hind III. Como controlo positivo utilizou-se o ADN do vetor de transformação (PV-BVGT08).

Xbal e BamHI clivam o PV-BVGTO8 somente uma vez e não clivam dentro da sonda marcada que foi utilizada CP4-EPSPS (vide Fig. 4) . HindIII cliva o PV-BVGTO8 três vezes, mas 23 ΕΡ1597373Β1 todos os três sítios se localizam fora da sonda, e do mesmo lado, 5' em relação à sonda. Por isso, cada enzima deveria libertar um fragmento de ADN que hibridizaria com a sonda CP4-EPSPS e conteria uma parte do ADN inserido, bem como o ADN genómico adjacente da planta. 0 número de fragmentos libertados aumenta o número de insertos presentes no evento. Os resultados estão representados na Fig. 5.

Após a digestão com as enzimas HindIII, Xbal ou BamHI localizaram-se, para cada uma delas, apenas um único fragmento de hibridização. Os fragmentos de 5,2 kb da digestão com HindIII (pista 4), 4 kb da digestão com Xbal (pista 5) e aproximadamente 11 kb da digestão com BamHI (pista 7) mostram que o transformante H7-1 representa um único evento de integração (Fig. 4) . 0 forte sinal na pista 1 representa o plasmídeo PV-BVGTO 8 linearizado. Os sinais fracos adicionais referem-se a pequenas quantidades de PV-BVGT08 não digerido ou a sinais de fundo não específicos da hibridização. 2. Número de cópias

Teoricamente, um local de integração poderia consistir em mais de uma cópia do ADN inserido. No entanto, isto não foi possível devido aos tamanhos dos fragmentos da análise de restrição descrita acima. Se houvesse mais de uma cópia do ADN H7-1 inserido, detectar-se-iam fragmentos adicionais. Isto foi confirmado pela digestão com o enzima de restrição PstI. Pstl cliva duas vezes dentro das sequências limite direita e esquerda. Um dos pontos de restrição se localiza dentro da região codificante da CP4-EPSPS, de forma que, após a digestão, são esperados dois fragmentos hibridizantes com a sonda CP4-EPSPS. Um dos fragmentos esperados 24 ΕΡ1597373Β1 corresponde ao fragmento interno de aproximadamente 1,2 kb. 0 segundo fragmento deve ser um fragmento limite. Novamente, se houvesse mais de uma cópia, teriam que ser detectáveis mais fragmentos. Mas os resultados mostram que PstI cliva o ADN conforme o esperado. 0 fragmento interno de 1,2 kb e apenas um fragmento adicional de aproximadamente 4,9 kb foram detectados (Fig. 5, pista 3; Fig. 4).

Para controlo interno adicional clivou-se o ADN com Ciai (Fig. 5, pista 6; Fig. 4) . Conforme esperado, apenas um fragmento de 2,4 kb resultou hibridizado, já que Clal cliva duas vezes, porém à esquerda e à direita, fora do fragmento CP4-EPSPS utilizado. Este resultado é também uma prova da inteireza do fragmento de ADN integrado e coincide com os resultados reproduzidos a seguir. A hibridização do plasmideo PV-BVGTO8 (PV-BVGTO8 = 8590 bp) com o fragmento CP4-EPSPS produz, conforme se esperava, um sinal de 8,6 kb (Fig. 5, pista 1) . Uma segunda listra, muito fraca, se deve à restrição incompleta de PV-BVGT08.

Em suma, os experimentos demonstram que a linhagem de beterraba açucareira transformada H7-1 contém uma única cópia do T—ADN de PV-BVGTO8 no genoma da planta. 3. Integridade da região codificante A inserção da cassete genética CP4-EPSPS com os elementos isolados (P-FMV-Promotor, região codificante de ctp2-CP4-EPSPS e a região E9-3' não traduzida) foi determinada por digestão com as enzimas HindIII para P-FMV, HindIII mais BamHI para ctp2-CP4-EPSPS e EcoRI e PstI para a região E9-3' não traduzida. Realizaram-se experimentos 25 ΕΡ1597373Β1 adicionais com Saci e Xhol para a região P-FMV-ctp2-CP4-EPSPS e a região E9-3'. ADN plasmídico, misturado com ADN de beterraba açucareira não-transgênica e ADN de beterraba açucareira não-transgênica sozinho foram digeridos com as mesmas enzimas a titulo de controlo positivo e controlo negativo.

Essas enzimas clivam dentro do inserto de ADN previsto, entre os limites direito e esquerdo de T-ADN (vide o mapa plasmídico na Fig. 1) , de forma que, quando os elementos correspondentes estão intactos, os tamanhos dos fragmentos hibridizantes no ADN de H7-1 e no ADN de PV-BVGT08 devem ser idênticos.

Como controlo adicional digeriram-se os ADNs com Xbal. Xbal cliva uma vez entre o promotor e a região codificante da ctp2-CP4-EPSPS. Portanto, espera-se um fragmento de 8,6 kb com PV-BVGTO8-ADN e, no caso de H7-1, um fragmento limite que se diferencia em tamanho, comparado com o fragmento PV-BVGT08. Os resultados estão representados nas Fig. 6, 7 e

Figura 6: A digestão com HindIII e BamHI libertou o gene CP4-EPSPS e o blot foi sondado com um fragmento de CP4-EPSPS gerado através de PCR. 0 controlo negativo (pista 6) não mostrou nenhuma banda de hibridização. 0 ADN do evento H7-1 e o plasmídeo PV-BVGT08, misturado com ADN não-transgênico, formaram, ambos, um fragmento de aproximadamente 1,7 kb, dentro do tamanha esperado. A digestão com Xbal resultou no fragmento esperado de 8,6 kb do PV-BVGTO8 linearizado. Quanto ao evento H7-1, a digestão resultou num fragmento limite de aproximadamente 4,0 kb (vide também Fig. 4 e 5) . Novamente, o controlo negativo não apresentou nenhum sinal. 26 ΕΡ1597373Β1

Figura 7: A digestão com HindIII libertou o promotor do virus do mosaico da escrofulária e o blot foi sondado com um fragmento do promotor gerado por PCR. 0 controlo negativo (pista 5) não apresentou nenhum sinal de hibridização. ADN genómico do evento H7-1 e o plasmideo PV-BVGT08, misturados com ADN não-transgênico, formaram, cada um, um fragmento hibridizante com um tamanho aproximado de 0,6 kb. Esse fragmento corresponde ao tamanho esperado do promotor (pistas 4 e 6) . A digestão com Xbal resultou no esperado fragmento de 8,6 kb do PV-BVGT08 linearizado e no fragmento fronteira esquerda de aproximadamente 1,3 kb (pistas 1 e 3) do evento H7-1. Esse fragmento de 1,3 kb é também uma prova a mais do facto de que o evento H7-1 só contém uma única cópia do transgene. Novamente, o controlo negativo (pista 2) não apresentou nenhum sinal. A digestão com Sacl/Xhol libertou o promotor, juntamente com a região codificante da CP4-EPSPS e a região poli-A. A hibridização com o cassete completo promotor-ctp2-CP4-EPSPS-poli-A-sinal (fragmento Pmel/Xhol) resultou nos esperados fragmentos 2,3-kb-promotor-ctp2-CP4-EPSPS e 0,7-kb-poly-A-sinal, tanto com o PV-BVGTO8-ADN, misturado com ADN não-transgênico, como com o ADN genómico de H7-1 (pistas 9 e 11) .

Figura 8: A digestão com PstI e EcoRI libertou o sinal de poliadenilação E9-3' e o blot foi sondado com um fragmento de sinal de poliadenilação. O controlo negativo (pista 3) não mostrou nenhuma banda de hibridização. O plasmideo PV-BVGTO8, misturado com ADN não-transgênico, e o ADN genómico do evento H7-1 formaram, ambos, um fragmento de 27 ΕΡ1597373Β1 aproximadamente 0,6 kb, dentro do tamanho esperado. A digestão com Xbal resultou no fragmento esperado de 8,6 kb do PV-BVGT08 linearizado e num fragmento limite de aproximadamente 4,0 kb no evento H7-1. A digestão com PstI libertou o sinal de poliadenilação E9-3', combinado com uma seção 3' da região codificante da CP4-EPSPS de 0,5 kb. Foi possivel detectar o fragmento de 1,2 kb obtido, conforme esperado, tanto com o ADN genómico do H7-1 como com o ADN PV-BVGTO8. A digestão com HindIII resultou em um fragmento de 8,0 kb do PV-BVGT08 linearizado, menos o fragmento do promotor (pista 13), e um fragmento limite de 5,2 kb (pista 11) com H7-1. O fragmento único de 5,2 kb resultante da digestão com HindIII e o fragmento único de 4,0 kb resultante da digestão com Xbal representam uma prova adicional de gue o evento H7-1 só contém uma cópia do ADN inserido. Novamente, o controlo negativo não apresentou nenhum sinal.

Em suma, os resultados dos blots comprovam que todos os elementos do ADN transferido permanecem intactos e que o evento H7-1 contém uma única região codificante da CTP2-CP4-EPSPS, com os elementos regulatórios desta, o promotor pFMV e a sequência de transcrição do terminador E9-3'. 4. Análise para determinar os fragmentos da "espinha dorsal" A região da "espinha dorsal" de um plasmídeo Ti é definida como a região fora do T-ADN, delimitada pelas sequências direita e esquerda que são formadas pelos ori genes e os genes de seleção responsáveis respectivamente pela replicação bacteriana e a selecção de bactérias e que 28 ΕΡ1597373Β1 normalmente não são transferidos pelo Agrobacterium para o genoma da planta. Para confirmar a ausência do ADN vector "espinha dorsal" no evento H7-1, foram digeridos - com a enzima de restrição Xbal - ADN genómico de H7-1, ADN de controlo não transformado e ADN genómico de H7-1, misturados com ADN de PV-BVGT08-ADN, e examinados com três sondas sobrepostas geradas por PCR, as quais compreendiam a sequência completa da "espinha dorsal". Uma quarta sonda apresenta da "espinha dorsal" inteira em um fragmento.

As sondas utilizadas representam a sequência da "espinha dorsal" (vide Fig. 9): 1: bp 2730- 5370 2: bp 5278- 6419 3: bp 6302- 7851 4: bp 2730- 7851

Figura 10 mostra o resultado da análise por Southern blot. Pistas 6, 10, 14 e 18: o ADN genómico de H7-1 que foi sondado com os fragmentos de "espinha dorsal" da "espinha dorsal" inteira, não apresentou nenhuma banda de hibridização. Só as pistas 4, 8, 12, 16 e 20: o ADN genómico de H7-1, misturado com o ADN de PV-BVGT08, mostra bandas de 8,6 kb, como esperado. As bandas representam o ADN PV-BVGT08 linearizado.

Pistas 2 e 4: ADN genómico do H7-1 e ADN genómico de H7-1, misturados com PV-BVGT08, e hibridizados com o fragmento CP4-EPSPS, não apresentou sinais de hibridização. A banda de 4 kb na pista 2 representa o fragmento limite direito, as duas bandas da pista 4 representam o fragmento limite direito de 4,0 kb e o plasmídeo de PV-BVGT08 linearizado de 29 ΕΡ1597373Β1 8,6 kb. As duas bandas apresentam a mesma intensidade. Isto constitui uma clara indicação de que a concentração do ADN PV-BVGT08 adicionado é comparável à concentração do elemento CP4-EPSPS no ADN do H7-1. A concentração do ADN plasmidico utilizado corresponde a 0,5 (meia) cópia. Se houvesse sequências "espinha dorsal" integradas no genoma do H7-1, seriam detectáveis sinais claros.

Os resultados comprovam que ο H7-1 não contém nenhuma sequência "espinha dorsal" detectável do plasmídeo utilizado na transformação. Esse resultado foi corroborado também pelos dados da análise das regiões genómicas flanqueadoras 5' e 3'. 5. Identificação das sequências genómicas flanqueadoras 5' e 3' : A transformação via Agrobacterium normalmente resulta na integração de todas as sequências localizadas entre os limites esquerdo e direito ao genoma da planta. As extremidades 5' e 3' do ADN plasmidico integrado deveriam localizar-se dentro ou próximo das sequências limites esquerda ou direita. Por isso utilizou-se a técnica da PCR inversa, a fim de identificar essas regiões. Os produtos clonados da PCR foram sequenciados e os dados das sequências foram comparados com a sequência de PV-BVGT08.

Figura 11 mostra a comparação entre a sequência do fragmento clonado por PCR reversa (D1U.RPT)(= genoma H7-1, sequência superior), obtida com primers para a análise da região limite esquerda, e a sequência PV-BVGT08 (sequência inferior). A comparação das duas sequências mostra que a homologia termina exatamente dentro da sequência limite. 30 ΕΡ1597373Β1

Figura 12 mostra a comparação entre a sequência do fragmento clonado por PCR inversa (B3UNI.RPT)(= genoma H7-1, sequência superior), obtida com primers para a análise da região limite direita, e a sequência PV-BVGT08 (sequência inferior). A comparação das duas sequências mostra que a homologia termina 18 nucleótidos antes da sequência limite.

No geral, isto constitui uma clara indicação de que a sequência entre as fronteiras esquerda e direita do Ti-plasmideo PV-BVGT08 está integrada correctamente. A sequência termina dentro ou imediatamente antes dos limites. Esses dados apoiam o resultado da análise da "espinha dorsal", mostrando que não houve integração de nenhuma sequência da "espinha dorsal" fora da região limite ao genoma do H7-1.

Para verificar se as sequência flanqueadoras do lado direito e esquerdo do inserto no evento de beterraba açucareira H7-1 são sequência genómicas intactas da planta, efectuou-se uma análise por PCR inversa com as combinações de primers Pl, P2, P3 e P4.

Os primers das combinações Pl e P2 localizam-se fora do inserto. Se o ADN do local da inserção dentro do evento H7-1 for idêntico ao ADN de um controlo não-transformado, a PCR deveria resultar em dois fragmentos da PCR que representem a síntese das duas combinações de primers. Os primers das combinações P3 e P4 são desenhados de tal forma que um dos primers correspondentes fica localizado dentro do inserto CP4-EPSPS e o outro primer fora do inserto, dentro do ADN genómico da planta. Por isso, a PCR deve formar exclusivamente fragmentos do ADN do evento H7-1. 31 ΕΡ1597373Β1

Os dados das sequências obtidas com a técnica da PCR inversa, combinados com os dados do vector PV-BVGT08, resultam em uma sequência que contém o inserto H7-1 (sequência PV-BVGT08), as áreas de junção direita e esquerda e adicionalmente ADN genómico da beterraba açucareira (SEQ ID NO: 5).

Para a identificação das junções ADN do genoma da planta ADN transgênico (identificação da especificidade do evento) e para as regiões genoma - ADN do lado esquerdo e direito do inserto utilizaram-se as seguintes combinações de primers:

Combinação PI (primer para a análise do ADN genómico localizado fora da região limite direita, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19):

Primer superior: 5'CGG TAA ATG CAT TGG CCT TTG TT

Primer inferior: 5'CAC CCA GAT CCC AAT AAA ACC GTA AT

Produto da PCR esperado 241 bp

Combinação P2 (primer para a análise do ADN genómico localizado fora da região limite esquerda, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21) :

Primer superior: 5'AAA TGG TTG TAG ATA AAT AAG GAA ATC A

Primer inferior: 5'ACA TGT TTG AGC ACT CTT CTT GT

Produto da PCR esperado 377 bp

Combinação P3 (primer para a análise da junção ADN do genoma da planta - ADN transgênico, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8) : 32 ΕΡ1597373Β1

Primer superior: 5'ATG CAT TGG CCT TTG TTT TTG AT

Primer inferior: 5'TGT CGT TTC CCG CCT TCA G

Produto esperado da PCR 288 bp (SEQ ID NO: 11)

Combinação P4 (primer para a análise da junção ADN do genoma da planta - ADN transgênico, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10) :

Primer superior: 5'CGC TGC GGA CAT CTA CAT TTT TGA AT

Primer inferior: 5'AGT TAA CTT TCC ACT TAT CGG GGC ACT G

Produto esperado da PCR 751 bp (SEQ ID NO: 12)

Experimentos em PCR com o ADN do evento H7-1 e o ADN de uma planta de controlo não-transgênica, utilizando a combinação de primers P3, tendo um primer localizado dentro do inserto do H7-1, produziram tão-somente um fragmento com o ADN do evento H7-1. Em contraste, os experimentos em PCR em que se utilizou a combinação de primers Pl, homóloga às sequências localizadas fora do inserto, produziram fragmentos tanto com o ADN do evento H7-1 como também com o ADN de controlo não-transgênico. Vide Fig. 13 para esses resultados.

Os resultados mostram que a sequência localizada o lado da junção direita do inserto está presente no ADN do evento H7-1 transgênico e no ADN das plantas não-transgênicas. Dai se conclui que esse ADN localizado fora do inserto do evento H7-1 é um ADN genómico não-transgênico.

Nos experimentos em PCR realizados com o ADN do evento H7-1 e o ADN de uma planta de controlo não-transgênica, utilizando a combinação de primers P4, contendo um primer localizado dentro do inserto CP4-EPSPS, obteve-se um 33 ΕΡ1597373Β1 fragmento exclusivamente com o ADN do evento H7-1. Em contraste, nos experimentos em PCR em que se utilizou a combinação de primers P2, homóloga às sequências localizadas fora do inserto, produziram-se fragmentos tanto com o ADN do evento H7-1 como também com o ADN de controlo não-transgênico (Fig. 14).

Os resultados mostram que a sequência localizada o lado da junção esquerda do inserto está presente no ADN do evento H7-1 transgênico e no ADN das plantas não-transgênicas. Dai se conclui que esse ADN localizado fora do inserto do evento H7-1 é um ADN genómico não-transgênico.

Em suma, pode-se afirmar que as sequências localizadas fora do inserto do evento de beterraba açucareira H7-1 são idênticas às sequências presentes em plantas não-transgênicas. Pode-se concluir que essas sequências são sequências vegetais genómicas presentes na linhagem parental utilizada para a transformação e em outras linhagens convencionais de beterraba açucareira. 6. Estabilidade ao longo de gerações

Para demonstrar a estabilidade do ADN integrado, comparou-se o evento de transformação original H7-1 com três progénies (64801H, 74922H e 83002S; vide Fig. 15) dessa linhagem obtidas por autopolinização com linhagens de beterraba açucareira não-transgênicas. As linhagem original transformada e as progénies foram produzidas nos anos 1995, 1996, 1997 e 1998.

Como controlo analisarem-se quatro diferentes linhagens não-transgênicas de beterraba açucareira (3S0057, 5R7150, 34 ΕΡ1597373Β1 8Κ1180, 6S0085). Todos os ADNs foram hibridizados com Xbal,

HindIII ou BamHI e com um fragmento CP4-EPSPS marcado. Para demonstrar que o T-ADN está integrado de forma estável no genoma da planta, todas as pistas das progénies do H7-1, tratadas com a mesma enzima de restrição, deveriam apresentar uma banda com exatamente o mesmo tamanho.

Os ADNs das progénies do H7-1, pistas 3 a 6, mostram os fragmentos esperados: 0 ADN digerido com BamHI produziu bandas de aproximadamente 11 kb, digestões com Xbal

produziram fragmentos de 4,0 kb e a restrição com HindIII formou bandas de 5,2 kb. Todas as bandas com a mesma restrição, mas de diferentes anos, eram idênticas em tamanho. Nenhuma das linhagens não-transgênicas apresentou qualquer sinal (Fig. 16).

Esses resultados mostram que a sequência introduzida está integrada de forma estável no ADN genómico e se transmite também de forma estável.

Listagem das sequências - texto livre SEQ IP; 5 <223>: ADN inserido, com as sequências flanqueadoras 3'- e 5' SEQ IP; 6 <223>: Produto da PCR SEQ IP; 11 <223>: Produto da PCR SEQ IP: 12

<223>: Produto da PCR 35 ΕΡ1597373Β1 SEQ ID: 13 <223>: Produto da PCR SEQ ID: 17

<223>: Produto da PCR 36 ΕΡ1597373Β1

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

<110> KWS SAAT AG <120> Beterraba açucareira tolerante ao glifosato <130> PCT 0079 <150> EP 03003866.5<151> 2003-02-20 <150> US 10/376763<151> 2003-02-28 <160> 21 <170> Patente versão 3.1 <210> 1<211> 30<212> ADN<213> Sequência artificial <220><223> Primer <400> 1 ttaatttttg caggcgatgg tggctgttat 30 <210> 2<211> 30<212> ADN<213> Sequência artificial <220><223> Primer <400> 2 catacgcatt agtgagtggg ctgtcaggac 30 <210> 3<211> 20<212> ADN<213> Sequência artificial <220><223> Primer <400> 3 atgttatctt taccacagtt 20 <210> 4<211> 24<212> ADN<213> Sequência artificial<220><223> Primer <400> 4 gtccctaaat gaaatacgta aaac 24 <210> 5<211> 3778<212> ADN<213> Sequência artificial <220><223> ADN inserido, com as sequências flanqueadoras 3' e 5' <400> 5 ctcgagcggc cgccagtgtg atggatatct gcagaattcg cccttatgtt atctttacca 60 37 ctctgacaca accggtaaat gcattggcct ttgtttttga tggcatcaac ctgattttgc atattcagcc ttttccatgg taattctttt acaagaattt ttaagtataa acacttagct tgggacaaac ttctgatcct atttcttaat gatggtggct gttatgagca ttttgtgttt gatgtttctt tcttctcatt tgggatctgg gtggctctaa ctatttacat gagcctccgc gcgtttgctg acgacaatct gatccccatc aagcttgagc tcaggattta gcagcattcc caatcaacaa ggtacgagcc atatcacttt attcaaattg gtatcgccaa gaactcccat cctcaaaggt ttgtaaggaa gaattctcag tccaaagcct agggtacaga gtctccaaac cattagccaa aagctacagg agatcaatga atcaaagtaa actactgttc cagcacatgc atcatggtca gtaagtttca tccaccgaag acttaaagtt agtgggcatc tttgaaagta atcttgtcaa ctggcttgtg gggaccagac aaaaaaggaa tggtgcagaa ttgttaggcg aagcatcttt gcctttattg caaagataaa gcagattcct ctagtacaag aataacgtgg aaaagagctg tcctgacagc ccactcacta atgcgtatga gacgaccaca aaagaattcc ctctatataa gaaggcattc attcccattt cagatactca accaatcctt ctagaagatc taagcttatc gataagcttg aggaagatca aaattttcaa tccccattct tcgattgctt caattgaagt gcgcaagtta gcagaatctg caatggtgtg cagaacccat ctcttatctc aaatccagtc aacgcaaatc tcccttatcg gtttctctga agacgcagca gcttatccga tttcgtcgtc gtggggattg aagaagagtg ggatgacgtt gagcttcgtc ctcttaaggt catgtcttct gtttccacgg cgtgcatgct agcagccgtc cagcaactgc tcgtaagtcc tctggtcttt ctggaaccgt ggtgacaagt ctatctccca caggtccttc atgtttggag gtctcgctag cgtatcaccg gtcttttgga aggtgaagat gttatcaaca ctggtaaggc atgggtgcca gaatccgtaa ggaaggtgat acttggatca ttgatggtgt ggactccttg ctcctgaggc tcctctcgat ttcggtaacg ctgcaactgg actatgggtc ttgttggtgt ttacgatttc gatagcactt tcattggtga actaagcgtc caatgggtcg tgtgttgaac ccacttcgcg aaatgggtgt tctgaagacg gtgatcgtct tccagttacc ttgcgtggac caaagactcc acctacaggg tacctatggc ttccgctcaa gtgaagtccg ctgttctgct aacaccccag gtatcaccac tgttatcgag ccaatcatga ctcgtgacca atgcttcaag gttttggtgc taaccttacc gttgagactg atgctgacgg atccgtcttg aaggtcgtgg taagctcacc ggtcaagtga ttgatgttcc tcctctactg ctttcccatt ggttgctgcc ttgcttgttc caggttccga cttaacgttt tgatgaaccc aacccgtact ggtctcatct tgactctgca gccgacatcg aagtgatcaa cccacgtctt gctggtggag aagacgtggc gttcgttctt ctactttgaa gggtgttact gttccagaag accgtgctcc gacgagtatc caattctcgc tgttgcagct gcattcgctg aaggtgctac ggtttggaag aactccgtgt taaggaaagc gaccgtcttt ctgctgtcgc aagctcaacg gtgttgattg cgatgaaggt gagacttctc tcgtcgtgcg ΕΡ1597373Β1 tggtcgtcct gacggtaagg gtctcggtaa cgcttctgga gcagctgtcg ctacccacct 2520 cgatcaccgt atcgctatga gcttcctcgt tatgggtctc gtttctgaaa accctgttac 2580 tgttgatgat gctactatga tcgctactag cttcccagag ttcatggatt tgatggctgg 2640 tcttggagct aagatcgaac tctccgacac taaggctgct tgatgagctc aagaattcga 2700 gctcggtacc ggatcctcta gctagagctt tcgttcgtat catcggtttc gacaacgttc 2760 gtcaagttca atgcatcagt ttcattgcgc acacaccaga atcctactga gtttgagtat 2820 tatggcattg ggaaaactgt ttttcttgta ccatttgttg tgcttgtaat ttactgtgtt 2880 ttttattcgg ttttcgctat cgaactgtga aatggaaatg gatggagaag agttaatgaa 2940 tgatatggtc cttttgttca ttctcaaatt aatattattt gttttttctc ttatttgttg 3000 tgtgttgaat ttgaaattat aagagatatg caaacatttt gttttgagta aaaatgtgtc 3060 aaatcgtggc ctctaatgac cgaagttaat atgaggagta aaacacttgt agttgtacca 3120 ttatgcttat tcactaggca acaaatatat tttcagacct agaaaagctg caaatgttac 3180 tgaatacaag tatgtcctct tgtgttttag acatttatga actttccttt atgtaatttt 3240 ccagaatcct tgtcagattc taatcattgc tttataatta tagttatact catggatttg 3300 tagttgagta tgaaaatatt ttttaatgca ttttatgact tgccaattga ttgacaacat 3360 gcatcaatcg acctgcagcc actcgaagcg gccgccactc gagtggtggc cgcatcgatc 3420 gtgaagtttc tcatctaagc ccccatttgg acgtgaatgt agacacgtcg aaataaagat 3480 ttccgaatta gaataatttg tttattgctt tcgcctataa atacgacgga tcgtaatttg 3540 tcgttttatc aaaatgtact ttcattttat aataacgctg cggacatcta catttttgaa 3600 40 ΕΡ1597373Β1 ttgaaaaaaa ttggtaatta ctctttcttt ttctccatat tgaccatcat actcattgct 3660 gatccatgta gatttcccgg acatgaagcc atttacaatt gaatatatcc taagtaaaac 3720 ctcataggtt ttacgtattt catttaggga caagggcgaa ttccagcaca ctggcggc 3778 <210> 6<211> 3706<212> ADN<213> Sequência artificial <220><223> Produto da [ PCR <4 0 0> 6 atgttatctt taccacagtt tgttgctctg acacaaccgg taaatgcatt ggcctttgtt 60 tttgatggca tcaactttgg agcatctgat tttgcatatt cagccttttc catggtaatt 120 cttttacaag aattttcatt ctttcttaag tataaacact tagcttggga caaacttctg 180 atcctatttc ttaatttttg caggtgatgg tggctgttat gagcattttg tgtttgatgt 240 ttctttcttc tcattacggt tttattggga tctgggtggc tctaactatt tacatgagcc 300 tccgcgcgtt tgctgaaggc gggaaacgac aatctgatcc ccatcaagct tgagctcagg 360 atttagcagc attccagatt gggttcaatc aacaaggtac gagccatatc actttattca 420 aattggtatc gccaaaacca agaaggaact cccatcctca aaggtttgta aggaagaatt 480 ctcagtccaa agcctcaaca aggtcagggt acagagtctc caaaccatta gccaaaagct 540 acaggagatc aatgaagaat cttcaatcaa agtaaactac tgttccagca catgcatcat 600 ggtcagtaag tttcagaaaa agacatccac cgaagactta aagttagtgg gcatctttga 660 aagtaatctt gtcaacatcg agcagctggc ttgtggggac cagacaaaaa aggaatggtg 720 cagaattgtt aggcgcacct accaaaagca tctttgcctt tattgcaaag ataaagcaga 780 ttcctctagt acaagtgggg aacaaaataa cgtggaaaag agctgtcctg acagcccact 840 cactaatgcg tatgacgaac gcagtgacga ccacaaaaga attccctcta tataagaagg 900 41 catttgaagg atcatcagat actcaaccaa tccttctaga agatctaagc gcttgatgta attggaggaa gatcaaaatt ttcaatcccc attcttcgat gaagtttctc cgatggcgca agttagcaga atctgcaatg gtgtgcagaa atctccaatc tctcgaaatc cagtcaacgc aaatctccct tatcggtttc cagcagcatc cacgagctta tccgatttcg tcgtcgtggg gattgaagaa acgttaattg gctctgagct tcgtcctctt aaggtcatgt cttctgtttc atgcttcacg gtgcaagcag ccgtccagca actgctcgta agtcctctgg accgtccgta ttccaggtga caagtctatc tcccacaggt ccttcatgtt gctagcggtg aaacccgtat caccggtctt ttggaaggtg aagatgttat aaggctatgc aagctatggg tgccagaatc cgtaaggaag gtgatacttg ggtgttggta acggtggact ccttgctcct gaggctcctc tcgatttcgg actggttgcc gtttgactat gggtcttgtt ggtgtttacg atttcgatag ggtgacgctt ctctcactaa gcgtccaatg ggtcgtgtgt tgaacccact ggtgtgcagg tgaagtctga agacggtgat cgtcttccag ttaccttgcg actccaacgc caatcaccta cagggtacct atggcttccg ctcaagtgaa ctgcttgctg gtctcaacac cccaggtatc accactgtta tcgagccaat gaccacactg aaaagatgct tcaaggtttt ggtgctaacc ttaccgttga gacggtgtgc gtaccatccg tcttgaaggt cgtggtaagc tcaccggtca gttccaggtg atccatcctc tactgctttc ccattggttg ctgccttgct ΕΡ1597373Β1 tgttccaggt tccgacgtca ccatccttaa cgttttgatg aacccaaccc gtactggtct 2100 catcttgact ctgcaggaaa tgggtgccga catcgaagtg atcaacccac gtcttgctgg 2160 tggagaagac gtggctgact tgcgtgttcg ttcttctact ttgaagggtg ttactgttcc 2220 agaagaccgt gctccttcta tgatcgacga gtatccaatt ctcgctgttg cagctgcatt 2280 cgctgaaggt gctaccgtta tgaacggttt ggaagaactc cgtgttaagg aaagcgaccg 2340 tctttctgct gtcgcaaacg gtctcaagct caacggtgtt gattgcgatg aaggtgagac 2400 ttctctcgtc gtgcgtggtc gtcctgacgg taagggtctc ggtaacgctt ctggagcagc 2460 tgtcgctacc cacctcgatc accgtatcgc tatgagcttc ctcgttatgg gtctcgtttc 2520 tgaaaaccct gttactgttg atgatgctac tatgatcgct actagcttcc cagagttcat 2580 ggatttgatg gctggtcttg gagctaagat cgaactctcc gacactaagg ctgcttgatg 2640 agctcaagaa ttcgagctcg gtaccggatc ctctagctag agctttcgtt cgtatcatcg 2700 gtttcgacaa cgttcgtcaa gttcaatgca tcagtttcat tgcgcacaca ccagaatcct 2760 actgagtttg agtattatgg cattgggaaa actgtttttc ttgtaccatt tgttgtgctt 2820 gtaatttact gtgtttttta ttcggttttc gctatcgaac tgtgaaatgg aaatggatgg 2880 agaagagtta atgaatgata tggtcctttt gttcattctc aaattaatat tatttgtttt 2940 ttctcttatt tgttgtgtgt tgaatttgaa attataagag atatgcaaac attttgtttt 3000 gagtaaaaat gtgtcaaatc gtggcctcta atgaccgaag ttaatatgag gagtaaaaca 3060 cttgtagttg taccattatg cttattcact aggcaacaaa tatattttca gacctagaaa 3120 agctgcaaat gttactgaat acaagtatgt cctcttgtgt tttagacatt tatgaacttt 3180 cctttatgta attttccaga atccttgtca gattctaatc attgctttat aattatagtt 3240 43 ΕΡ1597373Β1 atactcatgg atttgtagtt gagtatgaaa atatttttta atgcatttta tgacttgcca 3300 attgattgac aacatgcatc aatcgacctg cagccactcg aagcggccgc cactcgagtg 3360 gtggccgcat cgatcgtgaa gtttctcatc taagccccca tttggacgtg aatgtagaca 3420 cgtcgaaata aagatttccg aattagaata atttgtttat tgctttcgcc tataaatacg 3480 acggatcgta atttgtcgtt ttatcaaaat gtactttcat tttataataa cgctgcggac 3540 atctacattt ttgaattgaa aaaaattggt aattactctt tctttttctc catattgacc 3600 atcatactca ttgctgatcc atgtagattt cccggacatg aagccattta caattgaata 3660 tatcctaagt aaaacctcat aggttttacg tatttcattt agggac 3706 <210> 7<211> 23<212> ADN<213> Sequência artificial <220><223> Primer <4 0 0> 7 atgcattggc ctttgttttt gat 23 <210> 8<211> 19<212> ADN<213> Sequência artificial <22 0><223> Primer <4 0 0> 8 tgtcgtttcc cgccttcag 19 <210> 9<211> 26<212> ADN<213> Sequência artificial<220><223> Primer <400> 9 cgctgcggac atctacattt ttgaat 26 <210> 10<211> 28<212> ADN<213> Sequência artificial <220><223> Primer <400> 10 agttaacttt ccacttatcg gggcactg 28 44 ΕΡ1597373Β1 <210> 11<211> 288<212> ADN<213> Sequência artificial

<220><223> Produto da PCR <4 0 0> 11 atgcattggc ctttgttttt gatggcatca actttggagc atctgatttt gcatattcag 60 ccttttccat ggtaattctt ttacaagaat tttcattctt tcttaagtat aaacacttag 120 cttgggacaa acttctgatc ctatttctta atttttgcag gcgatggtgg ctgttatgag 180 cattttgtgt ttgatgtttc tctcttctca ttacggtttt attgggatct gggtggctct 240 aactatttac atgagcctcc gcgcgtttgc tgaaggcggg aaacgaca 288 <210> 12<211> 751<212> ADN<213> Sequência artificial<220><223> Produto da PCR <4 0 0> 12 cgctgcggac atctacattt ttgaattgaa aaaaaattgg taattactct ttctttttct 60 ccatattgac catcatactc attgctgatc catgtagatt tcccggacat gaagccattt 120 acaattgaat atatcctaag taaaacctca taggttttac gtatttcatt tagggactaa 180 aatggtttag gataattact ttagctaaca taagataata aataaataaa taaataaaaa 240 taaaatggtt gtagataaat aaggaaatca ataatgaata tgagtgtgag tgataggacg 300 ggaatgggaa acttttacac tactttaacg ctattgaacg agtatgagta tgttataaac 360 gtaaaatgtt ttatgtgtta gacaatggcc tcaagtgaaa gtgaccctat taatggagga 420 aatgcaaacc acgagtctga ggtcacgctc gaagaaatga gggcaaggat cgacgcattg 480 cgtagcgacc ctgtttttgg agatgccacg ggagatgcta gtgataaccg aatggattta 540 atgaggttga tgatgatgga gcttttacaa ggaaatcgac aaaggcctag aactgaacaa 600 45 ΕΡ1597373Β1 gaagagtgct caaacatgtt caagaggttt tcggctcata agcccccaac ttatgatgga 660 aagccagacc ccactgagtt tgaagaatgg ctcaacggca tggaaaaatt gttcgatgcc 720 acccagtgcc ccgataagtg gaaagttaac t 751 <210> 13<211> 664<212> ADN<213> Sequência artificial

<220><223> Produto da PCR <400> 13 ttaatttttg caggcgatgg tggctgttat gagcattttg tgtttgatgt ttctctcttc 60 tcattacggt tttattggga tctgggtggc tctaactatt tacatgagcc tccgcgcgtt 120 tgctgaaggc gggaaacgac aatctgatcc ccatcaagct tgagctcagg atttagcagc 180 attccagatt gggttcaatc aacaaggtac gagccatatc actttattca aattggtatc 240 gccaaaacca agaaggaact cccatcctca aaggtttgta aggaagaatt ctcagtccaa 300 agcctcaaca aggtcagggt acagagtctc caaaccatta gccaaaagct acaggagatc 360 aatgaagaat cttcaatcaa agtaaactac tgttccagca catgcatcat ggtcagtaag 420 tttcagaaaa agacatccac cgaagactta aagttagtgg gcatctttga aagtaatctt 480 gtcaacatcg agcagctggc ttgtggggac cagacaaaaa aggaatggtg cagaattgtt 540 aggcgcacct accaaaagca tctttgcctt tattgcaaag ataaagcaga ttcctctagt 600 acaagtgggg aacaaaataa cgtggaaaag agctgtcctg acagcccact cactaatgcg 660 tatg 664 <210> 14<211> 30<212> ADN<213> Sequência artificial <220><223> Primer <4 0 0> 14 46 ΕΡ1597373Β1 gctctgacac aaccggtaaa tgcattggcc 30 <210> 15<211> 30<212> ADN<213> Sequência artificial <220><223> Primer <400> 15 gacccatagt ttgattttaa gcacgacatg 30 <210> 16<211> 29<212> ADN<213> Sequência artificial <220><223> Primer <4 0 0> 16 gcagattctg ctaacttgcg ccatcggag 29 <210> 17<211> 1042<212> ADN<213> Sequência artificial

<220><223> Produto da PCR

<220><221> misc_feature <223> Produto da PCR <4 0 0> 17 gctctgacac aaccggtaaa tgcattggcc tttgtttttg atggcatcaa ctttggagca 60 tctgattttg catattcagc cttttccatg gtaattcttt tacaagaatt ttcattcttt 120 cttaagtata aacacttagc ttgggacaaa cttctgatcc tatttcttaa tttttgcagg 180 cgatggtggc tgttatgagc attttgtgtt tgatgtttct ctcttctcat tacggtttta 240 ttgggatctg ggtggctcta actatttaca tgagcctccg cgcgtttgct gaaggcggga 300 aacgacaatc tgatccccat caagcttgag ctcaggattt agcagcattc cagattgggt 360 tcaatcaaca aggtacgagc catatcactt tattcaaatt ggtatcgcca aaaccaagaa 420 ggaactccca tcctcaaagg tttgtaagga agaattctca gtccaaagcc tcaacaaggt 480 cagggtacag agtctccaaa ccattagcca aaagctacag gagatcaatg aagaatcttc 540 47 ΕΡ1597373Β1 aatcaaagta aactactgtt ccagcacatg catcatggtc agtaagtttc agaaaaagac 600 atccaccgaa gacttaaagt tagtgggcat ctttgaaagt aatcttgtca acatcgagca 660 gctggcttgt ggggaccaga caaaaaagga atggtgcaga attgttaggc gcacctacca 720 aaagcatctt tgcctttatt gcaaagataa agcagattcc tctagtacaa gtggggaaca 780 aaataacgtg gaaaagagct gtcctgacag cccactcact aatgcgtatg acgaacgcag 840 tgacgaccac aaaagaattc cctctatata agaaggcatt cattcccatt tgaaggatca 900 tcagatactg aaccaatcct tctagaagat ctaagcttat cgataagctt gatgtaattg 960 gaggaagatc aaaattttca atccccattc ttcgattgct tcaattgaag tttctccgat 1020 ggcgcaagtt agcagaatct gc 1042 <210> 18<211> 23<212> ADN<213> Sequência artificial <220><223> Primer <4 0 0> 18 cggtaaatgc attggccttt gtt 23 <210> 19<211> 26<212> ADN<213> Sequência artificial <220><223> Primer <4 0 0> 19 cacccagatc ccaataaaac cgtaat 26 <210> 20<211> 28<212> ADN<213> Sequência artificial <220><223> Primer <4 0 0> 20 aaatggttgt agataaataa ggaaatca 28 <210> 21<211> 23<212> ADN<213> Sequência artificial<220><223> Primer 48 ΕΡ1597373Β1 <4 Ο 0> 21 acatgtttga gcactcttct tgt

Lisboa 21 de Setembro de 2012

Claims (6)

1. ΕΡ1597373Β1 REIVINDICAÇÕES 1. Planta da beterraba açucareira tolerante ao glifosato, caracterizada pelo facto de a) ser possível amplificar um fragmento de DNA do DNA genómico da planta da beterraba, partes ou sementes dela, pela reação em cadeia da polimerase com um primeiro primer que contenha a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 3, e com um segundo primer contendo a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 4, em que o fragmento de DNA tenha pelo menos 95% de identidade com a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 6, e/ou b) ser possível amplificar um fragmento de DNA do DNA genómico da planta da beterraba, partes ou sementes dela, pela reação em cadeia da polimerase com um primeiro primer que contenha a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 9, e com um segundo primer contendo a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 10, em que o fragmento de DNA tenha pelo menos 95% de identidade com a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 12, e/ou c) ser possível amplificar um fragmento de DNA do DNA genómico da planta da beterraba, partes ou sementes dela, pela reação em cadeia da polimerase com um primeiro primer que contenha a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 14, e com um segundo primer contendo a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 16, em que o fragmento de DNA tenha pelo menos 95% de identidade com a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 17.
2. 2. Sementes de uma planta de acordo com a reivindicação 1. 1 ΕΡ1597373Β1
3. 3. Célula, tecido ou partes da planta de acordo com a reivindicação 1.
4. 4. Método para a identificação de uma planta da beterraba resistente ao glifosato, caracterizado pelo facto de o método compreender o(s) passo(s): a) amplificar um fragmento de DNA de 3500-3900 bp, de preferência 3706 bp do DNA genómico da planta da beterraba, partes ou sementes dela, pela reação em cadeia da polimerase com um primeiro primer que contenha a sequência nucleotidica da SEQ ID NO: 3, e com um segundo primer contendo a sequência nucleotidica da SEQ ID NO: 4, e/ou b) amplificar um fragmento de DNA de 710- 790 bp, de preferência 751 bp do DNA genómico da planta da beterraba, partes ou sementes dela, pela reação em cadeia da polimerase com um primeiro primer que contenha a sequência nucleotidica SEQ ID NO: 9, e com um segundo primer contendo a sequência nucleotidica SEQ ID NO: 10, e/ou c) amplificar um fragmento de DNA de 990-1100 bp, de preferência 1042 bp do DNA genómico da planta da beterraba pela reação em cadeia da polimerase com um primeiro primer que contenha a sequência nucleotidica SEQ ID NO: 14, e com um segundo primer contendo a sequência nucleotidica SEQ ID NO: 16.
5. 5. Kit de teste para a identificação de uma planta da beterraba transgênica tolerante ao glifosato, cujas células, 2 ΕΡ1597373Β1 tecido ou partes, compreendendo pelo menos um par de primer com um primeiro e um segundo primer para a reação em cadeia da polimerase, onde o primeiro primer reconhece um sequência dentro de um DNA estranho inserido no genoma da planta, e o segundo primer reconhece uma sequência dentro das regiões 3' ou 5' do DNA, sendo a planta uma planta esta definida na reivindicação 1.
6. 6. Kit de testes de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de a) o primeiro primer conter a sequência nucleotídica SEQ ID NO: 9 e o segundo primer a sequência nucleotídica SEQ ID NO: 10, e/ou b) o primeiro primer contém a sequência nucleotídica SEQ ID NO: 14 e o segundo primer a sequência nucleotídica SEQ ID NO: 16. Lisboa, 21 de Setembro de 2012 3