CZ2003629A3

CZ2003629A3 - Rostlina pšenice 33391 tolerantní ke glyfosátu a kompozice a způsoby její detekce

Info

Publication number: CZ2003629A3
Application number: CZ2003629A
Authority: CZ
Inventors: Guilan Chen; Catherine M. Hironaka; Hua-Ping Zhou
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2000-09-29
Filing date: 2001-09-25
Publication date: 2003-08-13
Also published as: CZ300073B6; US20020062503A1; EP1322773A2; WO2002027004A2; AR030812A1; AU2001293044B2; CA2420406A1; CA2420406C; WO2002027004A3; AR069294A2; US7071325B2; AU9304401A; US7268274B2; PL365885A1; PL214848B1; US20040133939A1; US20040133940A1; US6689880B2

Description

Rostlina pšenice 33391 tolerantní ke glyfosátu a kompozice a způsoby její detekce

Oblast techniky ⁽

Vynález se týká oblasti rostlinné molekulární biologie, přesněji se týká DNA konstruktu pro prokazatelně lepší toleranci rostliny pšenice vůči glyfosátu. Vynález se přesněji týká rostliny pšenice 33391 tolerantní ke glyfosátu a jejího rodu a testů detekce přítomnosti DNA rostliny pšenice 33391 ve vzorku a testovacích kompozic.

Dosavadní stav vynálezu

Pšenice je důležitá plodina a v mnoha oblastech světa je primárním zdrojem potravin. Na pšenici byly aplikovány biotechnologické metody za účelem vylepšení agronomických vlastností a kvality produktu. Jednou z takových agronomických vlastností je tolerance vůči herbicidům, zejména tolerance vůči glyfosátovému herbicidu. Tato vlastnost pšenice je způsobena expresí transgenu v rostlinách pšenice (Zhou et al., Plant Cell Rep. 15:159-163, 1995). Exprese cizích genů v rostlinách je, jak známo, ovlivněna pozicí začlenění těchto genů do chromozomu, pravděpodobně díky chromatinové struktuře (tzv. heterochromatin) nebo těsné blízkosti transkripčně regulačních elementů (tzv. enhancery) od místa integrace (Weising et al., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988). Z těchto důvodů je často nezbytné sledovat velké množství případů z důvodu identifikace případu charakterizovaného optimální expresí žádaného zaváděného genu. Například bylo pozorováno u rostlin a dalších organismů, že se může vyskytnout široká variabilita v hladinách exprese zaváděného genu v rámci případů. Rozdíly mohou být v prostorovém nebo časovém charakteru exprese, například rozdíly v relativní expresi transgenu v různých rostlinných tkáních, které nemusí odpovídat charakteru očekávanému na základě transkripčně regulačních elementů přítomných v zaváděném genovém konstruktu. Z těchto důvodů je běžné produkovat stovky až tisíce různých případů a sledovat tyto případy za zisku jednoho případu, který má požadované expresní hladiny transgenu, a charakter exprese pro komerční použití. Případ, který má požadované hladiny a charakter exprese transgenu je použitelný pro vnesení transgenu do dalších genetických pozadí sexuálním „outcrossingem“ s použitím konvenčních šlechtitelských metod. Potomci takových kříženců udržují charakter exprese transgenu původního transfomnanta. Tato strategie je používána za účelem zajištění spolehlivé genové exprese v množství variet, které jsou dobře adaptovány pro lokální růstové podmínky.

Bylo by výhodné umět detekovat přítomnost případu zejména při určování, zda potomek sexuálního křížení obsahuje požadovaný transgen. Navíc způsob detekce specifických případů by byl užitečný například pro vyhovění předpisům vyžadujícím schválení pro trh a označení potravin odvozených z rekombinantních rostlin. Přítomnost transgenu je možné detekovat jakoukoliv obecně známou metodou detekce nukleových kyselin, jako je polymerázová řetězcová reakce (PCR, polymeraze chain reaction) nebo DNA hybridizace s využitím prob nukleových kyselin. Tyto detekční metody se obecně zaměřují na často používané genetické elementy jako jsou promotory, terminátory, značkové geny atd. Ve výsledku tyto metody nemusí být užitečné pro rozlišení mezi různými případy a to zejména těmi, které byly vyprodukovány s využitím stejného DNA konstruktu bez toho, aniž by byla • · • · · ·

známa sekvence chromozomální DNA přilehlá k vložené DNA („přiléhající DNA“). Je například diskutován PCR test specifický pro případy (Windels et al., Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent 64/5b:459 - 462, 1999), kdy byl pomocí PCR identifikován případ sóji 40-3-2 tolerantní ke glyfosátu s využitím setu primerů překlenuj ících spoj mezi inzertem vložené DNA, přesněji jeden primer zahrnoval sekvenci insertu a druhý primer obsahoval sekvenci vložené DNA.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje rostliny pšenice 33391 (Triticum aestivum) s vylepšenou tolerancí vůči glyfosátu, DNA rostlinných expresních konstruktů rostliny pšenice 33391 a dále detekce oblasti inzerce transgenu do genomu u pšenice 33391 a jejích potomků.

Podle jednoho provedení vynálezu je poskytnut DNA konstrukt, který, pokud je exprimován v rostlinných buňkách pšenice, tak tyto rostliny vykazují lepší toleranci vůči glufosátovému herbicidu. Vynález poskytuje způsob produkce a selekce rostlin pšenice tolerantních vůči glyfosátu obsahujících DNA konstrukt pMON30139. DNA konstrukt pMON30139 obsahuje dvě transgenní expresní kazety. První expresní kazeta obsahuje promotor actin 1 (P-Os.Act1) z rýže (Oryzae sativa) a intron (IOs.Actl) funkčně napojený na EPSPS chloroplastovou tranzitní peptidovou sekvenci (TS-At.EPSPS) zArabidopsis funkčně napojenou na gen (AGRTU.aroA:CP4) kódující glyfosát rezistentní 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfátsyntázu (EPSPS) izolovaný z Agrobacterium tumefaciens (AGRTU) sp. kmen CP4 funkčně napojený na transkripční inhibitor nopalin syntázy (T-AGRTU.nos). Druhá transgenní expresní kazeta se sestává z 35Spromotoru (P-CaMV.35S:en) mozaikového viru květáku (CaMV) obsahujícího tandemový duplikát oblasti enhanceru funkčně napojený na Hsp70 intron (l-Zm.Hsp70) z rostliny Zea mays, funkčně napojený na sekvenci nukleových kyselin kódující EPSPS chloroplastovou tranzitní peptidovou sekvenci zArabidopsis thaliana, funkčně napojený na gen kódující glyfosát rezistentní 5-enol-pyruvylšikimát-3-fosfát syntázu izolovanou z Agrobacterium tumefaciens (AGRTU) sp. kmen CP4, funkčně napojený na transkripční inhibitor nopalin syntázy. Tyto expresní kazety jsou v tandemu a jsou přemostěny oblastí DNA, která obsahuje DNA sekvence Agrobacterium tumefacies (RB a LB) jako komponenty způsobu, který je použit v rámci způsobu zprostředkované organismem Agrobacterium pro vložení expresních kazet do genomu pšenice.

Podle dalšího provedení vynálezu, je poskytnuto osivo pšenice 33391 obsahující tyto molekuly DNA, jak je uloženo v Americké sbírce typů kultur (American type culture collection, ATCC), záznam č. PTA-2347. Toto provedení podle vynálezu se tedy týká osiva pšenice 33391, rostlin pšenice 33391, částí rostlin pšenice 33391, které obsahují pyl a vajíčka, a způsobů produkce pšeničných rostlin s lepší tolerancí vůči glyfosátu křížením rostlin pšenice 33391 se stejnou rostlinou pšenice nebo jiného druhu.

Podle dalšího provedení vynálezu jsou poskytnuty kompozice a způsoby detekce přítomnosti oblasti inzerce transgenu do genomu u rostlin pšenice 33391 a osiva. Podle jednoho z provedení vynálezu jsou DNA molekuly vytvořeny tak, aby obsahovaly alespoň jednu sekvenci oblasti inzerce transgenu do genomu pšenice 33391, kde sekvence je vybrána ze skupiny obsahující SEQ ID č.5 a

SEQ ID č.6 a jejich komplementární sekvence, kde sekvence oblasti inzerce zahrnuje spojení mezi • · • · · · • · · • · · · * · · ·· · · ···· · heterologní DNA vloženou do genomu pšenice a DNA genomu pšenice navazující na místo inzerce, a charakterizuje případ.

Zahrnuty jsou DNA sekvence, které obsahují dostatečnou délku polynudeotidové sekvence transgenního inzertu a dostatečnou délku polynudeotidové sekvence pšeničného genomu pšenice 33391 ze sekvence SEQ ID č.5, které jsou použitelné jako příměrové sekvence pro vznik amplikonu charakteristického pro pšenici 33391. Zahrnuty jsou DNA sekvence, které obsahují dostatečnou délku polynudeotidové sekvence transgenního inzertu a dostatečnou délku polynudeotidové sekvence pšeničného genomu pšenice 33391 ze sekvence SEQ ID č.6, které jsou použitelné jako primerové sekvence pro vznik amplikonu charakteristického pro pšenici 33391.

Podle jiného provedení vynálezu jsou vytvořeny molekuly DNA, které jsou charakteristické pro pšenici 33391. Toto provedení vynálezu je určeno pro pšenid 33391 obsahující alespoň jednu novou molekulu DNA. DNA molekuly obsahující primerové sekvence jsou vytvořeny tak, že poskytují alespoň jeden nový DNA amplikon pšenice 33391 obsahující sekvence SEQ ID č.7 a SEQ ID č.8 a sekvence k nim komplementární. Tyto DNA amplikony jsou charakteristické pro pšenici 33391. Amplifikace nukleových kyselin genomové DNA pšenice 33391 dá vzniku amplikonu obsahujícího tyto charakteristické DNA sekvence. Vynález poskytuje izolované DNA molekuly, které obsahují dostatečnou délku sekvence transgenního inzertu a dostatečnou délku genomové sekvence pšenice 33391, které fungují jako sekvence primerů pro produkd amplikonu charakteristického pro pšenid 33391.

Podle dalšího provedení vynálezu je poskytnut způsob detekce přítomnosti DNA odpovídající pšenici 33391 ve vzorku. Způsob podle vynálezu zahrnují a) kontakt vzorku obsahujícího DNA se setem primerů, které, když jsou použity pn amplifikační reakd nukleových kyselin společně s genomovou DNA pšenice 33391, dávají vzniknout amplikonu charakteristického pro pšenid 33391; b) provedení amplifikační reakce nukleových kyselin při které vzniká amplikon; a c) detekci amplikonu.

Podle jiného provedení vynálezu je poskytnut kit pro detekci pšenice 33391. Kit obsahuje alespoň jednu polynukleotídovou DNA sekvenci o dostatečné délce komplementární k SEQ ID č. 5 nebo SEQ ID č.6, kde DNA sekvence jsou použitelné jako primery nebo proby, které hybridizují s izolovanou DNA z pšenice 33391 nebo jejích potomků.

Podle dalšího provedení vynálezu je poskytnut způsob produkce rostliny pšenice s lepší tolerancí vůči glyfosátu, který zahrnuje kroky: a) sexuální křížení prvního rodiče pšeničné linie obsahující konstrukt pMON30139, který zajišťuje lepší tolerand vůči aplikaci glyfosátu, a druhého rodiče pšeničné linie, který nevykazuje toleranci vůči glyfosátu, za vzniku velkého množství dceřiných rostlin; a b) výběr dceřiné rostliny, která je tolerantní vůči aplikad glyfosátu. Způsob podle vynálezu je užitečný pro vnesení vlastnosti tolerance vůči glyfosátu do různých genetických pozadí. Tyto způsoby mohou případně zahrnovat další krok zpětného křížení dceřiné rostliny do druhého rodiče pšeničné linie za vzniku rostliny pšenice tolerantní vůči aplikaci glyfosátu.

Výše uvedené a další provedení vynálezu budou zřejmější z následujícího detailního popisu a doprovodných obrázků.

Stávající přihláška vynálezu nárokuje výhodu U.S.Provisional Aplication No. 60/236 653, uplatněno 09/29/00 a U.S.Provisional Application No. 60/236 653?, uplatněno 09/29/00. Pro lepší • · definici vynálezu a jako instrukce pro odborníky v dané oblasti při uvádění do praxe jsou uvedeny následující definice a způsoby. Bez toho, aby to bylo dále rozváděno, použité termíny jsou srozumitelné a konvenčně používané odborníky v dané oblasti. Definice běžných termínů molekulární biologie mohou být také nalezeny v práci Rieger et al., Glossaty of Genetics: Classical and Molecular, 5. vydání, Springer-Verlag: New York, 1991; a Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994. Je použita názvosloví DNA baží, jak je uvedeno v 37CFR § 1.822.

Jak je použito zde, termín „pšenice“ znamená Tríticum aestivum (včetně jarních, zimních a fakultativních variant pšenice), jakékoliv další druhy pšenice, které mohou být kříženy s Tríticum aestivum, včetně, ale ne pouze, tvrdá pšenice [Tríticum durum), pšenice špaldy [Tríticum spelta) a pšenice „emmer [Tríticum dicoccum). Zahrnuty jsou také rostliny, které jsou produkovány konvenčními technikami s využitím Tríticum aestivum jako rodiče při sexuálním křížení s druhy nespadajícími do Tríticum (jako je žito [Secale cereale]), včetně, ale ne pouze druh „triticale“.

Jak je použito zde, termín „obsahuje“ znamená .zahrnuje, ale nevyčerpává možnosti“.

„Glyfosát“ znamená N-fosfonometylglycin a jeho soli. Glyfosát je aktivní složka herbicidu Roundup® (Monsanto Co, St. Louis, MO). Ošetření „glyfosátovým herbicidem“ znamená ošetření přípravkem Roundup®, Roundup Ultra®, nebo jakoukoliv další formulací obsahující glyfosát. Pro účely vynálezu termín „glyfosát“ zahrnuje jakoukoliv herbicidně aktivní formu N-fosfonometylglycinu (včetně jeho jakýchkoliv solí) a další formy, které dávají vzniknout glyfosátového aniontu v rostlině. Ošetření „glyfosátem“ znamená ošetření přípravkem Roundup® nebo Roundup Ultra®, pokud není uvedeno jinak. Pro transformaci rostlin a regenerace v tkáňové kultuře je použit glyfosát nebo soli glyfosátu. Pro testy na celých rostlinách je použita formulace Roundup® nebo Roundup Ultra®. Další formulace s herbicidní aktivitou, které obsahují N-fosfonometylglycin nebo jakékoliv jeho soli, jsou zde uvedeny jako glyfosátový herbicid.

Transgenní „případ“ vzniká transformací rostlinných buněk heterologní DNA, tzn. konstruktu tvořeného nukleovou kyselinou, který obsahuje požadovaný transgen, regenerací populace rostlin vznikající na základě inzerce transgenu do genomu rostliny a selekcí zejména rostlin charakterizovaných inzercí do specifických genomových oblastí. Termín „případ“ označuje originálního transformanta a potomky transformanta, který obsahuje heterologní DNA. Termín „případ“ označuje také potomky vznikající sexuálním „outcross“ mezi transformantem a jinou variantou, která obsahuje heterologní DNA. Dokonce po opakovaném zpětném křížení rekurentního rodiče, vložená DNA a přiléhající sousední DNA z transformovaného rodiče je přítomna u potomků křížení ve stejném místě chromozomu. Termín „případ“ také označuje DNA z originálního transformanta a jeho potomků obsahující DNA inzert a genomové přiléhající sousední sekvence bezprostředně sousedící s DNA inzertem, u kterého se očekává, že bude přenesen potomkům, kteří obdrží DNA inzert včetně požadovaného transgenu jako výsledek sexuálního křížení rodičovské linie jež obsahuje DNA inzert (např. originální transformant a potomek vznikající vegetativním rozmnožováním (selfing) a rodičovské linie, která neobsahuje DNA inzert. Termín „případ“ ve vynálezu zahrnuje osivo pšenice 33391, jak je uloženo v ATCC, záznam č. PTA-2347 a rostliny pšenice, které vyrostli z osiva pšenice 33391 a jejich potomky. Rostlina pšenice, která je tolerantní k dostatečnému množství glyfosátového herbicidu pro řízení růstu plevele bez ovlivnění rostlin pšenice, může být namnožena sexuálním křížením prvního • · • · • · · · • · * · • · · · »»· ··

• · · · ·· ·· ··· ·· ·· rodiče rostliny pšenice, kterou představuje rostlina pšenice obsahující expresní kazety pMON30139 zajišťující lepší toleranci vůči aplikaci glyfosátového herbicidu a druhého rodiče rostliny pšenice, která postrádá toleranci vůči glyfosátovému herbicidu, za vzniku množství prvních potomků rostlin, poté selekcí prvních rostlinných potomků, které jsou tolerantní vůči aplikaci glyfosátu, vegetativním rozmnožováním (selfing) prvních rostlinných potomků za vzniku množství druhých rostlinných potomků a selekcí tolerantních rostlin vůči glyfosátu mezi druhým potomstvem. Tyto kroky mohou dále zahrnovat zpětné křížení rostliny prvního potomka tolerantního vůči aplikaci glyfosátového herbicidu nebo rostliny druhého potomstva tolerantního vůči aplikaci glyfosátového herbicidu s druhým rodičem rostliny pšenice nebo třetím rodičem rostliny pšenice za vzniku rostlin pšenice, které tolerují aplikaci glyfosátového herbicidu. Rostliny pšenice zahrnující osivo pšenice 33391 nebo jejich potomky, přičemž mohou být pěstovány na poli a ošetřovány dostatečným množstvím glyfosátového herbicidu pro řízení růstu plevele bez významného ovlivnění úrody pšenice. Dostatečné množství glyfosátového herbicidu je asi 59 μΙ na m² (8 uncí na akr) nebo více, 119μΙ na m² (16 uncí na akr) nebo více, 237 μΙ na m² (32 uncí na akr) nebo více nebo 474 μΙ na m² (64 uncí na akr) nebo více. Jakékoliv formulace obsahující glyfosátový herbicid mohou být použity pro řízení růstu plevele ve sklizni pšenice obsahující rostliny pšenice 33391 nebo jejich potomky.

Je také zřejmé, že dvě různé transgenní rostliny mohou být také kříženy za vzniku potomků, kteří obsahují dva nezávislé, oddělené exogenní geny. Vegetativní rozmnožování (selfing) vhodného potomka může vést ke vzniku rostlin, které jsou homozygotní pro oba přidané exogenní geny kódující požadovaný polypeptid. Stejně jako vegetativní rozmnožování je uvažováno také zpětné křížení s rodičovskou rostlinou a „out-crossing“ s netransgenní rostlinou. Popisy dalších šlechtitelských metod, které jsou běžně používány pro různé vlastnosti a plodiny, mohou být nalezeny v jedné z následujících prací: Fehr, in Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronoy, Madison Wl (1987) zde začleněna jako reference na celek; Poehlman, J. M. (1987); reeding Field Crops, 3. vydání. Van Nostrand Reinhold, NY, Knott, D. R. (1987); zde začleněna jako reference na celek The Application of Breeding Procedures to Wheat, strany 419-427 a také v práci E.G Heyne (ed.) In „Wheat and Wheat Improvement“, Madison, Wl. zde začleněna jako reference na celek. Šlechtění s využitím zpětného křížení je používáno pro transfer genů pro jednoduše děděné, vysoce děditelné vlastnosti do požadovaného homozygotního kultivaru nebo imbrední linie, kterou je rekurentní rodič. Zdroj vlastnosti, která má být přenesena, se nazývá donorový rodič. U výsledné rostliny se předpokládá, že bude vykazovat atributy rekurentního rodiče (například kultivaru) a požadovanou vlastnost přenesenou z donorového rodiče. Po počátečním křížení jsou vybráni potomci, kteří vykazují fenotyp donorového rodiče, a opakovaně zpětně kříženi s rekurentním rodičem. U výsledného rodiče se očekává, že bude mít atributy rekurentního rodiče (například kultivar) a požadovanou vlastnost přenesenou z donorového rodiče.

DNA molekuly podle vynálezu mohou být použity jako molekulární markéry u metody MAB (markér assisted breeding). DNA molekuly podle vynálezu mohou být použity v metodách jako jsou

AFLP (amplified fragment length polymorphismus), RFLP (restriction fragment length polymorphismus), SNP a SSR (simple sequence repeats), které slouží k identifikaci genetické vazby agronomicky užitečných vlastností, a které jsou popsány v pracech: Walton, Seed World 22-29 (červenec, 1993) zde začleněna tímto odkazem; Burow and Blake, Molecular Dissection of Complex Traits, 13-29, Eds. Paterson, CRC Press, New York (1988) zde začleněna tímto odkazem. Znak lepší tolerance vůči glyfosátu u rostliny pšenice 33391 může být u potomků křížení s rostlinou pšenice 33391 a jakoukoliv jinou variantou zjišťován pomocí metody MAB. DNA molekuly jsou markéry pro tento znak a v případě metody MAB je velice dobře známo, že může být použita pro zjišťování glyfosátové tolerance u pšenice, kde rostlina pšenice 33391 byla rodič nebo předek.

Termín „proba“ označuje izolovanou nukleovou kyselinu, ke které je připojena konvenčně detekovatelná nebo reportérová molekula, například radioizotop, ligand, chemiluminiscenční činidlo nebo enzym. Proba je komplementární k řetězci cílové nukleové kyseliny, v případě vynálezu k řetězci genomové DNA případu pšenice 33391 (ať už z rostliny pšenice nebo vzorku, který obsahuje DNA případu). Proby podle vynálezu nezahrnují pouze deoxyribonukleové nebo ribonukleové kyseliny, ale také polyamidy a další materiály tvořící proby tak, že se váží specificky k cílové DNA sekvenci a mohou být využity k detekci dané cílové DNA sekvence.

Termín „primery“ označuje izolované nukleové kyseliny, které jsou hybridizovány s kompiementámím řetězcem cílové DNA za vzniku hybridu mezi primerem a cílovým řetězcem DNA, poté prodlužovány podél cílového řetězce DNA pomocí polymerázy, například DNA polymerázy. Pár nebo set primerů může být použit pro amplifikaci sekvence nukleových kyselin například metodou PCR (polymerázová řetězcová reakce) nebo dalšími konvenčními metodami pro amplifikaci nukleových kyselin.

Proby a primery obvykle obsahují 8 nebo více polynukleotidů, 18 nebo více polynukleotidů, 24 nebo více polynukleotidů, 30 polynukleotidů nebo více. Polynukleotidy vhodné jako proby a primery mají dostatečnou délku, aby hybridizovaly specificky s cílovou sekvencí za stringentních (přesně daných) podmínek pro hybridizaci. Proby a primery podle vynálezu vykazují úplnou sekvenční podobnost s cílovou sekvencí, ačkoliv mohou být konvenčními metodami navrženy proby lišící se od cílové sekvence a přesto si udržují schopnost hybridizovat s cílovou sekvencí.

Metody přípravy a použití prob a primerů jsou popsány například v knize Molecular Cloning: A Laboratory manual, 2. vydání, svazek 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (dále, „Sambrook et al., 1989“) zde začleněna tímto odkazem; Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York, 1992 (s periodickými dodatky, dále .Ausubel et al., 1992) zde začleněna tímto odkazem; alnnis et al., PCR Protocols: A Guide to methods and Applications, Academie Press: San Diego, 1990 zde začleněna tímto odkazem. Pár PCR primerů může být odvozen od známé sekvence například použitím počítačových programů zamýšlených pro toto použití jako je například Primer (verze 0.5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA) zde začleněn tímto odkazem.

Primery a proby na bázi DNA sousedící s inzertem a na sekvencích inzertů popsaných ve vynálezu mohou být použity k potvrzení (a pokud je nezbytné k opravě) popsaných sekvencí konvenčními metodami, například reklonováním a sekvenováním těchto sekvencí.

Primery a proby podle vynálezu ve formě nukleových kyselin hybridizují za stringentních podmínek s cílovou DNA sekvencí. K identifikaci přítomnosti DNA transgenního případu ve vzorku může být použita jakákoliv konvenční metoda pro hybridizaci a amplifikaci nukleových kyselin.

• · · · • ·

Termín „stringentní podmínky“ je funkčně definován vzhledem k hybridizaci proby ve formě nukleové kyseliny s cílovou nukleovou kyselinou (například se specifickou sekvencí požadované nukleové kyseliny) podle specifického hybridizačního postupu popsaného v knize Sambrook et al., 1989, v kapitolách 9.52 - 9.55. Viz také Sambrook et al., 1989 kapitoly 9.47 - 9.52, 9.56 - 9.58 zde začleněn tímto odkazem; Kanehisa, (Nucl. Acids Res. 12:203 - 213, 1984, zde začleněn tímto odkazem; a Wetmur and Davidson, (J. Mol. Biol. 31:349 - 370, 1988, zde začleněn tímto odkazem). Tudíž nukleotidové sekvence podle vynálezu mohou být využity pro svoji schopnost selektivní tvorby duplexních molekul s komplementárními relaxovanými DNA fragmenty. V závislosti na zamýšlené aplikaci je možné požadovat aplikaci různých hybridizačních podmínek hybridizace, aby bylo dosaženo různých stupňů selektivity proby vůči cílové sekvenci. Pro aplikace vyžadující vysokou selektivitu jsou obvykle vyžadovány relativně stringentní podmínky pro tvorbu hybridů, například budou zvoleny podmínky s nízkým obsahem soli a/nebo vysokou teplotou, jako je například koncentrace soli v rozmezí asi 0,02M až asi 0,15 M pň teplotách v rozmezí asi 50 °C až asi 70 °C. Stringentní podmínky jsou určeny například také promýváním hybridizačního filtru alespoň dvakrát vysoce stringentním pufrem (0,2 x SSC, 0,1% SDS, 65°C). Vhodné stringentní podmínky, které usnadňují hybridizaci DNA, například 6 x SSC (chlorid sodný / citrát sodný) při teplotě 45 °C s následným promýváním 2 x SSC při teplotě 50 °C, jsou odborníkům v oblasti známé a mohou být nalezeny v knize Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 6.3.6. Například koncentrace soli v promývacím kroku se může pohybovat v rozmezí nízké stringence asi 2 x SSC při teplotě 50 °C až vysoké stringence asi 0,2 x SSC při teplotě 50 °C. Navíc může být měněna teplota v kroku promývání z podmínek nízké stringentnosti při pokojové teplotě asi 22 °C až k podmínkám vysoké stringentnosti při teplotě asi 65 °C. Jak teplota, tak koncentrace soli se mohou měnit nebo může být buď teplota, nebo koncentrace soli držena konstantní, zatímco druhý faktor se mění. Tyto selektivní podmínky dovolují vzniknout pouze malému množství, pokud nějakému, nesprávně spojených „mismatch“ hybridizaci mezi probou a templátem cílového řetězce. Detekce DNA sekvencí pomocí hybridizace je odborníkům v oblasti dobře známa a postupy v patentech U.S. Pat. No. 4 965 188 a 5 176 995 jsou příklady metod hybridizačních analýz.

Vzhledem k amplifikací cílových sekvencí nukleových kyselin (například pomocí PCR) s využitím specifického amplifikačního páru primerů, „stringentní podmínky“ jsou podmínky, které umožňují hybridizaci příměrového páru pouze k cílovým sekvencím nukleových kyselin, ke kterým by se primer s odpovídající neupravenou „wild - type“ sekvencí (nebo k ní komplementární) měl s výhodou vázat za vzniku unikátního amplifikačního produktu, amplikonu.

Termín „specifický pro (cílovou sekvenci“ znamená, že proba nebo primer hybridizuje za stringentních hybridizačních podmínek pouze s cílovou sekvencí ve vzorku obsahujícím cílovou sekvenci.

Zde použitý termín „amplifikovaná DNA“ nebo „amplikon“ označuje produkt amplifikace nukleových kyselin cílové sekvence nukleových kyselin, která je částí templátu tvořeného nukleovou kyselinou. Například pro určení, jestli rostlina pšenice vyprodukovaná na základě sexuálního křížení obsahuje transgenní případ, může být genomová DNA rostliny pšenice podrobena amplifikací nukleových kyselin s využitím příměrového páru, který zahrnuje primer odvozený od sekvence ·· · · · · ···· • ♦ · t · · « ·· • · · · ···· · · •··· ·· · · ··· ·· genomu rostliny přilehlé k místu inzerce vložené heterologní DNA a druhý primer odvozený od vložené heterologní DNA, za vzniku amplikonu, který je charakteristický pro přítomnost případu. Amplikon má délku a sekvenci, která je charakteristická pro případ. Nebo také může být pár primerů odvozen od sekvencí sousedících s inzertem na obou stranách vložené DNA, vznikne tak amplikon, který zahrnuje celý inzert.

Amplifikace nukleových kyselin může být dosaženo jakoukoliv z různých v oblasti známých metod amplifikace nukleových kyselin, včetně polymerázóvé řetězcové reakce - PCR. Je známo množství amplifikačních metod a jsou popsány v patentech U.S.Pat. No. 4 683 195 a 4 683 202 a v práci PCR protocols: A guide to Methods and Applications, ed. Innis et. al., Academie Press, San Diego, 1990. Pro využití vynálezu může být použita jakákoliv ze známých metod pro amplifikaci nukleových kyselin. Sekvence heterologní DNA inzertu nebo sousedící sekvence u případu pšenice 33391, vATCC záznam č. PTA-2347 může být ověřena (a pokud je nezbytné také opravena) amplifikaci těchto sekvencí z případu použitím primerů odvozených ze sekvencí poskytnutých vynálezem a následnými standardními metodami DNA sekvenování PCR amplikonu nebo klonované DNA molekuly.

Amplikon vyprodukovaný těmito metodami může být detekován množstvím metod. Běžná a známá metoda pro detekci DNA amplikonů je agarózová elektroforéza s detekcí pomocí etidium bromidu. Další metoda je metoda „Genetic Bit Analysis“ (Nikiforov, et al. Nucelic Acid Res. 22:4167 4175, 1994), kde je navržen DNA oligonukleotid, který zahrnuje DNA sekvenci jak k inzertu přilehlé oblasti, tak vloženého inzertu. Oligonukleotid je imobilizován v jamkách mikrotitrační destičky. Následuje PCR oblasti zájmu (s využitím jednoho primerů v oblasti vložené sekvence a druhého v oblasti s inzertem sousedící genomové DNA sekvence), jednořetězcový PCR produkt může být hybridizován k imobilizovanému oligonukleotidu a slouží jako templát pro reakci o jeden nukleotid prodlužující daný oligonukleotid DNA polymerázou a značeného nukleotidu ddNTP specifického pro další očekávanou bázi. Odečítání může být založeno na fluorescenci nebo dalších standardních postupů ELISA. Signál znamená přítomnost sekvence inzert/přilehlá DNA jako výsledek úspěšné amplifikace, hybridizace a reakce prodlužující oligonukleotid o jednu bázi.

Další metodou je technika pyrosekvenace (Pyrosequencing technique) popsaná autorem Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). V této metodě je oligonukleotid navržen tak, že zahrnuje přechod mezi vloženou DNA a přilehlou genomovou DNA. Oligonukleotid je hybridizován k jednořetězcovému PCR produktu z požadované oblasti (jeden primer v oblasti vložené sekvence a druhý v oblasti sousedící genomové DNA sekvence) a inkubován v přítomnosti DNA polymerázy, ATP, sulfurylázy, luciferázy, apyrázy, adenosin 5‘ fosfosulfátu (APS) a luciferinu. Molekuly dNTP se přidávají individuálně a jejich inkorporace způsobuje vznik světelného signálu, který je měřen. Světelný signál označuje přítomnost sekvence inzert/přilehlá DNA jako výsledek úspěšné amplifikace, hybridizace a reakce prodlužující oligonukleotid o jednu nebo více baží.

Fluorescenční polarizace, metoda popsaná autory Chen et al., (Genome Res. 9:492 - 498,

1999), je metoda, která může být použita pro detekci vzniku amplikonu podle vynálezu. V této metodě je oligonukleotid navržen tak, že zahrnuje přechod mezi vloženou DNA a přilehlou genomovou DNA.

Oligonukleotid je hybridizován k jednořetězcovému PCR produktu z požadované oblasti (jeden primer • · ·

• · · e v oblasti vložené sekvence a druhý v oblasti sousedící genomové DNA sekvence) a inkubován v přítomnosti DNA polymerázy a fluorescenčně značených molekul ddNTP. Reakce prodlužující oligonukleotid o jednu bázi vkládá značený ddNTP. Vkládání baží může být stanovena jako změna polarizace pomocí fluorometru. Změny v polarizaci indikují přítomnost sekvence inzert/pňlehlá DNA jako výsledek úspěšné amplifikace, hybridizace a reakce prodlužující oligonukleotid o jednu bázi.

Jako metoda detekce a kvantifikace přítomnosti DNA sekvence je popsána metoda Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) a je podrobně popsána v manuálu dodávaném výrobcem. Pouze stručně, oligonukleotidová FRET proba je navržena tak, že zahrnuje přechod mezi vloženou DNA a přilehlou genomovou DNA. FRET proba a PCR primery (jeden primer v oblasti vložené sekvence a druhý v oblasti sousedící genomové DNA sekvence) jsou podrobeny teplotnímu cyklování v přítomnosti termostabilní polymerázy a dNTP. Hybridizace FRET proby způsobuje odštěpení a uvolnění fluorescenční sondy z těla sondy zhášejícího fluorescenci FRET proby. Fluorescenční signál indikuje přítomnost sekvence inzert/přilehlá DNA jako výsledek úspěšné amplifikace a hybridizace.

Pro detekci sekvence byla popsána metoda „Molecular Beacons“ v práci Tyangi, et al., (Nátuře Biotech. 14:303-308, 1996). Pouze stručně, oligonukleotidová FRET proba je navržena tak, že zahrnuje přechod mezi vloženou DNA a přilehlou genomovou DNA. Unikátní struktura FRET proby způsobuje, že její sekundární struktura udržuje v těsné blízkosti fluorescenční oblast a oblast zhášející fluorescenci. FRET proba a PCR primery (jeden primer v oblasti vložené sekvence a druhý v oblasti sousedící genomové DNA sekvence) jsou podrobeny teplotnímu cyklování v přítomnosti termostabilní polymerázy a dNTP. Po úspěšné PCR amplifikace, hybridizace FRET proby s cílovou sekvencí způsobuje změnu sekundární struktury FRET proby a tím oddálení fluorescenční oblasti a oblasti fluorescenci zhášející a vzniká tak fluorescenční signál. Fluorescenční signál indikuje přítomnost sekvence inzert/přilehlá DNA jako výsledek úspěšné amplifikace a hybridizace.

Stručný popis obrázků

Obr. 1 Plazmidová mapa pMON30167

Obr. 2 Plazmidová mapa pMON42411

Obr. 3 Plazmidová mapa pMON30139

Příklady provedení vynálezu

Pro demonstraci příkladů určitých výhodných provedení podle vynálezu jsou uvedeny následující příklady. Pro odborníky v oblasti by mohlo být přínosem, že techniky popsané v příkladech popisujících reprezentativní přístupy vynálezců, dobře fungují při uplatnění vynálezu a tak mohou být považovány, že tvoří příklady výhodných způsobů pro jejich uplatnění. Nicméně odborníci v oblasti z hlediska prezentovaných popisů si jsou vědomi, že v popsaných specifických provedeních, která jsou uvedena, může být učiněno množství změn se získáním stejného nebo podobného výsledku bez vybočení z ducha a oblasti vynálezu.

·♦ ««

Příklad 1

Transgenní rostliny pšenice byly vytvořeny Agrobacřerium-zprostředkovanou transformací pšeničných embryí metodou popsanou v práci Cheng et al. (Plant Physiol. 115:971 - 980, 197) s využitím binárních vektorů vynálezu a modifikovaných podmínek pro glyfosátovou selekci podle práce Zhou et al., (Plant Cell Rep. 15:159 -13, 1995). Odborníkům v oblasti transformace pšenice jsou známé další metody, jako je „genová pistole“ (gene gun) nebo „částicové ostřelování“ ( particle bombardment), které mohou být použity pro vložení expresních kazet vynálezu do genomu pšeničných buněk. T-DNA konstruktu pMON30139 (Obr. 3) obsahuje dvě expresní kazety , které dohromady zapříčiňují vysokou míru tolerance vůči glyfosátovým herbicidům. První transgenní expresní kazeta obsahuje DNA sekvence promotoru a intronu actin 1 z rýže (P-Os.Act1 a l-Os.Actl, U.S.Patent 5 641 876, zde začleněn tímto odkazem) funkčně napojenou na DNA sekvenci kódující EPSPS chloroplastovou tranzitní peptidovou sekvenci zArabidopsis thaliana (TS-At.EPSPS:CTP2, Klee et al.., Mol. Gen. Genet. 210:47 -442, 1987, zde začleněno tímto odkazem), funkčně napojenou na DNA sekvenci kódující glyfosát rezistentní 5-enol-pyruvylšikimát-3-fosfát syntázu (EPSPS) izolovanou z Agrobacterium tumefaciens sp. kmen CP4 (gen AGRTU.aroA, U.S.Patent 5 633 435, zde začleněn tímto odkazem), funkčně napojenou na DNA sekvenci transkripčního terminátoru nopalin syntázy (T-AGRTU.nos, Fraley et al., Proč. Natí. Acad. Sci. USA 80:4803 - 4807, 1983, zde začleněno tímto odkazem). Druhá transgenní expresní kazeta obsahuje DNA sekvenci z 35S promotoru mozaikového viru květáku obsahujícího tandemový duplikát oblasti enhanceru (P-CaMV.35S:en, Kay et al., Science 236:1299-1302, 1987; U.S.Patent 5 164 316, zde začleněn tímto odkazem) funkčně napojenou na DNA sekvenci Hsp70 intronu z rostliny Zea mays (l-Zm.Hsp70, U.S.Patent 5 424 412, zde začleněn tímto odkazem), funkčně napojenou na DNA sekvenci kódující EPSPS chloroplastovou tranzitní peptidovou sekvenci z Arabidopsis thaliana (TS-At.EPSPS:CTP2, Klee et al.., Mol. Gen. Genet. 210:47 -442, 1987) funkčně napojenou na DNA sekvenci kódující glyfosát rezistentní 5-enol-pyruvylshikimát-3-fosfát syntázu (EPSPS) izolovanou z Agrobacterium tumefaciens sp. kmen CP4 (AGRTU.aroA, U.S.Patent 5 633 435) funkčně napojenou na DNA sekvenci transkripčního terminátoru nopalin syntázy (T-AGRTU.nos, Fraley et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80:4803-4807, 1983).

pMON30167 (Obr. 1) je samostatná expresní kazeta identická s první transgenní expresní kazetou konstruktu pMON30139 popsanou výše. pMON42411 (Obr. 2) je samostatná expresní kazeta identická s druhou transgenní expresní kazetou konstruktu pMON30139 popsanou výše.

Po inkubaci pšeničných buněk s buňkami Agrobacterium obsahujícími konstrukty pMON42411, pMON30167 a pMON30139, byly vůči glyfosátu tolerantní transgenní pšeničné kalusy selektovány na médiu, které obsahovalo 2 mM glyfosát, po dobu jednoho týdne, dále přeneseny do diferenciačního média s 0,1 mM glyfosátem na dobu dvou týdnů a nakonec přeneseny do regeneračního média o obsahu glyfosátu 0,02 mM a 0,1 μΜ koncentrací aromatických aminokyselin.

Transformací buněk konstrukty pMON42411, pMON30167 a pMON30139 bylo získáno 284 případů. Rostliny s konstrukty pMON30167 a pMON30139 byly postříkány jednou glyfosátovým herbicidem (Roundup Ultra ™) v množství 474 μί na m² (64 uncí na akr) za účelem vybrat linie s vegetativní a reprodukční tolerancí vůči glyfosátovému herbicidu (tabulka 1). Rostliny s konstruktem pMON42411 byly postříkány dvakrát glyfosátovým herbicidem. Selekce transformovaných pšeničných rostlin s konstrukty pMON42411 a pMON30167 obsahujícími jednu expresní kazetu poskytla malé procento rostlin pšenice s jak vegetativní tak reprodukční tolerancí (1,4% a 3,2% respektive). Pouze 3 ze 134 rostlin obsahujících tyto konstrukty vykazovaly přijatelnou hladinu tolerance vůči glyfosátovému herbicidu. Naproti tomu mezi transformovanými rostlinami pšenice obsahující konstrukt pMON30139 s dvojící expresních kazet bylo vysoké procento rostlin (16%) sjak vegetativní tak reprodukční tolerancí (24/150).

Případ pšenice 33391 (dále označován jako rostlina pšenice 33391 nebo pšenice 33391 se zahrnutím všech částí rostliny a osiva této rostliny) byl vybrán ze 150 transgenních případů, které vznikly na základě transformace konstruktem pMON30139. Z této populace bylo vybráno 24 případů, které vykazovaly lepší vegetativní a reprodukční toleranci vůči glyfosátu. Těchto 24 případů bylo dále testováno z hlediska agronomických vlastností a z hlediska přítomnosti jednoho intaktního inzertu. Z této populace případů byla vybrána pšenice 33391. Skleníkové a polní testování pšenice 33391 a potomků odvozených od pšenice 33391 naznačilo, že transgenní inzerce zajišťuje toleranci vůči glyfosátu, která převyšuje komerční specifikace plné vegetativní a reprodukční tolerance na 84 mg/m²(340 g na akr, 840 g glyfosátu na hektar; 32 oz Roundup Ultra na akr) glyfosátu s dvounásobnou hranicí spolehlivosti, pokud je glyfosát aplikován ve stádiu 3-5 listů.

Tabulka č.1 Srovnání účinnosti přítomnosti jedné a dvou expresních kazet pro zajištění tolerance vůči glyfosátu u pšenice

pMON#	počet testovaných případů	počet případů s vegetativní tolerancí	Počet případů s vegetativní tolerancí a reprodukční toleranci
42411	71	26	1 (1,4%)
30167	63	4	2 (3,5%)
30139	150	104	24 (16%)

Příklad 2

Izolace odpovídajících sekvencí přiléhajících k inzertu z pšeničného genomu je možno provádět množstvím metod známých v oboru (například s použitím ligovaných adaptérů a „dvoukolové“ (nested) PCR, jak je popsáno v kitu Genome Walker™ (CloneTech Laboratories, lne., Palo Alto, CA)). Genomová DNA pšenice 33391 byla izolována purifikační metodou CTAB (Rogers et al., Plant Mol Biol 5:69-76,1985). Reagencie jsou komerčně dostupné (viz například Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). DNA knihovny genomu pro amplifikaci byly připraveny podle přiloženého manuálu (Genome Walker™, CloneTech Laboratories, lne., Palo Alto, CA). Genomová DNA byla v oddělených reakcích štěpena přes noc při teplotě 37°C následujícími restrikčními endonukleázami produkujícími tupé konce (blunt-end endonucleases): Dral, EcoRV, Pvull, Seal a Stul (CloneTech Laboratories, lne., Palo Alto, CA). Reakční směsi byly extrahovány extrakční směsí fenol:chloroform, DNA byla precipitována ···· ·· ·· ··· ·« ·· přídavkem etanoiu do vodné fáze, centrifugována za vytvoření peletu a resuspendována v pufru TrisEDTA (10 mM Tris-HCI, pH 8.0, 1 mM EDTA). Purifikované fragmenty genomové DNA s tupými konci byly ligovány k adaptorům Genome Walker™ podle přiloženého manuálu. Po ligaci adaptorů ke fragmentům genomové DNA byla každá reakce ukončena zahříváním na teplotu 70 ^eC po dobu 5 min a poté 10 krát naředěna v pufru Tris-EDTA. Jeden mikrolitr ligačních produktů byl poté amplifikován v reakci o objemu 50 μΙ podle výrobcem doporučeného postupu s použitím adaptér-specifických oligonukleotidů (dodaných výrobcem) a oligonukleotidů specifických vůči transgenů pšenice 33391, jako je SEQ ID č.1, která přisedá blízko 5‘ konce P-Os.Act1. PCR směs obsahovala 1 μΙ odpovídající ligované DNA knihovny, 1μΙ 10μΜ adaptorového Genome Walker™ primerů AP1 dodávaného výrobcem (5‘GTATATCGACTCACTATAGGGC3‘, SEQ ID č. 11), 1μΙ 10μΜ oligonukleotidů specifického vůči transgenů pšenice 33391 (SEQ Id č.1), 1 μΙ 10 mM deoxyribonukleotidů, 5 μΙ 10x koncentrovaného PCR pufru obsahujícího MgCI₂, 0,5 μΙ (2,5 jednotek) Taq DNA polymerázy (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) a byla doplněna vodou do objemu 50 μΙ. PCR reakce byly prováděny v termocykleru s využitím řízení teploty výpočtem a za následujících podmínek cyklů: 1 cyklus při 94°C 1 minutu; 7 cyklů (94 °C 2 sekundy, 70 °C 3 minuty); 37 cyklů (94 °C 2 sekundy, 65 °C 3 minuty); 1 cyklus 65 °C 10 minut. Jeden mikrolitr každé reakční směsi byl poté amplifikován v druhé amplifikaci s využitím „nested“ adaptér-specifických oligonukleotidů (dodaných výrobcem) a „nested“ oligonukleotidů specifických vůči transgenů, jako je SEQ Id č.2, která přisedá na P-Os.Act1 nad (upstream) primerem použitým v první reakci (ve smyslu směru přepisu DNA řetězce). PCR směs pro druhou PCR obsahovalal μΙ odpovídajících primárních PCR produktů, 1μΙ 10μΜ adaptorového Genome Walker™ primerů AP2 dodávaného výrobcem (5‘ACTATAGGGCACGCGTGGT3‘, SEQ ID č. 12), 1μΙ 10μΜ oligonukleotidů specifického vůči transgenů pšenice 33391 (SEQ Id č.2), 1μΙ 10 mM deoxyribonukleotidů, 5 μΙ 10xkoncentrovaného PCR pufru obsahujícího MgCI₂, 0,5 μΙ (2,5 jednotek) Taq DNA polymerázy (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) a byla doplněna vodou do objemu 50 μΙ. PCR reakce byly opět prováděny v termocykleru s využitím řízení teploty výpočtem a za následujících podmínek cyklů: 1 cyklus při 94 °C 1 minutu; 7 cyklů (94 °C 2 sekundy, 70 °C 3 minuty); 31 cyklů (94 °C 2 sekundy, 65 °C 3 minuty); 1 cyklus 65 °C 10 minut. PCR produkty představující 5‘ oblast, která zahrnuje spojení mezi transgenním inzertem pšenice 33391 a přilehlou sousední genomovou sekvencí, byly následně purifikovány pomocí agarózové elektroforézy s následnou izolací DNA z agarózového gelu s využitím kitu QIAquick Gel Extraction Kit (kat. č. 28704, Qiagen lne., Valencia, CA) a poté přímo klonovány do vektoru pGEM-T Easy (kat. č. A1360, Promega, Madison, Wl). Identita klonovaného PCR produktu byla potvrzena DNA sekvenční analýzou (ABI Prism™ 377, PE Biosystems, Foster City, CA a software pro analýzu sekvence DNASTAR, DNASTAR lne., Madison, Wl).

Podobně byla amplifikována ke transgenů pšenice 33391 na 3‘ konci přilehlá sousední genomová sekvence a klonována s využitím „nested“ genově specifických primerů SEQ ID č.3 a SEQ ID č.4, které přisedají k transkripčnímu terminátoru T-nos. Při inzerci transgenů do genomu u pšenice 33391 jsou přítomny dva transkripční terminátory T-nos, jeden uvnitř konstruktu a druhý na 3‘ konci konstruktu v sousedství sekvence genomu pšenice. PCR produkty této reakce byly sekvenovány a srovnáním se známou sekvencí konstruktu pMON30139 byly od sebe odlišeny produkt zahrnující • · spojení mezi transgenním inzertem a přilehlou sousední genomovou sekvencí a produkt interního Tnos.

Pro pšenici 33391 byla zjištěna k inzertu přilehlá sousedící sekvence genomu pšenice na obou stranách inzertu sekvenováním amplifikačních produktů získaných pomocí systému Genome Walker™ a přiřazena ke známé sekvenci transgenu. Na 5' konci místa inzerce transgenu byla určena sekvence segmentu 399 párů baží (bp) v okolí místa inzerce. Tento segment se sestává z 257 bp genomové sekvence pšenice (nukleotidové baze 1-257 za SEQ ID č.5), 93 bp nosné sekvence vektoru (nukleotidové baze 258-350 ze SEQ ID č.5) a 49 bp 5* konce promotoru Act1 z rýže (nukleotidové baze 251-399 ze sekvence SEQ ID č.5). Podobně byla charakterizována sekvence segmentu 431 bp na 3‘ konci místa inzerce transgenu (SEQ ID č.6). Ta začíná 32 bp ze sekvence transkripčního terminátoru T-nos (nukleotidové baze 1-32 ze sekvence SEQ ID č.6), pokračuje 68 bp nosné sekvence vektoru (nukleotidové vaze 33-100) a končí 331 bp sekvence genomu pšenice přiléhající k inzerčnímu místu transgenu (nukleotidové baze 101-431 ze sekvence SEQ ID č.6). Byla provedena identifikace pšenice 33391 s využitím PCR amplifikace oblasti inzerce transgen/genom pomocí jednoho primerů ze sekvence transgenu a druhého primerů z oblasti pšeničné genomové DNA přilehlé ke transgenu. PCR amplifikací DNA, že amplikon 5‘ oblasti inzerce transgenu do genomu je specifický pro pšenici 33391. Tato identifikace byla ukázána pro PCR amplikon s využitím primerů 5 (SEQ ID č.7) a primerů 6 (SEQ ID č.8). Další příměrové sekvence mohou být navrženy na základě DNA sekvence SEQ ID č.5, s jejich použitím vzniknou amplikony s odlišnou délkou DNA než pň použití primerů 5 a primerů 6, ale stále charakteristické pro pšenici 33391 a její potomky. Zde záleží na zkušenostech a umění molekulárních biologů rostlin, jak vybrat DNA sekvence primerů ze SEQ ID č.5 a najít stringentní podmínky pro vznik ampiikonu. Podobně odborníci v oblasti mohou vybrat DNA sekvence primerů ze SEQ ID č.6, které budou generovat amplikony charakteristické pro pšenici 33391. Do oblasti vynálezu spadá, že DNA sekvence primerů odvozené na základě sekvencí SEQ ID č.5 a SEQ ID č.6 mohou být použity pro izolaci do genomu přidané DNA molekuly z rostlin pšenice 33391, jejího osiva a rostlinných částí metodami zde popsanými nebo metodami známými v oblasti molekulární biologie rostlin. Tyto do pšeničného genomu přidané DNA molekuly mohou být izolovány metodou, která využívá jakoukoliv část s dostatečnou délkou DNA sekvence popsané SEQ ID č.5 a SEQ ID č.6 aby byla použitelná jako primer nebo proba. Tyto do pšeničného genomu přidané DNA molekuly mohou být využity jako molekulární markéry charakteristické pro pšenici 33391.

DNA sekvence, které zahrnují oblast spojení genomové DNA pšenice 33391 a inzertu pMON30139 , a jsou obsaženy v SEQ ID č.5 a SEQ ID č.6, mohou být použity jako proby pro hybridizační reakci za účelem identifikace DNA pšenice 33391. Například DNA molekula použitelná jako proba navržená na základě sekvence SEQ ID č.5 může zahrnovat nukleotidovou sekvenci 245270 nebo sekvenci k ní komplementární; DNA molekula použitelná jako proba navržená na základě sekvence SEQ ID č.6 může zahrnovat nukleotidovou sekvenci 87-113 nebo sekvenci kní komplementární. Odborníci v oblasti mohou vybrat kratší nebo delší nukleotidové sekvence než uvedené sekvence tak, že překrývají oblast spojení a jsou využitelné jako specifické DNA proby nebo primery pro pšenici 33391 za vysoce stringentních podmínek.

Jako kontrola pro podmínky PCR reakce (tabulka 2) a kontrola kvality extrahované genomové DNA pšenice 33391 slouží amplikon generovaný pň použití primeru 7 (SEQ ID č.9) a primeru 8 (SEQ ID č.10), který reprezentuje DNA fragment o délce asi 400 bp z pšeničného genu acetyl CoA karboxylázy (Acc), endogenního genu pšeničného genomu v jedné kopii. Kontroly pro tyto analýzy by měly zahrnovat pozitivní kontrolu z pšenice 33391, negativní kontrolu z pšenice, která není pšenice 33391, a negativní kontrolu, která jako templát neobsahuje DNA pšenice, jak je ukázáno v tabulce 2. Pro testování na přítomnost amplikonů charakteristických pro pšenici 33391 může být použit termocykler Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700 nebo Eppendorf Mastercycler Gradient thermocycler, jak je ukázáno v tabulce 3, nebo metody přístroje známé v dané oblasti.

Tabulka č.2 PCR procedura a PCR reakční směs pro potvrzení přítomnosti 5‘ oblasti spojení transgenů a genomové DNA u pšenice 33391

Krok	Reagencie	Množství	Poznámka
1	voda bez nukleázy	doplnit do objemu 20 μΙ	-
2	10x konc. reakční pufr (s MgCI₂)	2,0 μΙ	konečná koncentrace pufru je 1x, u MgCI₂1,5 mM
3	10 mM roztok dATP, dCTP, dGTP adTTP	0,4 μΙ	konečná koncentrace pro každý dNTPje 200 μΜ
4	primer 5 (SEQ ID č.7) (rekonstituován v 1xTE pufru nebo vodě bez nukleázy na koncentraci 10 μΜ)	0,4 μΙ	konečná koncentrace je 0,2 μΜ
5	primer 6 (SEQ ID č.8) (rekonstituován v 1xTE pufru nebo vodě bez nukleázy na koncentraci 10 μΜ)	0,4 μΙ	konečná koncentrace je 0,2 μΜ
6	primer 7 (SEQ ID č.9) (rekonstituován v 1xTE pufru nebo vodě bez bez nukleázy na koncentraci 10 μΜ)	0,2 μΙ	konečná koncentrace je 0,1 μΜ
7	primer 8 (SEQ ID č.10) (rekonstituován v 1xTE pufru nebo vodě bez nukleázy na koncentraci 10 μΜ)	0,2 μΙ	konečná koncentrace je 0,1 μΜ
8	RNáza bez DNázové aktivity (500ng/pl)	0,1 μΙ	50 ng na reakci
9	REDTaq DNA polymeráza (1 jednotka na mikrolitr)	1,0 μΙ	1 jednotka na reakci doporučeno změnit pipetu před dalším krokem
10	Extrahovaná DNA (templát) • analyzované vzorky • jednotlivé listy • směs více listů (max. 50 listů v jedné směsi) • negativní kontrola • negativní kontrola • positivní kontrola	• 10-200 ng genomové DNA • 200 ng genomové DNA • 50 ng pšeničné genomové DNA (ne pšenice 33391) • žádný DNA templát • 50 ng genomové DNA pšenice 33391

• · • · »··· »· · · » · ··· ··» «· ·

Tabulka č.3 Navržené parametry PCR reakce pro různé termocyklery

PCR směs je nutno jemné promíchat a pokud je potřeba (ne u termocyklerů se zahřívaným víčkem) přidat 1 až 2 kapky minerálního oleje na hladinu každé reakce. Dále je možno provést PCR s následujícími parametry cyklů u Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700 nebo Eppendorf Mastercycler Gradient thermocycler.

Poznámka: MJ Engine nebo Eppendorf Mastercycler Gradient thermocycler by měly být spuštěny v módu počítání teploty. U termocyklerů Perkin-Elmer 9700 je nutno nastavit rychlost nástupu teploty na maximum.

Počet cyklů	Nastavení: Stratagene Robocycler
1	94 °C 3 minuty
38	94 °C 1 minuta 63 °C 1 minuta 72 °C 90 sekund
1	72 °C 10 minut

Počet cyklů	Nastavení: MJ Engine nebo Perkin-Elmer 9700
1	94 °C 3 minuty
38	94 °C 10 sekund 63 °C 30 sekund 72 °C 1 minuta
1	72 ^eC 10 minut

Počet cyklů	Nastavení: Eppendorf Mastercycler Gradient
1	94 °C 3 minuty
38	94 °C 15 sekund 63 °C 15 sekund 72 °C 1 minuta
1	72 °C 10 minut

Příklad 3

Exprese proteinu EPSPS glyfosátové rezistence (CP4 EPSPS) z genu aroA:CP4 může být detekována imunologickými metodami (Rogen et al., Food Control 10:407-414, 1999, zde začleněno tímto odkazem) v extraktech rostlinných tkání. Jsou vyvíjeny imunologické metodiky jako je western blot, stripové testy a testy ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) ke specifické detekci exprese proteinu z genu aroA:CP4, který je obsažen v expresním vektoru transformovaném do rostlin. Reagencie, které zahrnují polyklonální a monoklonální protilátky specifické pro CP4 EPSPS, jsou komerčně dostupné u firmy Strategie Diagnostics (Nwark, DE). CP4 EPSPS může být detekován v proteinových extraktech rostlin pšenice 33391, rostlinných částí a osiva imunologickými metodami včetně ELISA.

U ELISA testu je 100 ng monoklonální protilátky anti-CP4 EPSPS na jamku mikrotitrační destičky naředěné ve 100 μΙ 50 mM uhličitanového pufru pH 9,6 ponecháno adsorbovat přes noc při teplotě 4 °C. Jamka je promyta pufrem PBS-T (PBS (phosphate buffered šalině) pH 7,4 s 0,05% • · · ·

Tween-20). Tkáň je zhomogenizována v PBS pomocí třecí misky a paličky nebo jiného vhodného zařízení. Homogenát je přidán do jamek mikrotitrační destičky a inkubován po dobu 2 hodin při teplotě 37 “C. Jamka je třikrát promyta PBS-T. Podle jednoho způsobu je sekundární protilátka, purifikovaná králičí anti-CP4 EPSPS, naředěna na dostatečnou koncentraci, aby byla zajištěna dostatečná hladina k zajištění specifické vazby na protein CP4 EPSPS, a inkubována v jamce při teplotě 37 °C po dobu jedné hodiny. Podle druhého způsobu je použita jako sekundární protilátka kozí protilátka anti-CP4 EPSPS. Do jamky je přidána monoklonální protilátka (1: 40000 naředěna v PBS) proti králičím nebo proti kozím imunoglobulinům IgG (Sigma Corp, St Louis MO) a inkubována pn 37 °C 30 minut. Jamka je třikrát promyta PBS-T. Dále je v jamce po dobu 15 min pň teplotě 37 °C inkubována křenová peroxidáza konjugovaná savidinem (NeutrAvidin Horseradish Peroxidase) naředěná 1:10000 stabilizačním roztokem StabilZyme HRP-stabilizer (SurModics, Eden Prairie, MN). Jamka je třikrát promyta PBS-T. Do jamky je nakonec na 10 minut přidán substrát TMB (Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD), poté je reakce ukončena 3 M fosforečnou kyselinou. Jamky jsou odečítány pomocí čtečky mikrodestiček „mikroplate readeru“ při vlnové délce 450 nm a referenční vlnové délce 650 nm. Tato metoda je příklad ELISA testu vhodného pro detekci CP4 EPSPS a není uvažována jako jediná ELISA metoda, která může být použita pro detekci CP4 EPSPS, odborníci v oblasti ELISA metod mohou navrhnout varianty metody pro specifický detekční test dostatečně citlivý pro detekci CP4 EPSPS v extraktech rostlinných tkání.

Pomocí ELISA metody je u pšenice 33391 vyrostlé na poli detekována průměrná hladina proteinu CP4 EPSPS 58,2 ± 8,4 pg/g v rozmezí 45,5 až 72,4 pg/g, vztaženo na hmotnost čerstvé tkáně (fwt, fresh weight tissue), zatímco u netransgenních rostlin sklizených z pole není detekovatelná hladina proteinu CP4 EPSPS, hladina nepřesahuje detekční limit testu ELISA 0,9pg/g fwt. Tkáň zrní pšenice 33391 obsahuje průměrně 12,6 ± 2,5 pg/g v rozmezí 9,5 až 17,6 pg/g fwt proteinu CP4 EPSPS, u netransgenní kontroly není detekovatelná hladina proteinu CP4 EPSPS, hladina nepřesahuje detekční limit testu ELISA 0,9pg/g fwt. ELISA, nebo další imunologické metody, může být použita jako diagnostický test pro detekci proteinu CP4 EPSP pšenice 33391, protože pšenice 33391 a její potomci je jediná pšenice tolerantní vůči glyfosátu registrovaná agenturou USDA (United States Department of Agriculture), která exprimuje protein CP4 EPSPS.

Pšenice 33391, Monsanto Company, zde popsané a uvedené v přiložených nárocích, byla uložena v Americké sbírce typů kultur (American Type Culture Collection, ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110 dle Budapešťské smlouvy. Registrační ATCC číslo je PTA-2347. Depozit bude uchováván v depozitáři po dobu 30-ti let nebo 5 let po posledním požadavku nebo po dobu účinnosti patentu, kteréhokoliv, který trvá delší dobu, a může být během této doby přemístěn, pokud to bude nezbytné.

Odborníkům v oblasti by mělo být z ilustrací a popsaných principů vynálezu zřejmé, že vynález může být modifikován v uspořádání a detailech bez odchýleni se od principu. Předmětem nároků jsou všechny modifikace, které spadají do oblasti a duchu připojených nároků.

Všechny publikace a publikované patentové dokumenty zde citované, jsou zde začleněny těmito odkazy se stejným obsahem jako kdyby každá individuální publikace nebo přihláška vynálezu byla specificky a individuálně označena, že je uvedena jako odkaz.

Claims

PATETOVÉ NÁROKY p 1/ —G>

vytyty''

Způsob zlepšení tolerance vůči glyfosátu u rostliny pšenice, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(1) vytvoření DNA konstruktu obsahujícího první a druhou expresní kazetu, kde první expresní kazeta obsahuje funkčně spojené (i) promotor rýžového actinu 1; (ii) intron rýžového actinu 1; (iii) DNA molekulu kódující chloroplastový transitní peptid; (iv) DNA molekulu kódující protein EPSPS zajišťující toleranci vůči glyfosátu; a (v) DNA molekulu s funkcí transkripčního terminátoru, a druhá expresní kazeta obsahuje funkčně spojené (a) promotor CaMV 35S; (b) intron Hsp70; (c) DNA molekulu kódující chloroplastový transitní peptid; (d) DNA molekulu kódující protein EPSPS zajišťující toleranci vůči glyfosátu; a (e) DNA molekulu s funkcí transkripčního terminátoru; a (2) transformaci pšeničných buněk DNA konstruktem; a (3) regeneraci pšeničných buněk v rostlinu pšenice; a (4) vystavení těchto rostlin pšenice ošetření účinnou dávkou glyfosátu; a (5) selekci fertilních rostlin pšenice, které vykazují vegetativní a reprodukční toleranci vůči glyfosátu.
2. Fertilní rostliny pšenice tolerantní vůči glyfosátu získané způsobem podle nároku 1.
3. Potomci osiva rostliny pšenice tolerantní vůči glyfosátu podle nároku 2.
4. DNA molekula izolovaná z fertilní rostliny pšenice tolerantní vůči glyfosátu podle nároku 2 obsahující nukleotidovou sekvenci identifikovanou jako SEQ ID č.5.
5. DNA molekula izolovaná z fertilní rostliny pšenice tolerantní vůči glyfosátu podle nároku 2 obsahující nukleotidovou sekvenci identifikovanou jako SEQ ID č.6.
6. Dvojice DNA molekul obsahující první a druhou DNA molekulu, kde první DNA molekula je dostatečně dlouhý souvislý řetězec nukleotidů pšeničného genomu ze SEQ ID č.5 nebo ze sekvence k ní komplementární tak, aby mohl být použit jako primer, a druhá DNA molekula je dostatečně dlouhý souvislý řetězec nukleotidů inzertu ze SEQ ID č.5 nebo ze sekvence k ní komplementární tak, aby mohl být použit jako primer, a použitím dvojice DNA molekul při amplifikaci DNA vzniká amplikon charakteristický pro DNA extrahovanou z rostliny pšenice 33391 tolerantní vůči glyfosátu nebo jejích potomků.
7. Dvojice DNA molekul obsahující první a druhou DNA molekulu, kde první DNA molekula je dostatečně dlouhý souvislý řetězec nukleotidů pšeničného genomu ze SEQ ID č.6 nebo ze sekvence k ní komplementární tak, aby mohl být použit jako primer, a druhá DNA molekula je dostatečně dlouhý souvislý řetězec nukleotidů inzertu ze SEQ ID č.6 nebo ze sekvence k ní komplementární tak, aby mohl být použit jako primer, a použitím dvojice DNA molekul při • · ···· · * ·· · amplifikaci DNA vzniká amplikon charakteristický pro DNA extrahovanou z rostliny pšenice 33391 tolerantní vůči glyfosátu nebo jejích potomků.
8. Způsob detekce přítomnosti DNA molekuly charakteristické pro rostlinu pšenice 33391 tolerantní vůči glyfosátu nebo její potomky, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(a) extrakci vzorku DNA z dané rostliny pšenice 33391 nebo potomků osiva a rostlin nebo z částí rostlin; a (b) poskytnutí DNA molekuly primerů SEQ ID č.7 a SEQ ID č.8; a (c) poskytnutí reakčních podmínek DNA amplifikace; a (d) provedení dané DNA amplifikační reakce za vzniku amplikonové DNA molekuly; a (e) detekce amplikonové DNA molekuly.
9. Způsob podle nároku 8, amplikonové DNA molekula obsahuje DNA molekuly SEQ ID č.7 a SEQ

ID č.8.
10. Způsob detekce přítomnosti DNA molekuly SEQ ID č.5 ve vzorku DNA, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(a) extrakci vzorku DNA z rostliny pšenice;

(b) kontakt vzorku DNA s molekulou DNA, která zahrnuje oblast spojení genomové DNA pšenice 33391 a DNA inzertu SEQ ID č.5, kde molekula DNA je DNA proba, která hybridizuje za stringentních podmínek s DNA molekulou SEQ ID č.5; a (c) vystavení vzorku a proby stringentním hybridizačním podmínkám; a detekci hybridizace proby s cílovou DNA.
11. Způsob detekce přítomnosti DNA molekuly SEQ ID č.6 ve vzorku DNA, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(a) extrakci vzorku DNA z rostliny pšenice;

(b) kontakt vzorku DNA s molekulou DNA, která zahrnuje oblast spojení genomové DNA pšenice 33391 a DNA inzertu SEQ ID č.6, kde molekula DNA je DNA proba, která hybridizuje za stringentních podmínek s DNA molekulou SEQ ID č.6; a (c) vystavení vzorku a proby stringentním hybridizačním podmínkám; a detekci hybridizace proby s cílovou DNA.
12. Způsob zmnožení vlastnosti tolerance vůči glyfosátu do rostlin pšenice vyznačující se tím, že zahrnuje:

a) křížení potomka pšenice 33391 tolerantní vůči glyfosátu s rostlinou pšenice, která není tolerantní vůči glyfosátu; a

b) produkci potomků křížení rostlin pšenice; a

c) extrakci vzorku DNA z potomků rostlin pšenice;

• · • · • ·

d) kontakt DNA vzorku s markerovou molekulou nukleové kyseliny, která hybridizuje s SEQ ID č.5 nebo SEQ ID č.6 nebo s jejich komplementárními sekvencemi; a

e) provedení metody zmnožení za pomocí markéru pro vlastnost tolerance vůči glyfosátu, kde tolerance vůči glyfosátu je geneticky vázána ke komplementu markerové molekuly nukleové kyseliny.
13. DNA detekční kit vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu DNA molekulu dostatečné délky souvislého řetězce nukleotidů homologních nebo komplementárních k SEQ ID č.5 nebo SEQ ID č.6, která má funkci DNA primeru nebo proby specifické pro rostliny pšenice 33391 a její potomky.
14. Způsob detekce případu pšenice 33391 a jejích potomků, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(a) extrakci vzorku proteinů případu pšenice 33391; a (b) otestování extrahovaných proteinů způsobem založeným na imunologickém stanovení pomocí protilátek specifických vůči proteinu CP4 EPSPS; a (c) detekci reakce protilátek s proteinem CP4 EPSPS.
15. Osivo pšenice označené 33391 v Americké sbírce typů kultur pod záznamem č. PTA-2347.
16. Rostlina pšenice nebo její části vyprodukované pěstováním osiva podle nároku 15.
17. Rostlina pšenice podle nároku 16, kde rostlina pšenice je tolerantní vůči glyfosátu.
18. Rostlina pšenice nebo její části, kde alespoň jeden předek dané rostliny pšenice je rostlina pšenice nebo její část podle nároku 17.
19. Způsob produkce rostlin pšenice tolerantních vůči aplikaci glyfosátu, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(a) sexuální křížení první rostliny pšenice vyrostlé z pšeničného osiva 33391 ATCC č. PTA-2347, která zajišťuje toleranci vůči aplikaci glyfosátu a druhé rostliny pšenice, která nemá toleranci vůči glyfosátu, za vzniku velkého množství rostlin prvního potomstva; a (b) selekci prvního potomstva rostlin, kteří jsou tolerantní vůči aplikací glyfosátu; a (c) vegetativní rozmnožování rostlin prvního potomstva za vzniku velkého množství druhých potomků rostlin; a (d) selekci rostlin z druhého potomstva tolerantních vůči glyfosátu.
20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že dále obsahuje krok zpětného křížení rostliny prvního potomstva, které jsou tolerantní vůči glyfosátu, nebo rostliny z druhého potomstva s tolerancí vůči glyfosátu s jakoukoliv rostlinou pšenice netolerující aplikaci glyfosátu; a selekci jejich potomků tolerantních vůči glyfosátu.
21. Způsob selektivního ovlivňování plevele na polích s plodinou pšenice, vyznačující se tím, že se vysadí osivo pšenice 33391 nebo osivo jejích potomků, přičemž zahrnuje kroky:

(a) vyseti osiva pšenice 33391 nebo jejích potomků, které jsou tolerantní vůči glyfosátu; a (b) aplikaci dostatečného množství glyfosátového herbicidu na pole pšenice s plevelem tak, aby bylo ovlivněno množství plevele bez významného ovlivnění plodiny pšenice.

Notl 8886