CZ300073B6 - Zpusob vylepšení tolerance vuci glyfosátu u rostliny pšenice, její bunka, její DNA, dvojice molekulDNA primeru, zpusoby její detekce, zpusob šírení vlastnosti tolerance vuci glyfosátu u rostlin, DNAdetekcní kit - Google Patents
Zpusob vylepšení tolerance vuci glyfosátu u rostliny pšenice, její bunka, její DNA, dvojice molekulDNA primeru, zpusoby její detekce, zpusob šírení vlastnosti tolerance vuci glyfosátu u rostlin, DNAdetekcní kit Download PDFInfo
- Publication number
- CZ300073B6 CZ300073B6 CZ20030629A CZ2003629A CZ300073B6 CZ 300073 B6 CZ300073 B6 CZ 300073B6 CZ 20030629 A CZ20030629 A CZ 20030629A CZ 2003629 A CZ2003629 A CZ 2003629A CZ 300073 B6 CZ300073 B6 CZ 300073B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- dna
- wheat
- seq
- glyphosate
- dna molecule
- Prior art date
Links
- 241000209140 Triticum Species 0.000 title claims abstract description 179
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 102
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 title claims abstract description 89
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 title claims abstract description 89
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 81
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 title claims description 54
- 238000009395 breeding Methods 0.000 title abstract description 9
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 title abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 210
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims abstract description 100
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 57
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 16
- 108010020183 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase Proteins 0.000 claims abstract 4
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 59
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 57
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 30
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 30
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 29
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 27
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 26
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims description 25
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 20
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 20
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 241000677647 Proba Species 0.000 claims description 8
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 7
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 6
- 108010031100 chloroplast transit peptides Proteins 0.000 claims description 5
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 5
- 101710197633 Actin-1 Proteins 0.000 claims description 4
- 101100507655 Canis lupus familiaris HSPA1 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 3
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims 2
- 230000035558 fertility Effects 0.000 claims 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 claims 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 40
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 35
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 27
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 20
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 19
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 19
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 19
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 18
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 17
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 14
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 9
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 7
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 7
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 7
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 6
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 5
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 241001167018 Aroa Species 0.000 description 4
- 101100491986 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) aromA gene Proteins 0.000 description 4
- 101150037081 aroA gene Proteins 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 3
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- 101100083503 Caenorhabditis elegans acl-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N D-nopaline Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)N[C@@H](C(O)=O)CCC(O)=O LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 description 2
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 240000000359 Triticum dicoccon Species 0.000 description 2
- 235000001468 Triticum dicoccon Nutrition 0.000 description 2
- 235000007264 Triticum durum Nutrition 0.000 description 2
- 241000209143 Triticum turgidum subsp. durum Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 2
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 2
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QUTYKIXIUDQOLK-PRJMDXOYSA-N 5-O-(1-carboxyvinyl)-3-phosphoshikimic acid Chemical compound O[C@H]1[C@H](OC(=C)C(O)=O)CC(C(O)=O)=C[C@H]1OP(O)(O)=O QUTYKIXIUDQOLK-PRJMDXOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000148064 Enicostema verticillatum Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001058146 Erium Species 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 108010034791 Heterochromatin Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N Metaphosphoric acid Chemical compound OP(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700015679 Nested Genes Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102000004523 Sulfate Adenylyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010022348 Sulfate adenylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 208000024780 Urticaria Diseases 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- -1 aromatic amino acid Chemical class 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000005081 chemiluminescent agent Substances 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- MWEQTWJABOLLOS-UHFFFAOYSA-L disodium;[[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-oxidophosphoryl] hydrogen phosphate;trihydrate Chemical compound O.O.O.[Na+].[Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP([O-])(=O)OP(O)([O-])=O)C(O)C1O MWEQTWJABOLLOS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 201000006549 dyspepsia Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 244000037666 field crops Species 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 208000024798 heartburn Diseases 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000004458 heterochromatin Anatomy 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000004922 lacquer Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 108010087904 neutravidin Proteins 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 238000009401 outcrossing Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 208000024981 pyrosis Diseases 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000009417 vegetative reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000013466 vegetative reproduction Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
- C12N9/1092—3-Phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (2.5.1.19), i.e. 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
- C12N15/8275—Glyphosate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
- C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
- C12Y205/01019—3-Phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (2.5.1.19), i.e. 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Rešení se týká zpusobu vylepšení tolerance rostliny pšenice vuci glyfosátu. Rovnež se týká bunky, DNA a dvojice molekul DNA primeru rostliny pšenice 33391 tolerantní ke glyfosátu. Dále je popsán zpusob detekce prítomnosti DNA molekuly rostliny pšenice 33391 ve vzorku, zpusob šírení vlastnosti tolerance vuci glyfosátu u rostlin pšenice a DNA detekcního kitu. Mimoto se týká i bunky pšenicné rostliny tolerantní ke glyfosátu obsahující v bunecném genomu zaclenenou inzertní DNA molekulu kódující EPSPS rezistentní vuci glyfosátu a DNA obsahující SEQID c.5, SEQ ID c.6 nebo celé jejich komplementy. Ve výhodném provedení pochází bunka rostliny pšenice ze vzorových semen rostliny pšenice oznacené 33391, které byly uloženy v ATCC pod prístupovým císlem PTA-2347.
Description
Způsob vylepšení tolerance vůči glyfosátu u rostliny pšenice, její buňka, její DNA, dvojice molekul DNA primerů, způsoby její detekce, způsob šíření vlastnosti tolerance vůči glyfosátu u rostlin, DNA detekční kit ? Oblast techniky
Vynález se týká oblasti rostlinné molekulární biologie, přesněji se týká DNA konstruktu pro prokazatelně lepší toleranci rostliny pšenice vůči glyfosátu. Vynález se přesněji týká rostliny pšenice 33391 tolerantní kc glyfosátu a její buňky. DNA a dvojice molekul DNA primerů. Dále io se vynález týká zpusobu detekce přítomnosti DNA molekuly rostliny pšenice 33391 ve vzorku.
způsobu šíření vlastnosti tolerance vůči glyfosátu u rostlin pšenice a DNA detekčního kitu.
Dosavadní stav techniky i? Pšenice je důležitá plodina a v mnoha oblastech světa je primárním zdrojem potravin. Na pšenici byly aplikovány biotechnologické metody za účelem vylepšení agronom ických vlastností a kvality produktu. Jednou z takových agronomicky ch vlastností je tolerance vůči herbicidům, zejména tolerance vůči glyfosálovému herbicidu. Tato vlastnost pšenice je způsobena expresí transgenu v rostlinách pšenice (Zhou et al., Plant Cell Rep. 15:159-163. 1995). Exprese cizích genů
2() v rostlinách je, jak známo, ovlivněna pozicí začlenění těchto genů do chromozomu, pravděpodobně díky chromatinové struktuře {tzv. heterochromatin) nebo těsné blízkosti transkripčnč regulačních elementů (tzv. enhancerv) od místa integrace (Weising et al., Ann. Rev. Gcnct 22:-421-177_ 1988). Z těchto důvodů je často nezbytné sledovat velké množství případů z důvodu identifikace případu charakterizovaného optimální expresí žádaného zaváděného genu. Například bylo pozorováno u rostlin a dalších organismů, že se může vyskytnout široká variabilita v hladinách exprese zaváděného genu v rámci případů. Rozdíly mohou být v prostorovém nebo časovém charakteru exprese, například rozdíly v relativní expresi transgenu v různých rostlinných tkáních, které nemusí odpovídat charakteru očekávanému na základě transkripčnč regulačních elementů přítomných v zaváděném genovém konstruktu. Z těchto důvodů je běžné produkovat stovky až tisíce různých případů a sledovat tyto případy za zisku jednoho případu, který má požadované expresní hladiny transgenu. a charakter exprese pro komerční použití. Případ, který má požadovaně expresní hladiny transgenu, a charakter exprese pro komerční použití. Případ, který má požadované hladiny a charakter exprese transgenu je použitelný pro vnesení transgenu do dalších genetických pozadí sexuálním „outerossingem“ s použitím konvenčních šlechtitelských metod.
Potomci takových kříženců udržují charakter exprese transgenu původního transformanta. Tato strategie je používána za účelem zajištění spolehlivé genové exprese v množství variet, které jsou dobře adaptovány pro lokální růstové podmínky.
Bylo by výhodné umět detekovat přítomnost případu zejména při určování, zda potomek to sexuálního křížení obsahuje požadovaný transgen. Navíc způsob detekce specifických případů by byl užitečný například pro vyhovění předpisům vyžadujícím schválení pro trh a označení potravin odvozených z rekombinantních rostlin. Přítomnost transgenu je možné detekovat jakoukoliv obecné známou metodou detekce nukleových kyselin, jako je polymerázová řetězcová reakce (PCR, polymerase chain reaction) nebo DNA hybridizace s využitím prob nukleových kyselin,
-15 Tyto detekční metody se obecně zaměřují na často používané genetické elementy jako jsou promotory, terminátory, značkové geny atd. Ve výsledku tyto metody nemusí být užitečné pro rozlišení mezi různými případy a to zejména těmi, které byly vyprodukovány s využitím stejného DNA konstruktu bez toho, aniž by byla známa sekvence chromozomální DNA přilehlá k vložené DNA („flaking DNA”). Je například diskutován PCR test specifický pro případy (Windels et al.,
5(i Med. Eac. Eandbouw, Univ. Cent 64/5b;459 462, 1999). kdy byl pomocí PCR identifikován případ sóji 40-3-2 tolerantní ke glyfosátu s využitím setu primerů překlenuj ících spoj mezi inzertem vložené DNA, přesněji jeden primer zahrnovat sekvenci inzertu a druhý primer obsahoval sekvenci vložené DNA.
- 1 CZ 300073 B6
Podstata vynálezu
Vynález poskytuje způsob vylepšení tolerance vůči glyfosátu li rostliny pšenice (Trificum aestivum). dále buňku rostliny pšenice s vylepšenou tolerancí vůči glyfosátu získanou způsobem podle vynálezu. DNA molekulu izolovanou z této buňky a dvojici molekul DNA primerů. Dále se vynález týká způsobu detekce přítomnosti DNA molekuly rostliny pšenice 33391 tolerantní vůči gly fosátu nebo jejích potomků a způsobu šíření tolerance vůči glyfosátu do rostlin pšenice. Vynález se rovněž týká DNA detekčního kitu a buňky pšeničné rostliny tolerantní ke glyfosátu obsahující v buněčném genomu začleněnou inzertní DNA molekulu kódující EPSPS rezistentní io vůči glyfosátu a DNA obsahující SEQ ID č. 5. SEQ ID č. 6 nebo celé jejich komplementy.
Podle jednoho provedení vynálezu je poskytnout DNA konstrukt, který, pokud je exprimován v rostlinných buňkách pšenice, tak tyto rostliny vykazují lepší toleranci vůči glyfosátovému herbicidu. Vynález poskytuje způsob produkce a selekce rostlin pšenice tolerantních vůči glyI? fosátu obsahujících DNA konstrukt pMON30139. DNA konstrukt pMON30139 obsahuje dvě transgenní expresní kazety. První expresní kazeta obsahuje promotor actin l (P-Os.Acll) z ryže (Orvzae sativa) a intron (I-Os.Act 1) funkčně napojený na EPSPS chlorplastovou tranzitní peptidovou sekvenci (TS-At. EPSPS) z Árabidapsis funkčně napojenou na gen (A G RT U .a ro A: C P4) k ód uj í c í g I y fo sát rezistentní 5-en o 1 py ru vy I š i k i mát-3 - fos fá l sy ntážu co (EPSPS) izolovaný z Agrobacterium tumefaciens (ACíRTLJ) sp. kmen CP4 funkčně napojený na transkripční inhibitor nopalin syntázy (T-AGRTU.nos). Druhá transgenní expresní kazeta sestává z 35Spromotoru (P CaMV.35S:en) mozaikového viru květáku (CaMV) obsahujícího tandemový duplikát oblasti enhaneeru funkčně napojený na Hsp70 intron (l-Zm.Hsp70) z rostliny Zea ma\x, funkčně napojený na sekvenci nukleových kyselin kódující EPSPS chloroplastovou tranzitní peptidovou sekvenci / Árabidapsis thaliana, funkčně napojený na gen kódují glyíósát rezistentní 5-enol- pyruvyjšikimát-3-fosfát syntázu izolovanou 7. Agrobacterium tumefaciens (AGRTU) sp. kmen CP4, funkčně napojený na transkripční inhibitor nopalin syntázy . Tyto expresní kazety jsou v tandemu a jsou přemostěny oblastí DNA, která obsahuje DNA sekvence Agrobacterium tumefaciens (RB a LB) jako komponenty způsobu, který je použit v rámci způsobu /prostředkosu vaně organismem Agrobacterium pro vložení expresních kazet do genomu pšenice.
Podle dalšího provedení vynálezu se výše uvedeným způsobem získá buňka pšenice tolerantní vůči glyfosátu, která ve výhodném provedení obsahuje SEQ ID ě, 5 a SEQ ID č. 6. V dalším provedení se vynález týká DNA molekuly izolované z buňky pšenice tolerantní ke glyfosátu, která obsahuje SEQ ID ě, 5 a/nebo SEQ ID č. 6.
Podle jednoho z provedení vynálezu jsou DNA molekuly vytvořeny tak, aby obsahovaly alespoň jednu sekvenci oblasti inzerce transgenu do genomu pšenice 33391, kde sekvence je vybrána ze skupiny obsahující SEQ ID č. 5 a SEQ ID č. 6 a jejich komplementární sekvence, kde sekvence oblasti inzerce zahrnuje spojení mezi heterologní DNA vloženou do genomu pšenice a DNA genomu pšenice navazující na místo inzerce, a charakterizuje případ.
Podle dalšího provedení vynálezu je poskytnuta dvojice molekul DNA primerů obsahující první a druhou DNA molekulu, kde první DNA molekula obsahuje 8 nebo více následuj ících nukleotidů z nukleotidů 1-257 ze SEQ ID ě. 5 nebo ze sekvence k ní komplementární, a druhá DNA molekula obsahuje 8 nebo více následujících nukleotidů z nukleotidů 258-399 ze SEQ ID ě, 5 nebo ze sekvence k ní komplementární, a použitím dvojice molekul DNA primerů při amplifikaci DNA vzniká amplikon charakteristický pro DNA extrahovanou z rostliny pšenice 33391 tolerantní vůči gly fosátu nebo jej ich potomků.
Podle dalšího provedení vynálezu je poskytnuta dvojíce molekul DNA obsahující první a druhou
DNA molekulu, kde první DNA molekula obsahuje 8 nebo více následujících nukleotidů z nukleotidů 101 431 ze SEQ ID č. 6 nebo ze sekvence k ní komplementární tak, aby mohl být použít jako primer, a druhá DNA molekula obsahuje 8 nebo více následuj ících nukleotidů z nukleotidů 1-100 ze SEQ ID č. 6 nebo ze sekvence k ní komplementární tak, aby mohl být
použit jako primer. a použitím dvojice DNA molekul při amplifikací DNA vzniká amplikon charakteristicky pro DNA extrahovanou / rostliny pšenice 33391 tolerantní vůči glyfosátu nebo jejích potomku.
Zahrnuty jsou DNA sekvence, které obsahují dostatečnou délku polynukleotidové sekvence ? transgenního inzertu a dostatečnou délku polynukleolidové sekvence pšeničného genomu pšenice 33391 zc sekvence SEQ ID č. 5, které jsou použitelné jako příměrové sekvence pro vznik amplikonu charakteristického pro pšenici 33391. Zahrnuty jsou DNA sekvence, které obsahují dostatečnou délku polynukleotidové sekvence transgenního inzertu a dostatečnou délku polynukleotidové sekvence pšeničného genomu pšenice 33391 ze sekvence SEQ ID č. 6. které jsou in použitelné jako příměrové sekvence pro vznik amplikonu charakteristického pro pšenici 33391.
Podle jiného provedení vynálezu jsou vytvořeny molekuly DNA. které jsou charakteristické pro pšenici 33391. loto provedení vynálezu je určeno pro pšenici 33391 obsahující alespoň jednu novou molekulu DNA. DNA molekuly obsahující priměrové sekvence jsou vytvořeny tak. že l? poskytují alespoň jeden nový DNA amplikon pšenice 33391 obsahující sekvence SEQ ID č, 7 a
SEQ IDč. 8 a sekvence k nim komplementární. Tyto DNA amplikony jsou charakteristické pro pšenici 33391, Amplifikace nukleových kyselin genomové DNA pšenice 33391 dá vzniku amplikonu obsahujícího tyto charakteristické DNA sekvence. Vynález poskytuje izolované DNA molekuly, které obsahují dostatečnou délku sekvence transgenního inzertu a dostatečnou délku zo genomové sekv ence pšenice 33391, které fungují jako sekvence primerú pro produkci amplikonu charakteristického pro pšenici 33391.
Podle dalšího provedení vynálezu je poskytnut způsob detekce přítomnosti DNA odpovídající pšenici 33391 tolerantní vůči glyfosátu nebo jejím potomkům ve vzorku. Způsob podle vynálezu zahrnuje a) extrakci vzorku DNA z rostliny pšenice nebo potomků osiva a rostlin nebo zčásti rostlin; b) kontakt vzorku DNA s výše uvedenou dvojicí molekul DNA primerů; a c) provedení DNA amplifikací reakce za vzniku amplikonové DNA molekuly; a d) detekci amplikonové DNA molekuly . Ve výhodném provedení jsou molekuly primerů SEQ ID č. 7 a SEQ ID č. 8.
so Vynález rovněž zahrnuje způsob detekce přítomnosti DNA molekuly SEQ ID č. 5 ve vzorku DNA. který zahniuje a) extrakci vzorku DNA z rostliny pšenice; b) kontakt vzorku DNA s molekulou DNA, která zahrnuje oblast spojení genomové DNA pšenice 33391 a DNA inzertu SEQ ID č. 5. kde molekula DNA je DNA proba. která hybridizuje za stringentních podmínek s DNA molekulou SEQ ID č. 5; a e) vystavení vzorku a proby stringentním hybridizačním podmínkám; a detekci hybridízace proby s cílovou DNA.
Dále vynález zahrnuje způsob detekce přítomnosti DNA molekuly SEQ ID ě. 6 ve vzorku DNA zahrnující a) extrakci vzorku DNA z rostliny pšenice; b) kontaktu vzorku DNA s molekulou DNA, která zahrnuje oblast spojení genomové DNA pšenice 33391 a DNA inzertu SEQ ID č. 6,
-m kde molekula DNA je proba, která hybridizuje za stringentních podmínek s DNA molekulou SEQ ID č. 6; a c) vystavení vzorku a proby stringentním hybridizačním podmínkám, a detekci hybridízace proby s cílovou DNA.
V dalším provedení se vynález týká způsobu šíření vlastnosti tolerance vůči glyfosátu do rostlin pšenice zahrnujícího a) křížení potomka pšenice 33391 tolerantní vůči glyfosátu s rostlinou pšenice, která není tolerantní vůči glyfosátu; a b) produkci potomků křížení rostlin pšenice; a c) extrakci vzorku DNA z potomků rostlin pšenice; d) kontakt DNA vzorku s markerovou molekulou nukleové kyseliny, která hybridizuje s SEQ ID č. 5 nebo SEQ ID č. 6 nebo s jejich komplementárními sekvencemi; a e) provedení metody MAB (markér assisted breeding) pro vlastnost tolerance vůči glyfosátu, kde tolerance vůči glyfosátu jc geneticky vázána kc komplementu markerovc molekuly nukleové kyseliny.
Dále se vynález týká DNA detekčního kilu. Kit obsahuje alespoň jednu DNA molekulu obsahující 8 nebo více následujících nukleotidů komplementárních k SEQ ID č. 5 nebo
-3C'Z 300073 Bó
SEQ ID č. 6. která má funkci DNA primerů nebo proby specifické pro rostliny pšenice 33391 a jejich potomky.
Další provedení vynálezu zahrnuje buňku pšeničné rostliny tolerantní ke glyfosátu obsahující v buněčném genomu začleněnou inzertní DNA molekulu kódující EPSPS rezistentní vůči glyfosátu a DNA obsahující SEQ ID č. 5. SEQ ID č. 6 nebo celé jejich kompíementv Ve výhodném provedení vynálezu buňka rostliny pšenice pochází ze vzorových semen rostliny pšenice označené 33391. které byly uloženy v ATCC pod přístupovým číslem PTA 2347.
Výše uvedená další provedení vynálezu budou detailněji popsána v následujícím popise a ío doprovodných výkresech.
Přihláška nárokuje prioritu zE.S. Provisional Aplicatíon No. 60/236 653, datum podání 29. 9. 2000 a U.S, Provisional Application No. 60/236 762, datum podání 29. 9. 2000. Pro lepší definici vy nálezu a jako instrukce pro odborníky v dané oblasti při uvádění do praxe jsou uvedeb ny následující definice a způsoby. Bez toho. aby to bylo dále rozváděno, použité termíny jsou srozumitelné a konvenčně používané odborníky vdané oblasti. Definice běžných termínů molekulární biologie mohou být také nalezeny v práci Rieger et al., Glossatv of Genetics: Classical and Molecular. 5. vydání. Springer-Verlag: New York, 1991; a Lewin. Genes V, Oxford University Press: New York, 1994. Je použita názvosloví DNA bází, jak je uvedeno v 37CLR § 1.822.
Jak je použito zde. termín „pšenice znamená Triticum aestivum (včetně jarních, zimních a fakultativních variant pšenice), jakékoliv další druhy pšenice, které mohou být kříženy s Triticum aestivum. včetně, ale ne pouze, tvrdá pšenice (Triticum durum). pšenice špafdy (Triticum spefta) a pšenice „emmer (Triticum dicoccum). Zahrnuty jsou také rostliny, které jsou produkovány konvenčními technikami s využitím Triticum aestivum jako rodiče při sexuálním křížení s druhy nespadajícími do Triticum (jako je žito [Secale cereale]). včetně, ale ne pouze druh ,.tritieale’.
Jak je použito zde, termín ..obsahuje“ znamená „zahrnuje, ale nevyčerpává možnosti“.
„Glyfosát znamená N-fosfonometylglycin a jeho soli. Glyfosát je aktivní složka herbicidu Roundup (Monsanto Co. St. Louis, MO). Ošetření „glyfosátovym herbicidem znamená ošetření přípravkem Roundup“. Roundup Ultra“, nebo jakoukoliv další formulací obsahující glyfosát. Pro účely vynálezu termín „glyfosát“ zahrnuje jakoukoliv herbicidně aktivní formu N-fosfonomctylglycinu (včetně jeho jakýchkoliv solí) a další formy, které dávají vzniknout glyfosátového (5 aniontu v rostlině. Ošetření „glyfosátem“ znamená ošetření přípravkem Roundup“ nebo Roundup Ultra“, pokud není uvedeno jinak. Pro transformaci rostlin a regenerace v tkáňové kultuře je použit glyfosát nebo soli glyfosátu. Pro testy na celých rostlinách je použita formulace Roundup“ nebo Roundup Ultra”. Další formulace s herbicidní aktivitou, které obsahují N-fosfonometylglycin nebo jakékoliv jeho soli, jsou zde uvedeny jako gly fosátový herbicid.
Transgenní „případ vzniká transformací rostlinných buněk heterologní DNA. tzn. konstruktu tvořeného nukleovou kyselinou, který obsahuje požadovaný Iransgen, regenerací populace rostlin vznikající na základě inzerce transgenu do genomu rostliny a selekcí zejména rostlin charakterizovaných inzercí do specifických gcnomových oblastí. Termín „případ“ označuje originálního transformanta a potomky transformanta. který obsahuje heterologní DNA. Termín „případ označuje také potomky vznikající sexuálním „outeross“ mezi Iransformanlem a jinou variantou, která obsahuje heterologní DNA. Dokonce po opakovaném zpětném křížení rekurentního rodiče, vložená DNA a přiléhající sousední DNA z transformovaného rodiče je přítomna u potomků křížení ve stejném místě chromozomu. Termín „případ“ také označuje DNA z originálního transformanta
5« a jeho potomku obsahující DNA inzert a genomové přiléhající sousední sekvence bezprostředně sousedící s DNA inzertem, u kterého se očekává, že bude přenesen potomkům, kteří obdrží DNA inzert včetně požadovaného transgenu jako výsledek sexuálního křížení rodičovské linie jež obsahuje DNA inzert (např. originální iransformant a potomek vznikající vegetativním rozmnožováním (sclfing) a rodičovské linie, která neobsahuje DNA inzert. Termín „případ“ ve vynálezu
-4CZ 300073 B6 zahrnuje osivo pšenice 33391, jak jc uloženo v ATCC, záznam č. PTA-2347 a rostliny pšenice, které vyrostly z osiva pšenice 33391 a jejich potomky. Rostlina pšenice, která je tolerantní k dostatečnému množství glyfosatového herbicidu pro řízení rustu plevele bez ovlivnění rostlin pšenice, může byt namnožena sexuálním křížením prvního rodiče rostliny pšenice, kterou představuje rostlina pšenice obsahující expresní kazety pMON30139 zajišťující lepší toleranci vůči aplikaci glyfosatového herbicidu a druhého rodiče rostliny pšenice, která postrádá toleranci vůči glyfosátovému herbicidu, za vzniku množství prvních potomků rostlin, poté selekcí prvních rostlinných potomků, které jsou tolerantní vůči aplikaci glyfosátu, vegetativním rozmnožováním (selřing) prvních rostlinných potomků za vzniku množství druhých rostlinných potomků a selekcí ni tolerantních rostlin vůči glyfosátu mezi druhým potomstvem. Tyto kroky mohou dále zahrnovat zpětné křížení rostliny prvního potomka tolerantního vůči aplikaci glyfosatového herbicidu nebo rostliny druhého potomstva tolerantního vůči aplikaci glyfosatového herbicidu s druhým rodičem rostliny pšenice nebo třetím rodičem rostliny pšenice za vzniku rostlin pšenice, které tolerují aplikaci glyfosatového herbicidu. Rostliny pšenice zahrnují osivo pšenice 33391 nebo jejich i? potomky, přičemž mohou být pěstovány na poli a ošetřovány dostatečným množstvím glyfosátového herbicidu pro řízení růstu plevele bez významného ovlivnění úrody pšenice. Dostatečné množství glyfosatového herbicidu jc asi 59 pl na m' (8 uncí na akr) nebo více. 119 pl na m2 (16 uncí na akr) nebo více, 237 μΐ na ni (32 uncí za akr) nebo více nebo 474 μΙ na m2 (64 uncí na akr) nebo více. Jakékoliv formulace obsahující glyfosátový herbicid mohou být použity pro řízení
2o růstu plevele ve sklizni pšenice obsahující rostliny pšenice 33391 nebo jejich potomky.
Je také zřejmé, že dvě různé transgenní rostliny mohou být také kříženy za vzniku potomků, kteří obsahují dva nezávislé, oddělené exogenní geny. Vegetativní rozmnožování (selfíng) vhodného potomka může vést ke vzniku rostlin, které jsou homozygotní pro oba přidané exogenní geny kódující požadovaný polypeptid. Stejně jako vegetativní rozmnožování je uvažováno také zpětné křížení s rodičovskou rostlinou a „out-crossing“ s netransgenní rostlinou. Popisy dalších šlechtitelských metod, které jsou běžně používány pro různé vlastnosti a plodiny, mohou být nalezeny v jedné z následujících prací: Fehr, in Breeding Methods for Cullivar Development. Wilcox J. ed., American Society of Agronoy. Madison WI (1987) zde začleněna jako reference na celek; io Poehlman. J. M. (1987); reeding Field Crops. 3. vydání. Van Nost rand Reinhold, NY, Knott, D. R, (1987): zde začleněna jako reference na celek The Application of Breeding Proeedures to Wheat. strany 419-427 a také v práci E. G. Heyne (ed.) In „Wheat and Wheal Iniprovemeiit“. Madison. Wl. zde začleněna jako reference na celek. Šlechtění s využitím zpětného křížení je používáno pro transfer genů pro jednoduše děděné, vysoce děditelné vlastnosti do požadovaného homozygotního kultivaru nebo ímbredni linie, kterou je rekurentní rodič. Zdroj vlastnosti, která má být přenesena, se nazývá donorový rodič. U výsledné rostliny se předpokládá. Že bude vykazovat atributy rekurentního rodiče (například kultivaru) a požadovanou vlastnost přenesenou z donorového rodiče. Po počátečním křížení jsou vy bráni potomci, kteří vykazují fenoty p donorového rodiče, a opakovaně zpětně kříženi s rekurentním rodičem. U výsledného rodiče se očekává, že bude mít atributy rekurentního rodiče (například kultivar) a požadovanou vlastnost přenesenou z donorového rodiče.
DNA molekuly podle vynálezu mohou být použity jako molekulární markéry u metody MAB (markér assisted breeding). DNA molekuly podle vynálezu mohou být použity v metodách jako jsou AFLP (amplified fragment length polymorphismus), REEP (restriction fragment length polymorphismus), SNP a SSR (simple sequence repeats), které slouží k identifikaci genetické vazby agronomicky užitečných vlastností, a které jsou popsány v pracech: Walton. Secd World 22-29 (červenec, 1993) zde začleněna tímto odkazem; Burow and Blake, Molecular Dísseetion of Complex Iraits. 13 29, Eds. Paterson, CRC Press. New York (1988) zde začleněna tímto odkazem. Znak lepší tolerance vůči glyfosátu u rostliny pšenice 33391 může být u potomků křížení s rostlinou pšenice 33391 a jakoukoliv jinou variantou zjišťován pomocí metody MAB. DNA molekuly jsou markéry' pro tento znak a v případě metody MAB je velice dobře známo, že může být použita pro zjišťování glyfosátové tolerance u pšenice, kde rostlina pšenice 33391 byla rodič nebo předek.
- S CZ 300073 Bó
Termín „proba označuje izolovanou nukleovou kyselinu, ke které je připojena konvenčně detekovatelná nebo reportérové molekula, například radioizotop, ligand, chemiluminiscenční činidlo nebo enzym. Proba je komplementární k řetězci cílové nukleové kyseliny. \ případě vynálezu k řetězci genomové DNA případu pšenice 33391 {ať už / rostliny pšenice nebo vzorku, který obsahuje DNA případu). Proby podle vynálezu nezahrnují pouze deoxyribonukleové nebo ribonukleové kyseliny, ale laké polyamidy a další materiály tvořící proby tak. že se váží specificky k cílové DNA sekvenci a mohou být využity k detekci dané cílové DNA sekvence.
Termín ..primery označuje izolované nukleové kyseliny, které jsou hybridizovánv s komplimente tárním řetězcem cílové DNA za vzniku hybridu mezi primerem a cílovým řetězcem DNA. poté prodlužovány podél cílového řetězce DNA pomocí polymerázy, například DNA polymerázy. Pár nebo set primerů může být použit pro amplifikací sekvence nukleových kyselin například metodou PCR (polymerázová řetězcová reakce) nebo dalšími konvenčními metodami pro amplifikací nukleových kyselin,
Proby a primery obvy kle obsahují 8 nebo více polynukleotidů. 18 nebo více póly nukleotidů, 24 nebo více polynukleotidů, 30 polynukleotidů nebo více. Póly nukleotidy vhodné jako proby a primeiy mají dostatečnou délku, aby hybrid izovaly specificky s cílovou sekvencí za stríngentních (přesně daných) podmínek pro hybridizaci. Proby a primery podle vynálezu vykazují úplnou
2o sekvenční podobnost s cílovou sekvencí, ačkoliv mohou být konvenčními metodami navrženy proby lišící se od cílové sekvence a přesto si udržují schopnost hybridizovat s cílovou sekvencí.
Metody přípravy a použití prob a primerů jsou popsány například v knize Molecular Cloning: A Laboratory manual, 2. vydání, svazek 1-3, ed. Sambrook et al.. Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (dále, „Sambrook et al„ 1989“) zde začleněna tímto odkazem; Current Protocols ín Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York. 1992 (s periodickými dodatky, dále „Ausubel et al„ 1992) zde začleněna tímto odkazem; a Innis et al.. PCR Protocols: A Guide to methods and Applications, Academie Press: San Diego, 1990 zde začleněna tímto odkazem. Pár PCR primerů může být .to odvozen od známé sekvence například použitím počítačových programů zamýšlených pro toto použití jako je například Primer (verze 0.5. © 1991. Whitehead Institute for Biomedtcal Research, Cambridge, MA) zde začleněn tímto odkazem.
Primery' a proby na bázi DNA sousedící s inzertem a na sekvencích inzertů popsaných ve vynálezu mohou být použity k potvrzení (a pokud je nezbytné k opravě) popsaných sekvencí konvenčními metodami, například reklonováním a sekvenováním těchto sekvencí.
Primery a proby podle vynálezu ve formě nukleových kyselin hybridizují za slringentních podmínek s cílovou DNA sekvencí. K identifikaci přítomnosti DNA transgenního případu ve vzorku
4(i může být použita jakákoliv konvenční metoda pro hybridizaci a amplifikací nukleových kyselin.
Termín „stringentní podmínky je funkčně definován vzhledem k hybridizaci proby ve formě nukleové kyseliny s cílovou nukleovou kyselinou (například se specifickou sekvencí požadované nukleové kyseliny) podle specifického hybridizačního postupu popsaného v knize Sambrook et al., 1989, v kapitolách 9.52 - 9.55. Viz také Sambrook el al., 1989 kapitoly 9.47 - 9.52. 9.56 9.58 zde začleněn tímto odkazem; Kanehisa, (Nuel. Acids Res. 12:203 - 213, 1984, zde začleněn tímto odkazem; a Wetniur and Davidson, (J. Mol. Biol. 31:349- 370, 1988, zde začleněn tímto odkazem). Tudíž nukleotidové sekvence podle vynálezu mohou být využity pro svoji schopnost selektivní tvorby duplexních molekul s komplementárními relaxovanými DNA fragmenty.
V závislosti na zamýšlené aplikaci je možné požadovat aplikaci různých hybridizačních podmínek hybridizace. aby bylo dosaženo různých stupňů selektivity proby vůči cílové sekvenci. Pro aplikace vyžadující vysokou selektivitu jsou obvykle vyžadovány relativně stringentní podmínky pro tvorbu hybridů, například budou zvoleny podmínky s nízkým obsahem solí a/nebo vysokou teplotou, jako je například koncentrace soli v rozmezí asi 0.02M až asi 0.15 M při teplotách v rozmezí asi 50 °C až asi 70 °C. Stringentní podmínky jsou určeny například také promýváním
-6CZ 300073 B6 hybridizačního filtru alespoň dvakrát vysoce stringentním pufrem (0,2 x SSC. 0,1% SDS. 65 °C).
Vhodné stringentní podmínky, které usnadňují hybridizaci DNA. například 6 x SSC (chlorid sodný / citrát sodný) při teplotě 45 °C s následným promýváním 2 x SSC při teplotě 50 °C. jsou odborníkům v oblasti známé a mohou být nalezeny v knize Current Protocois in Molecular
Biology, John Wiley & Sons. N.Y. (1989). 6.3.1 - 6,3.6. Například koncentrace soli v promývacím kroku se může pohyboval v rozmezí nízké stringenee asi 2 x SSC při teplotě 50 °C až vysoké stringenee asi 0,2 x SSC při teplotě 50 0C, Navíc může být měněna teplota v kroku promývání z podmínek nízké stringentnosti při pokojové teplotě asi 22 °C až k podmínkám vysoké stringentnosti při teplotě asi 65 °C. Jak teplota, tak koncentrace soli se mohou měnit nebo io může být buď teplota, nebo koncentrace soli držena konstantní, zatímco druhý faktor se mění. Tyto selektivní podmínky dovolují vzniknout pouze malému množství, pokud nějakému, nesprávné spojených ..mismatch hybridizaci mezi probou a templátem cílového řetězce. Detekce DNA sekvencí pomocí hybridizace je odborníkům v oblasti dobře známa a postupy v patentech
US 4 965 188 a US 5 176 995 jsou příklady metod hybridizačních analýz.
Vzhledem k amplifikaci cílových sekvencí nukleových kyselin (například pomocí PCR) s využitím specifického amplifikačního páru primerů, „stringentní podmínky” jsou podmínky, které umožňují hybridizaci příměrového páru pouze k cílovým sekvencím nukleových kyselin, ke kterým by sc primer s odpovídající neupravenou „vvild - type sekvencí (nebo k ní komplementámí) měl s výhodou vázat za vzniku unikátního amplifikačního produktu, amplíkonu.
lermín „specifický pro cílovou sekvenci” znamená, že proba nebo primer hybridizuje za slringentníeh hybridizačních podmínek pouze s cílovou sekvencí vc vzorku obsahujícím cílovou sekvenci.
Zde použitý termín „ampl i Okovaná DNA nebo „amplikon“ označuje produkt amplifikace nukleových kyselin cílové sekvence nukleových kyselin, která je částí lemplátu tvořeného nukleovou kyselinou. Například pro určení, jestli rostlina pšenice vy produkovaná na základě sexuálního křížení obsahuje transgenní případ, může být genomová DNA rostliny pšenice podrobena amplifikaci nukleových kyselin s využitím příměrového páru, který zahrnuje primer odvozený od so sekvence genomu rostliny přilehlé k místu inzerce vložené heterologní DNA a druhý primer odvozený od vložené heterologní DNA. za vzniku amplíkonu. který je charakteristický pro přítomnost případu. Amplikon má délku a sekvenci, která je charakteristická pro případ. Nebo také může být pár primerů odvozen od sekvencí sousedících s inertem na obou stranách vložené
DNA, vznikne tak amplikon, který zahrnuje celý inzert.
Amplifikace nukleových kyselin může být dosaženo jakoukoliv z různých v oblasti známých metod amplifikace nukleových kyselin, včetně polymerázové řetězcové reakce - PCR. Je známo množství amplifikačních metod a jsou popsány v patentech US 4 683 195 a US 4 683 202 a v práci PCR protocois: A guidc to Methods and Applications, ed. Innis et al.. Academie Press,
San Diego, 1990, Pro využití vynálezu může být použita jakákoliv ze známých metod pro amplifikaci nukleových kyselin. Sekvence heterologní DNA inzertu nebo sousedící sekvence u případu pšenice 33391, v ATCC záznam č, PTA-2347 může být ověřena (a pokud je nezby tné také opravena) amplifikaci těchto sekvencí z případu použitím primerů odvozených ze sekvencí poskytnutých vynálezem a následnými standardními metodami DNA sekvenování PCR anipli45 kónu nebo klonované DNA molekuly.
Amplikon vyprodukovaný těmito metodami může být detekován množstvím metod. Běžná a známá metoda pro detekci DNA amplikonů je agarózová clektroťoréza s detekcí pomocí etidium bromidu. Další metoda je metoda „Genetic Bit Analysis (Nikiforov, et al. Nucleic Acid Res.
22:4167 - 4175, 1994), kde je navržen DNA oligonukleotid. který zahrnuje DNA sekvenci jak k inzertu přilehlé oblasti, tak vloženého inzertu. Oligonukleotid je imobilizován v jamkách mikrotitrační destičky. Následuje PCR oblasti zájmu (s využitím jednoho primerů v oblasti vložené sekvence a druhého v oblasti s inzertem sousedící genomové DNA sekvence), jednořetčzcový PCR produkt může být hybridizován k imobil izovanéniu oligonukleotidu a slouží jako
-7CZ 300073 B6 templát pro reakci o jeden nukleotid prodlužující daný oligonukleotid DNA polvmerázou a značeného nukleotidu ddNTP specifického pro další očekávanou bázi, Odečítání muže být založeno na fluorescenci nebo dalších standardních postupech ELISA. Signál znamená přítomnost sekvence inzert/přilehlá DNA jako výsledek úspěšné amplifikace. hybridizace a reakce ? prodlužující oligonukleotid o jednu bázi.
Další metodou je technika pyrosekvence (Pyrosequencing technique) popsaná autorem Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24. 2000). V této metodě je oligonukleotid navržen tak. že zahrnuje přechod mezi vloženou DNA a přilehlou genomovou DNA. Oligonukleotid je hybridizován io k jednořetězcovému PCR produktu z požadované oblasti (jeden primer v oblasti vložené sekvence a druhý v oblasti sousedící genomové DNA sekvence) a inkubován v přítomnosti DNA polymerázy. A I P, sulfurylázy, lucilerázy. apyrázy, adcnosin 5' fosfosullatu (APS) a lueiferinu. Molekuly dN'I P se přidávají individuálně a jejich inkorporace způsobuje vznik světelného signálu, který je měřen. Světelný signál označuje přítomnost sekvence inzert/při lehlá DNA jako výsledek i* úspěšné amplifikace, hybridizace a reakce prodlužující oligonukleotid o jednu nebo více bází.
Fluorescenční polarizace, metoda popsaná autory' Chen et al., (Genomc Res. 9:492 - 498, 1999). jc metoda, která může být použita pro detekci vzniku arnplikonu podle vynálezu. V této metodě je oligonukleotid navržen tak, že zahrnuje přechod mezi vloženou DNA a přilehlou genomovou
2o DNA. Oligonukleotid je hybridizován k jednořetězcovému PCR produktu z požadované oblasti (jeden primer v oblastí vložené sekvence a druhý v oblasti sousedící genomové DNA sekvence) a inkubován v přítomnosti DNA polymerázy a fluorescenčně značených molekul ddNTP, Reakce prodlužu jící oligonukleotid o jednu bázi vkládá značený ddNTP. Vkládání bází může být stanoveno jako změna polarizace pomoeí fluorometru, Změny v polarizaci indikují přítomnost sekven25 ce inzert/při lehlá DNA jako výsledek úspěšné amplifikace, hybridizace a reakce prodlužující oligonukleotid o jednu bázi.
Jako metoda detekce a kvantifikace přítomnosti DNA sekvence je popsána metoda Taqman (PE Applied Biosystcms, Foster City, CA) a je podrobně popsána v manuálu dodávaném výrobcem.
5(i Pouze stručně, oligonukleotidová FRET proba je navržena tak, že zahrnuje přechod mezi vloženou DNA a přilehlou genomovou DNA. FRET proba a PCR primery (jeden primer v oblasti vložené sekvence a druhý v oblasti sousedící genomové DNA sekvence) jsou podrobeny teplotnímu cyklování v přítomnosti termostabilní polymerázy a dNTP. Hybridizace FRET proby způsobuje odštěpení a uvolnění fluorescenční sondy z těla sondy zhášející fluorescenci FRET (5 proby. fluorescenční signál indikuje přítomnost sekvence inzert/při lehlá DNA jako výsledek úspěšné amplifikace a hybridizace.
Pro detekci sekvence byla popsána metoda „Molecular Beaeons v práci Tvangi, et al., (Nátuře Biotech. 14:303-308, 1996). Pouze stručně, oligonukleotidová FRET proba je navržena tak. že
4o zahrnuje přechod mez i vloženou DNA a přilehlou genomovou DNA. Unikátní struktura FRET proby způsobuje, že její sekundární struktura udržuje v těsné blízkosti fluorescenční oblast a oblast zhášející fluorescenci. FRET proba a PCR primery (jeden primer v oblasti vložené sekvence a druhý v oblastí sousedící genomové DNA sekvence) jsou podrobeny teplotnímu cyklování v přítomnosti termostabilní polymerázy a dNTP. Po úspěšné PCR amplifikaci.
hybridizace FRET proby s cílovou sekvencí způsobuje změnu sekundární struktury FRET proby a tím oddálení fluorescenční oblasti a oblasti fluorescenci zhášející a vzniká tak fluorescenční signál. Fluorescenční signál indikuje přítomnost sekvence inert/přilehlá DNA jako vvsledek úspěšné amplifikace a hybridizace.
5(; Stručný popis obrázků
Obr. I Plazmidová mapa pMON30167 Obr. 2 Plazmidová mapa pMON424l 1 Obr. 3 Plazmidová mapa pMON30139.
-8CZ 300073 B6
Příklady provedení vynálezu
Pro demonstraci příkladů určitých výhodných provedení podle vynálezu jsou uvedeny následující příklady. Pro odborníky v oblasti by mohlo býl přínosem, že techniky popsané v příkladech popisujících reprezentativní přístupy vynálezců, dobře fungují při uplatnění vynálezu a tak mohou být považovány, že tvoří příklady výhodných způsobů pro jejich uplatnění. Nicméně odborníci v oblasti z hlediska prezentovaných popisů si jsou vědomi, že v popsaných specifických provedeních, která jsou uvedena, může být učiněno množství změn se získáním stejného io nebo podobného výsledku bez vybočení z ducha a oblasti vynálezu.
Příklad 1
Transgenní rostliny pšenice byly vytvořeny Jgroóč/e/ťnz/w-zprostředkovanou transformací pšeničných embryí metodou popsanou v práci Cheng et al. (Plant Physiol. 115:971 - 980. 197) s využitím binárních vektoru vynálezu a modifikovaných podmínek pro glyfosátovou selekci podle práce Zhou et al.. (Plant Cell Rep. 15:159 - 13, 1995). Odborníkům v oblasti transformace pšenice jsou známé další metody, jako je „genová pistole (gene gun) nebo „částicové ostřelová2o ní (partije hombardment), které mohou být použity pro vložení expresních kazet vynálezu do genomu pšeničných buněk. T-DNA konstrukci pMON30139 (Obr. 3) obsahuje dvě expresní kazety, které dohromady zapříčiňují vysokou míru tolerance vůči glyfosátovým herbicidům. První transgenní expresní kazeta obsahuje DNA sekvence promotoru a intronu actin 1 z rýže (P-Os.Actl a l-Os.Actl, US 5 641 876, zde začleněn tímto odkazem) funkčně napojenou na DNA sekvenci kódující EPSPS chloroplastovou tranzitní peptidovou sekvenci zArubidopsis thaliana (TS-At.EPSPS:CTP2. Klec ct at„ Mol. Gen. Genet. 210:47-442, 1987. zde začleněno tímto odkazem), funkčně napojenou na DNA sekvenci kódující glyfosát rezistentní 5-enol-pynivvlšikimát-3-fosfát syntézu (EPSPS) izolovanou z Agrobac/erium tumefaciens sp. kmen CP4 (gen AGRTU.aroA, US 5 633 435, zde začleněn tímto odkazem), funkčně napojenou na DNA at sekvenci transkripčního terminátoru nopalin syntézy (T-AGRTU.nos, Fraley et al.. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80:4803 -4807, 1983. zde začleněno tímto odkazem). Druhá transgenní expresní kazeta obsahuje DNA sekvenci z 35S promotoru mozaikového viru květáku obsahujícího tandemový duplikát oblasti cnhanceru (P CaMV.35S:en, Kay el al„ Science 236:1299- 1302. 1987; US 5 164 316, zde začleněn tímto odkazem) funkčně napojenou na DNA sekvenci I lsp70 intronu z rostliny Ze a mays (l-Zm.Hsp70, US 5 424 412, zde začleněn tímto odkazem), funkčně napojenou na DNA sekvenci kódující EPSPS chloroplastovou tranzitní peptidovou sekvenci z Arahidopsis thaliana (TS-At.FPSPS:CTP2, Klee et al., Mol. Gen. Genet. 210:47 442, 1987) funkčně napojenou na DNA sekvenci kódující glyfosát rezistentní 5-enol-pyruvylshikiinát-3fosfát syntézu (EPSPS) izolovanou z Agrobacleriwn tumefacíens sp. kmen CP4 (AGRTU.aroA,
US 5 633 435) funkčně napojenou na DNA sekvenci transkripčního terminátoru nopalin syntézy (l-AGRTU.nos, Fraley et al., Proe. Nati. Acad. Sci. USA 80:4803 - 4807. 1983).
pMON30167 (obr. I) je samostatná expresní kazeta identická s první transgenní expresní kazetou konstruktu pMON30139 popsanou výše. pMON42411 (obr. 2) je samostatná expresní kazeta identická s druhou transgenní expresní kazetou konstruktu pMON30139 popsanou výše.
Po inkubací pšeničných buněk s buňkami Agrobacterium obsahujícími konstrukty pMON4241 U pMON30167 a pMON3()l39, byly vůči glyfosátu tolerantní transgenní pšeničné kalusy selektovány na médiu, které obsahovalo 2 mM glyfosát, po dobu jednoho týdne, dále přeneseny do diferenciačního média s 0.1 mM glyfosátem na dobu dvou týdnů a nakonec přeneseny do regeneračního média o obsahu gly fosátu 0,22 mM a 0,1 μΜ koncentrací aromatických aminokyselin.
Transformací buněk konstrukty pMON42411, pM()N30167 a pMON30139 bylo získáno 284 případů. Rostliny s konstrukty pMON30I67 a pMON3()139 byly postříkány jednou glyfosáto55 vým herbicidem (Roundup Ultra ) v množství 474 μΙ na m (64 uncí na akr) za účelem vybrat
-9CZ 300073 B6 linie s vegetativní a reprodukční tolerancí vůči glyfosátovemu herbicidu (tabulka 1). Rostliny s konstruktem pMON4241 I byly postříkány dvakrát glyfosátovým herbicidem. Selekce transformovaných pšeničných rostlin s konstrukty pMON42411 a pMON30167 obsahujícími jednu expresní kazetu poskytla malé procento rostlin pšenice s jak vegetativní tak reprodukční tolerancí (1,4 % a 3,2 % respektive). Pouze 3 zc 134 rostlin obsahujících tyto konstrukty vykazovaly přijatelnou hladinu tolerance vůči glyfosátovemu herbicidu. Naproti tomu mezi transformovanými rostlinami pšenice obsahující konstrukt pMON30139 s dvojicí expresních kazet bylo vysoké procento rostlin (16 %) s jak vegetativní tak reprodukční tolerancí (24/150).
tu Případ pšenice 33391 (dále označován jako rostlina pšenice 33391 nebo pšenice 33391 se zahrnutím všech částí rostliny a osiva této rostliny ) byl vybrán ze 150 transgenních případů, které vznikly na základě transformace konstruktem pMON30139. Z této populace bylo vybráno 24 případů, které vykazovaly lepší vegetativní a reprodukční toleranci vůči glyfosátu. Těchto 24 případů bylo dále testováno z hlediska agronomiekých vlastností a z hlediska přítomnosti jednoho b intaktního inzertu. Z této populace případů byla vybrána pšenice 33391. Skleníkové a polní testování pšenice 33391 a potomků odvozených od pšenice 33391 neznačilo, že transgenní inzerce zajišfuje toleranci vůči glyfosátu. která převyšuje komerční specifikace plné vegetativní a reprodukční tolerance na 84 mg/m (340 g na akr, 840 g gly fosátu na hektar: 32 oz Roundup Ultra na akr) glyfosátu s dvojnásobnou hranicí spolehlivosti, pokud je glyfosát aplikován ve cn stádiu 3-5 listů.
Tabulka č. 1 Srovnání účinnosti přítomnosti jedné a dvou expresních kazet pro zajištění tolerance vůči glyfosátu u pšenice
| pMON# | počet testovaných případů | počet případů s vegetativní tolerancí | Počet případů s vegetativní tolerancí a reprodukční tolerancí |
| 42411 | 71 | 26 | 1 (1,4%) |
| 30167 | 63 | 4 | 2 (3.5%) |
| 30139 | 150 | 104 | 24(16%) |
Příklad 2
Izolace odpovídajících sekvencí přiléhajících k inzertu / pšeničného genomu je možno provádět so množstvím metod známých v oboru (například s použitím ligovanýeh adaptérů a ..dvoukolové“ (nested) PCR, jak je popsáno v kitu Genome Walker (CloneTech Laboratories, lne., Palo Alto, CA)). Genomová DNA pšenice 33391 byla izolována purifikační metodou CTAB (Rogers et af. Platit Mol Biol 5:69-76, 1985). Rcagencie jsou komerčně dostupně (viz například Sigma Chemical Co.. St. Louis, MO). DNA knihovny genomu pro amplifíkaci byly připraveny podle přiloženého manuálu (Genome Walker. CloneTech Laboratories, lne., Palo Alto, CA). Genomová DNA byla v oddělených reakcích štěpena přes noc při teplotě 37 °C následujícími restrikěními endonukleázami produkujícími tupé konce (blunt end endonucleascs): Dral. EcoRV, Pvull, Seal a Stul (Cloně Pech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). Reakční směs byly extrahovány extra kě ní směsí fenol: chloroform. DNA byla přec i pilová na přídavkem etanolu do vodné fáze, centrifugována za vytvoření peletu a resuspendována v pufru Tris-EDTA (10 mM Tris-HCl. pil 8.0. 1 mM EDTA). Purifikované fragmenty genornové DNA s tupými konci bylv ligovány k adaptorům Genome Walker podle přiloženého manuálu. Po ligaei adaptorů ke fragmentům genornové DNA byla každá reakce ukončena zahříváním na teplotu 70 °C po dobu 5 min a poté 1 Okřát naředčna v pufru Tris-EDTA. Jeden mikrolitr ligaěních produktů byl poté amplifikován v reakci o objemu 50 μΙ podle výrobcem doporučeného postupu s použitím adaptér-specifických oligonukleotidů (dodaných výrobcem) a oligonukleotidů specifických vůči transgenu pšenice
- 10CZ 300073 Bó
33391, jako je SEQ ID č. 1, která přisedá blízko 5' konce P Os.ActE PCR směs obsahovala 1 μΐ odpovídající ligované DNA knihovny, 1 μί 10 μΜ adaptorového Genome Wolker primeru API dodávaného výrobcem (5ΌΤΑTATCGACTCACTATAGGGC3'. SEQ ID č. 11). 1 μί ΙΟμΜ oligonukleotidů specifického vůči transgenu pšenice 33391 (SEQ ld č. 1), 1 μί 10 mM deoxy> ribonukleotidů. 5 μί lOx koncentrovaného PCR pufru obsahujícího MgCE, 0,5 μΙ (2.5 jednotek) Taq DNA polymerázy (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) a byla doplněna vodou do objemu 50 μΙ. PCR reakce byly prováděny v termocykleru s využitím řízení teploty výpočtem a za následujících podmínek cyklů: 1 cyklus při 94 °C 1 minutu: 7 cyklů (94 '( 2 sekundy. 70 °C 3 minuty): 37 cyklů (94 °C 2 sekundy, 65 °C 3 minuty); 1 cyklus 65 °C io 10 minut. Jeden mikrolitr každé reakční smčsi by l poté amplífikován v druhé amplifikaci s využitím „nested“ adaptér-specífiekých oligonukleotidů (dodaných výrobcem) a „nested“ oligonukleotidů specifických vůči transgenu. jako je SEQ Id. č. 2, která přisedá na P-Os.Actl nad (upstream) příměrem použitým v první reakci (ve smyslu směru přepisu DNA řetězce). PCR směs pro druhou PCR obsahovala 1 μΐ odpovídajících primárních PCR produktů, 1 μΙ 10 μΜ adaptorového i? Genome Walker primeru AP2 dodávaného výrobcem (5'ACTATAGGGCACGCG 1GGT3', SEQ ID č. 12). I μί 10 μΜ oligonukleotidů specifického vůči transgenu pšenice 33391 (SEQ ld č. 2), 1 μΙ lOmM deoxyribonukleotidů, 5 μΙ lOx koncentrovaného PCR pufru obsahujícího MgCE, 0,5 μΐ (2,5 jednotek) Taq DNA polymerázy (Boehringer Mannheim Biochemicals. Indianapolis. IN) a byla doplněna vodou do objemu 50 μί. PC R reakce bvly opět prováděny
2o v termocykleru s využitím řízení teploty výpočtem a za následujících podmínek cyklů: 1 cyklus při 94 °C 1 minutu: 7 cyklů (94 °C 2 sekundy. 70 °C 3 minuty); 31 cyklů (94 °C 2 sekundy, 65 °C 3 minuty); I cyklus 65 °C 10 minut, PCR produkty představující 5' oblast, která zahrnuje spojení mezi transgenním inzertem pšenice 33391 a přilehlou sousední genomovou sekvencí, byly následně purifíkovány pomocí agarózové elektroforézy s následnou izolací DNA zagaró25 zovélio gelu s využitím kitu QlAquick Gel Extraction Kit (kat. č. 28704, Qiagen lne., Valeneia, CA) a poté přímo klonovány do vektoru pGEM-T Easy (kat. č. A1360, Promega. Madison, Wl). Identita klonovaného PCR produktu byla potvrzena DNA sekvenční analýzou (ABI Přisni 377. PE Biosystems, Poster City. C’A a software pro analýzu sekvence DNASTAR. DNASTAR lne., Madison, Wl).
Podobně byla amplifikována ke transgenu pšenice 33391 na 3' konci přilehlá sousední genomová sekvence a klonována s využitím „nested genově specifických primerů SEQ ID č. 3 a SEQ ID č. 4, které přisedají k transkripčnímu terminátoru T nos. Při inzerci transgenu do genomu u pšenice 33391 jsou přítomny dva transkripční terminátory T-nos. jeden uvnitř konstruktu a druhý na 3' konci konstruktu v sousedství sekvence genomu pšenice. PCR produkty této reakce byly sekvenovány a srovnáním se známou sekvencí konstruktu pMON30139 byly od sebe odlišeny produkt zahrnující spojení mezi transgenním inzertem a přilehlou sousední genomovou sekvencí a produkt interního T-nos.
4ii Pro pšenici 33391 byla zjištěna k inzertu přilehlá sousedící sekvence genomu pšenice na obou stranách inzertu sekvenovánírn amplifikačních produktů získaných pomocí systému Genome Walker a přiřazena ke známé sekvenci transgenu. Na 5' konci místa inzerce transgenu byla určena sekvence segmentu 399 párů bází (bp) v okolí místa inzerce, fento segment se sestává /257 bp genomové sekvence pšenice (nukléótidóvé báze I 257 za SEQ ID č. 5), 93 bp nosné sekvence vektoru (nukléótidóvé báze 258 350 ze SEQ ID č. 5) a 49 bp 5' konce promotoru Acl 1 z rýže (nukléótidóvé báze 251-399 ze sekvence SEQ ID č, 5). Podobně byla charakterizována sekvence segmentu 431 bp na 3' konci místa inzerce transgenu (SEQ ID č. 6). Ta začíná 32 bp ze sekvence iranskripčního terminátoru T-nos (nukléótidóvé báze 1-32 ze sekvence SEQ ID č, 6), pokračuje 68 bp nosné sekvence vektoru (nukléótidóvé vaze 33-100) a končí 331 bp sekvence genomu pšenice přiléhající k inzerčnímu místu transgenu (nukléótidóvé báze 101-431 ze sekvence SEQ ID č. 6). Byla provedena identifikace pšenice 33391 s využitím PCR amplifikace oblasti inzerce transgen/genom pomocí jednoho primeru ze sekvence transgenu a druhého primeru z oblasti pšeničné genomové DNA přilehlé ke transgenu. PCR amplifikaci DNA. že amplikon 5' oblasti inzerce transgenu do genomu je specifický pro pšenici 33391. Tato identifikace byla
-IIC.7. 300073 Bó ukázána pro PCR amplikon s využitím primerů 5 (SEQ ID č. 7) a primerů 6 (SEQ ID é. 8). Další příměrové sekvence mohou být navrženy na základě DNA sekvence SEQ IDe, 5, sjejich použitím vzniknou amplíkony $ odlišnou délkou DNA než při použiti primem 5 a primerů 6. ale stále charakteristické pro pšenici 33391 a její potomky. Zde záleží na zkušenostech a umění molekulárních biologii rostlin, jak vybrat DNA sekvence primerů ze SEQ IDč. 5 a najít stringentní podmínky pro vznik amplikonu. Podobně odborníci v oblasti mohou vybrat DNA sekvence primerů ze SEQ ID ě, 6, které budou generovat amplikony charakteristické pro pšenicí 33391. Do oblasti vynálezu spadá, že DNA sekvence primerů odvozené na základě sekvencí SEQ ID č. 5 a SEQ ID é. 6 mohou být použity pro izolaci do genomu přidané DNA molekuly z rostlin pšenice io 33391, jejího osiva a rostlinných částí metodami zde popsanými nebo metodami známými v oblasti molekulární biologie rostlin. Tyto do pšeničného genomu přidané DNA molekul} mohou být izolovány metodou, která využívá jakoukoliv část s dostatečnou délkou DNA sekvence popsané SEQ ID č. 5 a SEQ IDe. ó aby byla použitelná jako primer nebo proba. Tyto do pšeničného genomu přidané DNA molekuly mohou být využity jako molekulární markéry charakteristické pro pšenici 33391.
DNA sekvence, které zahrnují oblast spojení genomové DNA pšenice 33391 a inzertu pMON30139. a jsou obsaženy v SEQ ID ě. 5 a SEQ ID č, 6. mohou být použity jako proby pro hybridizační reakci za účelem identifikace DNA pšenice 33391. Například DNA molekula použitelná jako proba navržená na základě sekvence SEQ ID č. 5 muže zahrnovat nukleotidovou sekvenci 245-270 nebo sekvenci k ní komplementární; DNA molekula použitelná jako proba navržená na základě sekvence SEQ ID č. 6 může zahrnovat nukleotidovou sekvenci 87- 113 nebo sekvenci k ní komplementární. Odborníci v oblastí mohou vybrat kratší nebo delší nukleotidové sekvence než uvedené sekvence lak. že překrý vají oblast spojení a jsou využitelné jako specifické
DNA proby nebo primery pro pšenici 33391 /a vysoce stringentních podmínek.
Jako kontrola pro podmínky PCR reakce (tabulka 2) a kontrola kvality extrahované genomové DNA pšenice 33391 slouží amplikon generovaný při použití primerů 7 (SEQ ID č, 9) a primerů 8 (SEQ ID č. 10). který reprezentuje DNA fragment o délce asi 400 bp z pšeničného genu acetyl so CoA karbo.xytázy (Jcc), endogenního genu pšeničného genomu v jedné kopii. Kontroly pro tyto analýzy by měly zahrnovat pozitivní kontrolu / pšenice 33391, negativní kontrolu z pšenice, která není pšenice 33391. a negativní kontrolu, která jako templát neobsahuje DNA pšenice, jak je ukázáno v tabulce 2, Pro testování na přítomnost amplikonú charakteristických pro pšenici
33391 může být použit termocykler Stratagene Roboeycler, MJ Engine. Perkin-Elmcr 9700 nebo
Eppendorf Mastcreycler Gradient thermocyeler. jak je ukázáno v tabulce 3, nebo metody přístroje známé v dané oblasti.
Tabulka č. 2 PCR procedura a PCR reakční směs pro potvrzení přítomnosti 5' oblasti spojení transgenu a genomové DNA u pšenice 33391
| Krok 1 | Reagencie | Množství | Poznámka |
| 1 | voda bez nukleázy | doplnit do objemu 20 μΙ | - |
| 2 | 10x konc. reakční pufr (s MgCl2) | 2,0 μΙ | konečná koncentrace pufru je 1x, u MgCI21,5mM |
| 3 | 10 mM roztok dATP, dCTP, dGTP adTTP | 0,4 μΙ | konečná koncentrace pro každý dNTPje 200 μΜ |
| 4 | primer 5 (SEQ ID Č7) (rekonstituován v 1xTE pufru nebo vodě bez nukleázy na koncentraci 10 μΜ) | 0,4 μΙ | konečná koncentrace je 0,2 μΜ |
| 5 | primer 6 (SEQ ID č.8) (rekonstituován v 1xTE pufru nebo vodě bez nukleázy na koncentraci 10 μΜ) | 0,4 μΙ | konečná koncentrace je 0,2 μΜ |
- 12CZ 300073 B6
Pokračování tabulky č. 2
| 6 | primer 7 (SEQ ID č.9) (rekonstituován v 1xTE pufru nebo vodě bez nukleázy na koncentraci 10 μΜ) | 0,2 μΙ | konečná koncentrace je 0,1 μΜ |
| 7 | primer 8(SEQ IDč,10) (rekonstituován v 1xTE pufru nebo vodé bez nukleázy na koncentraci 10 μΜ) | 0,2 μΙ | konečná koncentrace je 0,1 μΜ |
| 8 | RNáza bez DNázové aktivity (500ng/pl) | 0,1 μΙ | 50 ng na reakci |
| 9 | REDTaq DNA polymeráza (1 jednotka na mikrolitr) | 1,0 μΙ I | 1 jednotka na reakcí doporučeno změnit pipetu před dalším krokem |
| 10 | Extrahovaná DNA (templát) • analyzované vzorky • jednotlivé listy • směs více listů (max. 50 listů v jedné směsi) • negativní kontrola • negativní kontrola • pozitivní kontrola | • 10-200 ng genomové DNA • 200 ng genomové DNA • 50 ng pšeničné genomové DNA (ne pšenice 33391) • žádný DNA templát • 50 ng genomové DNA pšenice 33391 |
Tabulka č. 3 Navržené parametry PCR reakce pro různé termoevklery
PCR směs je nutno jemné promíchat a pokud je potřeba (ne u termocyklerů se zahřívaným víčkem) přidat I až 2 kapky minerálního oleje na hladinu každé reakce. Dále je možno provést PCR s následujícími parametry cyklu u Stratagene Robocycler, MJ Engine. Perkin-Elmer 9700 nebo LppendorťMastercyelcr Gradient thermocyclcr.
Poznámka: MJ Engine nebo Eppendorf Mastercycler Gradient thermocycler by měly být ui spuštěny v módu počítání teploty. U termocyklerů Perkin-Elmer 9700 je nutno nastavit rychlost nástupu teploty na maximum.
| Počet cyklu | Nastaveni: Stratagene Robocycler |
| 1 | 94 °C 3 minuty |
| 38 | 94 °C 1 minuta 63 ĎC 1 minuta 72 °C 90 sekund |
| 1 | 72 5C 10 minut |
| Počet cyklů | Nastavení: MJ Engine nebo Perkin-Elmer 9700 |
| 1 | 94 °C 3 minuty |
| 38 | 94 °C 10 sekund 63 °C 30 sekund 72 °C 1 minuta |
| 1 | 72 °C 10 minut |
| Počet cyklů | Nastavení: Eppendorf Mastercycler Gradient |
| 1 | 94 °C 3 minuty |
| 38 | 94 °C 15 sekund 63 °C 15 sekund 72 °C 1 minuta |
| 1 | 72 °C 10 minut |
- 13CZ 300073 B6
Příklad 3
Exprese proteinu EPSPS glyfosátové rezistence (CP4 EPSPS) z genu aroA:CP4 muže být dete5 kována imunologickými metodami (Rogen et al.. Food Control 10:407-414. 1999, zde začleněno tímto odkazem) v extraktech rostlinných tkání. Jsou vyvíjeny imunologické metodiky jako je western blot, stripové testy a testy ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) ke specifické detekci exprese proteinu z genu aroA:CP4. který je obsažen v expresním vektoru transformovaném do rostlin. Reageneie. které zahrnují polyklonální a monoklonální protilátky specifické pro in CIM EPSPS. jsou komerčně dostupné u firmy Strategie Diagnostics (Nwark. DL). C'P4 EPSPS muže být detekován v proteinových extraktech rostlin pšenice 33391. rostlinných částí a osiva imunologickými metodami včetně ELISA.
U ELISA testu je 100 ng monoklonální protilátky anti-CP4 EPSPS na jamku mikrotitrační destičky naředěné ve 100 pl 50 mM uhličitanového pufru pH 9.6 ponecháno adsorbovat přes noc při teplotě 4°C. Jamka je promyta pufrem PBS-T (PBS (phosphate buffered salinc) pil 7,4 s 0,05% Tween-20). Tkáň je /homogenizována v PBS pomocí třecí misky a paličky nebo jiného vhodného zařízení. Ilomogenát je přidán do jamek mikrotitrační destičky a inkubován po dobu 2 hodin při teplotě 37 QC. Jamka je třikrát promyta PBS-T. Podle jednoho způsobu je sekundární
2o protilátka, purifíkovaná králičí anti CP4 EPSPS. naředěna na dostatečnou koncentraci, aby byla zajištěna dostatečná hladina k zajištění specifické vazby na protein CP4 EPSPS, a inkubována v jamce při teplotě 37 °C po dobu jedné hodiny. Podle druhého způsobu je použita jako sekundární protilátka kozí protilátka anti-CP4 EPSPS. Do jamky je přidána monoklonální protilátka (1:4000 naředěna v PBS) proti králičím nebo proti kozím imunoglobulínum IgG (Sigma Corp, St
Louis MO) a inkubována při 37 °C 30 minut. Jamka je třikrát promyta PBS-T. Dále je v jamce po dobu 15 min při teplotě 37 °C inkubována křenová peroxidáza konjugovaná savidincm (NeutrAvidin Horseradish Peroxidase) naředěna 1:10000 stabilizačním roztokem StabilZyme HRP-stabilizer (SurModics, Eden Prairie, MN), Jamka je třikrát promyta PBS-T. Do jamky je nakonec na 10 minut přidán substrát 1MB (Kirkegaard and Perry, Gaithersburg. MD), poté je so reakce ukončena 3 M fosforečnou kyselinou. Jamky jsou odečítány pomocí čtečky mikrodestiček „mikroplate rcaderu při vlnové délce 450 mn a referenční vlnové délce 650 nm. l ato metoda je příklad ELISA testu vhodného pro detekci CP4 EPSPS a není uvažována jako jediná ELISA metoda, která může být použita pro detekci CP4 EPSPS, odborníci v oblasti ELISA metod mohou navrhnout varianty metody pro specifický detekční test dostatečně citlivý pro detekci CP4
EPSPS v extraktech rostlinných tkání.
Pomocí ELISA metody je u pšenice 33391 vyrostlé na poli detekována průměrná hladina proteinu CP4 EPSPS 58.2 ± 8.4 pg/g v rozmezí 45,5 až 72,4 pg/g. vztaženo na hmotnost čerstvé tkáně (fwt, fresh wighl tissue), zatímco u netransgenních rostlin sklizených z. pole není detekovatelná hladina proteinu CP4 EPSPS. hladina nepřesahuje detekční limit testu LUISA 0.9pg/g fwt. Tkáň zrní pšenice 33391 obsahuje průměrně 12.6 ± 2,5 pg/g v rozmezí 9.5 až 17,6 pg/g fwt proteinu CP4 EPSPS. u netransgcnní kontroly není detekovatelná hladina proteinu C’P4 EPSPS, hladina nepřesahuje detekční limit testu ELISA 0,9pg/g fwt. ELISA. nebo další imunologické metody, může být použita jako diagnostický test pro detekci proteinu CP4 EPSP pšenice 33391, protože pšenice 33391 a její potomci je jediná pšenice tolerantní vůči glyfosátu registrovaná agenturou USDA (United States Department of Agriculture). která exprímuje protein CIM EPSPS.
Pšenice 33391, Monsanto Company, zde popsané a uvedené v přiložených nárocích, byla uložena v Americké sbírce typů kultur (American Type Culture Colleetion, ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110 dle Budapešťské smlouvy. Registrační ATCC číslo je PTA2347. Depozit bude uchováván v depozitáři po dobu 30 ti let nebo 5 let po posledním požadavku nebo po dobu účinnosti patentu, kteréhokoliv, který trvá delší dobu, a může být během této doby přemístěn, pokud to bude nezbytné.
- 14CZ 300073 Bó
Odborníkům v oblasti by melo být z ilustrací a popsaných principů vynálezu zřejmé, že vy nález může být modifikován v uspořádání a detailech bez odchýlení se od principu. Předmětem nároků jsou všechny modifikace, které spadají do oblasti a duchu připojených nároků.
Všechny publikace a publikované patentové dokumenty zde citované jsou zde začleněny těmito odkazy se stejným obsahem, jako kdyby každá individuální publikace nebo přihláška vynálezu byla specificky a individuálně označena, že je uvedena jako odkaz.
SEZNAM SEKVENCÍ <110> Monsanto Technology LLC Chen. Guilan í lironaka, Catherine Zhou, Hua- Ping < 120> : Rostlina pšenice 33391 tolerantní ke glyfosátu a kompozice a způsoby její detekce <I30> 38-21 (52232)A- MOBT:226P <140> 60/236653 a 60/236653 <141> 2000-09 29 <160> 12 <170> Palentln verze 3.0 <210> 1 <211> 32 (o <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 cgactcaaat acagatatgc atttccaaaa gc 35 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 2 gactatcccg actctcttct caagcatatg <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 3 catgtaatgc atgacgttat ttatgag <21O> 4 <21l> 30 <212> DNA <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 4 atcqcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga 30 <210> 5 <211> 399 <212> DNA <213 > vykonstruovaná sekvence <220>
<221> misc_znak <222> (1)...(399) <22 3 > ch i měrní sekvence genomu pšenice a transgenní inzert <400> 5
| atcgcgcgcg | gtgtcatcta | tgttactaga | tcggggatat | ccccagcttg | atggggatca | 60 |
| gattgtcgtt | tcccgccttc | agtttaaact | atcagtgttt | aaataat tga | tagaacctca | 120 |
| aataattatg | acgatgtcca | ggcaccgatc | aatacatagg | catcacgtcg | aagattagta | 180 |
| gatcgaagat | tagtagactg | acgatgtcca | ggcactgatc | aatacatagg | gatcggggat | 240 |
| aaccaaatta | ctgttgggca | attgatagaa | cctcaaataa | ttatgacgat | gtccaggcac | 300 |
| tgatcaatac | ataggeatea | cgtcgaagat | tagtagaccg | actccttcct | gcatctacta | 360 |
| ctattactcc | acacatcgac | agttatccag | catacatcta | gtgtattaag | ttcatggaaa | 420 |
| aacggaaatg | c | 431 |
<210> 6 <211> 431 <212> DNA <213> vykonstruovaná sekvence <220>
<221> mise znak <222> (1)...(431) <223> ehimerní sekvence genomu pšenice a transgenní inzert <400> 6
| atcgcgcgcg | gtgtcatcta | tgttactaga | tcggggatat | ccccagcttg | atggggatca | 60 |
| gattgtcgtt | tcccgccttc | agtttaaact | atcagtgttt | aaataattga | tagaacctca | 120 |
| aataattatg | acgatgtcca | ggcactgatc | aatacatagg | catcacgtcg | aagattagta | 180 |
| gatcgaagat | tagtagactg | acgatgtcca | ggcactgatc | aatacatagg | gatcggggat | 240 |
| aaccaaatta | ctgttgggca | attgatagaa | cctcaaataa | t tatgaegat | gtccaggcac | 300 |
| tgatcaatac | ataggeatea | cgtcgaagat | tagtagaccg | actccttcct | gcatctacta | 360 |
| ctattactcc | acacatcgac | agttatccag | catacatcta | gtgtattaag | ttcatggaaa | 420 |
| aacggaaatg | c | 431 |
- 16CZ 300073 B6 io
2l) <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Triticum acstivum <400> 7 cgatcagaag aggagccaaa aacc <2IO> 8 <21l> 26 <212> DNA <213> Orvza sativa <400> 8 cgactcaaat acagatatgc atttcc <2IO> 9 <21I> 24 <212> DNA <213> Triticum acstivum <400> 9 cataatggga ggcatgcttc gctg <210> 10 <21 í> 24 <2I2> DNA <213> Tricitum asctivum <400> 10 ccggttctca ctgctatctg caac <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> vykonstruovaná sekvence <220>
<221> misc_znak 4o <222> (1)...(22) <223> zcela vykonstruovaná sekvence <400> 11 gtatatcgac teactatagg gc <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> vykonstruovaná sekvence <220>
<221> misejmak <222> (1)...(19) <223> zcela vykonstruovaná sekvence
- 17C.7. 300073 B6 <400> 12 actatagggc acgcgtggt 19
Claims (15)
- PATENTOVÉ NÁROKY ίο 1. Způsob vylepšení tolerance vůči glyfosátu li rostliny pšenice, vyznačující se tím, že zahrnuje:(i) získáni DNA konstruktu obsahujícího první a druhou expresní kazetu, kde první expresní kazeta obsahuje funkčně spojené (i) promotor rýžového aktinu 1: (ii) intron rýžového aktinu 1; (iii) DNA molekulu kódující chloroplastový tranzitní peptid: (iv) DNA molekulu kódující protein is EPSPS zajištující toleranci vůči glyfosátu: a (v) DNA molekulu s funkcí iranskripčního terminátoru, a druhá expresní kazeta obsahuje funkčně spojené (i) promotor CaMV 35S; (ii) intron Hsp70; (iii) DNA molekulu kódující chloroplastový tranzitní peptid; (iv) DNA molekulu kódující protein EPSPS zajišťující toleranci vůči glyfosátu; a (v) DNA molekulu s funkcí iranskripčn ího terminátoru; a20 (2) transformaci pšeničných buněk DNA konstruktem; a (3) regeneraci pšeničných buněk v rostlinu pšenice; a (4) vystavení těchto rostlin pšenice ošetření účinnou dávkou gly fosátu; a (5) selekci fertilit ích rostlin pšenice, které vykazují vegetativní a reprodukční toleranci vůči glyfosátu.
- 2? za stringenlníeh podmínek s DNA molekulou SEQ ID č. 6: a (e) vystavení vzorku a proby stringentním hybridizačním podmínkám; a detekci hybridizace proby s cílovou DNA.2. Buňka rostliny pšenice tolerantní vůči glyfosátu získaná způsobem podle nároku I.
- 3. Buňka rostliny pšenice tolerantní vůči glyfosátu podle nároku 2, vyznačující se tím, že obsahuje SEQ ID č. 5 a SEQ ID č. ó.
- 4. DNA molekula izolovaná z buňky rostliny pšenice tolerantní vůči glyfosátu podle nároku 3 obsahující nukleotidovou sekvenci identifikovanou jako SEQ ID č. 5.
- 5. DNA molekula izolovaná z buňky rostliny pšenice tolerantní vůči glyfosátu podle nároku 355 obsahující nukleotidovou sekvenci identifikovanou jako SEQ ID č. 6.5 o
- 6. Dvojice molekul DNA primerů obsahující první a druhou DNA molekulu, kde první DNA molekula obsahuje 8 nebo více následujících nukleotidů z nukleotidů 1257 ze SEQ ID č, 5 nebo ze sekvence k ní komplementární, a druhá DNA molekula obsahuje 8 nebo více následujících •tu nukleotidů /.nukleotidů 258-399 ze SEQ ID č. 5 nebo ze sekvence k ní komplementární, a použitím dvojice molekul DNA primerů při amplifikací DNA vzniká amplikon charakteristický pro DNA extrahovanou z rostliny pšenice 33391 tolerantní vůči gly fosátu nebo jejích potomků.
- 7. Dvojice molekul DNA obsahující první a druhou DNA molekulu, kde první DNA molekula45 obsahuje 8 nebo více následujících nukleotidů z nukleotidů 101-431 ze SEQ ID č. 6 nebo ze sekvence k ní komplementární tak. aby mohl být použit jako primer, a druhá DNA molekula obsahuje 8 nebo více následujících nukleotidů z nukleotidů 1-100 ze SEQ ID č, 6 nebo ze sekvence k ní komplementární tak. aby mohl být použit jako primer, a použitím dvojice DNA molekul při amplifikací DNA vzniká amplikon charakteristický pro DNA extrahovanou z rostliny so pšenice 33391 tolerantní vůči glyfosátu nebo jejích potomků.
- 8. Způsob detekce přítomnosti DNA molekuly charakteristické pro rostlinu pšenice .33391 tolerantní vůči glydosáhl nebo její potomky, vyznačující se t í m . žc zahrnuje:- 18’ (a) extrakcí vzorku DNA z dané rostliny pšenice 33391 nebo potomků osiva a rostlin nebo z částí rostlin: a (b) uvedení vzorku DNA do styku s dvojicí molekul DNA příměrů podle nároku 6 nebo nároku 7; a * (c) provedení DNA amplifikační reakce za vzniku amplikonové DNA molekuly: a (d) detekci amplikonové DNA molekulv.
- 9. Způsob podle nároku 9. vyznačující sc tím. že molekuly DNA příměrů jsou SEQ ID č. 7 a SEQ ID č. 8.io
- 10. Způsob detekce přítomnosti DNA molekuly SEQ ID č. 5 ve vzorku DNA, vyznačující se t í m . že zahrnuje:(a) extrakci vzorku DNA z rostliny pšenice:(b) kontakt vzorku DNA s molekulou DNA. která zahrnuje oblast spojení genomové DNA i* pšenice 33391 a DNA inzertu SEQ ID č. 5, kde molekula DNA je DNA proba. která hybridizujc za stringenlníeh podmínek s DNA molekulou SEQ ID č. 5: a (c) vystavení vzorku a proby stringentním hybridizačním podmínkám: a detekci hybridizace proby s c í 1 o voli DNA, zo ll.
- Způsob detekce přítomnosti DNA molekuly SEQ ID č. 6 ve vzorku DNA. vyznačující se t í m , že zahrnuje:(a) extrakci vzorku DNA z rostliny pšenice:(b) kontakt vzorku DNA s molekulou DNA, která zahrnuje oblast spojení genomové DNA pšenice 33391 a DNA inzertu SEQ ID č. 6. kde molekula DNA je DNA proba. která hybridizujc
- 12. Způsob šíření vlastnosti tolerance vůči glyfosátu do rostlin pšenice, vyznačující se ?o tím, že zahrnuje:a) křížení potomka pšenice 33391 tolerantní vůči glyfosátu s rostlinou pšenice, která není tolerantní vůči glyfosátu: ab) produkci potomků křížení rostlin pšenice: ac) extrakci vzorku DNA z potomků rostlin pšenice;55 d) kontakt DNA vzorku s markerovou molekulou nukleové kyseliny, která hybridizujc s SEQ ID č. 5 nebo SEQ ID č. 6 nebo s jejich komplementárními sekvencemi; ae) provedení metody MAB (markér assisíed brceding) pro vlastnost tolerance vůči glyfosátu, kde tolerance vůči glyfosátu je geneticky vázána ke komplemenlu markerové molekuly nukleové kyseliny.4o
- 13. DNA detekční kit. vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu DNA molekulu obsahující 8 nebo více následujících nukleotidů komplementárních k SEQ ID č. 5 nebo SEQ IDč. 6, která má funkci DNA primeru nebo proby specifické pro rostliny pšenice 33391 a jejich potomky.
- 14. Buňka pšeničné rostliny tolerantní ke glyfosátu obsahující v buněčném gen oni u začleněnou inzertní DNA molekulu kódující EPSPS rezistentní vůči glyfosátu a DNA obsahující SEQ ID č. 5, SEQ ID č. 6 nebo celé jejich komplementy.- 19CZ 300073 Bó
- 15. Buňka rostliny pšenice podle nároku 14, vyznačující se tím, že buňka rostliny pochází ze vzorových semen rostliny pšenice označené 33391. které byly uloženy v A I CC pod přístupovým číslem PTA-2347.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US23676200P | 2000-09-29 | 2000-09-29 | |
| US23665300P | 2000-09-29 | 2000-09-29 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2003629A3 CZ2003629A3 (cs) | 2003-08-13 |
| CZ300073B6 true CZ300073B6 (cs) | 2009-01-21 |
Family
ID=26929984
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20030629A CZ300073B6 (cs) | 2000-09-29 | 2001-09-25 | Zpusob vylepšení tolerance vuci glyfosátu u rostliny pšenice, její bunka, její DNA, dvojice molekulDNA primeru, zpusoby její detekce, zpusob šírení vlastnosti tolerance vuci glyfosátu u rostlin, DNAdetekcní kit |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6689880B2 (cs) |
| EP (1) | EP1322773A2 (cs) |
| AR (2) | AR030812A1 (cs) |
| AU (2) | AU9304401A (cs) |
| CA (1) | CA2420406C (cs) |
| CZ (1) | CZ300073B6 (cs) |
| PL (1) | PL214848B1 (cs) |
| WO (1) | WO2002027004A2 (cs) |
Families Citing this family (185)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR122013026754B1 (pt) | 2000-06-22 | 2018-02-27 | Monsanto Company | Molécula de dna e processos para produzir uma planta de milho tolerante à aplicação do herbicida glifosato |
| CN101508996B (zh) | 2002-07-18 | 2012-01-11 | 孟山都技术有限公司 | 利用人工的多核苷酸及其组合物来减少转基因沉默的方法 |
| MX336070B (es) | 2003-01-31 | 2016-01-07 | Monsanto Technology Llc | Eventos de alfalfa tolerantes a glifosato y metodos para su deteccion. |
| AR044219A1 (es) * | 2003-04-14 | 2005-09-07 | Temasek Life Sciences Lab | Deteccion de transgenes de organismos geneticamente modificados mediante piroluminiscencia |
| WO2005041669A1 (en) * | 2003-10-28 | 2005-05-12 | Washington State University Research Foundation | Suppression of foliar and soilborne pathogens |
| PT1708560E (pt) | 2003-12-15 | 2015-06-03 | Monsanto Technology Llc | Planta de milho mon88017 e composições e métodos para a sua detecção |
| EP1718663B1 (en) * | 2004-01-20 | 2011-07-13 | Monsanto Technology, LLC | Chimeric promoters for use in plants |
| BRPI0509541A (pt) | 2004-03-30 | 2007-09-18 | Monsanto Technology Llc | métodos para controlar agentes patógenos de planta utilizando n-fosfonometilglicina |
| US20070197474A1 (en) * | 2004-03-30 | 2007-08-23 | Clinton William P | Methods for controlling plants pathogens using N-phosphonomethylglycine |
| FR2878532B1 (fr) * | 2004-11-26 | 2007-03-02 | Genoplante Valor Soc Par Actio | Methode d'adressage d'acides nucleiques vers des plastes |
| PT1885176T (pt) | 2005-05-27 | 2016-11-28 | Monsanto Technology Llc | Evento mon89788 de soja e métodos para a sua deteção |
| BRPI0711376A2 (pt) * | 2006-05-12 | 2011-11-01 | Commw Scient Ind Res Org | enzimas para degradação de herbicidas |
| US20080064032A1 (en) * | 2006-09-13 | 2008-03-13 | Syngenta Participations Ag | Polynucleotides and uses thereof |
| KR101597376B1 (ko) | 2008-02-15 | 2016-02-26 | 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 | 트랜스제닉 계통 ｍｏｎ８７７６９에 상응하는 대두 식물 및 종자, 및 그의 검출 방법 |
| WO2010024976A1 (en) | 2008-08-29 | 2010-03-04 | Monsanto Technology Llc | Soybean plant and seed corresponding to transgenic event mon87754 and methods for detection thereof |
| WO2010037016A1 (en) | 2008-09-29 | 2010-04-01 | Monsanto Technology Llc | Soybean transgenic event mon87705 and methods for detection thereof |
| US8618360B2 (en) * | 2009-03-30 | 2013-12-31 | Monsanto Technology Llc | Rice transgenic event 17314 and methods of use thereof |
| US10555527B2 (en) | 2009-05-18 | 2020-02-11 | Monsanto Technology Llc | Use of glyphosate for disease suppression and yield enhancement in soybean |
| US8816156B2 (en) | 2010-06-04 | 2014-08-26 | Monsanto Technology Llc | Transgenic Brassica event MON 88302 and methods of use thereof |
| CN103270173B (zh) | 2010-10-12 | 2017-11-21 | 孟山都技术公司 | 对应于转基因事件mon87712的大豆植物和种子及其检测方法 |
| AR088363A1 (es) | 2011-10-18 | 2014-05-28 | Dow Agrosciences Llc | MATERIALES Y METODOS PARA LA DETECCION DEL EVENTO pDAB4472-1606 QUE CONTIENE EL GEN ARILOXIALCANOATO DIOXIGENASA (AAD-12) EN PLANTAS |
| EP2806739A1 (en) | 2012-01-25 | 2014-12-03 | Bayer Intellectual Property GmbH | Active compound combinations containing fluopyram and biological control agent |
| EP2676536A1 (en) | 2012-06-22 | 2013-12-25 | AIT Austrian Institute of Technology GmbH | Method for producing plant seed containing endophytic micro-organisms |
| UA119532C2 (uk) | 2012-09-14 | 2019-07-10 | Байєр Кропсайєнс Лп | Варіант hppd та спосіб його застосування |
| AR093909A1 (es) | 2012-12-12 | 2015-06-24 | Bayer Cropscience Ag | Uso de ingredientes activos para controlar nematodos en cultivos resistentes a nematodos |
| UA121195C2 (uk) | 2013-02-05 | 2020-04-27 | Юніверсіті Оф Саскатчеван | Застосування ендофіта або його культури для обробки злакових культур |
| CN110172466A (zh) | 2013-03-07 | 2019-08-27 | 巴斯夫农业解决方案种子美国有限责任公司 | 毒素基因及其使用方法 |
| AR095867A1 (es) | 2013-04-19 | 2015-11-18 | Bayer Cropscience Ag | Método para una utilización mejorada del potencial de producción de plantas transgénicas |
| TW201507722A (zh) | 2013-04-30 | 2015-03-01 | Bayer Cropscience Ag | 做為殺線蟲劑及殺體內寄生蟲劑的ｎ－（２－鹵素－２－苯乙基）－羧醯胺類 |
| WO2014177514A1 (en) | 2013-04-30 | 2014-11-06 | Bayer Cropscience Ag | Nematicidal n-substituted phenethylcarboxamides |
| CA2916678C (en) | 2013-06-26 | 2024-02-06 | Symbiota, Inc. | Seed-origin endophyte populations, compositions, and methods of use |
| US10136646B2 (en) | 2013-06-26 | 2018-11-27 | Indigo Ag, Inc. | Agricultural endophyte-plant compositions, and methods of use |
| DK3041338T3 (da) | 2013-09-04 | 2020-03-16 | Indigo Ag Inc | Landbrugsmæssige endofytplantesammensætninger og fremgangsmåder til anvendelse |
| BR112016007566A2 (pt) | 2013-10-09 | 2017-09-12 | Monsanto Technology Llc | evento de milho transgênico mon87403 e métodos para a detecção do mesmo |
| CA2929487C (en) | 2013-11-06 | 2021-03-09 | The Texas A & M University System | Fungal endophytes for improved crop yields and protection from pests |
| US9364005B2 (en) | 2014-06-26 | 2016-06-14 | Ait Austrian Institute Of Technology Gmbh | Plant-endophyte combinations and uses therefor |
| WO2015100432A2 (en) | 2013-12-24 | 2015-07-02 | Symbiota, Inc. | Method for propagating microorganisms within plant bioreactors and stably storing microorganisms within agricultural seeds |
| US10271554B2 (en) | 2013-12-24 | 2019-04-30 | Ait Austrian Institute Of Technology Gmbh | Plants containing beneficial endophytes |
| MX2016011745A (es) | 2014-03-11 | 2017-09-01 | Bayer Cropscience Lp | Variantes de hppd y metodos de uso. |
| AU2015278238B2 (en) | 2014-06-20 | 2018-04-26 | The Flinders University Of South Australia | Inoculants and methods for use thereof |
| WO2015200902A2 (en) | 2014-06-26 | 2015-12-30 | Symbiota, LLC | Endophytes, associated compositions, and methods of use thereof |
| EP4151733A1 (en) | 2014-11-14 | 2023-03-22 | BASF Plant Science Company GmbH | Modification of plant lipids containing pufas |
| EP3240391A4 (en) | 2014-12-30 | 2018-07-11 | Indigo Agriculture, Inc. | Seed endophytes across cultivars and species, associated compositions, and methods of use thereof |
| BR112017023549A2 (pt) | 2015-05-01 | 2018-07-24 | Indigo Agriculture Inc | composições de endófito complexo isolado e métodos para melhorar características de planta. |
| CN108271340A (zh) | 2015-05-01 | 2018-07-10 | 靛蓝农业公司 | 用于改进的植物性状的经过设计的复合内生菌组合物和方法 |
| EP3097782A1 (en) | 2015-05-29 | 2016-11-30 | Bayer CropScience Aktiengesellschaft | Methods for controlling phytopathogenic nematodes by combination of fluopyram and biological control agents |
| CA2988764A1 (en) | 2015-06-08 | 2016-12-15 | Indigo Agriculture, Inc. | Streptomyces endophyte compositions and methods for improved agronomic traits in plants |
| KR20180043838A (ko) | 2015-09-11 | 2018-04-30 | 바이엘 크롭사이언스 악티엔게젤샤프트 | Ｈｐｐｄ 변이체 및 사용 방법 |
| CN105219767B (zh) | 2015-10-09 | 2018-02-13 | 上海交通大学 | 大豆转化事件shzd32‑01及其应用方法 |
| AU2016378742A1 (en) | 2015-12-21 | 2018-07-12 | Indigo Ag, Inc. | Endophyte compositions and methods for improvement of plant traits in plants of agronomic importance |
| WO2017198451A1 (en) * | 2016-05-17 | 2017-11-23 | Bayer Cropscience Nv | Method for increasing yield in small grain cereals such as wheat and rice |
| CN118256514A (zh) | 2016-11-23 | 2024-06-28 | 巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司 | Axmi669和axmi991毒素基因及其使用方法 |
| EP3547827A1 (en) | 2016-12-01 | 2019-10-09 | Indigo AG, Inc. | Modulated nutritional quality traits in seeds |
| EP3558006A1 (en) | 2016-12-23 | 2019-10-30 | The Texas A&M University System | Fungal endophytes for improved crop yields and protection from pests |
| AR110756A1 (es) | 2017-01-18 | 2019-05-02 | Bayer Cropscience Lp | Uso de bp005 para el control de patógenos de planta |
| CN110431234B (zh) | 2017-01-18 | 2024-04-16 | 巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司 | Bp005毒素基因及其使用方法 |
| WO2018160244A1 (en) | 2017-03-01 | 2018-09-07 | Indigo Ag, Inc. | Endophyte compositions and methods for improvement of plant traits |
| MX2019010349A (es) | 2017-03-01 | 2019-11-21 | Indigo Ag Inc | Composiciones de endofitos y metodos para mejorar las caracteristicas de las plantas. |
| CA3055317A1 (en) | 2017-03-07 | 2018-09-13 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Hppd variants and methods of use |
| AU2018259162A1 (en) | 2017-04-27 | 2019-11-21 | The Flinders University Of South Australia | Bacterial inoculants |
| US11263707B2 (en) | 2017-08-08 | 2022-03-01 | Indigo Ag, Inc. | Machine learning in agricultural planting, growing, and harvesting contexts |
| WO2019055968A2 (en) | 2017-09-18 | 2019-03-21 | Indigo Ag, Inc. | MARKERS OF VEGETABLE HEALTH |
| EP4273239A3 (en) | 2017-09-22 | 2024-01-24 | Technische Universität Graz | Polymeric particles containing microorganisms |
| BR112020008096A2 (pt) | 2017-10-24 | 2020-11-03 | Basf Se | método para conferir tolerância a um herbicida e planta de soja transgênica |
| BR112020008092A2 (pt) | 2017-10-24 | 2020-09-15 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | método para conferir tolerância a um herbicida e planta de soja transgênica |
| WO2019226938A1 (en) | 2018-05-23 | 2019-11-28 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Fruit-specific promoters |
| WO2021013721A1 (de) | 2019-07-22 | 2021-01-28 | Bayer Aktiengesellschaft | 5-amino substituierte pyrazole und triazole als schädlingsbekämpfungsmittel |
| US20220274947A1 (en) | 2019-07-23 | 2022-09-01 | Bayer Aktiengesellschaft | Novel heteroaryl-triazole compounds as pesticides |
| KR20220038402A (ko) | 2019-07-23 | 2022-03-28 | 바이엘 악티엔게젤샤프트 | 살충제로서의 신규 헤테로아릴-트리아졸 화합물 |
| EP3701796A1 (en) | 2019-08-08 | 2020-09-02 | Bayer AG | Active compound combinations |
| WO2021058659A1 (en) | 2019-09-26 | 2021-04-01 | Bayer Aktiengesellschaft | Rnai-mediated pest control |
| JP2022550564A (ja) | 2019-10-02 | 2022-12-02 | バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト | 脂肪酸を含んでいる活性化合物組み合わせ |
| MX2022004367A (es) | 2019-10-09 | 2022-05-06 | Bayer Ag | Nuevos compuestos de heteroarilo-triazol como pesticidas. |
| BR112022006774A2 (pt) | 2019-10-09 | 2022-06-28 | Bayer Ag | Compostos de heteroaril-triazol inovadores como pesticidas |
| CN114787360B (zh) | 2019-10-14 | 2025-09-16 | 巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司 | 新型昆虫抗性基因和使用方法 |
| EP4045519A4 (en) | 2019-10-14 | 2024-02-28 | Basf Agricultural Solutions Seed Us Llc | NOVEL INSECT RESISTANT GENES AND METHODS OF USE |
| KR20220098170A (ko) | 2019-11-07 | 2022-07-11 | 바이엘 악티엔게젤샤프트 | 동물 해충 방제를 위한 치환된 술포닐 아미드 |
| WO2021097162A1 (en) | 2019-11-13 | 2021-05-20 | Bayer Cropscience Lp | Beneficial combinations with paenibacillus |
| EP4061131A1 (en) | 2019-11-18 | 2022-09-28 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations comprising fatty acids |
| TW202134226A (zh) | 2019-11-18 | 2021-09-16 | 德商拜耳廠股份有限公司 | 作為殺蟲劑之新穎雜芳基-三唑化合物 |
| TW202136248A (zh) | 2019-11-25 | 2021-10-01 | 德商拜耳廠股份有限公司 | 作為殺蟲劑之新穎雜芳基-三唑化合物 |
| AR121242A1 (es) | 2020-01-31 | 2022-05-04 | Pairwise Plants Services Inc | Supresión de la respuesta de escape a la sombra en plantas |
| CN115551839B (zh) | 2020-02-18 | 2024-06-04 | 拜耳公司 | 作为农药的杂芳基-三唑化合物 |
| EP3708565A1 (en) | 2020-03-04 | 2020-09-16 | Bayer AG | Pyrimidinyloxyphenylamidines and the use thereof as fungicides |
| WO2021209490A1 (en) | 2020-04-16 | 2021-10-21 | Bayer Aktiengesellschaft | Cyclaminephenylaminoquinolines as fungicides |
| US20230212600A1 (en) | 2020-04-16 | 2023-07-06 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods for controlling meristem size for crop improvement |
| CN115715290A (zh) | 2020-04-21 | 2023-02-24 | 拜耳公司 | 作为农药的2-(杂)芳基取代的稠杂环衍生物 |
| TWI891782B (zh) | 2020-05-06 | 2025-08-01 | 德商拜耳廠股份有限公司 | 作為殺蟲劑之新穎雜芳基三唑化合物 |
| WO2021224220A1 (en) | 2020-05-06 | 2021-11-11 | Bayer Aktiengesellschaft | Pyridine (thio)amides as fungicidal compounds |
| CN115605462A (zh) | 2020-05-12 | 2023-01-13 | 拜耳公司（De） | 作为杀真菌化合物的三嗪和嘧啶(硫代)酰胺 |
| JP2023529294A (ja) | 2020-05-19 | 2023-07-10 | バイエル、アクチエンゲゼルシャフト、（ディビジョン、クロップサイエンス） | 殺真菌性化合物としてのアザ二環式（チオ）アミド |
| CA3185017A1 (en) | 2020-06-02 | 2021-12-09 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods for controlling meristem size for crop improvement |
| EP4161906A1 (en) | 2020-06-04 | 2023-04-12 | Bayer Aktiengesellschaft | Heterocyclyl pyrimidines and triazines as novel fungicides |
| KR20230024343A (ko) | 2020-06-10 | 2023-02-20 | 바이엘 악티엔게젤샤프트 | 살진균제로서의 아자비시클릴-치환된 헤테로사이클 |
| CA3186972A1 (en) | 2020-06-17 | 2021-12-23 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods for controlling meristem size for crop improvement |
| EP4167738A1 (en) | 2020-06-18 | 2023-04-26 | Bayer Aktiengesellschaft | Composition for use in agriculture |
| CA3187296A1 (en) | 2020-06-18 | 2021-12-23 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-(pyridazin-4-yl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine derivatives as fungicides for crop protection |
| BR112022025692A2 (pt) | 2020-06-19 | 2023-02-28 | Bayer Ag | 1,3,4-oxadiazóis e seus derivados como fungicidas |
| BR112022025710A2 (pt) | 2020-06-19 | 2023-03-07 | Bayer Ag | 1,3,4-oxadiazol pirimidinas e 1,3,4-oxadiazol piridinas como fungicidas |
| UY39276A (es) | 2020-06-19 | 2022-01-31 | Bayer Ag | Uso de compuestos de 1,3,4–oxadiazol–2–ilpirimidina para controlar microorganismos fitopatógenos, métodos de uso y composiciones. |
| UY39275A (es) | 2020-06-19 | 2022-01-31 | Bayer Ag | 1,3,4-oxadiazol pirimidinas como fungicidas, procesos e intermediarios para su preparación, métodos de uso y usos de los mismos |
| EP3929189A1 (en) | 2020-06-25 | 2021-12-29 | Bayer Animal Health GmbH | Novel heteroaryl-substituted pyrazine derivatives as pesticides |
| EP4175961A1 (de) | 2020-07-02 | 2023-05-10 | Bayer Aktiengesellschaft | Heterocyclen-derivate als schädlingsbekämpfungsmittel |
| WO2022033991A1 (de) | 2020-08-13 | 2022-02-17 | Bayer Aktiengesellschaft | 5-amino substituierte triazole als schädlingsbekämpfungsmittel |
| WO2022053453A1 (de) | 2020-09-09 | 2022-03-17 | Bayer Aktiengesellschaft | Azolcarboxamide als schädlingsbekämpfungsmittel |
| WO2022058327A1 (en) | 2020-09-15 | 2022-03-24 | Bayer Aktiengesellschaft | Substituted ureas and derivatives as new antifungal agents |
| EP3974414A1 (de) | 2020-09-25 | 2022-03-30 | Bayer AG | 5-amino substituierte pyrazole und triazole als schädlingsbekämpfungsmittel |
| CN112266419B (zh) * | 2020-10-29 | 2023-02-03 | 中国科学院微生物研究所 | 一种人工合成的抗除草剂蛋白 |
| EP3915971A1 (en) | 2020-12-16 | 2021-12-01 | Bayer Aktiengesellschaft | Phenyl-s(o)n-phenylamidines and the use thereof as fungicides |
| WO2022129188A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Bayer Aktiengesellschaft | 1,2,4-oxadiazol-3-yl pyrimidines as fungicides |
| WO2022129196A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Bayer Aktiengesellschaft | Heterobicycle substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides |
| CN116669554A (zh) | 2020-12-18 | 2023-08-29 | 拜耳公司 | 使用Dhodh抑制剂来防治作物中的抗性植物病原性真菌 |
| WO2022129190A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Bayer Aktiengesellschaft | (hetero)aryl substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides |
| EP4036083A1 (de) | 2021-02-02 | 2022-08-03 | Bayer Aktiengesellschaft | 5-oxy substituierte hetereozyklen, als schädlingsbekämpfungsmittel |
| CN117441015A (zh) | 2021-02-11 | 2024-01-23 | 成对植物服务股份有限公司 | 用于修饰植物中细胞分裂素氧化酶水平的方法和组合物 |
| CA3211121A1 (en) | 2021-02-25 | 2022-09-01 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying root architecture in plants |
| WO2022207496A1 (en) | 2021-03-30 | 2022-10-06 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| BR112023019400A2 (pt) | 2021-03-30 | 2023-12-05 | Bayer Ag | 3-(hetero)aril-5-clorodifluorometil-1,2,4-oxadiazol como fungicida |
| KR20240005019A (ko) | 2021-05-06 | 2024-01-11 | 바이엘 악티엔게젤샤프트 | 알킬아미드 치환된, 환형 이미다졸 및 살충제로서의 이의 용도 |
| CN117651702A (zh) | 2021-05-12 | 2024-03-05 | 拜耳公司 | 作为害虫防治剂的2-(杂)芳基取代的稠合杂环衍生物 |
| CN117897050A (zh) | 2021-06-17 | 2024-04-16 | 成对植物服务股份有限公司 | 大豆中生长调节因子家族转录因子的修饰 |
| UY39827A (es) | 2021-06-24 | 2023-01-31 | Pairwise Plants Services Inc | Modificación de genes de ubiquitina ligasa e3 hect para mejorar los rasgos de rendimiento |
| MX2023014883A (es) | 2021-07-01 | 2024-02-12 | Pairwise Plants Services Inc | Metodos y composiciones para mejorar el desarrollo del sistema radicular. |
| EP4384626A1 (en) | 2021-08-12 | 2024-06-19 | Pairwise Plants Services, Inc. | Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits |
| AU2022326207A1 (en) | 2021-08-13 | 2024-02-15 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations and fungicide compositions comprising those |
| UY39902A (es) | 2021-08-17 | 2023-03-31 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para modificar genes de histidina quinasa receptores de citoquinina en plant |
| MX2024002386A (es) | 2021-08-25 | 2024-03-14 | Bayer Ag | Nuevos compuestos de pirazinil-triazol como pesticidas. |
| US12359215B2 (en) | 2021-08-30 | 2025-07-15 | Pairwise Plants Services, Inc. | Modification of ubiquitin binding peptidase genes in plants for yield trait improvement |
| EP4144739A1 (de) | 2021-09-02 | 2023-03-08 | Bayer Aktiengesellschaft | Anellierte pyrazole als schädlingsbekämpfungsmittel |
| AR126938A1 (es) | 2021-09-02 | 2023-11-29 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para mejorar la arquitectura de las plantas y los rasgos de rendimiento |
| US20230087522A1 (en) | 2021-09-21 | 2023-03-23 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for reducing pod shatter in canola |
| WO2023060028A1 (en) | 2021-10-04 | 2023-04-13 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods for improving floret fertility and seed yield |
| AR127300A1 (es) | 2021-10-07 | 2024-01-10 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos para mejorar la fertilidad de la flor y el rendimiento de semillas |
| WO2023078915A1 (en) | 2021-11-03 | 2023-05-11 | Bayer Aktiengesellschaft | Bis(hetero)aryl thioether (thio)amides as fungicidal compounds |
| WO2023099445A1 (en) | 2021-11-30 | 2023-06-08 | Bayer Aktiengesellschaft | Bis(hetero)aryl thioether oxadiazines as fungicidal compounds |
| UY40060A (es) | 2021-12-09 | 2023-07-14 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos para mejorar la fertilidad de floretes y el rendimiento de semillas |
| AR128372A1 (es) | 2022-01-31 | 2024-04-24 | Pairwise Plants Services Inc | Supresión de la respuesta de evitación de la sombra en las plantas |
| CN118973394A (zh) | 2022-02-01 | 2024-11-15 | 环球化学股份有限公司 | 控制谷物上害虫的方法和组合物 |
| EP4472413A1 (en) | 2022-02-01 | 2024-12-11 | Globachem NV | Methods and compositions for controlling pests |
| US20240327858A1 (en) | 2022-03-02 | 2024-10-03 | Pairwise Plants Services, Inc. | Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits |
| EP4499842A1 (en) | 2022-03-31 | 2025-02-05 | Pairwise Plants Services, Inc. | Early flowering rosaceae plants with improved characteristics |
| EP4504759A1 (en) | 2022-04-07 | 2025-02-12 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving resistance to fusarium head blight |
| US20230383305A1 (en) | 2022-04-21 | 2023-11-30 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving yield traits |
| CA3250526A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-09 | Pairwise Plants Services Inc | PROCESSES AND COMPOSITIONS FOR IMPROVING YIELD AND DISEASE RESISTANCE |
| AU2023264210A1 (en) | 2022-05-03 | 2024-10-31 | Bayer Aktiengesellschaft | Use of (5s)-3-[3-(3-chloro-2-fluorophenoxy)-6-methylpyridazin-4-yl]-5-(2-chloro-4-methylbenzyl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine for controlling unwanted microorganisms |
| US20250304566A1 (en) | 2022-05-03 | 2025-10-02 | Bayer Aktiengesellschaft | Crystalline forms of (5s)-3-[3-(3-chloro-2-fluorophenoxy)-6-methylpyridazin-4-yl]-5-(2-chloro-4-methylbenzyl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine |
| CA3250542A1 (en) | 2022-05-05 | 2023-11-09 | Pairwise Plants Services Inc | METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODIFYING ROOT ARCHITECTURE OR IMPROVING PLANT YIELD PROPERTIES |
| UY40326A (es) | 2022-06-27 | 2023-12-29 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para modificar el escape a la sombra en plantas |
| US20240000031A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement |
| EP4547693A1 (en) | 2022-06-29 | 2025-05-07 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement |
| CN119768514A (zh) | 2022-08-04 | 2025-04-04 | 成对植物服务股份有限公司 | 用于改善产量性状的方法和组合物 |
| AR130164A1 (es) | 2022-08-11 | 2024-11-13 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para controlar el tamaño del meristema para la mejora de los cultivos |
| US20240090466A1 (en) | 2022-09-08 | 2024-03-21 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving yield characteristics in plants |
| WO2024068520A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| WO2024068518A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-heteroaryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| WO2024068519A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| WO2024068517A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| EP4295688A1 (en) | 2022-09-28 | 2023-12-27 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combination |
| EP4385326A1 (en) | 2022-12-15 | 2024-06-19 | Kimitec Biogorup | Biopesticide composition and method for controlling and treating broad spectrum of pests and diseases in plants |
| AU2023408197A1 (en) | 2022-12-19 | 2025-06-26 | Basf Agricultural Solutions Us Llc | Insect toxin genes and methods for their use |
| US20240279673A1 (en) | 2023-02-16 | 2024-08-22 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying shade avoidance in plants |
| AR132019A1 (es) | 2023-03-02 | 2025-05-21 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para modificar la evitación de la sombra en plantas |
| AR132071A1 (es) | 2023-03-09 | 2025-05-21 | Pairwise Plants Services Inc | Modificación de genes de la vía de señalización de brasinoesteroide para mejorar rasgos de rendimiento en plantas |
| UY40746A (es) | 2023-05-18 | 2024-12-13 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para mejorar las características de rendimiento de las plantas |
| WO2025008446A1 (en) | 2023-07-05 | 2025-01-09 | Bayer Aktiengesellschaft | Composition for use in agriculture |
| WO2025008447A1 (en) | 2023-07-05 | 2025-01-09 | Bayer Aktiengesellschaft | Composition for use in agriculture |
| AR133164A1 (es) | 2023-07-18 | 2025-09-03 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para modificar la arquitectura radicular en plantas |
| AR133310A1 (es) | 2023-07-27 | 2025-09-17 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para modificar rasgos de rendimiento de las plantas |
| WO2025026738A1 (en) | 2023-07-31 | 2025-02-06 | Bayer Aktiengesellschaft | 6-[5-(ethylsulfonyl)-1-methyl-1h-imidazol-4-yl]-7-methyl-3-(pentafluoroethyl)-7h-imidazo[4,5-c]pyridazine derivatives as pesticides |
| EP4501112A1 (en) | 2023-08-01 | 2025-02-05 | Globachem NV | Plant defense elicitors |
| WO2025026815A1 (en) | 2023-08-01 | 2025-02-06 | Globachem Nv | Insecticidal mixtures |
| WO2025031668A1 (en) | 2023-08-09 | 2025-02-13 | Bayer Aktiengesellschaft | Azaheterobiaryl-substituted 4,5-dihydro-1h-2,4,5-oxadiazines as novel fungicides |
| WO2025032038A1 (en) | 2023-08-09 | 2025-02-13 | Bayer Aktiengesellschaft | Pyridazin-4-yloxadiazines as novel fungicides |
| AR133901A1 (es) | 2023-09-21 | 2025-11-12 | Pairwise Plants Services Inc | Plantas de frambuesa negra de floración temprana con características mejoradas |
| WO2025078128A1 (en) | 2023-10-11 | 2025-04-17 | Bayer Aktiengesellschaft | Pyridazin-3-one-4-yloxadiazines as novel fungicides |
| WO2025080600A1 (en) | 2023-10-11 | 2025-04-17 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving crop yield traits |
| WO2025098876A1 (en) | 2023-11-10 | 2025-05-15 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations having insecticidal/acaricidal properties |
| WO2025098874A1 (en) | 2023-11-10 | 2025-05-15 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations having fungicidal/insecticidal/acaricidal properties |
| WO2025098875A1 (en) | 2023-11-10 | 2025-05-15 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations having insecticidal/acaricidal properties |
| WO2025168620A1 (en) | 2024-02-07 | 2025-08-14 | Bayer Aktiengesellschaft | Heteroaryl-substituted 4,5-dihydro-1h-2,4,5-oxadiazines as novel fungicides |
| WO2025178902A1 (en) | 2024-02-22 | 2025-08-28 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving yield characteristics in plants |
| WO2025186065A1 (en) | 2024-03-05 | 2025-09-12 | Bayer Aktiengesellschaft | Heteroaryl-substituted (aza)quinoxaline derivatives as pesticides |
| WO2025190927A1 (en) | 2024-03-14 | 2025-09-18 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations having insecticidal/acaricidal properties |
| EP4652843A1 (en) | 2024-05-21 | 2025-11-26 | Kimitec Biogroup S.L | Biopesticide composition, procedure of obtain thereof, and method for controlling and treating broad spectrum of pests in plants |
| EP4652842A1 (en) | 2024-05-21 | 2025-11-26 | Kimitec Biogroup S.L | Biopesticide composition, procedure of obtain thereof, and method for controlling and treating broad spectrum of pests, diseases and weeds in plants |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5633435A (en) * | 1990-08-31 | 1997-05-27 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases |
| US5948956A (en) * | 1997-10-16 | 1999-09-07 | Oms Investments, Inc. | Transgenic plants and method for node segment transformation |
| WO1999046396A2 (en) * | 1998-03-09 | 1999-09-16 | Monsanto Company | Glyphosate as a gametocide |
| CZ20012203A3 (cs) * | 2000-06-22 | 2002-02-13 | Monsanto Technology Llc | Kukuřice PV-ZMGT32(nk603)a DNA kompozice a způsoby detekce její přítomnosti |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6777589B1 (en) * | 1990-01-22 | 2004-08-17 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| AU782561B2 (en) * | 1999-09-16 | 2005-08-11 | Monsanto Technology Llc | Plant regulatory sequences for control of gene expression |
-
2001
- 2001-09-25 CZ CZ20030629A patent/CZ300073B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-09-25 EP EP01973471A patent/EP1322773A2/en not_active Withdrawn
- 2001-09-25 PL PL365885A patent/PL214848B1/pl unknown
- 2001-09-25 AU AU9304401A patent/AU9304401A/xx active Pending
- 2001-09-25 US US09/682,597 patent/US6689880B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-09-25 WO PCT/US2001/029902 patent/WO2002027004A2/en not_active Ceased
- 2001-09-25 CA CA2420406A patent/CA2420406C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-09-25 AU AU2001293044A patent/AU2001293044B2/en not_active Expired
- 2001-09-28 AR ARP010104580A patent/AR030812A1/es active IP Right Grant
-
2003
- 2003-12-04 US US10/727,423 patent/US7268274B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-12-16 US US10/737,487 patent/US7071325B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2008
- 2008-11-12 AR ARP080104938A patent/AR069294A2/es active IP Right Grant
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5633435A (en) * | 1990-08-31 | 1997-05-27 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases |
| US5948956A (en) * | 1997-10-16 | 1999-09-07 | Oms Investments, Inc. | Transgenic plants and method for node segment transformation |
| WO1999046396A2 (en) * | 1998-03-09 | 1999-09-16 | Monsanto Company | Glyphosate as a gametocide |
| CZ20012203A3 (cs) * | 2000-06-22 | 2002-02-13 | Monsanto Technology Llc | Kukuřice PV-ZMGT32(nk603)a DNA kompozice a způsoby detekce její přítomnosti |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20040133940A1 (en) | 2004-07-08 |
| US7071325B2 (en) | 2006-07-04 |
| WO2002027004A2 (en) | 2002-04-04 |
| US6689880B2 (en) | 2004-02-10 |
| CA2420406A1 (en) | 2002-04-04 |
| PL214848B1 (pl) | 2013-09-30 |
| US20020062503A1 (en) | 2002-05-23 |
| AR030812A1 (es) | 2003-09-03 |
| WO2002027004A3 (en) | 2002-12-05 |
| AU9304401A (en) | 2002-04-08 |
| AR069294A2 (es) | 2010-01-13 |
| EP1322773A2 (en) | 2003-07-02 |
| CA2420406C (en) | 2014-12-09 |
| US20040133939A1 (en) | 2004-07-08 |
| CZ2003629A3 (cs) | 2003-08-13 |
| PL365885A1 (en) | 2005-01-10 |
| US7268274B2 (en) | 2007-09-11 |
| AU2001293044B2 (en) | 2006-07-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ300073B6 (cs) | Zpusob vylepšení tolerance vuci glyfosátu u rostliny pšenice, její bunka, její DNA, dvojice molekulDNA primeru, zpusoby její detekce, zpusob šírení vlastnosti tolerance vuci glyfosátu u rostlin, DNAdetekcní kit | |
| US7807357B2 (en) | Cotton event PV-GHGT07(1445) and compositions and methods for detection thereof | |
| CN1753998B (zh) | 棉花事件mon88913及其组合物和检测方法 | |
| ES2564464T3 (es) | Evento PV-ZMGT32 (nk603) en maíz y composiciones y procedimientos para la detección del mismo | |
| AU2001293044A1 (en) | Glyphosate tolerant wheat plant 33391 and compositions and methods for detection thereof | |
| AU2017284519B2 (en) | Nucleic acid sequence for detecting existence of transgenic soybean event DBN9004 in biological sample, kit containing same and detection method therefor | |
| AU2002215363A1 (en) | Cotton event PV-GHGT07(1445) and compositions and methods for detection thereof | |
| WO2017215327A1 (zh) | 用于检测除草剂耐受性大豆植物dbn9008的核酸序列及其检测方法 | |
| WO2016173540A1 (zh) | 除草剂耐受性玉米植物dbn9888及用于检测其的核酸序列和方法 | |
| US20040009504A1 (en) | Cotton event pv-ghgto7(1445) and compositions and methods for detection thereof | |
| WO2016173539A1 (zh) | 除草剂耐受性玉米植物dbn9868及用于检测其的核酸序列和方法 | |
| RU2712730C2 (ru) | Растение кукурузы dbn9858, устойчивое к гербициду, и нуклеотидная последовательность и способ для ее выявления | |
| CN116694815B (zh) | 转基因大豆事件lp012-2及其检测方法 | |
| CN116694814B (zh) | 转基因大豆事件lp012-1及其检测方法 | |
| ZA200301081B (en) | Glyphosate tolerant wheat plant 33391 and compositions and methods for detection thereof. | |
| ME00840B (me) | Dnk sekvence vezane za kukuruzni transformant pv-zmgt 32 (nk 603) i preparati i metode za njegovu detekciju |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20210925 |