PL214848B1

PL214848B1 - Sposób wytwarzania tolerancyjnej na glifosat rosliny pszenicy, plodna tolerujaca glifosat roslina pszenicy, nasiono pszenicy, para czasteczek DNA, sposób wykrywania obecnosci diagnostycznej czasteczki DNA, sposób wykrywania sekwencji zawierajacej okreslone nukleotydy, sposób wytwarzania rosliny pszenicy z tolerancja glifosatu, zestaw do wykrywania DNA, nasiono transgenicznej pszenicy, roslina pszenicy wytworzona przez hodowle nasion, sposób wytwarzania rosliny pszenicy tolerujacej stosowanie glifosatu, sposób selektywnego kontrolowania chwastów na polu zawierajacym uprawe pszenicy, czasteczka DNA, roslina pszenicy tolerujaca glifosat, roslina zdolna do wytwarzania diagnostycznego amplikonu, nasiono, komórka

Info

Publication number: PL214848B1
Application number: PL365885A
Authority: PL
Inventors: Guilan Chen; Catherine M. Hironaka; Hua-Ping Zhou
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2000-09-29
Filing date: 2001-09-25
Publication date: 2013-09-30
Also published as: CA2420406C; AR069294A2; PL365885A1; US7268274B2; WO2002027004A3; US7071325B2; WO2002027004A2; US6689880B2; AU2001293044B2; US20040133940A1; US20040133939A1; US20020062503A1; CA2420406A1; CZ300073B6; AU9304401A; EP1322773A2; AR030812A1; CZ2003629A3

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania tolerancyjnej na glifosat rośliny pszenicy oraz płodna tolerująca glifosat roślina pszenicy oraz nasiono pszenicy wytworzone tym sposobem. Niniejszy wynalazek dotyczy także pary cząsteczek DNA, sposobu wykrywania obecności diagnostycznej cząsteczki DNA dla tolerującej glifosat rośliny pszenicy, sposobu wykrywania sekwencji zawierającej określone nukleotydy a także sposobu wytwarzania rośliny pszenicy z tolerancją glifosatu, zestawu do wykrywania DNA, nasiona transgenicznej pszenicy i rośliny pszenicy wytworzonej przez hodowlę powyższego nasiona. Ponadto, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rośliny pszenicy tolerującej stosowanie glifosatu, sposób selektywnego kontrolowania chwastów na polu zawierającym uprawę pszenicy, cząsteczka DNA, oraz roślina pszenicy tolerująca glifosat, a także roślina, nasiono, komórka zdolne do wytwarzania diagnostycznego amplikonu.

Pszenica jest ważną uprawą oraz podstawowym źródłem pożywienia w wielu rejonach świata. Dla polepszenia cech agronomicznych i jakościowych pszenicy stosowane są metody biotechnologiczne. Jedną z takich agronomicznych cech jest tolerancja na herbicyd, a zwłaszcza tolerancja na herbicyd glifosatowy. Cecha ta w pszenicy nadawana jest przez ekspresję transgenu w roślinach pszenicy (Zhou i wsp., Plant Cell rep. 15:159-163, 1995). Ekspresja obcych genów w roślinach jest znana jako taka, na którą ma wpływ ich pozycja chromosomalna, czasem wynikającą z budowy chromatyny (np., heterochromatyny) lub sąsiedztwa transkrypcyjnych elementów regulacyjnych (np. wzmacniaczy) blisko miejsca integracji (Weising i wsp., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988). Z tego powodu, jest często koniecznym przebadanie dużej liczby przypadków w celu zidentyfikowania przypadku charakteryzującego się optymalną ekspresją włączonego pożądanego genu. Na przykład, obserwowano w roślinach i w innych organizmach, że pomiędzy przypadkami może istnieć szeroka zmienność w poziomach ekspresji wprowadzonego genu. Mogą także istnieć różnice w przestrzennym i czasowym wzorcu ekspresji, na przykład, różnice we względnej ekspresji transgenu w różnych tkankach roślinnych, co może nie pokrywać się z wzorcami spodziewanymi z transkrypcyjnych elementów regulacyjnych obecnych we wprowadzonym konstrukcie genowym. Z tego powodu, powszechnym jest wytwarzanie setek do tysięcy różnych przypadków i badanie tych przypadków w celu wykrycia tego jednego przypadku mającego pożądane poziomy ekspresji transgenu i wzorca, dla celów handlowych. Przypadek posiadający pożądane poziomy lub wzorzec ekspresji transgenu jest użyteczny do introgresji tego transgenu do innego tła genetycznego poprzez płciowe krzyżowanie zewnętrzne (sexual outcrossing), stosując konwencjonalne metody hodowli. Potomstwo takich krzyżówek podtrzymuje charakterystykę ekspresji transgenu oryginalnego transformanta. Strategia ta jest stosowana dla zapewnienia pewnej ekspresji genu w wielu odmianach, które są lepiej zaadaptowane do miejscowych warunków wzrostu.

Korzystnym byłaby możliwość wykrywania obecności poszczególnych przypadków w celu określenia czy potomstwo krzyżówki płciowej zawiera poszukiwany transgen. Ponadto, sposób wykrywania poszczególnych przypadków byłby pomocny do spełniania przepisów regulujących wydawanie zezwolenia wstępnego i znakowania żywności pochodzącej na przykład z upraw roślin rekombinowanych. Możliwym jest wykrycie obecności transgenu każdą dobrze znaną metodą wykrywania kwasu nukleinowego taką jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) lub hybrydyzacją DNA stosując sondy kwasów nukleinowych. Te sposoby detekcji generalnie skupiają się na często stosowanych elementach genetycznych, takich jak promotory, terminatory, geny markerowe, itp. W wyniku, metody te mogą być nieużyteczne do rozróżniania pomiędzy różnymi przypadkami, zwłaszcza tymi które są produkowane przez stosowanie tego samego konstruktu DNA, chyba że sekwencja chromosomalnego DNA przyległego do wprowadzonego („DNA flankujące”) jest znana. Specyficzne w stosunku do danego przypadku, badanie PCR jest dyskutowane, na przykład przez Windels i wsp., (Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent 64/5b:459-462, 1999), który identyfikował metodą PCR przypadek soi 40-3-2 z tolerancją glifosatu, stosując zestaw starterów sprzęgających wiązanie pomiędzy insertem i DNA flankującym, zwłaszcza starter, który zawierał sekwencję z tego insertu i drugi starter, który zawierał sekwencję flankującego DNA.

Wynalazek niniejszy dotyczy polepszonej rośliny pszenicy 33391 (Triticum aestivum) z tolerancją na glifosatowy herbicyd i DNA roślinnego konstruktu ekspresji rośliny pszenicy 33391 oraz wykrywania regionu insertu transgenowo/genomowowego u pszenicy 33391 i jej potomstwa.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania tolerancyjnej na glifosat rośliny pszenicy polegający na tym, że zawiera etapy, w których:

PL 214 848 B1 (1) uzyskuje się konstrukt DNA zawierający pierwszą i drugą kasetę ekspresji, przy czym wspomniana pierwsza kaseta ekspresji w operacyjnym połączeniu zawiera:

(i) promotor aktyny 1 ryżu;

(ii) intron aktyny 1 ryżu;

(iii) cząsteczkę DNA kodującą tranzytowy peptyd chloroplastu;

(iv) cząsteczkę DNA kodującą EPSPS z tolerancją glifosatu; i (v) cząsteczkę DNA terminatora transkrypcji; a wspomniana druga kaseta ekspresji zawiera w połączeniu operacyjnym (a) starter CaMV 35S;

(b) intron Hsp70;

(c) cząsteczkę DNA kodującą tranzytowy peptyd chloroplastu;

(d) cząsteczkę DNA kodującą EPSPS z tolerancją glifosatu; i (e) cząsteczkę DNA terminatora transkrypcji; i (2) transformuje się komórki pszenicy wspomnianym konstruktem DNA; i (3) regeneruje się wspomnianą komórkę pszenicy do rośliny pszenicy; i (4) traktuje się wspomnianą roślinę pszenicy skuteczną dawką glifosatu; i (5) wybiera się płodne rośliny pszenicy, które wegetatywnie i reprodukcyjnie tolerują glifosat i zawierają cząsteczkę DNA zawierającą nukleotydy 245-270 SEQ ID nr 5 albo nukleotydy 87-113 SEQ ID nr 6.

Przedmiotem wynalazku jest też płodna tolerująca glifosat roślina pszenicy wytworzona sposobem jak określono powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest nasiono pszenicy wytworzone sposobem jak określono powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest para cząsteczek DNA zawierająca: pierwszą cząsteczkę DNA i drugą cząsteczkę DNA, przy czym pierwsza cząsteczka DNA zawiera 8 sąsiadujących ze sobą nukleotydów od nukleotydu 1 do 257 SEQ ID nr: 5 lub jej pełnego komplementu, a druga cząsteczka DNA zawiera co najmniej 8 sąsiadujących ze sobą nukleotydów od nukleotydu 258 do 399 z SEQ ID nr: 5 lub jej pełnego komplementu, i ta para cząsteczek DNA kiedy jest stosowana w metodzie amplifikacji DNA wytwarza amplikon obejmujący nukleotydy 245-270 o sekwencji SEQ ID nr: 5.

Przedmiotem wynalazku jest para cząsteczek DNA zawierająca: pierwszą cząsteczkę DNA i drugą cząsteczkę DNA, przy czym pierwsza cząsteczka DNA zawiera co najmniej 8 sąsiadujących ze sobą nukleotydów od nukleotydu 1 do 100 z SEQ ID nr: 6 pszenicy lub jej pełnego komplementu, a druga cząsteczka DNA zawiera co najmniej 8 sąsiadujących ze sobą nukleotydów od nukleotydu 101 do 431 z SEQ ID nr: 6 lub jej pełnego komplementu, i ta para cząsteczek DNA kiedy jest stosowana w metodzie amplifikacji DNA wytwarza amplikon obejmujący nukleotydy 87-113 sekwencji SEQ ID nr: 6.

Przedmiotem wynalazku jest też sposób wykrywania obecności diagnostycznej cząsteczki DNA dla tolerującej glifosat rośliny pszenicy zawierającej nukleotydy 245-270 SEQ ID nr: 5 albo nukleotydy 87-113 SEQ ID nr: 6 lub jej potomstwa, polegający na tym, że obejmuje etapy w których:

(a) ekstrahuje się próbkę DNA ze wspomnianej rośliny pszenicy lub jej nasion potomnych i roślin potomnych lub ich części; i (b) dostarcza się cząsteczki DNA startera jak zdefiniowano w powyżej; i (c) zapewnia się warunki amplifikacji DNA; i (d) przeprowadza się wspomnianą reakcję amplifikacji DNA, wytwarzając w ten sposób cząsteczkę DNA amplikonu; i (e) wykrywa się cząsteczkę DNA amplikonu.

Korzystnie wspomniane cząsteczki DNA zawierają SEQ ID nr: 7 i SEQ ID nr: 8.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania sekwencji zawierającej nukleotydy 245-270 SEQ ID nr 5 albo nukleotydy 87-113 SEQ ID nr: 6 w próbce DNA, charakteryzujący się tym, że sposób zawiera etapy, w których:

(a) ekstrahuje się próbkę DNA z rośliny pszenicy;

(b) kontaktuje się próbki DNA z cząsteczką DNA, zawierającą nukleotydy 245-270 z sekwencji SEQ ID nr: 5; lub nukleotydy 87-113 z SEQ ID nr: 6 i (c) poddaje się próbkę i sondę ostrym warunkom hybrydyzacji, i (d) wykrywa się hybrydyzację sondy z tym DNA.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rośliny pszenicy z tolerancją glifosatu polegający na tym, że: zawiera etapy w których:

PL 214 848 B1 (a) krzyżuje się potomstwo pszenicy tolerującej glifosat zawierającej sekwencję zawierającą nukleotydy 245-270 SEQ ID nr 5 albo nukleotydy 87-113 SEQ ID nr 6 z roślinami pszenicy nie tolerującymi glifosatu; i (b) wytwarza się potomstwo roślin pszenicy tej krzyżówki;

(c) ekstrahuje się próbki DNA z potomstwa roślin pszenicy;

(d) kontaktuje się próbki DNA z parą starterów wskazanych powyżej;

(e) przeprowadza się reakcję amplifikacji DNA; i (f) selekcjonuje się potomstwo roślin pszenicy, które produkuje amplikon obejmujący nukleotydy 245-270 z SEQ ID nr: 5 lub nukleotydy 87-113 z SEQ ID nr: 6.

Przedmiotem wynalazku jest zestaw do wykrywania DNA, znamienny tym, że zawiera kontrolę pozytywną dla sekwencji zawierającej nukleotydy 245-270 SEQ ID nr 5 albo nukleotydy 87-113 SEQ ID nr 6; i albo (a) wspomnianą parę starterów jak zdefiniowano w zastrz. 3 lub 4; (b) sondę zawierającą fragmenty sekwencji SEQ ID nr: 5 zawierającą nukleotydy 245-270 o sekwencji SEQ ID nr: 5; albo (c) sondę zawierającą fragmenty sekwencji SEQ ID nr: 6 zawierającą nukleotydy 87-113 o sekwencji SEQ ID nr: 6.

Przedmiotem wynalazku jest nasiono transgenicznej pszenicy zwierające sekwencje zawierającą nukleotydy 245-270 SEQ ID nr 5 albo nukleotydy 87-113 SEQ ID nr 6, przy czym genom wspomnianego nasiona obejmuje insert DNA zawierający dwie kopie cząsteczki DNA kodującego EPSPS z tolerancją glifosatu, gdzie wspomniany insert posiada połączenie 5' z genomowym DNA pszenicy obejmujące SEQ ID nr: 5 oraz posiada połączenie 3' z genomowym DNA pszenicy obejmujące SEQ ID nr: 6.

Przedmiotem wynalazku jest roślina pszenicy, wytworzona przez hodowlę nasion jak zdefiniowano powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rośliny pszenicy tolerującej stosowanie glifosatu, polegający na tym, że zawiera etapy w których:

(a) krzyżuje się płciowo pierwszą roślinę pszenicy zawierającą sekwencję zawierającą nukleotydy 245-270 SEQ ID nr 5 albo nukleotydy 87-113 SEQ ID nr 6 z drugą rośliną pszenicy z brakiem tolerancji na glifosat, wytwarzając przez to mnogość roślin pierwszego pokolenia;

(b) wybiera się roślinę pierwszego pokolenia, (c) doprowadza się do samozapylenia wspomnianą roślinę pierwszego pokolenia, wytwarzając w ten sposób mnogość roślin drugiego pokolenia;

(d) nanosi się herbicyd glifosat na wspomnianą roślinę drugiego pokolenia;

(e) wybiera się ze wspomnianych roślin drugiego pokolenia roślinę tolerującą glifosat.

Przedmiotem wynalazku jest sposób selektywnego kontrolowania chwastów na polu zawierającym uprawę pszenicy, polegający na tym, że zawiera etapy w których:

(a) sadzi się nasiona jak określono w powyżej i (b) nanosi się na uprawę pszenicy i chwasty na polu wystarczającą ilość herbicydu glifosatu dla kontrolowania chwastów bez znacznego uszkadzania uprawy pszenicy.

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka DNA obejmująca SEQ ID nr: 5 lub jej fragment zawierający nukleotydy 245-270 z SEQ ID nr: 5.

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka DNA obejmująca SEQ ID nr: 6 lub jej fragment zawierający nukleotydy 87-113 z SEQ ID nr: 6.

Przedmiotem wynalazku jest roślina pszenicy tolerująca glifosat, której genom zawiera insert DNA zawierający kasetę ekspresyjną kodującą oporną na glifosat syntazę 5-enolopirogronianoszikimowo-3-fosforanową (EPSPS) z Agrobacterium tumefaciens (ARGT) sp. Szczep CP4 i sekwencje połączenia spinające miejsce insertu zawierające nukleotydy 245-270 o SEQ ID nr: 5 i nukleotydy 87113 o sekwencji SEQ ID nr: 6.

Przedmiotem wynalazku jest roślina pszenicy zdolna do wytwarzania diagnostycznego amplikonu obejmującego SEQ ID nr: 5 lub SEQ ID nr: 6.

Przedmiotem wynalazku jest nasiono zdolne do wytwarzania diagnostycznego amplikonu obejmującego SEQ ID nr: 5 lub SEQ ID nr: 6.

Przedmiotem wynalazku jest komórka zdolna do wytwarzania diagnostycznego amplikonu obejmującego SEQ ID nr: 5 lub SEQ ID nr: 6.

Według jednego aspektu, konstrukt DNA jest dostarczany wtedy gdy jego ekspresja zachodzi w komórkach rośliny pszenicy i nadaje roślinie pszenicy polepszoną tolerancję na herbicyd glifosfatowy. Przedstawiono sposoby wytwarzania i selekcjonowania rośliny pszenicy z tolerancją glifosatu,

PL 214 848 B1 zawierającą konstrukt pMON30139. Konstrukt DNA pMON30139 składa się z dwóch transgenicznych kaset ekspresji. Pierwsza kaseta ekspresji stanowi promotor aktyny 1 ryżu (Oryzae sativa) (P-Os.Act1) i intron (I-Os.Act1) operacyjnie związane z sekwencją peptydu tranzytowego chloroplastu EPSPSc (TS-At.EPSPS), związaną operacyjnie z genem (AGRTU.aroA:CP4) kodującym oporną na glifosat syntazę 5-enolopyruviloshikimato-3-fosforanową (EPSPS) wyizolowaną z Agrobacterium tumefaciens (AGRTU) sp. szczepu CP4, operacyjnie związaną z terminatorem transkrypcji syntazy nopaliny (T-AGRTU.nos). Druga kaseta ekspresji transgenu stanowi promotor wirusa mozaiki kalafiora (CaMV)35S (P-CaMV.35S:en) zawierająca tandemowe podwojenie regionu wzmacniacza, operacyjnie związanej z intronem Zea mays Hsp70 (I-Zm.Hsp70), operacyjnie związany z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą sekwencją peptydu tranzytowego chloroplastu Arabidopsis thaliana EPSPS, operacyjnie związaną z genem kodującym oporną na glifosat syntazę 5-enolopyruviloshikimato-3-fosforanową (EPSPS) wyizolowaną z Agrobacterium tumefaciens sp. szczepu CP4, operacyjnie związaną z terminatorem transkrypcji synatazy nopaliny. Te kasety ekspresji są w tandemie i są flankowane przez regiony DNA, które zawierają sekwencje DNA Agrobacterium tumefaciens (RB i LB) jako składniki procesu stosowanego w metodach, w których bierze udział Agrobacterium w celu insercji kaset ekspresji do genomu pszenicy.

Zgodnie z innym aspektem, ujawniono także nasiono pszenicy 33391 zawierające takie cząsteczki DNA, jak złożono w ATCC, pod numerem dostępu #PTA-2347. Ujawnienie dotyczy zatem nasion pszenicy 33391, rośliny pszenicy 33391, części rośliny pszenicy 33391, która zawiera pyłek i komórkę jajową i sposobów wytwarzania polepszonej rośliny pszenicy z tolerancją glifosatu przez skrzyżowanie rośliny pszenicy 33391 z sobą lub inną rośliną pszenicy.

Zgodnie z innym aspektem, przedstawiono także kompozycje i sposoby do wykrywania obecności regionu insertu transgenowo/genomowego z roślin pszenicy 33391 i nasion. Zgodnie z jednym aspektem, dostarczane są cząsteczki DNA, które zawierają co najmniej jeden region insertu transgen/genomowy sekwencji pszenicy 33391 wybrany z grupy zawierającej SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO: 6 i ich komplementów, przy czym sekwencja regionu insercji stanowi połączenie pomiędzy heterologicznym DNA wstawionym w genom pszenicy i DNA z genomu pszenicy flankującego to miejsce insercji i jest diagnostyczny dla tego przypadku. Włączone są sekwencje DNA, które zawierają wystarczającą długość polinukleotydów sekwencji insertu transgenu i wystarczającą długość polinukleotydów genomowej sekwencji pszenicy z pszenicy 33391 o SEQ ID NO: 5, które są użyteczne, jako sekwencje starterowe do wytwarzania diagnostycznego dla pszenicy 33391 produktu - amplikonu. Włączone są sekwencje DNA, które zawierają wystarczającą długość polinukleotydów sekwencji insertu transgenu i wystarczającą długość polinukleotydów genomowej sekwencji z pszenicy 33391 o SEQ ID NO: 6, które są użyteczne, jako sekwencje starterowe do wytwarzania diagnostycznego dla pszenicy 33391 produktu - amplikonu.

Według innego aspektu, dostarcza się cząsteczki DNA, które są diagnostyczne dla pszenicy 33391. ten aspekt jest skierowany na pszenicę 33391 zawierającą co najmniej jedną nową cząsteczkę DNA. Cząsteczki DNA zawierające startery kwasów nukleinowych są dostarczane takie, które dostarczają co najmniej jeden nowy produkt - amplikon pszenicy 33391 zawierający SEQ ID nr: 7 i SEQ ID nr: 8, lub ich komplementy. Takie amplikony DNA są diagnostyczne dla pszenicy 33391. Amplifikacja kwasu nukleinowego genomowego DNA pszenicy 33391 wytwarza amplikon zawierający takie diagnostyczne sekwencje. Ujawniono także izolowane cząsteczki DNA zawierające wystarczającą długość insertowej sekwencji transgenu i wystarczającą długość genomowej sekwencji pszenicy z pszenicy 33391 dla działania, jako sekwencje starterowe do wytwarzania produktu amplikonu diagnostycznego dla pszenicy 33391.

Ponadto ujawniono sposoby wykrywania obecności DNA odpowiadającego pszenicy 33391 w próbce. Sposoby te obejmują:

(a) kontaktowanie próbki zawierającej DNA z starterem ustalonym w taki sposób, że wtedy gdy jest stosowany w reakcji amplifikacji kwasu nukleinowego z genomowym DNA z pszenicy 33391, wytwarza on amplikon, który jest diagnostyczny dla pszenicy 33391;

(b) przeprowadza się rekcję amplifikacji, dostarczając w ten sposób amplikon; i (c) wykrywa się amplikon.

Według innego aspektu, dostarcza się zestawu do wykrywania pszenicy 33391. Zestaw zawiera co najmniej jedną sekwencję DNA o dostatecznej długości polinukleotydów komplementarnych do SEQ ID nr: 5 lub SEQ ID nr: 6, przy czym te DNA sekwencje są użyteczne jako startery lub sondy, które hybrydyzują z DNA izolowanym z pszenicą 33391 lub jej potomstwa.

PL 214 848 B1

Według innego aspektu, dostarcza się sposobów wytwarzania rośliny pszenicy z polepszoną tolerancją na glifosat, które to sposoby obejmują etapy:

(a) krzyżowanie płciowe pierwszej linii rodzicielskiej zawierającej konstrukt pMON30139, który nadaje polepszoną tolerancją na stosowanie glifosatu z drugą linią rodzicielską, która ma brak tolerancji na glifosat, przez co wytwarza się wielorakość potomstwa roślin; i (b) wybiera się potomną roślinę tolerującą stosowanie glifosatu.

Sposoby te są użyteczne do wprowadzania cechy tolerancji glifosatu do różnego rodzaju tła genetycznego. Metody takie mogą ewentualnie zawierać dalszy etap wstecznego krzyżowania potomstwa rośliny z drugą rodzicielską linią pszenicy dla wytworzenia rośliny pszenicy tolerującej stosowanie glifosatu.

Te przedstawione powyżej jak i inne aspekty staną się oczywiste z dalszego szczegółowego opisu i załączonych figur. Załączone figury przedstawiają:

Figura 1. Mapa plazmidu pMON30167

Figura 2. Mapa plazmidu pMON42411

Figura 3. Mapa plazmidu pMON30139

W celu lepszego zdefiniowania niniejszym wynalazku i jako wskazówka dla fachowca dla zrealizowania w praktyce niniejszego wynalazku przedstawione są następujące definicje i sposoby. Jeśli nie zaznaczono inaczej to terminy należy rozumieć zgodnie z ich konwencjonalnym stosowaniem przez fachowców w odnośnych dziedzinach. Definicje terminów powszechnych w biologii molekularnej można także znaleźć w Rieger i wsp., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5 wydanie, Springer-Verlag: New York, 1991; I Lewin, genes V, Oxford Jniversity Press: New York, 1994. Dla DNA stosuje się nomenklaturę jak przedstawiono w 37CFR § 1.822.

Tak jak użyto w niniejszym opisie, termin „pszenica” oznacza Triticum aestivum (obejmując odmiany pszenicy: jarą, ozimą i dowolne) oraz inne gatunki pszenicy, które mogą być hodowane z Triticum aestivum, obejmujące lecz nie ograniczone do pszenicy twardej (Triticum durum), orkiszu (Triticum spelta) i pszenicy płaskurki (Triticum diccocum). Objęte są tym terminem także rośliny, które są wytwarzane technikami konwencjonalnym stosując Triticum aestivum jako rodzica w krzyżówce płciowej z gatunkami nie-Triticum (takimi jak żyto [Secale cereale]), obejmując lecz nie ograniczone do pszenżyta.

Tak jak użyto w niniejszym opisie, termin „zawierający” oznacza „obejmujący lecz nie ograniczony do”.

„Glifosat” odnosi się do N-fosfonometyloglicyny i jej soli. Glifosat jest aktywnym składnikiem herbicydu Roundup® (Monsanto Co, St. Louis, MO). Traktowanie herbicydem glifosatowym” odnosi się do traktowania herbicydem Roundup®, Roundup Utra® lub każdym innym preparatem zawierającym glifosat. Dla celów niniejszego wynalazku, termin „glifosat” obejmuje każdą aktywną herbicydowo postać N-fosfonometyloglicyny (obejmując każdą jej sól) i inne postacie jakie wynikają w wytwarzania anionu glifosatowego w roślinach. Traktowanie „glifosatem”, o ile nie stwierdzono inaczej, odnosi się do traktowania preparatem herbicydowym Roundup®, Roundup Utra®. Transformacja roślin i regeneracja w hodowli tkankowej stosuje glifosat lub sole glifosatu. W badaniach całych roślin stosuje się preparat Roundup® lub Roundup Utra®. Dodatkowe preparaty o aktywności herbicydowej zawierające N-fosfonometyloglicynę lub jakiekolwiek jej sole są tutaj włączone jako herbicyd glifosatowy.

Transgeniczny „przypadek” jest wytwarzany poprzez transformację komórek roślinnych heterologicznym DNA, to znaczy konstruktem kwasu nukleinowego, który zawiera poszukiwany transgen, regenerację populacji roślin otrzymanych z insercji transgenu do genomu tej rośliny i wybranie poszczególnych roślin charakteryzujących się insertem w określonym miejscu genomu.

Termin „przypadek” odnosi się do oryginalnego transformanta i potomstwa tego transformanta, który zawiera heterologiczne DNA.

Termin „przypadek” odnosi się również do potomstwa wytwarzanego przez płciową krzyżówkę zewnętrzną pomiędzy transformantem a innymi odmianami, które zawierają heterologiczne DNA. Nawet po powtórzeniu krzyżowania wstecznego do stałego rodzica, insertowy DNA i DNA flankujący z transformowanego rodzica jest obecny w potomstwie krzyżówki w tym samym miejscu chromosomu.

Termin „przypadek” odnosi się również do DNA z oryginalnego transformanta i jego potomstwa zawierającego insertowe DNA i genomową sekwencje flankującą bezpośrednio sąsiadującą z insertowym DNA jaki mógłby być spodziewany, że jest przenoszony na potomstwo, które otrzymuje insertowe DNA obejmujące poszukiwany transgen, jak wynika z krzyżówki płciowej jednej linii rodzicielskiej,

PL 214 848 B1 jaka obejmuje wstawione DNA (np., oryginalnego transformanta i potomstwo wynikające z samokrzyżowania się) i linię rodzicielską, która nie zawiera wstawionego DNA.

Termin „przypadek” według wynalazku obejmuje nasiona pszenicy 33391 posiadające numer dostępu ATCC No. PTA-2347 i rośliny pszenicy wyhodowane z pszenicy 33391 i jej potomstwo. Roślina pszenicy, która toleruje wystarczające ilości herbicydu glifosatowego do kontrolowania chwastów na polu bez wpływania na rośliny pszenicy mogą być hodowane przez pierwszą krzyżówkę płciową pierwszej rodzicielskiej rośliny pszenicy stanowiącej roślinę pszenicy zawierającą kasety ekspresji pMON30139 jakie nadają polepszoną tolerancję na zastosowanie herbicydu glifosatowego i drugiej rodzicielskiej rośliny pszenicy z brakiem tolerancji na herbicyd glifosatowy, przez co wytwarzana jest różnorodność roślin pierwszego potomstwa; i następnie wybieranie rośliny z pierwszego potomstwa, która jest tolerancyjna na stosowanie herbicydu glifosatowego i samokrzyżowanie się roślin pierwszego potomstwa, przez co wytwarzana jest różnorodność roślin drugiego potomstwa; i następnie wybieranie z drugiego potomstwa roślin z tolerancją herbicydu glifosatowego. Etapy te mogą dodatkowo obejmować wsteczne krzyżowanie roślin pierwszego pokolenia tolerancji glifosatu lub drugiego pokolenia tolerancji glifosatu z rośliną pszenicy z drugiego pokolenia rodzicielskiego lub rośliną pszenicy z trzeciego pokolenia rodzicielskiego, wytwarzając w ten sposób roślinę pszenicy, która toleruje zastosowanie herbicydu glifosatowego. Uprawa zawierająca nasiona pszenicy 33391 lub ich potomstwo może być uprawiana na polu i traktowana odpowiednią ilością herbicydu glifosatowego w celu kontrolowania chwastów bez znaczącego naruszania plonu pszenicy. Wystarczająca ilość herbicydu glifosatowego wynosi około 8 uncji/akr lub więcej, 16 uncji/akr lub więcej, 32 uncji/akr lub więcej, lub 64 uncji/akr lub więcej. Każdy glifosat zawierający preparat herbicydowy może być stosowany do kontrolowania chwastów w uprawie rośliny pszenicy 33391 lub jej potomstwa.

Należy także rozumieć, że dwie różne rośliny transgeniczne mogą być także kojarzone dla wytworzenia potomstwa, które zawiera dwa niezależnie segregujące dodane, egzogenne geny. Samokrzyżowanie się odpowiedniego potomstwa może wytwarzać rośliny, które są homozygotami dla zarówno dodanych jak i egzogennych genów kodujących poszukiwany polipeptyd. Wsteczne krzyżowanie się rodzicielskich roślin i out-crosing (krzyżowanie się dalej spokrewnionych przedstawicieli tej samej odmiany) z nie-transgenicznymi roślinami tak jak i rozmnażanie wegetatywne są także rozważane. Opisy innych metod hodowli jakie są powszechnie stosowane dla różnych cech i upraw można znaleźć w jednej z wielu publikacji, np., Fehr, w „Breeding Methods for Cultivar Develeopment, wydawca Wilcox J., American Society of Agronomy, Madison WI (1987) w całości włączone do opisu przez zacytowanie; Poehlman, J.M. (1987); Breeding Field Crops, wydanie 3. Van Nostrand Reinhold, NY, Knott, D.R. (1987); w całości włączone do opisu przez zacytowanie. The Application of Breeding Procedures to Wheat, str. 419-427. In E.G. Heyne (wydawca). In „Wheat and Wheat Improvement”, Madison, WI, w całości włączone doOpisu przez zacytowanie. Hodowle wsteczne były stosowane do przenoszenia genów prostych, wrodzonych, wysoko dziedziczonych cech do pożądanej homozygotycznej odmiany uprawnej lub linii wsobnej, która jest rodzicem powrotnym. Źródło cechy jak ma być przeniesiona jest zwana rodzicem donorowym. Oczekuje się, że otrzymana roślina posiada atrybuty rodzica powrotnego (np. odmiana uprawna) i pożądaną cechę przeniesioną z rodzica donorowego. Po wstępnym krzyżowaniu, poszczególne osobniki posiadające fenotyp rodzica donorowego są selekcjonowane i powtórnie krzyżowane (krzyżówka wsteczna) z rodzicem powrotnym. Otrzymany w wyniku rodzic powinien posiadać atrybuty powrotnego rodzica (np. odmiany uprawnej) i pożądaną cechę przeniesioną z rodzica donorowego.

Ujawnione cząsteczki DNA mogą być stosowane jako molekularne markery w sposobie hodowli, któremu towarzyszy marker (MAB). Takie cząsteczki DNA mogą być stosowane w sposobach takich jak markery AFLP, RFLP, RAPD, SNPs, i SSRs, które identyfikują genetycznie powiązane cechy użyteczne agronomicznie jak opisano w publikacji Waltona, Seed World 22-29 (July, 1993), w całości włączonej przez cytownie; Burlow i Blake Molecular Dissection of Complex traits, 13-29, Wydawcy Paterson, CRC Press, New York (1988), w całości włączonej przez cytowanie). Polepszona tolerancja glifosatu rośliny pszenicy 33391 może być zaznaczana w potomstwie krzyżówki z rośliną pszenicy 33391 i każdą inną odmianą uprawną lub odmianą stosując sposoby MAB. Cząsteczki DNA są markerami dla takiej cechy i w sposobach MAB dobrze znanych w stanie techniki mogą być stosowane do znakowania tolerancji na glifosat w pszenicy, tam gdzie roślina pszenicy 33391 była rodzicem lub przodkiem.

„Sonda” jest izolowanym kwasem nukleinowym, do którego jest przyłączona wykrywalna konwencjonalnie znakowana lub reporterowa cząsteczka, np., izotop radioaktywny, ligand, czynnik chemi8

PL 214 848 B1 luminescencyjny lub enzym. Taka sonda jest komplementarna do nici docelowego kwasu nukleinowego w przypadku niniejszego wynalazku, do nici genomowego DNA z przypadku pszenicy 33391 (czy to z rośliny pszenicy czy z próbki zawierającej DNA z tego przypadku). Ujawniona sonda zawiera nie tylko kwas deoksyrybonukleinowy lub rybonukleinowy lecz także poliamidy i inne materiały z sondy, jakie wiążą specyficznie się do docelowej sekwencji DNA i mogą być stosowane do wykrywania obecności docelowej sekwencji DNA.

„Startery” są izolowanymi kwasami nukleinowymi, które są wtapiane do komplementarnej docelowej nici DNA przez hybrydyzację kwasu nukleinowego do utworzenia hybrydy pomiędzy starterem a docelową nicią DNA, a następnie wydłużanie wzdłuż docelowej nici DNA przez polimerazę np. przez polimerazę DNA. Pary starterów lub zestawów mogą być stosowane do amplifikacji sekwencji kwasu nukleinowego, np. w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) lub innych konwencjonalnych metodami amplifikacji kwasu nukleinowego.

Sondy i startery mają długość co najmniej 8 lub więcej polinukleotydów, co najmniej 24 lub więcej polinukleotydów, co najmniej 30 lub więcej polinukleotydów. Polinukleotydy te są użyteczne jako sondy i startery, które są wystarczającej długości do hybrydyzacji specyficznej docelowej sekwencji w ostrych warunkach hybrydyzacji. Ujawnione sondy i startery mają pełne podobieństwo sekwencji z docelową sekwencją, jakkolwiek sondy, które są różne od sekwencji docelowej a które pozostają zdolne do hybrydyzowania z sekwencją docelową mogą być wyznaczane metodami konwencjonalnymi.

Sposoby przygotowywania i stosowania sond i starterów są opisane, na przykład, w Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie 2-gie, Tom 1-3, Wydawca Sambrook i wsp., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (dalej, Sambrook i wsp., 1989), w całości włączony tutaj przez zacytowanie; Current Protocols In Molecular Biology, wydawca Ausubel i wsp., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992 (okresowo uaktualniane) (tutaj Ausubel i wsp., 1992) w całości włączony tutaj przez zacytowane; i Innis i wsp., PST Protocols: A Guide to^Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990, w całości włączony tutaj przez zacytowanie. Pary PCR-starter mogą pochodzić z znanej sekwencji, na przykład, przez stosowanie programów komputerowych przeznaczonych do tych celów takich jak Primer (Version 0,5,© 1991, Whitehead Institute for Biochemical Research, Cambridge, MA) w całości włączone tutaj przez zacytowanie.

Ujawnione w niniejszym opisie startery i sondy oparte o flankujący DNA oraz sekwencje insertowe mogą być stosowane w celu potwierdzenia (i jeśli to konieczne, w celu skorygowania) ujawnionych sekwencji metodami konwencjonalnymi, np., przez powtórne klonowanie oraz sekwencjonowanie takich sekwencji.

Ujawnione tu sondy kwasów nukleinowych i startery hybrydyzują w ostrych warunkach z docelową sekwencją DNA. Każda konwencjonalna metoda hybrydyzacji i amplifikacji może być stosowana do identyfikowania obecności DNA z transgenicznych przypadków w próbce.

Termin „ostre warunki” jest zdefiniowany przez funkcję w odniesieniu do hybrydyzacji sondy kwasu nukleinowego z docelowym kwasem nukleinowym (to znaczy, ze szczególną, poszukiwaną sekwencją kwasu nukleinowego) w specyficznej procedurze omówionej w Sambrook i wsp., 1989, 9,52-9,55. Patrz także Sambrook i wsp., 1989, 9,47-9,52, 9.56-9.58 w całości włączone tutaj przez zacytowanie; Kanahisa, (Nucl. cid res. 12:203-213, 1984, w całości włączone tutaj przez zacytowanie); i Wetmur i Davidson, (U. Mol. Biol. 31:349-370, 1988, w całości włączone tutaj przez zacytowanie). Odpowiednio, ujawnione sekwencje kwasu nukleinowego mogą być stosowane dla ich zdolności do selektywnego tworzenia cząsteczek dupleksu z komplementarnymi fragmentami rozciągniętego DNA. W zależności od przewidywanego zastosowania, będą wykorzystywane różne warunki hybrydyzacji w celu osiągnięcia różnych stopni selektywności sondy w stosunku do sekwencji docelowej. Dla zastosowań wymagających wysokiej selektywności, raz będzie to wymagało typowo wykorzystania względnie ostrych warunków hybrydyzacji dla utworzenia hybryd, np. będzie się wybierało względnie słabe sole i/lub warunki wysokiej temperaturowy takie jakich dostarcza się przy około 0,02 M do około 0,15 M NaCl przy temperaturze około 50°C do około 70°C. Ostre warunki hybrydyzacji, to na przykład jest przemywanie filtra hybrydyzacji co najmniej dwukrotnie buforem myjącym o wysokiej ostrości (0,2 x SSC, 0,1% SDS, 65°C). Odpowiednie warunki ostrości, które promują hybrydyzację DNA i są znane w stanie techniki fachowcom to na przykład, 6,0 x chlorek sodu/cytrynian sodu (SSC) przy około 45°C, a następnie mycie 2,0 x SSC przy około 50°C i warunki te można znaleźć w Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Na przykład, stężenie soli w etapie mycia może być wybierane od niskiej ostrości o około 2,0 x SSC przy 50°C do wysokiej ostrości o około 0,2 x SSC przy 50°C. Ponadto, temperatura w etapie mycia może być podwyższona

PL 214 848 B1 z warunków niskiej ostrości przy temperaturze pokojowej, około 22°C, do warunków o wysokiej ostrości przy około 65°C. Zarówno temperatura i sole mogą się różnić, lub zarówno temperatura lub stężenie soli może być trzymane stałe podczas gdy inne zmienne są zmieniane. Tak selektywne warunki tolerują niewielkie, jeśli w ogóle, niedobranie pomiędzy sondą i wzorcem lub nicią docelową. Wykrywanie sekwencji DNA poprzez hybrydyzację jest dobrze znane fachowcom w stanie techniki i wskazówki z patentów St. Zjedn. Am. o numerach 4,965,188 i 5,176,995 są przykładowymi sposobami analizy hybrydyzacyjnej.

Odnośnie amplifikacji docelowej sekwencji kwasu nukleinowego (np., przez PCR) stosując określoną parę startera amplifikacyjnego, „ostre warunki” są warunkami, które pozwalają parze startera na hybrydyzację jedynie z taką sekwencją docelową kwasu nukleinowego, do której starter posiadający odpowiadający dziki typ sekwencji (lub jej komplement) mógłby wiązać się i preferencyjnie wytwarzać amplikon - unikalny produkt amplifikacji.

Termin „specyficzny dla (sekwencji docelowej)” wskazuje, że sonda lub starter hybrydyzuje w ostrych warunkach hybrydyzacji tylko z sekwencją docelową w próbce zawierającej sekwencję docelową.

Tak jak stosuje się w niniejszym opisie „amplifikowany DNA” lub „amplikon” oznacza produkt amplifikacji kwasu nukleinowego docelowej sekwencji kwasu nukleinowego, która jest częścią wzorca kwasu nukleinowego. Na przykład, w celu oznaczenia czy roślina pszenicy otrzymana z krzyżówki płciowej zawiera przypadek transgeniczny, genomowy DNA z rośliny pszenicy może być poddany amplifikacji kwasu nukleinowego stosując parę startera zawierającą starter pochodzący z sekwencji flankującej w genomie tej rośliny sąsiadujący z miejsca wstawienia (insercji) wstawionego heterologicznego DNA i drugą parę startera pochodzącą z wstawionego heterologicznego DNA w celu wytworzenia, diagnostycznego dla obecności tego przypadku, amplikonu. Amplikon ma długość i sekwencję, która jest diagnostyczna dla tego przypadku. Alternatywnie, para startera może pochodzić z sekwencji flankującej oba miejsca wstawionego DNA po to aby wytwarzać amplikon zawierający cały insert.

Amplifikacja kwasu nukleinowego może być zakończana wieloma różnymi metodami amplifikacji znanymi ze stanu techniki, włączając reakcję łańcuchową polimerazy (PCR). Wiele metod amplifikacji jest znanych w stanie techniki i są one opisane, między innymi w patentach St. Zjedn. Am. o nr.: 4,683,195 i 4,683,202 i w PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, wyd. Innis i wsp., Academic Press, San Diego, 1990. W realizacji wynalazku można stosować każdą dobrze znaną metodę dla amplifikacji kwasu nukleinowego. Sekwencja insertu heterologicznego DNA lub sekwencji flankującej z przypadku pszenicy 33391, numer dostępu PTA-2347 mogą być weryfikowane (i jeśli to konieczne korygowane) przez amplifikowanie takich sekwencji z tego przypadku stosując startery pochodzące z przedstawionych tutaj sekwencji, standardowymi metodami sekwencjonowania DNA PCR amplikonu lub klonowanej cząsteczki DNA.

Wytworzony tymi sposobami amplikon może być wykrywany wielorakimi technikami. Elektroforeza na żelu agarozowym i barwienie bromkiem etydyny jest powszechną dobrze znaną metodą wykrywania amplikonów DNA. Inną metodą jest Genetic Bit Analysis (Nikiforov, i wsp., Nucleic Acid Res. 22:4167-4175, 1994) gdzie DNA oligonukleotydu jest zaprojektowany tak, że zazębia się zarówno z sąsiednią flankująca sekwencją genomowego DNA jak i insertową sekwencją DNA. Oligonukleotyd ten jest unieruchomiony w studzienkach do płytek do mikromianowania. Po PCR regionu poszukiwanego (stosując jeden starter w sekwencji insertowej i jeden w sąsiadującej sekwencji flankującej genomowej), jednoniciowy produkt PCR może być hybrydyzowany do unieruchomionego oligonukleotydu i służyć jako wzorzec do reakcji wydłużenia jedno-zasadowego stosując polimerazę DNA i znakowany ddNTPs specyficzny dla spodziewanej następnej zasady. Odczyt może być oparty na fluorescencji lub ELISA. Sygnał wskazuje obecność sekwencji insertowej/flankującej wynikającej z skutecznej amplifikacji, hybrydyzacji i wydłużenia jedno-zasadowego.

Dodatkową metodą jest technika Pyrosequencing jak opisano przez Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). W tej metodzie oligonukleotyd jest projektowany tak, aby zazębiał złącze - sąsiadująca sekwencja genomowa DNA i insert DNA. Oligonukleotyd ten jest hybrydyzowany do jednoniciowego produktu PCR z regionu poszukiwanego (jeden starter w sekwencji wstawionej i jeden w flankującej sekwencji genomowej) i inkubowany w obecności polimerazy DNA, ATP, sulfurylazy, lucyferazy, aperazy, adenozyno-5-fosforanu i lucyferyny. DNTPs jest dodawany indywidualnie i sygnał świetlny będący wynikiem inkorporacji jest mierzony. Sygnał świetlny wskazuje obecność sekwencji transgenowo/flankującej wynikającej z amplifikacji, jaka zaszła w wyniku skutecznej, hybrydyzacji i pojedynczo- lub wielo- zasadowego przedłużenia.

PL 214 848 B1

Fluorescence Polarization jak opisano przez Chen i wsp., (Genome Res. 9:492-498, 1999) jest metodą jaka może być stosowana do wykrywania amplikonu. Stosując tę metodę, oligonukleotyd jest zaprojektowany tak, że zazębia się z połączeniem genomowym flankującym i wstawione DNA. Oligonukleotyd jest hybrydyzowany z jednoniciowym produktem PCR z regionu poszukiwanego (jeden starter w DNA insertu i jeden w sekwencji flankującej i genomowej DNA) i inkubowany w obecności polimerazy DNA oraz znakowanego fluorescencyjnie ddNTP. Przedłużenie jedno-zasadowe prowadzi do inkorporacji ddNTP. Inkorporacja może być zmierzona jako zmiana w polaryzacji stosując fluorometr. Zmiana w polaryzacji wskazuje obecność sekwencji transgenowo/flankującej wynikającej z amplifikacji dokonanej pomyślnie, hybrydyzacji i jedno- zasadowego wydłużenia.

Tagman® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) jest opisany jako sposób wykrywania i kwantyfikowania obecności sekwencji DNA i jest w pełni zrozumiałym z instrukcji dostarczonej przez producenta. W skrócie, projektuje się sondę oligonukleotydową FRET, która zazębia się z połączeniem - genomowy flankujący i insertowy DNA. Sonda FRET i startery PCR (jeden starter w sekwencji insertu DNA i jeden w genomowej sekwencji flankującej) są cyklizowane w obecności termostabilnej polimerazy i dNTPs. Hybrydyzacja sondy FRET powoduje pęknięcie i uwolnienie cząsteczki fluorescencyjnej ze stygnącej cząsteczki na sondzie FRET. Sygnał fluorescencyjny wskazuje obecność sekwencji flankującej/transgenowej wynikającej z pomyślnie przebiegłej amplifikacji i hybrydyzacji.

Molecular Beacons opisane były do stosowania w detekcji sekwencji jak w Tyangi i wsp., (Nature Biotech. 14;303-308, 1996). W skrócie projektuje się sondę oligonukleotydową FRET, która zazębia się z połączeniem genomowy flankujący i insertowy DNA. Unikalna budowa sondy FRET prowadzi do tego, że zawiera ona drugorzędową strukturę, która trzyma cząsteczki fluorescencyjne i stygnące w ścisłej bliskości. Sonda FRET i startery PCR (jeden starter w insertowej sekwencji DNA i jeden w genomowej flankującej sekwencji) są cyklizowane w obecności termostabilnej polimerazy dNTPs. Po skutecznie przeprowadzonej amplifikacji, hybrydyzacja sondy FRET z sekwencją docelową powoduje usunięcie drugorzędowej struktury sondy i przestrzenne oddzielenie cząsteczek fluorescencyjnej i stygnącej. Uzyskuje się sygnał fluorescencyjny. Sygnał fluorescencyjny wskazuje na obecność sekwencji flankująca/transgenowa wynikająca z pomyślnie przeprowadzonej amplifikacji i hybrydyzacji.

W celu przedstawienia pewnych korzystnych postaci wynalazku włączone są następujące przykłady. Powinno być zrozumiałym dla fachowca w tej dziedzinie, że techniki ujawnione w przykładach, które podążają za przedstawionymi podejściami twórców będą działały dobrze w praktyce wynalazku i zatem mogą być uznane, jako stanowiące przykłady korzystnych sposobów jego wykonania. Jednakże, fachowcy w tej dziedzinie powinni, w świetle niniejszego ujawnienia, docenić, że może być dokonanych wiele zmian w określonych ujawnionych postaciach i wciąż otrzymywać takie i podobne wyniki bez odchodzenia od ducha i zakresu wynalazku.

P r z y k ł a d I

Transgeniczne rośliny pszenicy są generowane przez Agrobacterium zależną transformację zarodków pszenicy metodą Cheng i wsp., (Plant Physiol. 115:971-980, 1997) stosując wektory binarne i modyfikację warunków selekcji glifosatu Zhou i wsp., (Plant Cell Rep. 15:159-163, 1995). Inne sposoby transformacji pszenicy są znane fachowcom w stanie techniki, takie jak, broń genowa lub bombardowanie cząsteczkami i może być używane do wstawiania kaset ekspresji do genomu komórek pszenicy. T-DNA z pMGN30139 (Figura 3) zawiera dwie kasety ekspresji, które wspólnie nadają wysoki stopień tolerancji na herbicyd glifosatowy. Pierwsza transgenowa kaseta ekspresji zawiera sekwencje DNA promotora aktyny ryżu i intron (P-Os.Act1 i I-Os.Act1, patent St. Zjedn. Am. 5,641,876, w całości włączone tutaj przez zacytowanie), operacyjnie połączone z sekwencją DNA kodującą Arabidopsis thaliana EPSPS tranzytowego peptydu chloroplastu (TS-At.EPSPS:CTP2, Klee i wsp., Mol. Gen. Genet. 210:47-442, 1987, w całości włączone tutaj przez zacytowanie), operacyjnie związaną z sekwencją DNA kodującą oporną na glifosat syntazę 5-enolopyruviloshikimato-3-fosforanową (EPSPS) wyizolowaną z Agrobacterium tumefaciens (AGRTU.aroAgene, patent St. Zjedn. Am. nr 5,633,435, w całości włączone tutaj przez zacytowanie.), operacyjnie związaną z terminatorem transkrypcji synatazy nopaliny (T-AGRTU. nos, Fraley i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-4807, 1983, w całości włączone tutaj przez zacytowanie). Druga kaseta ekspresji transgenu zawiera sekwencje DNA promotora 35S wirusa mozaiki kalafiora (P-CaMV.35S:en, Kay i wsp., Science 236:1299-1302, 1987; patent St. Zjedn. Am. 5,164,316 w całości włączone tutaj przez zacytowanie), operacyjnie związaną z sekwencją DNA intronu Zea mays Hsp70 (I-Zm.Hsp70, patent St. Zjedn. Am. nr 5,424,412, w całości włączone tutaj przez zacytowanie), operacyjnie związaną sekwencją DNA kodującą sekwencję tranzytowego peptydu chloroplastu Arabidopsis thaliana EPSPS (TS-At.EPSPS,

PL 214 848 B1

Klee i wsp., Mol. Gen. Genet. 210:47-442. 1987), operacyjnie związaną z sekwencją kodującą oporną na glifosat syntazę 5-enolo-pyruviloshikimato-3-fosforanową (EPSPS) wyizolowaną z Agrobacterium tumefaciens sp. Szczepu CP4 (AGRTU.aroAgene, patent St. Zjedn. Am. nr 5,633,435, w całości włączone tutaj przez zacytowanie), operacyjnie związaną z terminatorem transkrypcji synatazy nopaliny (T-30 AGRTU.nos, Fraley i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-4807, 1983.

pMON30167 (Figura 1) jest pojedynczą kasetą ekspresji identyczną z kastą ekspresji pierwszego transgenu pMON30139 jak opisano powyżej. pMON42411 (Figura 2) jest pojedynczą kasetą ekspresji identyczną z druga kasetą ekspresji pMGN30139 jak opisano powyżej.

Po inkubacji komórki pszenicy z Agrobacterium komórek zawierające konstrukty pMON42411, pMON30167 i pM030139, kallusy pszenicy z tolerancją glifosatu były wybierane na pożywkach zawierających 2 mM glifosat przez 1 tydzień a następnie przez transfer do pożywek różnicujących z 0,1 mm glifosatem przez 2 tygodnie i ostateczne przenoszone do medium regeneracyjnego z 0,02 mM glifosatem + 0,1 μΜ kwasami aromatycznymi.

Dwieście osiemdziesiąt cztery przypadki pszenicy było produkowanych z transformacji za pomocą pMON42411, pMON30167 i pM030139. Rośliny te które pochodziły z pMO30139 i pMON30167 były opryskane jeden raz w ilości 64 uncji/akr herbicydem glifosatowym. Wybór transformowanych roślin pszenicy z jedną kasetą ekspresji pMON42411 i pMON30167 dawało mały procent (1,4% 13,2%, odpowiednio) roślin pszenicy z tolerancją zarówno wegetatywną jak i reproduktywną. Tylko 3/134 rośliny z tych konstruktów miało akceptowalny poziom tolerancji herbicydu glifosatowego. W przeciwieństwie do tego, transformowane rośliny pszenicy zawierające podwójną kasetę ekspresji pMON30139 wytwarzały wysoki procent (16%) roślin z tolerancją zarówno wegetatywną jak i reproduktywną (25/100).

Przypadek pszenicy 33391 (odtąd zwana rośliną pszenicy 33391 lub pszenicą 33391 obejmuje wszystkie części pszenicy i nasiona tej rośliny) była wybrana z 150 transgenicznych przypadków pszenicy wytworzonych z transformacji pMON30139. Z populacji, która przedstawiała polepszoną wegetatywną i reproduktywną tolerancję glifosatu były wybrane dwadzieścia cztery przypadki. Dalsza ocena tych 24 przypadków była przeprowadzona dla rolniczego przedsięwzięcia i obecności pojedynczego nienaruszonego insertu. Pszenica 33391 wybrana była z tej populacji przypadków. Oceny w szklarni i na polu pszenicy 33391 i potomstwa pochodzącego od pszenicy 33391 wskazywały, że ten transgeniczny insert nadaje tolerancje na glifosat, przekraczającą handlową specyfikację pełnej wegetatywnej i reproduktywnej tolerancji na 340 g glifosatu/akr (840 g glifosatu/hektar; 32 oz Roundap'u Ultra/akr) z dwukrotnym marginesem bezpieczeństwa kiedy jest stosowany na etapie 3-5 liści.

T a b e l a 1

Porównanie skuteczności pojedynczej i podwójnej kaset ekspresyjnych dla nadawania tolerancji na glifosat w pszenicy

pMON#	# testowane przypadki	# przypadki z tolerancją wegetatywną	# weg. tolerancyjne przypadki z tolerancją reproduktywną
42411	71	26	1(1,4%)
30167	63	4	2(3,3%)
30139	150	104	24(16%)

P r z y k ł a d 2

Izolowanie odpowiadającej flankującej sekwencji genomowej jest możliwe wieloma metodami znanymi fachowcom w tanie techniki (na przykład, stosując ligowane adaptery i wewnętrzną PCR (nested) jak opisano w zestawie Genome Walker™ (Clonetech laboratories, Inc, Palo Alto, CA). Genomowy DNA z pszenicy 33391 był izolowany metodą oczyszczania CTAB (Rogers i wsp., Plant Mol Biol 5:69-76, 1985). Odczynniki są dostępne w sprzedaży (patrz, na przykład, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Biblioteki genomowe do amplifikacji były przygotowywane według instrukcji producentów (Genome Walker™, Clonetech Laboratories, Inc, Palo Alto, CA). W oddzielnej reakcji, genomowy DNA był poddawany trawieniu enzymami restrykcyjnymi przez całą noc w 37°C za pomocą następujących endonukleaz z tępymi końcami: DraI, EcoRV, PvuII, Scal i Stul (CloneTech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA.) Mieszanina reakcyjna była ekstrahowana układem fenol:chloroform, DNA strącano przez dodanie etanolu do fazy wodnej, osadzano przez wirowanie, a następnie zawieszano ponownie w Tris-EDTA buforze (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM RDTA). Oczyszczone fragmenty genomowego

PL 214 848 B1

DNA z tępymi końcami były następnie ligowane do adapterów Genome Walker™ według protokołu producenta. Po ligacji tych adapterów do genomowych fragmentów DNA, każda reakcja była poddawana działaniu ciepła (70°C przez 5 minut) w celu zatrzymania reakcji i następnie rozcieńczana 10-krotnie buforem Tris EDTA. Jeden μΐ każdej reprezentatywnej ligacji amplifikowano następnie w 50 μΐ reakcji według protokołu zalecanego przez producenta stosując specyficzny dla adaptera oligonukleotyd (dostarczony przez producenta) i specyficzny transgenowo oligonukleotyd pszenicy 33391, taki jak SEQ ID nr: 1, która rozplata się obok końca 5' P-Os.Act1. Mieszanina PCR zawierała 1 μl odpowiedniej biblioteki zligowanej z adapterem, 1 pi, 10μΜ adaptera Genome Walker™, starter AP1 dostarczony przez producenta (5'GTATAlCGACTCACTATAGGGC3', SEQ ID nr: 11), 1 μΐ 10 μΜ oligonukleotydu specyficznego transgenowo ( SEQ ID nr: 1), 1 μΐ 10 mM deoksyrybonukleotydów, 5 μΐ buforu PCR 10Χ zawierającego MgCl₂, 0,5 μΐ (2,5 jednostek) polimerazy Tag DNA (Borhringer Mannheim Bichemicals, Indianapolis, IN), i H₂O do 50 μΐ. Reakcja PCR prowadzona była w termocyklerze stosując wyliczoną temperaturę kontrolną i następujące warunki cykli: 1 cykl w 94°C przez 1 minutę; 7 cykli (94°C przez 2 sekundy, 70°C przez 3 minuty); 37 cykli w (94°C przez 2 sekundy, 65°C przez 3 minuty); 1 cykl w 65°C przez 10 minut. Jeden μΐ każdej reakcji podstawowej było następnie amplifikowane w drugiej amplifikacji stosując wewnętrzny adapterowo- specyficzny oligonukleotyd (dostarczony przez producenta) i wewnętrzny transgenowo-specyficzny oligonukleotyd taki jak SEQ ID nr: 2, która łączy się z P-Os.Act1 powyżej startera stosowanego w reakcji pierwotnej. Mieszanina do powtórnej PCR zawierała 1 μΐ odpowiednich produktów pierwotnej PCR, 1 μΐ 10 μΜ Genome Walker™ wewnętrznego adaptera, starter AP2 dostarczony przez producenta (5'ACTATAGGGCACGCGTGGT3', SEQ ID nr: 12), 1 μΐ 10 μΜ transgeno-specyficznego wewnętrznego oligonukleotydu (SEQ ID nr: 2), Iub 10 μΜ deoksyrybonukleotydów, 5 μΐ 10XPCR buforu zawierającego MgCl₂, 0,5 μΐ (2,5 jednostek) polimerazy Tag DNA (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) i H₂O do 50 μΐ. Reakcje PCR były znów przeprowadzane w termocyklerze stosując wyliczon ą temperaturę kontrolną i następujące warunki cykli: 1 cykl w 94°C przez 1 minutę; 7 cykli ( 94°C przez 2 sekundy, 70°C przez 3 minuty); 31 cykli w (94 0C przez 2 sekundy, 65°C przez 3 minuty), 1 cykl w 65°C przez 10 minut. Produkty PCR, reprezentujące regiony 5' stanowiących połączenie pomiędzy transgenicznym insertem pszenicy 33391 i flankującą genomową sekwencją sąsiadującą, były następnie oczyszczane na elektroforezie na żelu agarozowym a następnie izolowane z matrycy agarozowej stosując zestaw Del Extraction Kit QIAquick (katalog#28704, Qiagen Inc., Valencia, CA) i następnie klonowane bezpośrednio do wektora pGEM-T Easy (katalog#A1360, Promega, Madison, WI). Tożsamość klonowanych produktów była potwierdzana przez analizę sekwencji DNA (ABI Prism™ 337, PE Biosystems, FosterCity, CA i oprogramowanie do analizy sekwencji DNASTAR, DNASTAR Inc, Madison, WI).

Podobnie, flankująca sekwencja genomowa 3' DNA była amplifikowana i klonowana stosując wewnętrzne specyficzne startery genowe, takie jak SEQ ID nr: 3, i SEQ ID nr: 4, które łączą się z terminatorem transkrypcji T-nos. Dwa transkrypcyjne terminatory t-nos są obecne w insercie transgeniczno/genomowym pszenicy 33391, jeden wewnętrzny w konstrukcie i jeden przy końcu 3' konstruktu sąsiadującego z genomową sekwencją pszenicy. Produkty PCR wytwarzane w tej rekcji były sekwencjonowane i sekwencja DNA jaka spinała połączenie pomiędzy transgenem i flankującym genomowym była odróżniana od produktów wewnętrznego T-nos przez porównywanie z znanymi elementami sekwencji genetycznej konstruktu pMON 30139.

Sekwencja genomową pszenicy flankująca oba miejsca insertu transgenu w genomie pszenicy była oznaczana dla pszenicy 33391 przez sekwencjonowanie produktów amplifikacji pochodzących z Genome Walker™ i przyrównanie do znanej sekwencji transgenu. Sekwencja o segmencie 339 parach zasad (bp) wokół miejsca insertu była oznaczana przy końcu 5' miejsca insertu transgenu. Segment ten stanowił 257 (bp) sekwencję genomową pszenicy (zasady nukleotydowe 258-350 z SEQ ID nr: 5) i 49 bp końca 5' promotora aktyny ryżu Act1 (zasady nukleotydowe 251-399 SEQ ID nr: 5). Podobnie, sekwencja DNA była oznaczana dla segmentu o 431 bp flankującego połączenie insertowe (SEQ ID nr: 6), zaczynające się 32bp sekwencją terminatora transkrypcji T-nos (zasady nukleotydowe 1031 z SEQ ID nr: 6), 68 bp szkieletową sekwencji wektora (zasady nukleotydowe 33-100) i kończący się 331 bp genomową sekwencją pszenicy flankującą miejsce insercji transgenu (zasady nukleotydowe 101-431 SEQ ID nr:6). Identyfikację pszenicy 33391 przeprowadzono przez amplifikację PCR regionu insertu transgenowo/genomowego stosując jeden starter z sekwencji transgenu i inny starter z genomowej sekwencji flankującej pszenicy.

Transgenowo/genomowy region insertu 5' był potwierdzony przez amplifikacje PCR amplikonu DNA, że był on unikalny dla pszenicy 33391. Identyfikacja ta była wykazana na podstawie amplikonu

PL 214 848 B1

PCR generowanego przez starter 5 (SEQ ID nr: 7) i starter 6 (SEQ ID nr: 8). Dodatkowe sekwencje startera mogą być syntetyzowane stosując sekwencję DNA pokazaną w SEQ ID nr: 5, która będzie generować amplikony o długości DNA różnej niż amplikon generowany przez starter 5 i starter 6, ale wciąż diagnostyczne dla pszenicy 33391 i jej potomstwa. Mieści się w zakresie zwykłej wiedzy biologa biegłego w dziedzinie biologii molekularnej roślin wybór sekwencji starterowych DNA z SEQ ID nr: 5 i dobrać warunki ostrości hybrydyzacji dla wytworzenia amplikonu. Podobnie, fachowiec wybierze sekwencję DNA startera z SEQ ID nr: 6, która będzie generowała amplikony diagnostyczne dla pszenicy 33391. Mieści się w zakresie wynalazku, to że sekwencje starterowe DNA pochodzące od SEQ ID nr: 5 i SEQ ID nr: 6 są użyteczne dla izolowania dodatkowych genomowych cząsteczek DNA z roślin pszenicy 33391, nasion i części rośliny sposobami ujawnionymi w niniejszym opisie lub metodami znanymi w stanie techniki biologii molekularnej roślin. Te dodatkowe cząsteczki genomowego DNA pszenicy mogą być ujawnione w SEQ ID nr: 5 i SEQ ID nr: 6 użytecznych jako starter lub sonda. Te dodatkowe cząsteczki genomowego DNA pszenicy mogą być stosowane, jako molekularne markery diagnostyczne dla pszenicy 33391.

Sekwencje DNA, które spinają region złączenia genomowego DNA pszenicy 33391 i insertu DNA pMON30139 zawarte w SEQ ID nr: 5 i SEQ ID nr: 6, mogą być stosowane jako sondy w reakcji hybrydyzacji w celu identyfikacji DNA pochodzącego z pszenicy 33391. Na przykład, cząsteczka DNA użyteczna jako sonda z SEQ ID nr: 5 mogłaby zawierać sekwencję nukleotydową występującą w pozycji 245-270 lub jej komplement; cząsteczka DNA użyteczna jako sonda z SEQ ID nr: 6 mogłaby zawierać sekwencję nukleotydową występującą w pozycji 87-113 lub jej komplement. Fachowiec w stanie techniki może wybrać sekwencje nukleotydowe krótsze lub dłuższe niż te opisane, które spinają region złączenia i są użyteczne, jako specyficzne sondy DNA lub startery dla pszenicy 33391 w ostrych warunkach hybrydyzacji.

Warunki reakcji PCR (Tabela 2) i jakość ekstrahowanego genomowego DNA pszenicy 33391 są potwierdzone przez produkcję amplikonu przez starter 7 (SEQ ID nr: 9) i starter 8 (SEQ ID nr: 10) i reprezentuje w przybliżeniu 400 bp fragment DNA z genu karboksylazy acetylo CoA pszenicy (Acc), pojedynczą kopię endogennego genu w genomie pszenicy. Kontrole dla tych analiz powinny zawierać kontrolę pozytywną z pszenicy 33391, i negatywną kontrolę z rośliny pszenicy, która nie jest pszenicą 33391, oraz kontrolę negatywną, która zawiera nie wzorcowy DNA pszenicy jak pokazano w Tabeli 2. Próba dla amplikonu pszenicy 33391 może być przeprowadzona przez zastosowanie Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Eimer 9700 lub termocyklera Mastercycler Gradient jak pokazano w Tabeli 3, lub metodami i aparaturą znaną fachowcowi.

T a b e l a 2

Procedura PCR i mieszanina reakcyjna dla potwierdzenia regionu złączenia 5' transgenowo/genomowego pszenicy 33391

Etap	Odczynnik	Ilość	Komentarz
1	2	3	4
1	Woda wolna od nukleaz	Dodana do końcowej objętości 20 μl	-
2	Bufor reakcyjny 10X (z MgCb)	2,0 pi	1X stężenie buforu, 1,5 mM końcowe stężenie MgCl2
3	10 mM roztwór dATP, dCTP, dDTP i dTTP	0,4 pl	200 μΜ końcowe stężenie każdego dNIP
4	Starter 5 (SEQ ID nr: 7) (zawieszony ponownie w 1X buforze TE lub wodzie wolnej od nukleaz do stężenia 10 μΜ)	0,4 pl	0,2 μΜ stężenie końcowe
5	Starter 6 (SEQ ID nr: 8) (zawieszony ponownie w 1X buforze TE lub wodzie wolnej od nukleaz do stężenia 10 μΜ)	0,4 pl	0,2 μΜ stężenie końcowe
6	Starter 7 (SEQ ID nr: 9) (zawieszony ponownie w 1X buforze TE lub wodzie wolnej od nukleaz do stężenia 10 μΜ)	0,2 pl	0,1 μΜ stężenie końcowe

PL 214 848 B1 cd. tabeli 2

1	2	3	4
7	Starter 8 (SEQ ID nr: 10) (zawieszony ponownie w 1X buforze TE lub wodzie wolnej od nukleaz do stężenia 10 μΜ)	0,2 pl	0,1 μΜ stężenie końcowe
8	wolny od RNazy, DNazy (500 ng/ml)	0,1 pl	50 ng/reakcję
9	polimeraza DNA REDTaq	1,0 pl (zaleca się zmienić pipetę przed następnym etapem)	1 jednostka/reakcję
10	Ekstrahowany DNA (wzorzec): • próba analizowana • poszczególne liście • pula liści (maksymalnie 50 liści/pulę) • Kontrola negatywna • Kontrola negatywna • Kontrola pozytywna	• 10-200 ng genomowego DNA • 200 ng genomowego DNA • 50 ng genomowego DNA pszenicy (nie pszenicy 33391) • bez wzorca DNA • 50 ng genomowego DNA 33391

T a b e l a 3

Sugerowane parametry PCR dla różnych termocyklerów*

Numer cyklu	Ustawienia: Stratagene Robocycler
1	94°C 3 minuty
38	94°C 1 minuta 63°C 1 minuta 72°C 1 minuta i 30 sekund
1	72°C 10 minut
Numer cyklu	Ustawienia: MJ Engine or Perkin-Elmer 9700
1	94°C 3 minuty
38	94°C 10 sekund 63°C 30 sekund 72°C 1 minuta
1	72°C 10 minut
Numer cyklu	Ustawienia: Eppendorf Mastercycler Gradient
1	94°C 3 minuty
38	94°C 15 sekund 63°C 15 sekund 72°C 1 minuta
1	72°C 10 minut

Delikatnie mieszać i jeśli to potrzebne dodać 1-2 krople oleju mineralnego na wierzch każdej rekcji (nie na gorący wierzch termocyklera).

Przeprowadzać PCR w Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkm-Elmer 9700 lub termocyklerze Eppendorf Mastercycler Gradient stosując następujące parametry pracy cyklicznej.

Uwaga: MJ Engine lub termocykler Eppendorf Mastercycler Gradient powinny być uruchamiane w sposób wyliczony. Działanie termocyklera Perkin-Elmer 9700 z szybkością jednostajną ustawia się na maksimum.

PL 214 848 B1

P r z y k ł a d 3

Ekspresję opornych glifosatowo białek EPSPS (CP4 EPSPS) z aroA:CP4 można wykrywać metodami immunologicznymi z ekstraktów tkanek roślin (Rogan i wsp., Food Control 10:407-414, 1999, w całości włączone tutaj przez zacytowanie). Metody immunologiczne takie jak Western blots, testy paskowe i enzymatyczny test immunoabsorpcyjny (ELISA) były wykorzystywane w celu dokładnego wykrycia wyrażonych białek z genu aroA:CP4 zawartego w wektorze ekspresji transformowanym do roślin. Odczynniki, które zawierają poliklonalne i monoklonalne przeciwciała specyficzne dla CP4 EPSPS są dostępne handlowo z Strategie Diagnostics (Newark, DE). CP4 EPSPS mogą być wykryte z białkowych ekstraktów rośliny pszenicy 33391, części rośliny i nasion metodami immunologicznymi obejmującymi ELISA.

Procedura ELISA, w której stosuje się 100 ng monoklonalnego przeciwciała anty-CP4 EPSPS rozpuszczonego w 100 μl 0,05 M dwuwęglanu sodowego buforu o pH 9,6 jest absorbowane na studzience do mikromiareczkowania przez noc w 4°C. Studzienka jest myta buforem soli fosforanowej 0,05% Tween-20, pH 7,4 (PBS-T). Tkankę homogenizuje się w buforowanej fosforanem soli za pomocą moździerza i pistyla lub innego odpowiedniego rozdrabniacza tkanek. Homogenat nakłada się do studzienki do mikromiareczkowania i inkubuje się przez około 2 godziny w 37°C. Studzienkę przemywa się trzykrotnie za pomocą PBS-T. W jednej metodzie przeciwciało drugiego rzędu, oczyszczone królicze anty-CP4 EPSPS jest rozpuszczane do wystarczającego poziomu w celu dostarczenia wiązania specyficznego do białka CP4 EPSPS i inkubowane w 37°C przez około 1 godzinę. W drugiej metodzie, stosowane jest przeciwciało drugiego rzędu, kozie anty-CP4 EPSPS. Anty-królicza IgG skoniugowana z biotyną lub IgG anty-kozia (Sigma Corp, St. Louis MO) dodawana jest do studzienki (1:40,000 rozcieńczenie w PBS) i inkubowana w 37°C przez 30 minut. Studzienka jest myta trzykrotnie PBS-T. NeutrAvidin skoniugowana z peroksydazą chrzanową jest rozcieńczana 1:10,000 stosując stabilizator StabilZyme HRP (SurModics, Eden Prairie, MN) i inkubowana w 37°C przez 15 minut. Studzienka jest przemywana trzykrotnie za pomocą PBS-T. Subsirat TMB (Krikergard i Perry, Gathersburg, MD) dodawany jest przez 10 minut, a następnie reakcja jest studzona stosując 3 M kwas fosforowy. Studzienka jest odczytywana w czytniku do płytek do mikromiareczkowania przy 450 nm i długości fali odniesienia 650 nm. Metoda ta jest przykładem odpowiedniego testu ELISA do wykrywania CP4 EPSPS i nie tylko metoda ELISA może być stosowana do detekcji CP4 EPSPS, a fachowiec znający zagadnienia testów ELISA będzie znał odmiany tej metody jakie mogą być przeznaczone do dostarczenia testów wykrywania specyficznych i wystarczająco czułych dla detekcji CP4 EPSPS w ekstraktach tkanek roślinnych.

ELISA z pola porosłego paszową pszenicą 33391 zawiera średnio 58,2±8,4 μg/g, z zakresem 45,5 do 72,4 μg/g białka CP4 EPSPS w przeliczeniu na świeżą masę tkanki (fwt), podczas gdy nietransgeniczne kontrolne pole z zasiewem nie miało dającego się wykryć poziomu białka CP4 EPSPS powyżej limitu wykrywania w metodzie ELISA przy 0,9 μg/g fwt. Tkanka ziarna przypadku pszenicy 33391 zawiera średni poziom 12,6±2,5 μg/g, z zakresem 9,5 do 17,6 μg/g białka CP4 EPSPS w przeliczeniu na świeżą tkankę (fwt), podczas gdy nie transgeniczna kontrolna pasza nie miała wykrywalnego poziomu białka CP4 EPSPS powyżej limitu wykrywania w metodzie ELISA przy 0,1 μg/g fwt. Jako diagnostyczne testy do wykrywania CP4 EPSPS dla pszenicy 33391 stosowane mogą być ELISA lub inne metody immunologiczne, podczas gdy potomstwo pszenicy 33391 jest rejestrowaną tylko przez USDA (Departament Rolnictwa St. Zjedn. Am.) pszenicą tolerująca glifosat wyrażającą białko CP4 EPSPS.

Depozyt pszenicy 33391 dokonany na rzecz Monsanto Company, ujawniony w tym opisie i wymieniony w załączonych zastrzeżeniach został dokonany zgodnie z Budapeszteńskim Porozumieniem o Uznawaniu Depozytów Drobnoustrojów, w Amerykańskiej Kolekcji Hodowli Typowych (ATCC), 1081 University Boulevard, Manassas, Va. 20110. Numer dostępu - PTA-2347. Depozyt ten będzie utrzymywany u depozytariusza przez okres 30 lat, lub 5 lat po ostatniej prośbie lub przez skuteczny czas trwania patentu, w zależności od tego, który z tych okresów byłby dłuższy i będzie zastępowany jeśli będzie taka konieczność w czasie tego okresu.

Ilustrując i opisując główne zasady niniejszego wynalazku, powinno być oczywiste dla fachowca w tej dziedzinie, że wynalazek może być zmodyfikowany co do układu i szczegółów bez odejścia od tych zasad. Zastrzega się wszystkie modyfikacje mieszczące się w duchu i zakresie załączonych zastrzeżeń.

PL 214 848 B1

Wszystkie publikacje i opublikowane dokumenty patentowe cytowane w tym opisie są włączone tutaj przez zacytowanie w takim samym zakresie jak każda indywidualna publikacja lub zgłoszenie patentowe było specjalnie i indywidualnie wskazane będąc włączonym przez cytowanie.

Claims

1. Sposób wytwarzania tolerancyjnej na glifosat rośliny pszenicy, znamienny tym, że zawiera etapy w których:

(1) uzyskuje się konstrukt DNA zawierający pierwszą i drugą kasetę ekspresji, przy czym wspomniana pierwsza kaseta ekspresji w operacyjnym połączeniu zawiera:

(i) promotor aktyny 1 ryżu;

(ii) intron aktyny 1 ryżu;

(iii) cząsteczkę DNA kodującą tranzytowy peptyd chloroplastu;

(iv) cząsteczkę DNA kodującą EPSPS z tolerancją glifosatu; i (v) cząsteczkę DNA terminatora transkrypcji;

a wspomniana druga kaseta ekspresji zawiera w połączeniu operacyjnym (a) starter CaMV 35S;

(b) intron Hsp70;

(c) cząsteczkę DNA kodującą tranzytowy peptyd chloroplastu;

2. Płodna tolerująca glifosat roślina pszenicy wytworzona sposobem, jak określono w zastrz. 1.

3. Nasiono pszenicy wytworzone sposobem, jak określono w zastrz. 1.

4. Para cząsteczek DNA zawierająca: pierwszą cząsteczkę DNA i drugą cząsteczkę DNA, przy czym pierwsza cząsteczka DNA zawiera co najmniej 8 sąsiadujących ze sobą nukleotydów od nukleotydu 1 do 257 SEQ ID nr: 5 lub jej pełnego komplementu, a druga cząsteczka DNA zawiera co najmniej 8 sąsiadujących ze sobą nukleotydów od nukleotydu 258 do 399 z SEQ ID nr: 5 lub jej pełnego komplementu, i ta para cząsteczek DNA kiedy jest stosowana w metodzie amplifikacji DNA wytwarza amplikon obejmujący nukleotydy 245-270 o sekwencji SEQ ID nr: 5

5. Para cząsteczek DNA zawierająca: pierwszą cząsteczkę DNA i drugą cząsteczkę DNA, przy czym pierwsza cząsteczka DNA zawiera co najmniej 8 sąsiadujących ze sobą nukleotydów od nukleotydu 1 do 100 z SEQ ID nr: 6 pszenicy lub jej pełnego komplementu, a druga cząsteczka DNA zawiera co najmniej 8 sąsiadujących ze sobą nukleotydów od nukleotydu 101 do 431 z SEQ ID nr: 6 lub jej pełnego komplementu, i ta para cząsteczek DNA kiedy jest stosowana w metodzie amplifikacji DNA wytwarza amplikon obejmujący nukleotydy 87-113 sekwencji SEQ ID nr: 6.

6. Sposób wykrywania obecności diagnostycznej cząsteczki DNA dla tolerującej glifosat rośliny pszenicy zawierającej nukleotydy 245-270 SEQ ID nr 5 albo nukleotydy 87-113 SEQ ID nr 6 lub jej potomstwa, znamienny tym, że obejmuje etapy w których:

(a) ekstrahuje się próbkę DNA ze wspomnianej rośliny pszenicy lub jej nasion potomnych i roślin potomnych lub ich części; i (b) dostarcza się cząsteczki DNA startera jak zdefiniowano w zastrz. 4 lub zastrz. 5; i (c) zapewnia się warunki amplifikacji DNA; i (d) przeprowadza się wspomnianą reakcję amplifikacji DNA, wytwarzając w ten sposób cząsteczkę DNA amplikonu; i (e) wykrywa się cząsteczkę DNA amplikonu.

7. Para cząsteczek DNA według zastrz. 4, w której wspomniane cząsteczki DNA zawierają SEQ ID nr: 7 i SEQ ID nr: 8.

8. Sposób wykrywania sekwencji zawierającej nukleotydy 245-270 SEQ ID nr 5 albo nukleotydy 87-113 SEQ ID nr 6 w próbce DNA, znamienny tym, że sposób zawiera etapy, w których:

PL 214 848 B1 (a) ekstrahuje się próbkę DNA z rośliny pszenicy;

(b) kontaktuje się próbki DNA z cząsteczką DNA, zawierającą nukleotydy 245-270 z sekwencji

SEQ ID nr: 5; lub nukleotydy 87-113 z SEQ ID nr: 6, i (c) poddaje się próbkę i sondę ostrym warunkom hybrydyzacji, i (d) wykrywa się hybrydyzację sondy z tym DNA.

9. Sposób wytwarzania rośliny pszenicy z tolerancją glifosatu, znamienny tym, że: zawiera etapy w których (a) krzyżuje się potomstwo pszenicy tolerującej glifosat zawierającej sekwencję zawierającą nukleotydy 245-270 SEQ ID nr 5 albo nukleotydy 87-113 SEQ ID nr 6 z roślinami pszenicy nie tolerującymi glifosatu; i (b) wytwarza się potomstwo roślin pszenicy tej krzyżówki;

(c) ekstrahuje się próbki DNA z potomstwa roślin pszenicy;

(d) kontaktuje się próbki DNA z parą starterów jak określono w zastrz. 4 lub zastrz. 5;

10. Zestaw do wykrywania DNA, znamienny tym, że zawiera kontrolę pozytywną dla sekwencji zawierającej nukleotydy 245-270 SEQ ID nr 5 albo nukleotydy 87-113 SEQ ID nr 6; i albo (a) wspomnianą parę starterów jak zdefiniowano w zastrz. 4 lub 5;

(b) sondę zawierającą fragmenty sekwencji SEQ ID nr: 5 zawierającą nukleotydy 245-270 o sekwencji SEQ ID nr: 5; albo (c) sondę zawierającą fragmenty sekwencji SEQ ID nr: 6 zawierającą nukleotydy 87-113 o sekwencji SEQ ID nr: 6.

11. Nasiono transgenicznej pszenicy zwierające sekwencję zawierającą nukleotydy 245-270 SEQ ID nr 5 albo nukleotydy 87-113 SEQ ID nr 6, przy czym genom wspomnianego nasiona obejmuje insert DNA zawierający dwie kopie cząsteczki DNA kodującego EPSPS z tolerancją glifosatu, gdzie wspomniany insert posiada połączenie 5' z genomowym DNA pszenicy obejmujące SEQ ID nr: 5 oraz posiada połączenie 3' z genomowym DNA pszenicy obejmujące SEQ ID nr: 6.

12. Roślina pszenicy wytworzona przez hodowlę nasion jak zdefiniowano w zastrz. 11.

13. Sposób wytwarzania rośliny pszenicy tolerującej stosowanie glifosatu, znamienny tym, że zawiera etapy w których:

(d) nanosi się herbicyd glifosat na wspomnianą roślinę drugiego pokolenia;

14. Sposób selektywnego kontrolowania chwastów na polu zawierającym uprawę pszenicy, znamienny tym, że zawiera etapy, w których:

(a) sadzi się nasiona jak określono w zastrz. 11, i (b) nanosi się na uprawę pszenicy i chwasty na polu wystarczającą ilość herbicydu glifosatu dla kontrolowania chwastów bez znacznego uszkadzania uprawy pszenicy.

15. Cząsteczka DNA obejmująca SEQ ID nr: 5 lub jej fragment zawierający nukleotydy 245-270 z SEQ ID nr: 5.

16. Cząsteczka DNA obejmująca SEQ ID nr: 6 lub jej fragment zawierający nukleotydy 87-113 z SEQ ID nr: 6.

17. Roślina pszenicy tolerująca glifosat, której genom zawiera insert DNA zawierający dwie kasety ekspresyjne kodujące oporną na glifosat syntazę 5-enolopirogroniano-szikimowo-3-fosforanową (EPSPS) z Agrobacterium tumefaciens (ARGl) sp. Szczep CP4 i sekwencje połączenia spinające miejsce insertu zawierające nukleotydy 245-270 o SEQ ID nr: 5 i nukleotydy 87-113 o sekwencji SEQ ID nr: 6.

18. Roślina pszenicy zdolna do wytwarzania diagnostycznego amplikonu obejmującego SEQ ID nr: 5 lub SEQ ID nr: 6.

PL 214 848 B1

19. Nasiono zdolne do wytwarzania diagnostycznego amplikonu obejmującego SEQ ID nr: 5 lub SEQ ID nr: 6.

20. Komórka zdolna do wytwarzania diagnostycznego amplikonu obejmującego SEQ ID nr: 5 lub SEQ ID nr: 6.