BR112015018618B1 - Composição e métodos para melhorar a vitalidade de sementes, a saúde e/ou o rendimento de uma planta - Google Patents

Abstract

ENDÓFITO ISOLADO, COMPOSIÇÃO, SEMENTE E MÉTODOS PARA MELHORAR A VITALIDADE DE SEMENTES, A SAÚDE E/OU O RENDIMENTO DE UMA PLANTA. A presente invençãoinvenção fornece cepas endofíticas ou culturas das mesmas que têm uma relação simbiótica com plantas. A presente invenção proporciona ainda uma composição e uma semente compreendendo o endófito ou cultura do mesmo, bem como a métodos de melhorar a vitalidade das sementes, resistência ao estresse biótico e abiótico, a saúde das plantas e a produção sob estresse e condições ambientais não estressantes, que compreende inocular uma semente com as cepas endofíticas novas e cultivar uma planta da mesma.

Description

CAMPO

[001] A presente invenção se refere a endófitos fúngicos e bacte- rianos de plantas que melhoram a vitalidade das sementes e/ou saúde das plantas, que conferem melhorias gerais nas características agrícolas da planta, nas condições normais e estressadas. A descrição também se refere a esses endófitos isolados.

ANTECEDENTES

[002] Fungos e bactérias são micro-organismos ubíquos. Endófito é o termo primeiro cunhado por de Bary [1866] que define os micróbios que colonizam de forma assintomática tecidos vegetais [Stone et al., 2000]. A existência de endófitos é conhecida há mais de um século [Freeman 1904] e parece que cada hospedeiro individual, entre as 300 mil espécies de plantas, habita várias a centenas de endófitos [Tan e Zou, 2001]. Endófitos são organismos microbianos principalmente simbioticamente ou mutualísticamente associados com tecidos vivos de plantas hospedeiras. Muitos são capazes de conferir tolerância das plantas ao estresse abiótico, ou podem ser utilizados pela planta para a defesa contra os fungos e bactérias patogênicas [Singh et al. 2011]. Alguns destes micro-organismos têm se mostrado úteis para os setores da agricultura, silvicultura e horticultura, bem como a produção de plantas de compostos importantes medicinalmente.

[003] Endófitos determinam em grande parte célula de planta e regulação de genoma da planta inteira, incluindo os ciclos vitais da planta: (i) eventos de semente pré- e pós-germinação (micovitalismo) [Vujanovic e Vujanovic 2007 ] , (ii) a absorção de nutrientes das plantas e mecanismos de promoção do crescimento (mocoheterotrofismo) [Smith e Read 2008], e (iii) a tolerância da planta ao estresse ambien- tal e resistência sistêmica induzida contra doenças e pragas (micosim- bionticismo) [Wallin 1927; Margulis, 1991]. Eles poderiam desempenhar um papel importante na produção de biomassa vegetal, sequestro de CO 2 , e/ou o rendimento e, portanto, ser atores importantes na regulação da ecosfera, garantindo saúde vegetal e segurança alimentar. Além disso, eles podem ser importantes sentinelas (bioindicado- res) de alterações ambientais, uma vez que alterações na estrutura e na biomassa das comunidades endofíticas podem provocar mudanças não só nas vias de nutrientes (N, P, K), transferência de energia em cadeias alimentares e ciclos bioquímicos, mas também em UV-B, calor, tolerância à seca ou ao sal que influenciam o estabelecimento de ecossistema global de plantas e estabilidade. Apesar de sua abundância e provável importância em todos os ecossistemas terrestres, quase nada sobre a composição de endófitos em sementes ou espermosfera, suas interações, ou a sua resposta comum às mudanças ambientais é conhecido.

[004] Enquanto a espermosfera representa uma rápida mudança e zona microbiologicamente dinâmica de solo em torno de uma semente a germinar [Nelson, 2004], a rizosfera é uma zona microbiologi- camente ativa do solo em massa circundante às raízes da planta [Smith e Read 2008]. A rizosfera suporta micoheterotrofia ou uma relação simbiótica micorriza-planta. A espermosfera, por outro lado, promove micovitalidade ou uma relação de fungos endófitos com sementes de planta - melhorando o vigor das sementes, energia e uniformidade de germinação que poderia ser razoavelmente previsto. Fungos endófitos são distintos de micorrizas na medida em que não apenas podem colonizar raízes, mas também outros órgãos de plantas, inclu-indo sementes [Vujanovic et al. 2000; Hubbard et al. 2011]. Eles pertencem à Ascomicota de filos multicelulares e Basidiomicota e formam estruturas simbióticas de colonização diferentes daquelas produzidas por filo unicelular ou cenocítico Glomeromicota, conhecido como simbiose microrriza vesicular-arbuscular [Abdellatif et al. 2009]. Bactérias endófitas foram também encontradas em praticamente todas as plantas estudadas, onde coloniza um nicho ecológico semelhante ao de fungos, tais como os tecidos saudáveis internos. Embora a maioria das bactérias endofíticas pareçam se originar da rizosfera ou filosfera; al- gunas podem ser transmitidas através da semente [Ryan et al. 2008].

[005] A germinação das sementes é uma fenofase vital para a sobrevivência e reprodução das plantas em condições ambientais ideais ou estressantes. A colonização endofítica microbiana no estado semente é especialmente crítica por causa do papel da semente como um órgão gerador na regeneração e dispersão de plantas com flores [Baskin and Baskin 2004] e o papel dos micobiontes e bactérias simbi- oticamente associadas (bactobiontes) como s potenciais condutores de recrutamento de plântulas em habitatis naturais - não perturbadas, perturbados e poluídos - [Mühlmann and Peintner 2000; Adriaensen et al. 2006; White and Torres 2010]. Assim, os métodos em desenvolvimento, através dos quais a emergência das plântulas pode ser melhorada e protegida sob as limitações da pressão de doenças, calor ou seca é precioso. A utilização de endófitos simbiontes é um método promissor pelo qual a germinação da semente pode ser aumentada [Vujanovic et al. 2000; Vujanovic and Vujanovic 2006; Vujanovic and Vujanovic 2007]. Se a hipótese de que a robustez do estresse da planta pode ser conferida através de uma relação micobionte-semente conhecida como micovitalidade - um fenômeno que tinha sido reservada para Orchidaceae [ Vujanovic 2008] e via bactovitalidade que se refere a uma forma de bactosimbiose, utilizando diferentes linhagens endofí- ticas com variedade de atividades.

SUMÁRIO

[006] As endófitas podem beneficiar plantas hospedeiras como trigo, cevada, legumes, colza, árvores, arbustos ou relva em uma variedade de formas, incluindo bactovitalidade, micovitalidade e micohetero- trofia, e aumentado a tolerância ao estresse ambiental, tal como aqui demonstrado. Assistência pré-natal na agricultura, como aqui demonstrado com seis linhagens endofíticas, é mais do que apenas vitalidade de sementes ou germinativa, saúde ou o vigor. Também determina o que esperar antes e durante o processo de germinação, estabelecimento de mudas e, mais tarde, a produtividade ou rendimento das culturas.

[007] Vários parâmetros de eficácia simbiótica (quebra de dor mência, germinação, crescimento e rendimento) foram avaliados usando interações cepas-colheitas de Saskatchewan Microbial Collection and Database (SMCD) endofíticas eficientes em condições in vitro, fitotron, estufa e de campo.

[008] Também foi testada a capacidade de endófito bacteriana para conferir vitalidade das sementes. Para ambos os endosimbiontes fúngicos e bacterianos, vitalidade de sementes melhorada pode aumentar a tolerância para estresses bióticos e abióticos em plantas que progrediram além do estágio de plântula até a maturidade da planta via micoheterotrofia.

[009] Por conseguinte, a presente invenção proporciona uma en- dófita isolada de cepa Streptomyces sp . ou cultura da mesma que é depositado em International Depositary Authority of Canada (IDAC, National Microbiology Laboratory. Public Health Agency of Canada. 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canada, R3E 3R2) o número de acessão 081111-06 ou que compreende a sequência de 16S rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 6; um endófito isolado de cepa Paraconyothirium sp. ou cultura da mesma que é depositada como o número de acessão IDAC 081111-03 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 5; um endófito isolado de cepa Pseudeurotium sp. ou cultura da mesma que é depositado sob o número de acessão IDAC 081111-02 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 4; um endófito isolado de Penicillium sp. ou cultura da mesma que é depositado sob o número de acessão IDAC 081111-01 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 3; uma cultura isolada do Cla- dosporium sp. que é depositado sob o número de acessão IDAC 200312-06 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 1, e/ou um endófito isolado de Cladosporium sp. ou cultura da mesma que é depositado sob o número de acessão IDAC 200312-05 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 2.

[0010] É também aqui proporcionada uma composição compreen dendo um endófito isolado ou cultura aqui revelada, ou uma combinação ou mistura dos mesmos e um transportador.

[0011] É ainda aqui proporcionada uma semente que compreende um endófito ou cultura aqui descrita. Em uma modalidade, a semente é revestida com o endófito. Em uma outra modalidade, a semente é plantada em cultura ou perto do endófito de tal modo que o endófito é capaz de colonizar a semente.

[0012] A presente invenção também proporciona métodos para melhorar a vitalidade das sementes e melhorar a saúde e a produtividade das plantas em condições normais e condições estressantes. Por conseguinte, é proporcionado um método de melhorar a vitalidade das sementes, saúde da planta e/ou o rendimento da planta que compreende uma semente de inoculação com um endófito ou cultura aqui revelado, ou uma combinação ou mistura dos mesmos, ou com uma composição aqui revelada; e cultivar a semente em uma planta de primeira geração.

[0013] Em uma modalidade, o método compreende a inoculação de sementes com um endófito isolado ou cultura do mesmo da cepa Streptomyces sp . que está depositada sob o IDAC 081111-06 ou que compreende a sequência 16S rDNA como apresentado na SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, o método aumenta a germinação de sementes, diminui o tempo para atingir a energia de germinação, reduz o tempo necessário para a germinação hidrotérmica, aumenta o vigor da germinação de sementes, aumenta o peso fresco das plântulas, aumenta a atividade e frequência de nodulação Rhizobium , e/ou aumenta o rendimento das mudas. Em outra modalidade, o método compreende a redução dos efeitos do estresse, como seca, calor e/ou estresse biótico, como infecção por Fusarium .

[0014] Em outra modalidade, o método compreende a inoculação de sementes com um endófito isolado ou cultura dos mesmos de cepa Paraconyothirium sp. que está depositada como IDAC 081111-03 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 5. Em uma modalidade, o método aumenta a germinação de sementes, diminui o tempo para atingir a energia de germinação, reduz o tempo necessário para a germinação hidrotérmica, aumenta o vigor de germinação das sementes, aumenta o peso fresco das plântulas e/ou aumenta o rendimento das mudas. Em outra modalidade, o método compreende a redução dos efeitos do estresse, como seca, calor e/ou estresse biótico, como infecção por Fusarium .

[0015] Em ainda outra modalidade, o método compreende a inocu lação de sementes com um endófito isolado ou cultura dos mesmos de Pseudeurotium sp. que é depositada sob IDAC 081111-02 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade, o método diminui o tempo para atingir a energia de germinação, reduz o tempo necessário para a germinação hidrotérmica, aumenta o vigor de germinação das sementes, e/ou aumenta o peso fresco das plântulas. Em outra modalidade, o método compreende a redução dos efeitos do estresse, como seca e/ou estresse de calor.

[0016] Em outra modalidade, o método compreende a inoculação de sementes com um endófito isolado ou cultura dos mesmos de Pe- nicillium sp. que é depositada sob IDAC 081111-01 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade, o método aumenta a germinação de sementes, diminui o tempo para atingir a energia de germinação, reduz o tempo necessário para a germinação hidrotérmica, aumenta o vigor de germinação das sementes, e/ou aumenta o rendimento das mudas. Em outra modalidade, o método compreende estratificação melhorada, rompimento da dormência e resistência ao estresse aumentada através da modulação hormonal ent-kaurenoic (KAO), a repressão de genes de crescimento de rebentos (RSG), o ácido abscísico (ABA), ácido giberélico GA, 14-3-3 ou óxido nítrico (NO) e/ou resistência ao estresse da superóxido dismutase (SOD), estresse ao manganês SOD (MnSOD), expressões de genes de prolina (Pro) ou MYB, reduzindo os efeitos do estresse, como a seca, calor e/ou estresse biótico, como infecção por Fusarium.

[0017] Em ainda outra modalidade, o método compreende a inocu lação de sementes com um endófito isolado ou cultura dos mesmos de Cladosporium sp. que é depositada sob IDAC 200312-06 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, o método diminui o tempo para atingir a energia de germinação, reduz o tempo necessário para a germinação hidrotérmi- ca, aumenta o vigor de germinação das sementes, e/ou aumenta o peso fresco das plântulas. Em uma modalidade, o método compreende reduzir os efeitos do estresse, como seca e/ou calor.

[0018] Em ainda outra modalidade adicional, o método compreen de a inoculação de sementes com um endófito isolado ou cultura dos mesmos de Cladosporium sp. que é depositada sob IDAC 200312-05 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, o método compreende reduzir os efeitos do estresse, como seca e/ou estresse de calor.

[0019] Em uma modalidade, a semente é revestida com o endófito, cultivada com o endófito ou plantada perto do endófito. Em uma modalidade particular, a semente plantada perto do endófito é cerca de 4 cm de distância do endófito.

[0020] A planta pode ser qualquer planta. Em uma modalidade, a planta é um cereal (trigo ou cevada), leguminosa (ervilha, lentilha ou grão de bico), linho, canola, árvore conífera (abeto ou pinheiro), árvore de folha larga (salgueiro ou choupo), arbusto (caragana ou winterfat) ou grama (galho ou wildrye).

[0021] Em outro aspecto, é proporcionado um método de melhoria da saúde das plantas e/ou o rendimento da planta compreendendo o tratamento de material de propagação da planta ou uma planta com um endófito ou cultura aqui revelado, ou uma mistura ou combinação destes ou uma composição aqui revelada; e cultivar o material de propagação da planta em uma planta de primeira geração ou permitir que a planta cresça.

[0022] Em uma modalidade, o material de propagação vegetal é qualquer planta geradora/sexual (semente, broto generativa ou flor) e parte vegetativa/assexuada (caule, corte, raiz, bulbo, rizoma, tubérculo, broto vegetativo, ou folha) que tem a capacidade a ser cultivada em uma nova planta.

[0023] Em uma modalidade, o endófito isolado ou cultura dos mesmos é um endófito isolado de cepa Streptomyces sp . ou cultura da mesma que é depositado em International Depositary Authority of Canada (IDAC, National Microbiology Laboratory. Public Health Agency of Canada. 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canada, R3E 3R2) número de acessão 081111-06 ou que compreende a sequência de 16S rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 6; um endófito isolado de cepa Paraconyothirium sp. ou cultura da mesma que é depositado como o número de acessão IDAC 081111-03 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 5; um endófito isolado de Pseudeurotium sp. ou cultura da mesma que é depositado sob o número de acessão IDAC 081111-02 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 4; um endófito isolado de Penicillium sp. ou cultura da mesma que é depositado sob o número de acessão IDAC 081111-01 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 3; uma cultura isolada do Cladosporium sp. que é depositado sob o número de acessão 200312-06 IDAC ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 1, e/ou um endófito isolado de Cladospo- rium sp. ou cultura da mesma que é depositado sob o número de acessão IDAC 200312-05 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 2.

[0024] Em uma modalidade, os métodos aumentam o desenvolvi mento da paisagem e reparação. Por conseguinte, em uma modalidade, é proporcionado um método para reduzir a contaminação do solo que compreende o tratamento de material de propagação da planta ou uma planta com um endófito ou cultura aqui revelado, ou uma mistura ou combinação destes ou uma composição aqui revelada; e cultivar o material de propagação da planta em uma planta de primeira geração ou permitir que a planta cresça. Em uma modalidade, o contaminante de solo é hidrocarboneto, petróleo ou outras substâncias químicas, sais ou metais, como o chumbo, o cádmio ou radioisótopos.

[0025] Em outra modalidade, os métodos reduzem os efeitos do estresse, como o calor, seca e/ou estresse biótico.

[0026] A planta pode ser qualquer planta. Em uma modalidade, a planta é um cereal (trigo e cevada), leguminosa (ervilha, lentilha ou grão de bico), linho, canola, árvore conífera (abeto ou pinheiro), árvore de folha larga (salgueiro ou choupo), arbusto (caragana ou winterfat) ou grama (festuca ou centeio selvagem).

[0027] Outras características e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada. Deve ser entendido, no entanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indicando modalidades da invenção são apresentadas a título de ilustração unicamente, uma vez que várias alterações e modificações dentro do espírito e escopo da descrição irão se tornar evidentes para aqueles especialistas na técnica a partir desta descrição detalhada e respectivos desenhos e legendas dos desenhos .

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0028] A descrição agora será descrita em relação aos desenhos nos quais:

[0029] Figura 1 mostra a aparência fenotípica das cepas de fungos endofíticos SMCD 2204, 2004F, 2206, 2208 e 2210 e cepa bacteriana SMCD 2215; após 10 dias de crescimento em BDA, a 21°C.

[0030] Figura 2 mostra a árvore filogenética neighbour-joining infe rida do Cladosporium spp. SMCD 2204 e SMCD 2204F com base na sua rDNA. Números dos nós indicam valores de suporte de bootstrap para 1000 repetições; apenas valores que estavam> 70% são apresentados. Barra indica 0,01 substituições de nucleotídeos por sítio (posição de nucleotídeo).

[0031] Figura 3 mostra a árvore filogenética neighbour-joining inferida do Penicillium sp. SMCD 2206 com base na sua rDNA. Números dos nós indicam valores de suporte de bootstrap para 1000 replicações ; apenas valores que estavam> 70% são apresentados. Barra indica 0,01 substituições de nucleotídeo por sítio (posição de nucleotídeo).

[0032] Figura 4 mostra a árvore filogenética neighbour-joining inferida do Pseudeurotium sp. SMCD 2208 com base na sua rDNA. Números dos nós indicam valores de suporte de bootstrap para 1000 replicações ; apenas valores que estavam> 70% são apresentados. Barra indica 0,01 substituições de nucleotídeo por sítio (posição de nucleotídeo).

[0033] Figura 5 mostra a árvore filogenética neighbour-joining inferida de Coniothyrium cepa SMCD 2210 com base na sua rDNA. Números dos nós indicam valores de suporte de bootstrap para 1000 replicações ; apenas valores que estavam> 70% são apresentados. Barra indica 0,05 substituições de nucleotídeo por sítio (posição de nucleotídeo).

[0034] Figura 6 mostra a árvore filogenética neighbour-joining infe rida de Streptomyces sp cepa SMCD 2215 com base em 16S rDNA. Números dos nós indicam valores de suporte de bootstrap para 1000 replicações ; apenas valores que estavam> 60% são apresentados. Barra indica 0,05 substituições de nucleotídeo por sítio (posição de nucleotídeo).

[0035] Figura 7 mostra compartimentos da esquerda de placas de divisão (plantas com parceiro microbiano): aparência fenotípica saudável de trigo quando a raiz é cultivada em contato com tapetes microbianos; e compartimentos da direita de placas de divisão (plantas sem parceiro microbiano): formação maciça de pelos radiculares de trigo devido à associação planta-fungo feita nos compartimentos de esquerda das placas de divisão.

[0036] Figura 8 (A) e (C) mostra SMCD2206 descontínua coloni zação de raiz de trigo (epiderme e córtex) do tecido em comparação com (B) e (D), que mostra colonização celular uniforme/contínua de Fusarium graminearum patogênico de raiz de trigo incluindo cilindro vascular.

[0037] Figura 9 mostra Índice IREG - nível de desvio (irregularida de) em endófito (SMCDs) na forma celular.

[0038] Figura 10 mostra Índice Idir - nível de direção muda quando colonizando célula hospedeira de planta viva.

[0039] A Figura 11 mostra hifas endofíticas em raízes de trigo germinativo (A- SMCD 2204; B- SMCD 2206; C- SMCD 2210; e D- SMCD-2215) visualizadas com coloração lactofucsina e microscopia de fluorescência. Estruturas simbióticas/órgãos: (D) endófito bacteria- no SMCD 2215 formou principalmente filamentos intercelulares encaracolados, enquanto fungos endofíticos (figuras à direita) produziram: Emaranhados intracelulares e arbúsculos de SMCD 2204, vesículas intracelulares de SMCD 2206, e nós intracelulares de SMCD 2110.

[0040] Figura 12 mostra a aparência de mudas do trigo em germi nação simbiótica após 10 dias no papel de filtro umedecido em 21°C.

[0041] Figura 13 mostra comprimento da folha de mudas de trigo em germinação após 10 dias no papel de filtro umedecido a 21°C.

[0042] Figura 14 mostra um método de inoculação in vitro (A). Um plugue de 5 mm 2 em ágar, cortado a partir da margem da colônia parente, foi colocado ao lado de hifas para baixo no centro de uma placa de Petri de 60 mm contendo meio batata dextrose ágar (PDA). Em seguida, cinco sementes esterilizadas na superfície foram colocadas a uma distância equivalente a 48 h de crescimento de hifas do plugue de ágar e germinaram no escuro. O impacto de três métodos de esterilização de sementes de superfície sobre a germinação de sementes (B). Barras marcadas com um ou dois asteriscos (*) são significativamente, ou altamente significativamente, diferente do mesmo endófito cultivado sob condições de controle (p < 0,05 ou p < 0,01, respectiva-mente; ANOVA seguida do teste post-hoc LSD). As barras de erro re-presentam o erro padrão da média (SE).

[0043] A Figura 15 mostra as taxas de crescimento de endófitos de vida livre SMCD 2204, 2206, 2208, 2210, e 2215 in vitro em ágar de dextrose de batata (PDA) em estresse por calor (36°C), estresse de seca (8% polietileno glicol (PEG) 8000) e condições de controle de cinco dias e simultaneamente calor (36°C) e seca (8% de PEG) durante seis dias. Barras marcadas com um ou dois asteriscos (*) são significativamente, ou altamente significativamente, diferente do mesmo endófito cultivado sob condições de controle (p < 0,05 ou p < 0,01, respectivamente; ANOVA seguida do teste post-hoc LSD). As barras de erro representam o erro padrão da média (SE).

[0044] Figura 16 mostra o percentual de germinação e massa fresca de mudas de experimentos iniciais em que as sementes foram esterilizadas à superfície em hipoclorito de sódio a 5% por 3 min. Germinação percentual de sementes de trigo in vitro depois de três dias em ágar de dextrose de batata (PDA) sob estresse térmico (36 oC), estresse hídrico (8% de polietilenoglicol (PEG) 8000) e as condições de controle (A, B e C) com o eixo y normalizado para percentagem de germinação obtida sob as mesmas condições por sementes esterilizadas na superfície com hipoclorito de sódio a 5% durante 1 min. Peso fresco de mudas in vitro em sete dias no PDA sob estresse térmico, estresse hídrico e as condições de controle (D, E e F). Barras marcados com um (*) ou dois asteriscos (**) são significativamente, ou altamente significativamente, diferente do controle sem endófito (p < 0,05 ou p < 0,01, respectivamente; ANOVA seguida do teste post-hoc LSD). As barras de erro representam o erro padrão da média (SE).

[0045] Figura 17 mostra a percentagem de germinação ao longo do tempo de sementes de trigo co-cultivadas com os endófitos mais eficazes para conferir tolerância ao estresse abiótico (SMCD 2206, 2210 e 2215), em comparação com sementes não estressadas, não colonizadas (controle positivo) e sementes não colonizadas, estressadas (controle negativo). Energia de germinação (EG) está relacionada com o tempo, em dias (eixo x) em que 50% da germinação (eixo dos y) é alcançada. Os símbolos "■", "x", "o", "Δ", e "□" representam o con- trole positivo, sementes SMCD 2206 tratadas, sementes SMCD 2210 tratadas, sementes SMCD 2215 tratadas e controle negativo, respectivamente. Tratamentos térmicos e seca correspondem a 36°C e 8% de polietilenoglicol (PEG) 8000, respectivamente. As barras de erro representam o erro padrão da média (SE). Nota: As sementes utilizadas na determinação EG foram a partir da segunda rodada de experimentos, e, portanto, esterilizadas em solução de hipoclorito de sódio a 5% por um minuto, em vez de três.

[0046] Figura 18 mostra a relação entre o tempo hidrotérmico (HTT) necessário para alcançar a germinação de 50% para o calor e a seca sozinho e germinação de 5% para o calor e a seca combinados (eixo x) e a percentagem de germinação atingida após sete dias (eixo y). Germinação, após sete dias e HTT foram baseados nos resultados da segunda rodada de experimentos. Os símbolos "■", "□" e "▲" representam sementes expostas ao calor (36°C), seca (8% de polietile- noglicol (PEG) 8000) ou ambos calor e seca, respectivamente. Os valores de R-quadrado associados às linhas de tendência são 0,96, 0,80 e 0,18 para as sementes expostas ao calor, seca ou calor e estresse hídrico, respectivamente. Nota: As sementes utilizadas para determinar a percentagem de germinação aos sete dias e HTT eram da se-gunda rodada de experimentos, e, portanto, tratadas com hipoclorito de sódio a 5% por um minuto, em vez de três.

[0047] Figura 19 mostra sementes tratadas ou inoculadas com ce pas SMCD demonstra melhora em todos os parâmetros de germinação de sementes testados, incluindo eficácia no vigor de germinação das sementes (SGV).

[0048] Figura 20 mostra a relação entre os valores de eficiência de tolerância à seca (DTE) em cultivares de trigo (A) e cevada (B) sem (E-) e com (E +) endófitos, com base no efeito médio de simbiose usando todos os isolados de SMCD testados, sobre a produção expos- tos ao estresse hídrico em estufa.

[0049] A Figura 21 mostra (A) inoculantes endofíticos (E +) (SMCD 2206, SMCD 2210, e SMCD 2215) que melhoram a produção de grãos em genótipos de trigo em relação ao tratamento com controle (E-) (rendimento g/3 potes). (B) Inoculantes endofíticos (SMCD 2206, SMCD 2210, e SMCD 2215) melhoram a produção de grãos em cevada de duas fileiras (B a ) e cevada de seis fileiras (B b) em genótipos (rendimento do kernel: 3plantas/vaso).

[0050] Figura 22 mostra (A) Cevada de seis fileiras AC Metcalfe, da esquerda para a direita: Seca (E-), Seca e SMCD 2206 (E +), Controle (E-), Controle e SMCD 2206 (E +); (B) cultivar de trigo Unity, da esquerda para a direita: Seca (E-), Seca e SMCD 2215 (E +), Controle (E-), Controle e SMCD 2215 (E +); (C) cultivar de trigo-Verona, da esquerda para a direita: Seca (E-), Seca e SMCD 2215 (E +), Controle (E-), Controle e SMCD 2215 (E +); e (D) Trigo duro-TEAL, da esquerda para a direita: Seca (E-), Seca e SMCD 2210 (E +), Controle (E-), Controle e SMCD 2210 (E +).

[0051] Figura 23 mostra tronco peso seco de (A) grão de bico, (B) lentilhas, e (C) ervilhas em simbiose com endófitos SMCD (E +) sob condições fitotron de estresse térmico. Barras marcados com um (*) ou dois asteriscos (**) são significativamente, ou altamente significativamente, diferente controle estressado sem endófito (p < 0,05 ou p < 0,01, respectivamente; ANOVA seguida do teste post-hoc LSD).

[0052] A Figura 24 mostra peso seco de vagens de (A) grão de bico, (B) lentilhas, e (C) ervilhas em simbiose com endófitos SMCD (E +) sob condições fitotron de estresse térmico. Barras marcados com um (*) ou dois asteriscos (**) são significativamente, ou altamente significativamente, diferente controle estressado sem endófito (p < 0,05 ou p < 0,01, respectivamente; ANOVA seguida do teste post-hoc LSD).

[0053] Figura 25 mostra peso seco de raízes de (A) grão de bico, (B) lentilhas, e (C) ervilhas em simbiose com endófitos SMCD (E +) sob condições fitotron de estresse térmico. Barras marcados com um (*) ou dois asteriscos (**) são significativamente, ou altamente significativamente, diferente controle estressado sem endófito (p < 0,05 ou p < 0,01, respectivamente; ANOVA seguida do teste post-hoc LSD).

[0054] Figura 26 mostra peso seco de caule de (A) grão de bico, (B) ervilhas e lentilhas (C) sob estresse hídrico em uma estufa. Barras marcados com um (*) ou dois asteriscos (**) são significativamente, ou altamente significativamente, diferente do endófito não (E-), controle estressado (p < 0,05 ou p < 0,01, respectivamente; ANOVA, seguido por teste post-hoc teste LSD).

[0055] A Figura 27 mostra pesos secos de vagens de (A) grão de bico, (B) ervilhas, e (C) lentilhas, em associação com um endófito (E +) sob estresse hídrico na estufa. Barras marcados com um (*) ou dois asteriscos (**) são significativamente diferentes do controle estressado sem endófito (E-), (p < 0,05 ou p < 0,01, respectivamente; ANOVA seguida do teste post-hoc LSD).

[0056] A Figura 28 mostra as peso seco de raízes de (A) grão de bico, (B) ervilhas e lentilhas (C) sob estresse hídrico em estufa. Barras marcadas com um (*) ou dois asteriscos (**) são significativamente, ou altamente significativa, diferente de controle estressado sem endófito (E-) (p < 0,05 ou p < 0,01, respectivamente; ANOVA, seguido pelo teste post-hoc LSD).

[0057] A Figura 29 mostra A. plantas com flores de grão de bico Vanguard contendo vagens sob estresse hídrico em uma estufa - planta esquerda é não-simbiótica (E-) e planta da direita é simbiótica com a cepa SMCD 2215 (E +); B e C, as plantas de grão de bico Vanguard contendo vagens sob estresse hídrico em uma estufa - (B) não simbiótica e (C) simbiótica com SMCD 2215.

[0058] Figura 30 mostra nodulação das raízes das variedades de ervilha sob estresse térmico em um fitotron: Hendel (Acima) e Golden (Abaixo) inoculado (esquerda) e não inoculado (à direita) com SMCD 2215. Nota: em todas as amostras infecção natural com Rhizobium sp. a partir de sementes de ervilha foi observada.

[0059] Figura 31 mostra SMCD2206 e SMCD 2215 consideravel mente aumenta a energia de germinação das sementes (>50%) em Glamis (lentilha) como uma função do tempo sob calor e seca in vitro.

[0060] Figura 32 mostra SMCD2206 e SMCD 2215 consideravel mente aumenta energia de germinação das sementes (>50%) em Handel (ervilha) como uma função do tempo sob calor e seca in vitro.

[0061] Figura 33 mostra inoculantes endofíticos (SMCD 2206 e 2210) SMCD melhoram o rendimento de linho sob condições de seca em uma estufa. Diferentes letras acima das barras indicam diferenças estatisticamente significativas entre as amostras (p <0,05, teste de Kruskal-Wallis).

[0062] Figura 34 mostra inoculantes endofíticos (SMCD 2206, SMCD 2210, e SMCD 2215) melhoram o rendimento de Canola sob condições de seca em uma estufa. Diferentes letras acima das barras indicam diferenças estatisticamente significativas entre as amostras (p <0,05, teste de Kruskal-Wallis).

[0063] A Figura 35 mostra a sobrevivência de sementes de trigo pré-inoculadas in vitro - (placas em linha acima) e plântulas de trigo pré-inoculadas em estufa (potes na linha de baixo) com SMCD endofí- tico 2206-mostrando crescimento saudável das plantas , e com Fusarium avenaceum patogênico e Fusarium graminearum - mostrando sintomas doença e morte de plantas.

[0064] Figura 36 mostras inoculantes de Fusarium produzidos em grãos de trigo.

[0065] Figura 37 mostra que tombamento pós-emergência foi im pedido por SMCD 2206 endófito em estufa.

[0066] Figura 38 mostra biomassa de trigo (aérea a-d e raiz e-f) melhorou na presença de SMCD 2206 endófito em comparação com plantas não tratadas. (a) planta de controle (E-), (b) planta inoculada (E +), (c) plantas de floração de controle, (d) planta de floração inoculada, (e) planta de controle (E-, à esquerda) em comparação com planta inoculada com SMCD 2206 (E +, à direita), e (f) microscopia de fluorescência de colonização de raiz de trigo com SMCD 2206 (E +).

[0067] Figura 39 mostra uma biomassa/planta aérea ( esquerda) e biomassa/planta subterrânea (raiz) (direita) no controle (E-) e planta inoculada com SMCD (E +) contra F. graminearum e F. avenaceum . Barras de erro vertical em pontos de dados representam o erro padrão da média.

[0068] Figura 40 mostra o comprimento da raiz em planta de con trole (CDC Teal) sem SMCD endófito em comparação com planta inoculada com cepas SMCD. Barras em pontos de dados representam o erro padrão da média.

[0069] Figura 41 mostra o peso seco de grãos/planta (cultivar TEAL) utilizando a abordagem dupla pré-inoculação: a) endófito SMCD + Fusarium avenaceum (F.av), e b) endófito SMCD + Fusarium grami- nearum (F.gr). Barras de erro verticais em pontos de dados representam o erro padrão da média.

[0070] Figura 42 mostra comparação de tamanhos de pico TEAL na presença de patógeno (controle negativo) e sem presença do pató- geno (controle positivo). Figura da esquerda - da esquerda para a direita: i) planta + F.gr, ii) planta + F.av, e (iii ) planta; figura da direita -da esquerda para a direita: i) planta; ii) planta + endófito; iii) planta + en- dófito + F. av; e iv) planta + endófito + F.gr.

[0071] Figura 43 mostra um padrão específico de cepa de germi nação simbiótica que descreve micovitalidade: Handel + 6% PEG - Controle (A), Handel + 6% PEG + SMCD 2204 (B); Handel + 6% PEG + SMCD 2204F (C), Handel + 6% PEG + SMCD 2206 (D), Handel + 6% PEG + SMCD 2210 (E), Handel + 6% PEG + SMCD 2215 (F) após 7d 21°C na escuridão.

[0072] Figura 44 mostra expressões de genes (A) SOD e (B) MnSOD relativas em Handel expostos a PEG com e sem endófitos.

[0073] Figura 45 mostra a expressão gênica relativa de prolina em Handel exposto a PEG com e sem endófitos.

[0074] A Figura 46 mostra a germinação de sementes de trigo in vitro depois de três dias em ágar de dextrose de batata (PDA). Estratificação a frio foi imposta por manter sementes em 4 0 C sala fria por 48 horas. Para tratamentos de endófitos indiretos e endófitos diretos, as sementes foram germinadas em cerca de 4 cm de distância e em contato direto respectivamente. A) Percentagem de germinação, em comparação com a energia de germinação (50% de germinação). B) A eficácia da germinação de sementes de trigo submetidas a estratificação a frio e biológica. A eficácia foi calculada por subtração da percentagem de germinação do controle das sementes tratadas.

[0075] Figura 47 mostra os padrões de expressão diferenciais de genes giberelina (TaGA3ox2 e 14-3-3) e ABA ( TaNCED2 e TaA- BA8'OH1 ) em coleorriza de sementes de trigo em germinação por três dias, sob estratificação fria e biológica. A expressão gênica foi calculada como 2 - α CT .

[0076] Figura 48 mostra a relação entre os níveis de expressão (2 - α CT) de genes giberelina (TaGA3ox2 e 14-3-3) e ABA (TaNCED2 e TaABA8'OH1) em coleorriza de sementes de trigo em germinação para três dias, sob estratificação fria e biológica.

[0077] A Figura 49 mostra os padrões de expressão relativa de genes RSG hormonal e reguladores KAO e genes de resistência MYB 1 e MYB 2 em coleorriza de sementes de trigo em germinação para três dias, sob estratificação fria e biológica. A expressão gênica foi cal- culada como 2 - Δ CT .

[0078] Figura 50 mostra radícula emergente a partir de sementes de trigo em germinação (A) de fluorescência invertida (B) e imagiologia de fluorescência de fluorescência DAF-2DA após reação com o NO em células radículas (C) da AC Avonlea germinativa em 5 minutos após tratamento [Nakatsubo et al. 1998] com o exsudado SMCD 2206 de fungo. Nenhuma reação de fluorescência observada nas células radículas de controle. Barra =25μm; Barra =50μm.

[0079] Figura 51 mostra valores de intensidade de fluorescência DAF-2T a 5 min após o tratamento de radícula de trigo dos germinan- tes AC Avonlea com o exsudato SMCD 2206 de fungo, exsudato de fungo juntamente com o depurador de NO cPTIO, e água estéril. Segmentos de radícula foram incubados durante 30 min em 2 mL de tampão de detecção (10 mM de Tris-HCl, pH 7,4, KCl 10 mM) contendo 15 μM FAD-2DA (Sigma-Aldrich) com ou sem 1 mM de 2- (4-carboxifenil) -4,4,5,5-tetrametilimidazolina- 1-oxi-3-óxido (cPTIO) como um depura- dor de NO. Os valores médios de fluorescência são apresentados como uma razão entre a intensidade de fluorescência a 5 minutos para a intensidade de fluorescência no tempo 0. Letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas entre as amostras (p <0,05, teste de Kruskal-Wallis).

DESCRIÇÃO DETALHADA Novas cepas, composições e Sementes

[0080] Os presentes inventores isolaram seis novas cepas endofí- ticas que melhoram a vitalidade das sementes e saúde vegetal e em condições normais de rendimento e/ou condições estressadas. Estes endófitos foram depositadas como se segue: International Depository Authority of Canada - IDAC (cepas originais depositadas - IDAC, National Microbiology Laboratory, Public Health Agency of Canada, 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canada, R3E 3R2; recibos e vi- abilidade no Apêndice A) e Saskatchewan Microbial Collection and Database - Cepas SMCD (cópias de cepas depositadas): IDAC 081111-06 = SMCD 2215; IDAC 081111-03 = SMCD 2210; IDAC 081111-02 = SMCD 2208; IDAC 081111-01 = SMCD 2206; IDAC 200312-06 = SMCD 2204; e IDAC 200312-05 = SMCD 2204F.

[0081] Por conseguinte, a presente invenção proporciona um en- dófito isolado de cepa Streptomyces sp. ou cultura da mesma que é depositado sob IDAC 081111-06 ou que compreende a sequência de 16S rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 6; um endófito isolado de cepa Paraconyothirium sp. ou cultura da mesma que é depositado como IDAC 081111-03 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 5; um endófito isolado de Pseudeurotium sp. ou cultura da mesma que é depositado sob IDAC 081111-02 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 4; um endófito isolado de Penicillium sp. ou cultura da mesma que é depositado sob IDAC 081111-01 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 3; uma cultura isolada do Cla- dosporium sp. que é depositada sob IDAC 200312-06 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 1; e/ou um endófito isolado de Cladosporium sp. ou cultura da mesma que é depositado sob IDAC 200312-05 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 2; ou combinações ou misturas destes.

[0082] O termo "endófito", tal como aqui utilizado refere-se a um organismo bacteriano ou de fungos que pode viver em simbiose em uma planta e é também referido aqui como "endosimbionte". Um endó- fito de fungo pode estar na forma de um esporo, hifa, ou micélios. Um endófito bacteriano pode ser uma célula ou grupo de células. O termo "endófito" como aqui utilizado inclui a descendência das cepas aqui referidas.

[0083] É também aqui proporcionada uma composição compreen dendo um endófito isolado ou cultura aqui revelada, ou uma combinação ou mistura dos mesmos e um transportador. Os transportadores típicos incluem, entre outros, um material inerte (não à base de carbono) usado para suportar e fornecer o ingrediente ativo densamente povoado com o alvo, e opcionalmente compostos adjuvantes que: promovem e sustentam a função do ingrediente ativo de proteção contra a radiação UV; garantem a solidez com chuva no alvo; retêm a umidade ou protegem contra a dessecação; e/ou promovem a disseminação e a dispersão do biopesticida utilizando equipamentos agrícolas convencionais, como aqueles divulgados por Hynes and Boyetchko (2006, Soil Biology & Biochemistry 38: 845-84).

[0084] Em outra modalidade, as composições compreendem pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou seis das cepas de endófitos ou culturas aqui descritas.

[0085] É ainda aqui proporcionada uma semente que compreende um endófito ou cultura aqui revelado, ou uma combinação ou mistura dos mesmos.

[0086] Em uma modalidade, a semente é inoculada por meio de inoculação com base no solo. Em outra modalidade, a semente é revestida com o endófito ou cultura do mesmo. Em ainda outra modalidade, a semente é pulverizada, injetada, inoculada, enxertada, revestida ou tratada com o endófito ou cultura da mesma.

Métodos

[0087] É ainda aqui proporcionado um método de aumentar a vita lidade das sementes, saúde da planta e/ou rendimento de uma semente que compreende a inoculação com um endófito ou cultura aqui reve- lado, ou uma combinação ou mistura dos mesmos, ou com uma composição aqui revelada; e cultivar uma planta de primeira geração a partir da semente.

[0088] A frase "inocular uma semente", tal como aqui utilizado re fere-se a aplicação, infecção, co-plantação ou o revestimento da semente com o endófito. As técnicas para a inoculação de sementes são conhecidas na técnica, por exemplo, tal como descritas por Hynes and Boyetchko (2006, Soil Biology & Biochemistry 38: 845-84).

[0089] O termo "melhorar a vitalidade das sementes", tal como aqui utilizado refere-se a cuidado pré-natal da planta melhorando a capacidade das sementes para germinar e produzir uma planta em condições normais e/ou condições forçadas e inclui, sem limitação, qualquer um ou mais dos seguintes: rompimento da dormência, fornecer estratificação de sementes, aumentar a germinação das sementes, modular a expressão do gene, reduzir tempo para atingir a energia de germinação, proteger contra estresses bióticos, proteger contra estresses abióticos, reduzir o tempo necessário para a germinação hidro- termal, aumentar vigor de germinação de sementes, aumentar a eficácia da germinação de sementes, aumentar a uniformidade de germinação de sementes, melhorar a eficácia da tolerância à seca/calor, aumentar o peso de plântulas e aumentar o rendimento das mudas. Eficiência de tolerância à Seca/Calor (DTE/A) é o termo oposto (antônimo) à susceptibilidade.

[0090] Energia de germinação é definida como 50% de germina ção, em relação ao número de sementes testadas. O vigor de germinação de sementes mostra a diferença entre a percentagem total de germinação das sementes tratadas e sementes em germinação não tratadas. O tempo hidrotérmico postula que uma semente individual começa a germinar quando a soma de ambas as temperaturas e potencial da água são suficientemente acumuladas ao longo de um perí- odo de tempo, permitindo a germinação. A eficácia de germinação é definida como a percentagem de germinação de sementes tratadas depois de um determinado período de tempo após o plantio, em relação ao número de sementes testadas num controle não tratado. Estratificação biológica é definida como liberar a dormência das sementes por um simbionte na promoção da germinação. Uniformidade de germinação das sementes representa a porcentagem máxima de germinação das sementes dentro de um tempo mínimo de incubação.

[0091] O termo "melhorar a saúde e/ou o rendimento da planta" como aqui utilizado refere-se às melhorias gerais nas características agrícolas de plantas (por exemplo, saúde e de produtividade) da planta resultante sob condições normais e/ou condições de estresse e inclui, sem limitação, qualquer um ou mais do seguinte: modular a expressão do gene RSG, KAO, ABAs, GAs, 14-3-3 ou NO para melhorar as atividades hormonais de plantas, modular a expressão gêni- ca de MYBs , Pro, SOD, ou MnSOD para melhorar a resistência ao estresse, como resistência aos estresses bióticos e abióticos, aumentar o peso dos vários tecidos, como raiz, caule, folhas e vagens, aumentar atividade de Rhizobium e frequência nodulação e melhorar as características das primeiras ou subsequentes gerações de sementes, incluindo, sem limitação, qualquer um ou mais dos seguintes: peso de semente da geração subsequente e energia de geração subsequente de germinação.

[0092] Genes horomonais KAO, RSG, ABAs, GAs, 14-3-3 e con juntos de iniciadores são como divulgado por Zhang et al. [2007]. Resistência ao estresse de genes SOD, MnSOD, Pro e MYB e conjuntos de iniciadores são apresentados na Tabela 6 e Tabela 9 (SEQ ID NO: 8-19).

[0093] O termo "diminuir" ou "aumentar", tal como aqui utilizado refere-se a uma diminuição ou aumento de uma característica das sementes tratadas com endófito ou planta resultante em comparação com sementes não tratadas ou uma planta resultante. Por exemplo, uma diminuição em uma característica pode ser, pelo menos, 5%, 10%, 15%, 25%, 50%, 75%, 100%, ou 200% ou menor do que o controle não tratado e um aumento pode ser pelo menos 5%, 10%, 15%, 25%, 50%, 75%, 100%, ou 200% ou maior do que controle não tratado.

[0094] Em uma modalidade, a planta é cultivada sob condições estressadas abióticas ou bióticas.

[0095] O termo "estresse abiótico", tal como aqui utilizado refere- se a um estresse de não vivo, que tipicamente afeta a vitalidade das sementes e a saúde da planta e inclui, sem limitação, o estresse ao calor e seca. Em uma modalidade, o estresse abiótico é estresse de calor. Em outra modalidade, o estresse abiótico é o estresse da seca, estresse osmótico ou estresse salino. O termo "estresse biótico", tal como aqui utilizado refere-se a um estresse vivo que afeta tipicamente a vitalidade das sementes e saúde das plantas, e inclui, sem limitação, infecções microbianas de plantas. Em uma modalidade, o estresse biótico é uma infecção por Fusarium .

[0096] Em uma modalidade, o método compreende a inoculação de sementes com um endófito isolado ou cultura do mesmo da cepa Streptomyces sp . que está depositada sob o IDAC 081111-06 ou que compreende a sequência 16S rDNA como apresentado na SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, o método aumenta a germinação de sementes, para diminuir o tempo para atingir a energia de germinação, para reduzir o tempo requerido para a germinação hidrotérmica, para aumentar vigor da germinação de sementes, para aumentar o peso fresco das plântulas, para aumentar atividade de Rhizobium e nodula- ção frequência e/ou para aumentar a produção de mudas. Em uma modalidade, o método compreende reduzir os efeitos do estresse, co- mo seca, calor e/ou estresse biótico.

[0097] Em outra modalidade, o método compreende a inoculação de sementes com um endófito isolado ou cultura dos mesmos de cepa Paraconyothirium sp. que está depositada como IDAC 081111-03 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 5. Em uma modalidade, o método aumenta a germinação de sementes, diminui o tempo para atingir a energia de germinação, reduz o tempo necessário para a germinação hidrotérmica, aumenta o vigor de germinação das sementes, aumenta o peso fresco das plântulas e/ou aumenta o rendimento das mudas. Em outra modalidade, o método compreende a redução dos efeitos do estresse, como seca, calor e/ou estresse biótico.

[0098] Em ainda outra modalidade, o método compreende a inocu lação de sementes com um endófito isolado ou cultura dos mesmos de Pseudeurotium sp. que é depositada sob IDAC 081111-02 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade, o método diminui o tempo para atingir a energia de germinação, reduz o tempo necessário para a germinação hidro- térmica, aumenta o vigor de germinação das sementes, e/ou aumento do peso fresco das plântulas. Em outra modalidade, o método compreende a redução dos efeitos do estresse, como seca e/ou estresse de calor.

[0099] Em outra modalidade, o método compreende a inoculação de sementes com um endófito isolado ou cultura dos mesmos de Pe- nicillium sp. que é depositada sob IDAC 081111-01 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade, o método aumenta a germinação de sementes, diminui o tempo para atingir a energia de germinação, reduz o tempo necessário para a germinação hidrotérmica, aumenta o vigor de germinação das sementes, e/ou aumenta o rendimento das mudas. Em outra modali- dade, o método compreende a redução dos efeitos do estresse, como seca, calor e/ou estresse biótico. Em outra modalidade, o método compreende aumentar a estratificação, romper a dormência e aumentar a resistência ao estresse através da modulação de genes hormonal KAO, RSG, ABAs, GAs, 14-3-3 ou NO e/ou expressão de genes de resistência ao estresse SOD, MnSOD, Pro ou MYB, reduzindo os efeitos do estresse, como a seca, calor e/ou estresse biótico.

[00100] Em ainda outra modalidade, o método compreende a inoculação de sementes com um endófito isolado ou cultura dos mesmos de Cladosporium sp. que é depositada sob IDAC 200312-06 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, o método diminui o tempo para atingir a energia de germinação, reduz o tempo necessário para a germinação hidrotérmi- ca, aumenta o vigor de germinação das sementes, e/ou aumenta o peso fresco das plântulas. Em uma modalidade, o método compreende reduzir os efeitos do estresse, como seca e/ou calor.

[00101] Em ainda outra modalidade adicional, o método compreende a inoculação de sementes com um endófito isolado ou cultura dos mesmos de Cladosporium sp. que é depositada sob IDAC 200312-05 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, o método compreende reduzir os efeitos do estresse, como seca e/ou estresse de calor.

[00102] O termo "planta" como aqui utilizado refere-se a um membro do Reino Plantae e inclui todas as fases do ciclo de vida da planta, incluindo, sem limitação, sementes. Em uma modalidade, a planta é um cereal (trigo e cevada), leguminosa (ervilha, lentilha ou grão de bico), de linho, de canola ou de plantas.

[00103] Em uma modalidade, a semente é revestida com o endófito, cultivada com o endófito ou plantada perto do endófito. Em uma modalidade particular, a semente plantada perto do endófito é cerca de 4 cm de distância do endófito.

[00104] Em outro aspecto, é proporcionado um método de melhoria da saúde das plantas e/ou o rendimento da planta compreendendo o tratamento de material de propagação da planta ou uma planta com um endófito ou cultura aqui revelado, ou uma combinação ou mistura dos mesmos, ou com uma composição aqui revelada; e cultivar o material de propagação da planta em uma planta de primeira geração ou permitir que a planta cresça.

[00105] O termo "material de propagação de plantas" tal como aqui utilizado refere-se a qualquer parte da planta geradora/sexual e vege- tativa/assexuada que tem a capacidade de ser cultivada em uma planta nova. Em uma modalidade, o material de propagação da planta é semente geradora, broto gerador ou flor, e caule vegetativo, corte, raiz, bulbo, rizoma, tubérculo, broto vegetativo, ou partes da folha.

[00106] Em uma modalidade, o endófito isolado ou cultura dos mesmos é um endófito isolado de cepa Streptomyces sp . ou cultura da mesma que é depositado em International Depositary Authority of Canada (IDAC, National Microbiology Laboratory. Public Health Agency of Canada. 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canada, R3E 3R2) o número de acessão 081111-06 ou que compreende a sequência de 16S rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 6; um endófito isolado de cepa Paraconyothirium sp. ou cultura da mesma que é depositada como o número de acessão IDAC 081111-03 ou que com-preende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 5; um endófito isolado de cepa Pseudeurotium sp. ou cultura da mesma que é depositado sob o número de acessão IDAC 081111-02 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 4; um endófito isolado de Penicillium sp. ou cultura da mesma que é depositado sob o número de acessão IDAC 081111-01 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 3; uma cultura isolada do Cladosporium sp. que é depositado sob o número de acessão IDAC 200312-06 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 1, e/ou um endófito isolado de Cladospo- rium sp. ou cultura da mesma que é depositado sob o número de acessão IDAC 200312-05 ou que compreende a sequência ITS rDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 2.

[00107] Em outra modalidade, os métodos reduzem os efeitos do estresse, como o calor, seca e/ou estresse biótico.

[00108] Em uma modalidade, os métodos aumentam o desenvolvimento da paisagem e reparação.

[00109] Por conseguinte, em uma modalidade, é proporcionado um método de fitoremediação ou fitorecuperação de um local contaminado, compreendendo o tratamento de material de propagação da planta ou uma planta com um endófito ou cultura aqui revelado, ou uma combinação de mistura do mesmo ou uma composição aqui descrita, e cultivar o material de propagação na planta de primeira geração ou permitir que a planta cresça; assim, recuperar ou o local.

[00110] O termo "fitoremediação", tal como aqui utilizado refere-se à utilização de plantas para a remoção, redução ou neutralização das substâncias, ou resíduos de material perigoso a partir de um local, de modo a evitar ou minimizar quaisquer efeitos adversos sobre o ambiente. O termo "fitorecuperação", tal como aqui utilizado refere-se à utilização de plantas para a reconversão da terra perturbada com os seus usos produtivos anteriores ou outros.

[00111] Em uma modalidade, o local é o solo, tal como em um aterro. Em uma modalidade, as substâncias, resíduos ou materiais perigosos compreendem hidrocarbonetos, petróleo ou outras substâncias químicas, sais ou metais, como o chumbo, o cádmio ou radioisótopos.

[00112] A frase "tratamento de um material de propagação da planta ou planta" como aqui utilizado refere-se a aplicação do endófito ou cultura dos mesmos sozinhos ou com qualquer transportador sólido ou líquido para o material de propagação da planta ou planta ou uma parte da referida planta. Em uma modalidade, o tratamento compreende a aplicação foliar ou aplicação no solo do endófito ou sua combinação com qualquer transportador sólido ou líquido em todos os estágios de crescimento da planta.

[00113] A planta pode ser qualquer planta. Em uma modalidade, a planta é um cereal (por exemplo, trigo ou cevada), leguminosa (por exemplo, ervilha, lentilha ou grão de bico), linho, colza, árvore coníferas (por exemplo, abeto ou pinho), árvore de folha larga (por exemplo, salgueiro ou choupo), arbusto (por exemplo caragana ou winterfat ) ou grama (por exemplo, festuca ou centeio selvagem).

[00114] A invenção acima descreve geralmente o presente pedido. Uma compreensão mais completa pode ser obtida por referência aos seguintes exemplos específicos. Estes exemplos são descritos unicamente para fins de ilustração e não se destinam a limitar o escopo da revelação. Alterações na forma e substituição de equivalentes estão contempladas conforme as circunstâncias o possam sugerir ou tornar expediente. Embora termos específicos tenham sido aqui utilizados, estes termos são pretendidos em um sentido descritivo e não para fins de limitação.

[00115] Os seguintes exemplos não limitativos são ilustrativos da presente invenção:

EXEMPLOS EXEMPLOS (1-14)

[00116] Dormência e germinação dependem de vários processos e fatores. Para garantir estabelecimento de plântulas e sucesso, é importante controlar os processos ou condições subjacentes. O papel da genética de plantas, hormônios e diferentes tecidos de sementes foi relativamente bem estudado. Os presentes exemplos estudam a rela- ção de endófito- sementes de planta, transitando em uma fase simbiótica da raiz em direção a maturação das plantas.

Exemplo 1 Taxonomia

[00117] International Depository Authority of Canada - IDAC (cepas originais depositadas) e Saskatchewan Microbial Collection and Database - cepas SMCD (cópias de cepas depositadas) : IDAC 081111-06 = SMCD 2215; IDAC 081111-03 = SMCD 2210; IDAC 081111-02 = SMCD 2208; IDAC 081111-01 = SMCD 2206; IDAC 200312-06 = SMCD 2204; IDAC 200312-05 = SMCD 2204F (Figuras 1-6 e Tabela 1).

[00118] Cepa SMCD 2215 foi isolada originalmente como bactéria endofítica fungo SMCD endófito de planta Phyalocephala sensu lato . Classificação de acordo com Labeda et al. [2012]. Este estudo filoge- nético examina quase todas as espécies descritas (615 táxons) dentro da família Streptomycetaceae com base em sequências de genes 16S rDNA e ilustra a diversidade de espécies dentro desta família, o que é observado para conter 130 clades suportadas estatisticamente.

[00119] Os presentes dados de sequência 16S rDNA confirmam que cepa Streptomyces sp. SMCD 2215 pode ser atribuída a um clade desconhecido separado de acordo com Labeda et al [2012], mas espécies separadas de Streptomyces lividans .

Exemplo 2 Associação simbiótica micróbio-planta e nível de compatibilidade

[00120] O nível de compatibilidade micróbio-plantas foi avaliado utilizando um método ligeiramente modificado de Abdellatif et al. [2009]. Em uma placa ágar bicompartimental de 10 cm sem nutrientes (Figura 7), a saúde da planta e a formação de pelos radiculares - os absorventes de água e minerais - foram caracterizados em co-cultura, com e sem parceiros microbianos. Na Figura 7, o compartimento da esquerda de cada placa de separação apresenta uma cultura com o parceiro mi- crobiano, e o compartimento da direita de cada placa de separação apresenta uma cultura sem o parceiro microbiano. O experimento foi repetido duas vezes em três repetições.

[00121] Como mostrado no compartimento esquerdo de cada placa de separação, tecido de planta saudável se formaram mesmo quando as raízes das plantas foram cultivadas diretamente sobre os materiais microbianos densos. A biomassa de pelos radiculares é aumentada para cerca de duas vezes mais em comparação com o compartimento direito de cada placa de divisão em que o parceiro microbiano está ausente (veja compartimento da esquerda).

[00122] A eficácia da planta para estabelecer associação simbiótica é dependente do tipo de distribuição dos endófito dentro da endoder- me da raiz. Colonização radicular endofítica típica é descontínua e parcial com um menor número de células ocupadas <50% (Tabela 2) em comparação com a colonização de fungos patogênicos que se caracteriza por uma colonização de células uniforme/contínua (frequência: 60-80%) (Figura 8).

[00123] O desempenho de um endófito não só deve ser avaliado medindo a produção de biomassa, porque o que está subjacente ao rendimento visivelmente maior é a eficiência do endófito na colonização da planta. Isto pode ser avaliado ao caracterizar a sua associação com as células de plantas, tecidos ou órgãos (isto é, sementes e radí- culas) utilizando Índices matemáticos que foram desenvolvidos [Abdel- latif et al. 2009] e aplicados neste estudo (Figura 9 e Figura 10).

[00124] Estes índices baseiam-se nas seguintes observações: Sim- biontes endofíticos mostram diferentes padrões de colonização radicular (raiz) (regularidade ou nível de desvio na forma da célula endófita - Ireg e direção- Idir quando colonizando célula viva) em comparação com células radiculares mortas (que geralmente permanecem colonizados pelos verdadeiros saprófitas).

[00125] Altos valores de índice Ireg e Idir determinam as relações planta-simbionte (benéficos) mutualistas. Em conclusão, os resultados mostram que a associação simbiótica micróbio-planta é caracterizada por um elevado nível de compatibilidade entre os dois parceiros, levando a uma colonização de raiz equilibrada (<50% de células do córtex colonizadas) e descontínua pelos endófitos microbianos medida utilizando índices matemáticos [Abdellatif et al. 2009]. Esta parceria mutualística é ainda caracterizada pelo efeito direto dos micróbios en- dofíticos no crescimento saudável da planta (bacto- e micodependên- cia), quando a planta é desafiada a usar os parceiros microbianos como a única fonte de nutrientes ou energia para o crescimento. Além disso, a melhora da biomassa de pelos radiculares pelos endófitos foi observada e medida mesmo em raízes em compartimentos distais de placas de divisão em que os parceiros microbianos estavam ausentes, indicando uma possível função de promoção do crescimento vegetal sistêmico dos endófitos.

Exemplo 3 Órgãos simbióticas de endófitos no trigo

[00126] Cada grupo taxonômico de endófitos estabelece um único tipo de micovitalismo, consequentemente formando diferentes órgãos simbióticos. Caracterização do micovitalismo foi feita usando metodologia de Abdellatif et al. [2009], que consiste em co-culturas in vitro de sementes e micróbio avaliando uma fase inicial da associação simbiótica micróbio-planta. A diversidade de órgãos simbióticas microbianos formada por SMCD 2204, 2206, 2210, e 2215 em germinantes de trigo é mostrada na Figura 11.

[00127] Em resumo, os resultados mostram tipos diferenciais de órgãos simbióticos formados na raiz do trigo por cada endófito provavelmente relacionados com as suas diferentes funções simbióticas. Uma abundância de colonização equilibrada, padrões de colonização irregulares, aumento da septação de hifas em células da raiz viva, bem como a formação de arbúsculos, nós, enovelamentos e vesículas - órgãos funcionais putativos simbióticos - podem indicar especialização local, dentro dos endófitos de fungos para promover micovita- lidade da planta e micoheterotrofia. Bactovitalidade é principalmente caracterizada por filamentos encaracolados intercelulares de Strep- tomyces .

[00128] Simbiose ao nível das sementes resultou num aumento de germinantes de trigo depois de 10 dias de co-inoculação (Figura 12 e Figura 13).

Exemplo 4 Endófitos melhoram a germinação de sementes de trigo sob o estresse de calor e a seca

[00129] A germinação das sementes é uma etapa da vida crítica para a sobrevivência da planta e estabelecimento de plântulas em tempo útil especialmente em ambientes estressantes. Postula-se que endófitos melhorariam a germinação de sementes de trigo sob o estresse por calor e seca. O modelo de tempo hidrotérmico (HTT) de germinação é um modelo conceitual útil para prever o tempo e a energia de germinação (EG) no escopo de um dado conjunto de condições. O HTT e EG são aplicados para determinar se um ou mais endófitos compatíveis melhoram a tolerância ao calor ou seca em trigo. Endófi- tos testados dramaticamente aumentaram a porcentagem de germinação, melhoraram valores EG e HTT, e diminuíram a susceptibilidade de trigo ao calor e à seca, medida pelo peso fresco das plântulas. Quando colonizado pelo endófito mais eficaz, os valores dos parâmetros testados em sementes de trigo expostas a estresse térmico asse-melhavam-se aos de sementes não estressadas.

Materiais e métodos Modelo de tempo hidrotérmico de germinação e energia de germinação

[00130] O modelo de tempo hidrotérmico (HTT) [Gummerson 1986] postula que uma semente individual começa a germinar quando estiverem preenchidas duas condições. Em primeiro lugar, a soma das temperaturas diárias, acima de um valor mínimo cardinal (T mínimo ), acumulada ao longo de um período de tempo, deve passar um valor limite (θ T ), medido em graus dias. Em segundo lugar, a semente deve acumular potencial de água suficiente (θ H ) por graus-dia. Assim, HTT (θ HT ) pode ser expressa como: θHT = (θH)(θT). (Equação 1)

[00131] De acordo com Kochy Tielborger e [2007], θ T= (T substrato - T min ) t (Equação 2) com t representando o tempo decorrido em dias, e θ H = Φ substrato - Φ min (Equação 3) em um ambiente constante assumindo que T substrato é igual a ou menos do que a temperatura ideal para a germinação de sementes. Na equação 3, Φ substrato e Φ min representam o potencial de água do substrato e o potencial mínimo de água no qual a germinação é possível, em MPa, respectivamente. Consistente com Bradford [2002], as equações 2 e 3 podem ser substituídas na equação 1 para gerar: θHT = (Φsubstrato - Φmin)(Tsubstrato - Tmin) t (Equação 4).

[00132] No entanto, no presente estudo, a temperatura excede a temperatura ideal para a germinação de trigo [revisto por McMaster (2009)], o que exige a consideração de uma temperatura máxima (T max ) acima da qual a germinação pode não ocorrer. Assim, a equação 2 foi modificada para: θ T = ^ [(T substrato - T min ) (I T substrato - T max I)] t (Equação 5) onde T min ^ T substrato ^ T max . Se a equação 5 é substituído por 2 na equação 4, o seguintes resulta: θ HT = (Φ substrato - Φ min ) ^ [(T substrato - T min ) (|T substrato - T max I)] t (Equação 6) onde T min — T substrato — T max .

[00133] Energia de germinação ( EG) pode ser definida de várias formas, incluindo a percentagem de sementes que germinam após um determinado período de tempo após o plantio, em relação ao número de sementes testadas [Ruan et al. 2002; Dong-dong et al. 2009], ou 50% de germinação atingida [Allen 1958]. A fim de integrar EG com o modelo HTT de germinação, foi usada a última definição, o que significa que, EG é igual a T na Equação 2. Estimativa de parâmetros

[00134] A estimativa de T min e T max para o trigo foi baseada em ambas as informações disponíveis na literatura e próprias observações dos presentes inventores. McMaster [2009] resume os dados provenientes de Friend et al. [1962], Cao and Moss [1989], e Jame et al. [1998], que indica a existência de uma relação curvilínea entre a taxa de desenvolvimento de trigo e temperatura. Uma vez que a germinação e o desenvolvimento do trigo não ocorrem abaixo de 0°C ou acima de 40°C, T min e T max foram atribuídos os valores de 0°C e 40°C, respectivamente.

[00135] O parâmetro Φ min foi estimado in vitro por sementes de trigo em germinação cultivadas em ágar de dextrose de batata (PDA; Disco) como meio que contêm uma gama de concentrações de polietileno glicol (PEG) 8000 (Amresco Inc.). A atividade de água (a w ) do PDA sozinho e PDA contendo 8%, 12% e 16% de PEG foi medida utilizando AquaLab 4TE, Series 4 Quick Start, Decagon Devices. A atividade de água foi convertida no potencial da água (Φ) usando a relação adaptada de Bloom e Richard [2002]: Φ = [(RT) In (a w )]/V (Equação 7) em que R é a constante de gás universal (8,314 mol J -1 K -1 ), T é a temperatura em °K, e V é o volume molar parcial da água (18 mL/mol). Para conversões de unidades, 1 J/mL = 1 MPa = 10 bar. Po- tencial da água é zero para uma superfície de água livre ou um meio saturado; todos os outros valores são negativos.

[00136] As atividades aquáticas de PDA e PDA contendo 8%, 12% e 16% de PEG foram 0,9974, 0,9890, 0,9863, e 0,9825, respectivamente. Estes valores são equivalentes a - 0,35, - 1,51, - 1,88 e - 2,41 MPa, respectivamente, e são consistentes com os relatados na literatura [Leone et al. 1994]. Planta e material de fungos

[00137] O material vegetal utilizado foi o cultivar de trigo duro AC Avonlea, que tem baixa resistência aos estressores ambientais[guia SaskSeed 2008]. As sementes utilizadas na primeira rodada de experimentos foram produzidas por Paterson Grain em 2008, em condições de campo, e não certificadas como livres de micróbios. Sementes utilizadas no segundo conjunto de experimentos foram produzidas pela Agriculture and Agri-Food Canada (AAFC) Seed Increase Unit Research Farm em 2006 em condições de estufa, e foram certificadas sendo livres de micróbios. Sementes de trigo foram esterilizadas na superfície com etanol 95% por 10 s, enxaguado em água destilada estéril por 10 s, ou submersas por 3 min (primeira rodada de experimentos envolvendo sementes não certificadas como livres de micróbios) ou 1 min (segunda ronda de experimentos com sementes certificadas como livres de micróbios) em hipoclorito de sódio 5% (Javex), lavadas três vezes em água destilada estéril e PDA para a germinação [Abdellatif et al. 2009]. Um terceiro método de esterilização de sementes, envolvendo uma exposição de 3 h para cloro gasoso (produzido através da combinação de 25 mL de hipoclorito de sódio a 6%, com 1,0 mL de ácido clorídrico concentrado em uma proveta) em uma caixa de plástico fechada colocada em um exaustor [Rivero et al. 2011 ] também foi testado. A percentagem de germinação de sementes submetidas a cada protocolo de esterilização e colocadas em PDA durante três dias é mostrada na Figura 14B. Apenas a submersão em hipoclorito de sódio por 3 min resultou em uma diminuição significativa na germinação (p < 0,01). A esterilização da superfície de sementes foi destinada a eliminar os micróbios que podem competir com os endófitos sendo investigados. Além disso, os micróbios presentes na superfície das sementes podem cobrir a placa e plântulas emergentes, inibindo o crescimento da planta. Todas as sementes utilizadas no estudo foram determinadas como sendo isentas de microrganismos após a esterilização, com base na ausência de crescimento microbiano não intencional sobre a placa.

[00138] Quatro isolados de fungos mitospóricos Ascomicota endofíti- cos (classificados de acordo com Kiffer e Morelet [2000]): SMCD 2204, SMCD 2206, SMCD 2208 e SMCD 2210, mais o isolado bacteriano gram positivo filamentoso Actinomycetes SMCD 2215; compatível com Triticum turgidum L. [Abdellatif et al. 2009] foram usados neste estudo. Os endófitos foram cultivados em PDA durante pelo menos três dias em temperatura ambiente no escuro antes da utilização experimental. Endófitos como organismos de vida livre

[00139] Plugues de ágar (5 mm 2 ) cortados das margens da colônia parente foram colocados no centro de uma placa de Petri de 90 mm contendo PDA sozinho ou alterado com 8% PEG (seca). A placa de Petri foi vedada com parafilme ( Pechiney Plastic Packaging) para manter a esterilidade e colocada em uma incubadora de bancada (Precision Thermo Scientific, modelo 3522) em 23°C, ou sob estresse por calor, 36°C, no escuro. O diâmetro da colônia foi medido em 24, 48, 72, 96 h, e cinco e seis dias. As mudanças de diâmetro foram usadas para calcular a taxa de crescimento da colônia. O crescimento de um mínimo de três réplicas por isolado foi medido. Capacidade de endófitos para conferir tolerância ao calor e à seca ao trigo

[00140] Cada isolado foi aplicado individualmente nas sementes de trigo antes da germinação de acordo com o método descrito em Abdel- latif et al. [2010] e mostrado na Figura 14A. Resumidamente, cinco sementes esterilizadas na superfície foram colocadas a uma distância equivalente a 48 h de crescimento de hifas de plugue de ágar 5 mm 2 , hifas colocados de lado para baixo no centro de uma placa de Petri de 60 mm. Para os isolados de crescimento lento, o plugue de ágar de colónia de endófito foi colocado na placa de Petri um a quatro dias, antes da introdução das sementes. As mudas foram germinadas durante uma semana sob condições de estresse e de controle abióticos.

[00141] A seca foi induzida utilizando PDA contendo 8% PEG. Es-tresse térmico foi induzido em uma incubadora de bancada na escuridão; a temperatura foi gradualmente aumentada por 2°C a cada 2 h de 28°C a 36°C. Na primeira rodada de experimentos, percentagem de germinação aos três dias e peso fresco em uma semana foram avaliados. Cada experimento consistiu em seis placas de Petri e foi repetido, independentemente, por três vezes. Em experimentos posteriores, percentagem de germinação foi avaliada a cada 24 horas por sete dias. Cada experimento consistiu em 10 placas de Petri e foi repetido duas vezes (calor e estresse hídrico combinados) ou três vezes (estresse térmico, estresse hídrico e as condições de controle).

[00142] A colonização interna estável de raízes de trigo pelos endó- fitos pretendidos foi confirmada por novo isolamento do organismo en- dófito de raízes que tinham sido esterilizadas na superfície para remover um crescimento microbiano externo, utilizando um procedimento modificado a partir de Larran et al . [2002]. Fragmentos de raiz (~ 0,5 cm) foram esterilizados na superfície em 95% de etanol durante 10 s, lavados em água destilada estéril durante 10 s, submersos por em hi- poclorito de sódio a 5% por 20 s (Javex), enxaguados três vezes em água destilada estéril e colocados em PDA em uma placa de Petri de 60 mm de diâmetro. A placa de Petri foi selada com parafilme e incubada no escuro em temperatura ambiente durante quatro a sete dias antes da avaliação.

Análise estatística

[00143] As taxas de crescimento de colônias de organismos endofí- ticos de vida livre cultivadas sob calor ou a seca foram comparadas com as do mesmo organismo cultivado sob condições de controle por meio de análise de variância (ANOVA) seguida do teste post-hoc de diferença mínima significativa de Fischer (LSD). Dados de percentagem de germinação foram submetidos a transformação arcsine antes da análise estatística [McDonald 2009]. As diferenças estatísticas entre percentual de germinação após ambos três e sete dias, e peso fresco aos sete dias foram avaliadas usando um único fator ANOVA para comparar todos os tratamentos. Subsequentemente, foi utilizado um teste post-hoc LSD para avaliar a significância das diferenças entre o controle sem endófito e sementes tratadas com cada micobionte. O nível de significância estatística associado com as diferenças entre o GE e HTT necessários para alcançar 50% de germinação de sementes colonizadas com endófitos e de controle foi avaliado por meio da avaliação do EG para cada uma das três repetições independentes do experimento. Os dados resultantes foram submetidos a uma análise de variância e análise post-hoc LSD. Os valores de P menos do que 0,05 e 0,01 foram considerados significativos e altamente significativos, respectivamente. Os testes estatísticos foram realizados com SPSS Inc. 2011.

Resultados

[00144] Dentro de cada seção, os resultados são organizados de acordo com o tipo de estresse: o calor, seca, calor e seca, ou nenhum estresse. Dentro de cada estresse, os resultados que lidam com material vegetal são apresentados de acordo com os traços germinativos e/ou de mudas medidos: percentagem de germinação em três e sete dias, massa fresca aos sete dias, EG e HTT.

Endófitos de vida livre

[00145] Os fenótipos de SMCD 2206, 2210 e 2215 não foram alteradas pelo calor (36°C), enquanto SMCD 2204 e 2208 não cresceu a 36°C. As taxas de crescimento de colônias de SMCD 2206 e 2210 foram reduzidos em 36°C, em comparação com condições não estressadas (p < 0,01), enquanto a taxa de crescimento de SMCD 2215 a 36°C foi aumentada (p < 0,05) (Figura 15). A 36°C SMCD 2215 cresceu mais rapidamente, seguido em ordem decrescente por 2206 e 2210 (Figura 15).

[00146] A morfologia do SMCD 2204, 2206, 2208 e 2215 não foi sensivelmente alterada pela seca (8% PEG). No entanto, quando SMCD 2210 foi exposto à seca, este organismo perdeu a sua aparência "lanosa" e, em vez adquiriu um aspecto "brilhante" ou "viscoso". As taxas de crescimento de colônias de SMCD 2204, 2206, e 2208 foram reduzidas pela seca (p < 0,01, p < 0,01, e p < 0,05, respectivamente), enquanto a taxa de crescimento de colônias de todos os outros endófi- tos permaneceu inalterada (Figura 15). Quando o estresse hídrico foi aplicado, SMCD 2204 cresceu em taxa mais alta, seguido em ordem decrescente por 2206, 2210, 2208 e 2215 (Figura 15).

[00147] Quando desafiado por 36°C de calor e seca (8% PEG) ao mesmo tempo, SMCD 2204, e 2208 não conseguiu crescer, enquanto SMCD 2206, 2210 e 2215 cresceram a uma taxa significativamente mais lenta do que em condições de controle (p < 0,01) (Figura 15). Em condições de controle, SMCD 2204 cresceu mais rápido, seguido em ordem decrescente por SMCD 2206, 2210, 2208 e 2215 (Figura 15).

Resposta de trigo colonizado por endófitos ao calor

[00148] A 36°C, a colonização por SMCD 2206 e 2215 aumentou a germinação, após três dias (p < 0,05 e p < 0,01, respectivamente; Fi- gura 16A), enquanto que SMCD 2204, 2208 e 2210 não alteraram esse parâmetro (p> 0,1; Figura 16A). Após sete dias, 63% e 56% de sementes germinaram em co-cultura com SMCD 2204 e 2208, respectivamente. Estes valores não foram estatisticamente diferentes (p> 0,1) a partir da germinação de 59% alcançada pelo controle não colonizado. Em contraste, os endosimbiontes SMCD 2206, 2210 e 2215 promoveram a germinação, após sete dias (p < 0,01; Figura 17).

[00149] Quando submetido a 36°C, o peso fresco de plântulas de trigo ficou estável em co --cultura com SMCD 2204, 2206, 2208 e 2210, enquanto SMCD 2215 aumentou significativamente este parâmetro (p < 0,01, respectivamente; Figura 16D).

[00150] O EG de sementes de trigo co-cultivadas a 36°C com endó- fito de fungo SMCD 2210 (p < 0,05; Tabela 3, Figura 17) melhorou em comparação com sementes livres de endófitos. No entanto, SMCD 2204, 2206, 2208 e 2215 não alteraram GE (p> 0,1; Tabela 3) em relação ao controle. SMCD 2210 aumentou o EG na maior extensão, seguido por SMCD 2206 e 2215 (Tabela 3). SMCD 2210 reduziu o tempo necessário para 50% das sementes germinarem em apenas dois dias.

[00151] Quando expostos ao estresse por calor, o HTT requerido para a germinação foi reduzido para sementes de trigo colonizadas por SMCD 2210 (p < 0,05; Tabela 3), mas não de quaisquer outros endófi- tos testados (p> 0,1; Tabela 3). Sementes de trigo isentas de endófitos requereram 50 MPa °C dias mais do que sementes colonizadas por SMCD 2210 (o endófito mais eficaz testado) para conseguir a germinação de 50% (Tabela 3). Houve uma correlação clara, negativa, linear entre o HTT necessário para a germinação de 50% e percentagem de germinação depois de sete dias sob estresse térmico (Figura 18).

Resposta do trigo colonizado por endófito à seca

[00152] Quando submetido ao estresse de seca, durante três dias, uma percentagem reduzida de sementes de trigo germinou em co- cultura com SMCD 2208, em comparação com sementes livres de en- dófitos (p < 0,01; Figura 16B), enquanto SMCD 2204, 2206, 2210, 2215 não alteraram este traço (p> 0,1; Figura 16B). Após sete dias, o tratamento com SMCD 2206, 2210 e 2215 levou a um aumento da germinação de sementes (p < 0,01, p < 0,05, e p < 0,01, respectivamente; Figura 17). Em contraste, 65 e 67% de sementes co-cultivadas com SMCD 2204 e 2208 tinham germinado após sete dias. Nenhum destes valores foi estatisticamente superior ao 59% de sementes não colonizadas que germinaram sob as mesmas condições (p> 0,1). Sob condições de seca, SMCD 2208 e 2210 diminuíram peso fresco após sete dias (p < 0,05 e p < 0,01, respectivamente;. Figura 16E). Nenhum dos outros micobiontes alterou este parâmetro (p> 0,1; Figura 16E).

[00153] O EG diminuiu para sementes de trigo co-cultivadas em condições de seca com todos os endófitos testados, em comparação com sementes livres de endófitos (0,05 <p < 0,1 para SMCD 2204 e 2208 e p < 0,05 para 2206, 2210 e 2215; Tabela 3). SMCD 2206 melhorou o EG na maior medida, reduziu o tempo decorrido antes de 50% germinação ser atingida após 2,6 dias (Tabela 3, Figura 17).

[00154] O HTT necessário para a germinação foi reduzido para sementes de trigo tratadas com todos os endófitos testados sob estresse hídrico (Tabela 3). Enquanto as sementes não colonizada precisaram de 80 MPa °C dias para alcançar 50% de germinação, sementes colonizadas por endófito SMCD 2206 (o endófito mais eficaz testado) precisaram apenas de 34 MPa °C dias, o que representa uma queda de 46 MPa °C dia (Tabela 3). Houve uma correlação visível, negativa, linear entre o HTT necessário para a germinação de 50% e a percentagem de germinação em sete dias sob estresse hídrico (Figura 18). No entanto, o valor R 2 associado a esta relação linear foi menor do que para a correlação encontrada em estresse por calor. As gamas de HTTS necessárias para alcançar 50% de germinação diferem entre estresse por calor e hídrico, com valores entre 34 e 44 MPa °C dias e 80 e 94 MPa °C dia sendo único para sementes expostas à seca e estresse térmico, respectivamente (Figura 18; Tabela 3). As gamas de percentagem de germinação após sete dias são semelhantes entre as sementes expostas à seca e aquelas submetidas ao calor, embora os níveis de germinação de sementes estressadas pelo calor cobriu uma gama um pouco maior (Figura 18). Resposta de trigo colonizado por endófito à seca e ao calor em combinação

[00155] Muitas poucas sementes de trigo germinaram quando expostas à seca (8% de PEG) e estresse por calor (36°C) simultaneamente (Figura 17). Colonização por micro-organismos endofíticos SMCD 2210 e 2215 aumentou a percentagem de germinação depois de sete dias (p < 0,01; Figura 17). Por outro lado, SMCD 2204, 2206 e 2208 não conseguiram melhorar esse traço (p> 0,1). Sementes co- cultivadas com SMCD 2215 (o micro-organismo mais benéfico para este parâmetro testado) atingiu 24% de germinação, quatro vezes o nível atingido pelos seus homólogos isentos de endófitos (Figura 17).

[00156] Porque nem sementes não colonizadas nem as colonizadas por qualquer um dos endófitos atingiu 50% de germinação dentro de sete dias, EG não pode ser determinado e HTT foi calculado para 5%, em vez de 50% de germinação. O tempo necessário para atingir a germinação 5% variou de 24 h a quatro dias. Nenhum dos endófitos testados diminuiu o tempo necessário para atingir 5% de germinação ou valores HTT (p> 0,1). No geral, o HTT necessário para atingir 5% de germinação variou 11 a 43 MPa °C dia (HTT média = 23,9) (Figura 18; Tabela 3).

[00157] O intervalo de valores para HTT para sementes submetidas ao estresse por calor e à seca foi único, em comparação com os valores HTT quando calor ou seca foi aplicado sozinho. Houve uma rela- ção linear negativa entre HTT necessário e a percentagem de germinação em estresse por calor e seca combinados. No entanto, o valor R2 associado com esta relação linear foi menor do que para a correlação encontrada quando nem estresse por calor ou seca foi aplicado individualmente (Figura 18). Resposta de trigo colonizado por endófitos para condições de controle

[00158] Sob condições não estressantes, SMCD 2215 aumentou significativamente germinação de sementes em comparação com sementes não colonizadas depois de três dias (p < 0,01) (Figura 16C). SMCD 2206, 2208 e 2210 impactou positivamente, enquanto que SMCD 2204 não alterou percentagem de germinação. Em condições não estressantes, SMCD 2204, 2210 e 2215 aumentou o peso fresco de plântulas de trigo após sete dias (p < 0,05 e p < 0,01, respectivamente). Além disso, SMCD 2206 e 2208 não mostrou nenhum impacto sobre a massa fresca, em comparação com mudas não colonizadas (Figura 16F).

[00159] Em condições de controle, parâmetros HTT EG e foram ligeiramente melhorados por endosimbiontes SMCD 2206 e 2215 (Tabela 3). Relativamente pouca alteração nos parâmetros EG e HTT foi medida associada com sementes não estressada de trigo em co- cultura com diferentes isolados.

Exemplo 5 Endófitos melhoram a produção de genótipos de trigo e cevada sob grave estresse hídrico

[00160] Sumário: Devido à mudança climática e o crescimento da população, o desenvolvimento de técnicas para aumentar a tolerância das culturas na agricultura em ambientes estressantes é crítico. A inoculação com três endófitos simbióticos, indígenas para as pradarias canadenses, aumenta a resistência de trigo e cevada ao calor ou ao estresse hídrico, bem como a produção de grãos e peso das semen- tes. A utilização de tais endófitos de fungos e bacterianas no campo tem o potencial para aumentar o vigor de germinação das sementes (SGV = diferença entre a percentagem total de sementes em germinação E- e sementes em germinação E +) (Figura 19, Figura 20A e B), e para melhorar rendimento em condições propensas ao estresse (Tabela 4; Figura 21 A, Ba e Bb). Evidências apontam que as cepas SMCD aumentam vitalidade de semente e vigor das plantas (Figura 22A-D). Os resultados gerais demonstram que o cuidado pré-natal de sementes usando micróbios endofíticos, especialmente as cepas SMCD, garantem o rendimento da cultura superior de genótipos de trigo e cevada através de melhorias fisiológicas.

Materiais e métodos

[00161] Sementes de cultivares de trigo e cevada foram produzidas em campos experimentais da Universidade de Saskatchewan e Crop Science Field Laboratory (Saskatoon). Sementes visualmente saudáveis foram esterilizadas na superfície em 95% de etanol durante 10 s, lavadas em água destilada estéril durante 10 s, submersas durante 1 min em hipoclorito de sódio a 5% (Javex) e, em seguida, enxaguadas três vezes em água destilada estéril.

[00162] Os isolados endofíticos utilizados neste estudo foram originalmente isolados das raízes de trigo duro Triticum turgidum L. cultivadas em locais de campo em Saskatchewan, Canadá [Vujanovic 2007b]: SMCD 2204, 2206, 2208, 2210, 2215. Todos os isolados de endófitos são cultiváveis em ágar de dextrose de batata (PDA; Difco) na ausência de uma planta hospedeira. Os isolados foram cultivados em PDA durante três dias em temperatura ambiente (23°C) na escuridão antes da utilização experimental.

[00163] As inoculações experimentais foram feitas em vasos. Cada um dos isolados endofíticos foi aplicado às sementes de cereal (trigo e cevada)antes da germinação de acordo com o método descrito em Abdellatif et al. [2010]. Resumidamente, cinco sementes esterilizadas na superfície foram posicionadas a uma distância equivalente a 48 h de crescimento de hifas de plugue de ágar ± 5 mm 2 , hifas colocados de lado para baixo no centro de um vaso de plástico de 2 L cheio com 300 gramas (peso seco) de solo de plantio mistura Sunshine 4 de capacidade de campo autoclavado. As sementes e plugue de ágar foram depois cobertos com uma camada de 3,5-4,0 cm de mistura Sunshine 4. Cinco sementes foram plantadas por vaso e havia doze vasos por tratamento. Vasos contendo plantas foram colocados em uma estufa durante os tratamentos de estresse hídrico e controle. Os vasos foram dispostos em um desenho de blocos randomizados.

[00164] O estresse hídrico foi induzido de maio a setembro, quando as temperaturas máximas noite-dia na estufa variaram de 18 a 26 °C. Em dias de sol, a luz solar natural forneceu irradiação, enquanto em dias nublados ou de inverno com um fotoperíodo mais curto, 1000 watts de lâmpadas de sódio de alta pressão, suspensas no teto aproximadamente 2 m acima das plantas, complementava a luz solar. No primeiro experimento, as plantas estressadas à seca e controle (bem regadas) foram cultivadas em 25% de teor de água no solo, em peso, e 100% da capacidade de retenção de água, respectivamente. Durante o experimento, as plantas de controle foram regadas a 100% da ca-pacidade de retenção de água, três vezes por semana, enquanto que as plantas submetidas à seca foram regadas com 100% da capacidade de retenção de água semanalmente. Este regime de seca foi adotado a fim de imitar o ciclo natural da seca que pode ocorrer durante a estação de crescimento em pradarias norte-americanas [Chipanshi et al. 2006].

[00165] Espigas maduras foram coletadas e grãos secos pesados em uma balança Mettler Toledo PG802-S em laboratório.

Resultados e discussão Vigor de germinação de sementes de trigo aumentado (SGV)

[00166] Sob condições de controle in vitro, sementes de trigo tratadas com SMCD (2204, 2206, 2208, 2210, 2215) germinaram consistentemente mais rápido, mais uniformemente, e com muito maior SGE (eficácia de germinação de semente). O SGV de sementes inoculadas com SMCD (E +) foi de 15% a 40% maior em comparação com sementes (E-) não tratadas (Figura 19), demonstrando a eficácia de SMCD no controle da dormência da semente e aumentando o vigor das sementes. Os efeitos positivos de cepas SMCD sobre o rendimento de genótipos de trigo e cevada sob seca severa, também foram demonstrados.

[00167] Genótipos de cevada geralmente mostram maior suscetibilidade à seca (valores baixos de DTE (Eficácia de tolerância à seca)) e produtividade mais baixa do que o trigo (Tabela 4), possivelmente devido às condições de seca extrema na estufa mais adequadas ao trigo. Em especial, cevada de duas fileiras CDC Kendall, sem endófito (E-), apresenta alta susceptibilidade ao estresse hídrico em comparação com outros genótipos de cevada. No entanto, os tratamentos de endó- fitos (E +) demonstram um efeito positivo no rendimento notável de todos os genótipos (Tabela 4). Resistência conferida varia de CDC Kendall com baixa resistência à seca para genótipos New Dale altamente resistentes, enquanto que resistência conferida ao trigo foi con-sistentemente alta.

[00168] Durante a fase de maturidade de trigo e cevada, endófitos SMCD aumentam drasticamente os parâmetros de tolerância de genó- tipos de seca, como eficácia DTE e rendimento. Aplicação SMCD em Avonlea, o cultivar de trigo mais suscetível à seca detectado (DTE = 16,1), resultou em um elevado aumento no rendimento (77%), sob condições de seca em comparação à rega de controle ou padrão. Carberry lucrou o máximo de endófitos sob controle ou condições nor- mais, enquanto CDC Utmost VB e BW 423 desempenharam igualmente bem em ambas as condições de seca e de controle.

[00169] Em conclusão, combinar genótipos resistentes à seca com endofíticos compatíveis SMCD 2206, SMCD 2210, e SMCD 2215 de simbiontes microbianos maximiza resistência à seca da planta, um aspecto importante na garantia da segurança alimentar. Sem querer estar limitado pela teoria, isto sugere que os cultivares de trigo (Figura 19A) e cevada (Figura 19b) mais suscetíveis à seca (valores baixos DTE) terão o máximo da associação simbiótica quando expostos ao estresse hídrico.

[00170] A única exceção parece ser genótipo de cevada de seis fileiras Legacy mostrando um DTE extremamente baixo = 1,1. Embora tenham respondido positivamente à presença de endófito com maior rendimento de 26,9% sob condições de controle, este melhorou de rendimento apenas para 5% em simbiose sob estresse. Assim, este cultivar foi excluído do modelo de cevada apresentado na Figura 19B.

[00171] Efeito de cepas SMCD individual em produtividade de trigo e cevada

[00172] Cepas SMCD individuais afetam positivamente o rendimento médio do grão de cada genótipo, embora a magnitude real varie de acordo com a combinação genótipo-cepa. A Figura 21 apresenta os resultados obtidos em condições de seca em estufa (Figura 21: A - trigo; B a -cevada (duas fileiras), e B b -cevada (seis fileiras)).

[00173] O contato precoce de semente com isolados de SMCD compatíveis é um pré-requisito para a proteção das culturas contra a seca, resultando em um maior rendimento ou produção de grãos. SMCD 2206 geralmente confere o mais alto grau de melhoria para a maioria dos genótipos. No entanto, a especificidade cepa-cultivar garante maiores melhorias de forma individual, por exemplo, Trigo-PT580 e cevada-CDC Copeland preferem SMCD 2210; enquanto Trigo- BW423 e PT580, bem como CDC Kendall mostram um desempenho mais elevado e resistência à seca quando inoculados com SMCD 2215.

[00174] Os resultados destacam a importância de micovitalismo em sementes de trigo e cevada desafiadas ao estresse, ajudando os criadores na produção de cultivares altamente produtivas capazes de suportar as condições de seca significativamente melhores do que qualquer cultivar sozinho (Figura 22: A-D). Após desempenho demonstrado de cepas SMCD em campos, os produtores terão produtos simbióticos verdes para garantir o rendimento das culturas, e o agronegócio irá se beneficiar de um nível garantido de resultados de culturas positivos independentes das flutuações nas condições ambientais.

Exemplo 6 Experimento de estresse por calor Fitotron em leguminosas

[00175] Este experimento foi conduzido em condições fitotron. Todas as variedades de sementes foram inoculadas com endófitos (SMCD 2204F, SMCD 2206, SMCD 2210, e SMCD 2215) e sem endó- fitos em vasos contendo a mistura de solo. Detalhes sobre as abordagens utilizadas para inoculação de endófito na planta são descritos acima no Exemplo 5. Vasos com plantas para estresse por calor foram colocados em uma câmara de crescimento fitotron Conviron PGR15 (Controlled Environments Ltd.), utilizando um desenho em blocos aleatórios. A temperatura de cerca de 33 0 C foi selecionada para o estresse por calor. As plantas foram expostas a esta temperatura durante 8 horas, tempo após o qual as plantas foram expostas a uma temperatura de 21 0 C durante 16 horas até 10 dias. Após o choque térmico, as temperaturas foram alteradas para 16 0 C durante 8 horas e 21 0 C durante 16 horas.

Resultados

[00176] Em resumo, os resultados mostram que a eficácia de cada endófito testado em conferir tolerância ao estresse por calor está relacionada com o genótipo da planta particular ou variedade de hospedeiro (A- grão de bico, B-lentilha, e C-ervilha), e que o aumento na biomassa está associado a um órgão de planta particular em que cada órgão: vagem (Figura 23), caule (Figura 24) e raiz (Figura 25), é diferencialmente afetado pelo estresse de calor.

[00177] SMCD 2215 em sua maioria melhorou a biomassa do caule e da vagem, em ervilha, e a biomassa de raiz em grão de bico. SMCD 2206 aumentou a biomassa do caule e da vagem, em lentilha, e a biomassa de raiz em grão de bico, ervilha, e lentilha. SMCD 2210 melhorou na maior parte da biomassa do caule e da vagem, em grão de bico, e a biomassa de raiz em ervilha. SMCD 2204F melhorou a biomassa de vagens na maioria das culturas testadas (grão de bico, ervilha, e lentilha). A melhor combinação de genótipo endófito-colheita executante (E +) mostrou uma melhoria de cerca de 300% na biomassa de vagem, caule e raiz em comparação com controle sem endófito (E-) estressado por calor.

[00178] Caule: Os seguintes endófitos mostraram a melhor resposta ao estresse térmico: Grão de bico: Amit: SMCD 2210. Vanguard: SMCD 2204F; Ervilha: Golden: SMCD 2215. Handel: SMCD 2215; e Lentilha: Glamis: SMCD 2206. Sedley: SMCD 2206.

[00179] Vagens : Os seguintes endófitos mostraram a melhor resposta ao estresse térmico: Grão de bico: Amit: SMCD 2210. Vanguard: SMCD 2204F; Ervilha: Golden: SMCD 2204F. Handel: SMCD 2215; Lentilha: Glamis: SMCD 2206. Sedley: SMCD 2204F.

[00180] Raiz : Os seguintes endófitos mostraram a melhor resposta ao estresse térmico: Grão de bico: Amit: SMCD 2215. Vanguard: SMCD 2206; SMCD 2215; Ervilha: Golden: SMCD 2210; SMCD2215. Handel: SMCD 2206; Lentilha: Glamis: SMCD 2206; Sedley: SMCD 2204F.

Exemplo 7 Experimento de estresse à seca em estufa em leguminosas

[00181] Seis variedades de sementes [Amit, Vanguard (grão de bico), Golden, Handel (ervilhas) e Glamis, Sedley (lentilhas)] e endófitos SMCD 2204, SMCD 2204F, SMCD 2206, SMCD 2210, e SMCD 2215 foram utilizados neste estudo. Estes experimentos foram realizados em estufa. Depois de semear a semente e inocular micro-organismos endofíticos, potes foram deixados ficar sem água por 14 dias para imitar seca grave, tal como proposto por Charlton et.al. [2008] e de acordo com a metodologia e as condições descritas por Gan et al. [2004].

Resultados

[00182] Em resumo, os resultados mostram que cada uma das cepas SMCD afeta positivamente vários parâmetros agrícolas sobre a produção ou rendimento de vagens (Figuras 27), e a biomassa de caule (figuras 26) e raiz (Figuras 28) em grão de bico (A), ervilha (B), lentilha (C) e sob estresse hídrico. No geral, genótipos de colheitas colonizados pelo endófito simbiótico (E +) tornou-se mais resistentes estresse à seca vs. por calor. O nível de eficácia dos endófitos testados em conferir tolerância à seca variou com o órgão de planta especial: a produção de vagens foi altamente melhorada em Glamis por SMCD 2204, em Vanguard por SMCD 2204F, em Sedley por SMCD 2206, em Golden por SMCD 2210, e em Handel por SMCD 2215.

[00183] Caule: Os seguintes endófitos mostraram a melhor resposta ao estresse hídrico: Grão de bico: Amit: SMCD 2204F, Vanguard: SMCD 2206; Ervilha: Golden: SMCD 2204, Handel: SMCD 2204; SMCD 2210; SMCD 2215; Lentilha: Glamis: SMCD 2204F; SMCD 2206. Sedley: SMCD 2204F; SMCD 2206.

[00184] Vagens: Os seguintes endófitos mostraram a melhor resposta ao estresse hídrico: Grão de bico: Amit: SMCD 2204; SMCD 2210. Vanguard: SMCD 2204; SMCD 2206; SMCD 2215; Ervilha: Gol- den: SMCD 2210; SMCD2215. Handel: SMCD 2204F; SMCD 2206; SMCD 2215; Lentilha: Glamis: SMCD 2204F; SMCD 2206. Sedley: SMCD 2210; SMCD2215.

[00185] Raiz: Os seguintes endófitos mostraram a melhor resposta ao estresse hídrico: Grão de bico: Amit: SMCD 2204; SMCD 2215. Vanguard: SMCD 2204F; SMCD 2206; Ervilha: Golden: SMCD 2204F; SMCD2215. Handel: SMCD 2204F; Lentilha: Glamis: SMCD 2204F; SMCD 2206; SMCD 2210. Sedley: SMCD 2206; SMCD 2210.

Exemplo 8 SMCD 2215 de Streptomyces sp. aumenta a atividade Rhizobium e frequência de nodulação nas ervilhas em estresse por calor

[00186] Como foi recentemente observado para outra espécie Streptomyces, S. lydicus WYEC10 [Tokala et al. 2002], a Strep- tomyces sp. nov. SMCD2215 coloniza as raízes das plântulas de ervilha jovens de sementes produzidas a partir de plantas cultivadas sob condições de controle. Esta especificamente aumenta florescimento e produção de vagens (Figura 29), e nodulação das raízes por Rhizo- bium sp. (Figura 30), um endófito nativo colonizador de sementes de ervilha descoberto neste estudo (Tabela 5). Hifas vegetativas de Strep- tomyces sp. nov. SMCD2215 coloniza as células de nódulos emergentes como descoberto por placa de cultura (PDA), microscopia de fluorescência (Carl Zeiss Axioskop 2 ) e PCR (BioRad) como métodos de amplificação [ Schrey e Tarkka de 2008]

Exemplo 9 Endófitos conferem tolerância ao estresse abiótico para leguminosas via viabilidade das sementes reforçada

[00187] Culturas em leguminosa referem-se a um grupo de mais de sessenta diferentes culturas de leguminosas em grão crescidas em todo o mundo. As sementes de leguminosas são importantes para a nutrição humana. As principais restrições à produção de leguminosas são estresses bióticos e abióticos, como a seca, calor, frio e salinidade. Pesquisas recentes sugerem que as interações micróbio endofíti- cos-planta são um determinante fundamental da adaptação da planta.

[00188] Este estudo levanta a hipótese de que endófitos aumentam a rapidez e uniformidade de germinação das sementes em condições ideais e de estresse in vitro. O objetivo era, em primeiro lugar, medir a capacidade intrínseca simbiótica de endófitos para desencadear a germinação; e, por em segundo lugar, para medir a eficiência dos en- dófitos compatíveis em conferir resistência ao calor e à seca para os genótipos de leguminosas.

Material e métodos

[00189] Duas variedades de grãos de leguminosas, Glamis (lentilha) e Handel (ervilha), foram co-cultivadas com SMCD 2206 e SMCD 2215 compatível, fungos e cepas bacterianas simbióticas, respectivamente. A capacidade dos cepas endofíticas para conferir tolerância ao estresse em genótipos Golden (Figura 31) e Handel (Figura 32) foi testada durante germinação das sementes in-vitro modelando ambientes de seca (6% PEG) e calor (33oC).

[00190] As sementes foram esterilizadas na superfície com etanol a 95% durante 20s, lavadas duas vezes em água destilada estéril durante 10 segundos, seguido de 2 min em hipoclorito de sódio a 3% (Javex). Finalmente, as sementes foram lavadas em água destilada estéril quatro vezes. As sementes foram inoculadas em meio de PDA com e sem en- dófitos no escuro, em temperatura ambiente [Abdellatif et al. 2009]. Organismos microbianos foram cultivados em PDA durante pelo menos três dias em temperatura ambiente no escuro antes da utilização experimental. A capacidade endofítica para conferir resistência da planta ao estresse foi avaliada utilizando a energia de germinação, que se destina a capturar a natureza temporal de germinação e que é definida como o número de dias necessários para atingir 50% das sementes em germinação.

Resultados

[00191] O presente estudo demonstra a capacidade diferencial de endófitos de fungos ou bacterianos para conferir resistência à seca e ao calor em leguminosas específicas para uma combinação de cepa bacteriana ou de com o genótico da planta e o estresse abiótico. Este estudo utilizou análise molecular e proteômica para mais bem compreender o mecanismo pelo qual endófitos conferem resistência ao estresse simbiótico para leguminosas.

[00192] Cepas SMCD aumentaram significativamente a frequência de germinação de sementes de leguminosas sob condições padrões in vitro (Figura 33). Sob condições estressantes, ambos os endófitos (SMCD 2206 e SMCD 2215) aumentaram a frequência de germinação quando comparados com sementes não colonizadas. Frequência de germinação foi de 70-100% em tratamentos simbióticos e 60-80% de germinação no controle, o que significa que os endófitos testados tiveram o potencial para aumentar o vigor de germinação das sementes (SGV) por> 15%. A maior frequência de germinação (100%) foi observada em Glamis (lentilha) associada com ambos SMCD 2206 e SMCD 2215 sob estresse hídrico vs. estresse por calor. Quando co-inoculado com cepas SMCD, a energia de germinação (> 50% em sementes em germinação) em Glamis foi alcançada em 2 dias sob seca e em 3 dias sob condições de calor. Resultados semelhantes foram obtidos em Handel (ervilha), exceto que este genótipo tem inerentemente uma maior capacidade para suportar o choque térmico do que Glamis (lentilha). Exemplo 10 Endófitos melhoram a produção de genótipos de linho e de canola sob grave estresse hídrico em estufa

[00193] O objetivo deste estudo foi utilizar três isolados selecionados aleatoriamente (SMCD 2206, SMCD 2210 e SMCD 2215) e para expandir o teste de eficiência no rendimento de produção de linho e canola sob estresse hídrico.

Material e métodos

[00194] O desenho experimental, manipulação de sementes de linho (Bethun e Sorel) e canola (1768S), aplicação de inoculantes endofíticos (SMCD 2206, SMCD 2210 e SMCD 2215), condições de seca, e avaliação de rendimento são como detalhados no Exemplo 5 com pequenas modificações. Resumidamente, as plantas de controle foram regadas a 100% da capacidade de retenção de água, três vezes por semana, enquanto plantas estressadas pela seca foram regadas a 100% de capacidade de retenção de água semanalmente. Este regime de seca foi adotado a fim de imitar o ciclo natural da seca que pode ocorrer durante a estação de crescimento da pradaria canadense em que nenhuma precipitação cai durante sete dias consecutivos, ou mais.

Resultados e discussão

[00195] Condições de seca severas comprometeram rendimento de linho não simbiótico, enquanto inoculantes endofíticos SMCD 2206 e SMCD 2210 melhoraram dramaticamente o rendimento de linho nessas mesmas condições. Em particular, sob condições de seca, SMCD 2206 mantém um rendimento de quase 100% em Bethun enquanto SMCD 2210 proporciona um rendimento de 50% em relação ao controle sem estresse na estufa (Figura 34). SMCD 2210 (> 100%), seguido por SMCD 2206 (~ 50%) e SMCD 2215 (~ 30%) em comparação com o controle sem estresse (Figura 35).

[00196] A capacidade bioproteção também foi testado em estufa contra Fusarium avenaceum e F. graminearum . Sementes autoclava- das foram infectadas por inoculantes Fusaria na escuridão por 7 dias a 25°C (Figura 36), e foram inoculadas por endófitos produzidos em placas de Petri conforme descrito por Abdellatif et al. [2009].

[00197] Mistura de solo de pote foi inoculada com vinte sementes contendo Fusarium. A composição do solo misto foi 55-65 % Canadian Sphagnum Peat Moss, Perlita e Calcário misturado com areia. Condições de estufa padrão foram dias 8h de luz intercambiados com um de regime fotoperíodo de 16h (1000 lux) umidade relativa de 70 % e a temperatura constante de 25°C ± 2 °C.

[00198] Tratamentos de Plantas foram como segue: T1: Plantas não tratadas (controle) T2 : Planta + endófito T3 : Planta + patógeno , Fusarium avenaceum T4 : Planta + patógeno , Fusarium graminearum T5 : Planta + endófito fungo + Fusarium ave- naceum T6: Planta + endófito + Fusarium graminearum

[00199] Cada tratamento foi repetido em três potes, e mudas foram regadas três vezes por semana sob condições controladas. A colonização de raiz por endófito foi testada utilizando um microscópio de fluorescência para distinguir relações simbiótica vs. endófito patogênico- trigo [Abdellatif et al. 2009].

[00200] Figuras 37-40 mostram o efeito positivo de endófitos em resistência de plântulas de trigo pós-emergência (Figura 37), folhagem e biomassa radicular (Figura 38 e Figura 39), e estágio e picos de flora- ção/antese (Figura 38, Figura 39, e Figura 40). Todos os endófitos testados induziram folhagem bem desenvolvida em comparação com o controle, bem como flores bem desenvolvidas na presença de endófitos.

[00201] Para confirmar a capacidade de os endófitos em estimular o crescimento da planta madura na presença de patógenos Fusarium , o desempenho do estágio de floração tendo os picos foi avaliado como uma fase de crescimento mais avançada.

[00202] Os histogramas da Figura 41 ilustram o desempenho de endófitos na melhoria da biomassa ou peso seco de espigas do trigo após a inoculação dupla (endófito SMCD e patógeno Fusarium ).

[00203] O rendimento de trigo na presença de um endófito e Fusarium melhora significativamente usando todas as cepas endofíticas em comparação com o tratamento infectado com F. graminearum e F. avenaceum mas sem um endófito (E-) (Figura 41). As plantas tratadas com o agente patogênico sozinho mostram um tamanho significativamente menor de espigas em comparação com as plantas de controle e de plantas com endófitos (E +) (Figura 42). Exemplo 11 Expressão Gênica de Resistência ao estresse abiótico Mediada por endófito em leguminosas Resumo:

[00204] Os mecanismos de genômica e proteômica de efeitos benéficos de endófitos de planta sobre a resistência de plantas hospedeiras a fatores de estresse abióticos são mal compreendidos. Uma das teorias contemporâneas sugere que as plantas simbióticas são protegidas contra os estressores oxidativos produzido por calor, seca e sal pela produção de moléculas antioxidantes. O objetivo deste estudo é o de lançar mais luz sobre simbiose defensiva de genótipos de ervilha, grão de bico e lentilha avaliando as expressões do gene Pro, SOD e MnSOD desencadeadas pela associação entre genótipos do hospedeiro e endófitos. Os resultados deste estudo demonstraram a expressão do gene mediada por endófitos em plantas inoculados com endófitos. Estes genes desempenham um papel importante e fornecem a proteção do hospedeiro através de uma tolerância melhorada ao estresse para os estressores abióticos testados.

Materiais e métodos

[00205] As folhas foram coletadas para esta análise a partir de 6 variedades de sementes normais e estressadas (Amit, Vanguard [grão de bico] (Figura 43), Golden, Handel [ervilhas] e Glamis, Sedley [lentilhas]) com ou sem endófitos.

[00206] PCR em Tempo Real foi utilizado para amplificar os genes como prolina (Pro), a SOD e Mn SOD usando iniciadores como se mostra em SEQ ID NOs: 8-15 (Tabela 6), proteínas de estresse geral- mente são encontradas desempenhando papéis especiais na proteção de citoplasma de desidratação e na proteção de plantas por mitigar a toxicidade produzida pelas elevadas concentrações de íons. A PCR foi conduzida sob as seguintes condições: 3 min a 95°C (ativação de enzimas), 40 ciclos cada um de 30 segundos a 95°C (desnaturação) e 30 s a 60°C (anelamento/extensão). Finalmente, uma análise de curva de fusão foi realizada a partir de 65° a 95°C em incrementos de 0,5°C, cada um com duração de 5 s, para confirmar a presença de um único produto e ausência de dímero de iniciador. A quantificação é relativa ao gene controle através da subtração do CT do gene controle do CT do gene de interesse (ΔCT). A diferença resultante em número do ciclo é depois dividida pelo valor alvo normalizado calibrador, e o valor obti-do (ΔΔCT) é o expoente de base 2 (devido à duplicação da função de PCR) para gerar os níveis de expressão relativos.

Resultados

[00207] Foram analisadas as expressões de genes diferentes durante estresse hídrico. A Tabela 6 mostra os genes que foram testados. Alguns dos resultados obtidos a partir variedade Handel quando exposto as 6% de PEG. SOD e MnSOD

[00208] Em geral, SODs desempenham um papel importante nos mecanismos de defesa antioxidantes. No presente estudo foram observados níveis muito elevados de expressão SOD em folha normal (E-, controle) exposta a 6% PEG, um aumento de quase 200 vezes. Endófitos desempenhado um papel muito significativo na diminuição desse estresse. Especialmente, SMCD 2215, seguido por SMCD 2210, SMCD 2204 e SMCD 2206. Esses simbiontes reduziram drasticamente o estresse com apenas uma expressão aumentada de 9 e 24 vezes observada (Figura 44A).

[00209] MnSOD é uma das formas de SOD. Folhas de controle mostraram um aumento de 16 vezes na expressão do gene, enquanto que SMCD 2215 suprimiu o estresse e diminuiu a mudança de vezes de 16 vezes para 2 vezes, seguido de SMCD 2206, SMCD 2210 e SMCD 2204 (Figura 44B).

Prolina

[00210] A prolina é essencial para o metabolismo primário. Biossín- tese de prolina é controlada pela atividade dos dois genes P5CS em plantas. Este gene foi avaliado em ervilha variedade Handel com en- dófitos sob condição seca. Como esperado gene P5CS foi regulado positivamente e a expressão aumentada em 5 vezes nas folhas coletadas a partir de plantas expostas a PEG. Considerando que as folhas coletadas a partir de sementes associadas a SMCD 2206 expressaram 2,8 vezes seguido por SMCD 2215 em 3,4 vezes expressaram gene que codifica a prolina (Figura 45). Estes resultados confirmaram que endófitos desempenham papel importante na resistência ao estresse modificando a expressão do gene prolina em comparação com plantas estressadas não inoculadas. Exemplo 12 Padrões de Expressão Gênica em Coleorriza de trigo sob Estratificação a frio e Biológica Síntese:

[00211] O trigo é uma das principais culturas amplamente utilizadas no mundo. No entanto, a produção global de trigo diminuiu cerca de 5,5% nas últimas duas décadas e um novo declínio tem sido previsto devido ao aquecimento global generalizado. Assim, a elucidação condições e técnicas que melhoram a germinação das sementes são de grande importância. Estratificação a frio é um método há muito conhecido de liberar a dormência das sementes e promover a germinação. Estratificação biológica através de endófitos de fungos também pode estimular a germinação de sementes de muitas culturas de cereais. Coleorriza é um dos tecidos mais ativos na semente e é também a primeira parte a emergir das sementes em germinação. Para avaliar a eficiência dos métodos de estratificação, percentagem de germinação de sementes de trigo foi avaliada de acordo com a estratificação fria e biológica e o nível de expressão de genes de giberelina e ácido abscí- sico em coleorriza foram determinados. Ambos os tratamentos de estratificação fria e biológica significativamente (P <0,05) aumentaram a taxa de eficácia e de germinação. Distância espacial entre o endófito de fungos e sementes é um fator determinante da estratificação biológica conforme as sementes entram em contato direto com endófito de fungos mostraram maior percentagem de germinação (até 86%). Elevada expressão de gene GA3ox2 em coleorriza de trigo foi encontrada durante todo o período de germinação revelando uma produção consistente da molécula de GA3 bioativa. A expressão do gene 14-3-3 foi menor em tratamento direto com endófito. A expressão de gene bios- síntese do ácido abscísico -ABA, TaNCED2, foi consideravelmente alta em sementes de estratificação fria refletindo o papel do ácido abscísico como um hormônio de adaptação ao estresse. Alta expressão de gene TaABA8'OH1 também foi encontrada em coleorriza. Em geral, este estudo fornece provas moleculares da importância de coleorriza em sementes de trigo. Ao comparar métodos de estratificação fria e biológicas, a capacidade de germinação de sementes pode ser mar- cadamente melhorada através da aplicação de endófitos de fungos, e a distância espacial entre sementes e endófito é um fator determinante da micovitalidade. Materiais e métodos Sementes de trigo

[00212] Sementes do cultivar de trigo duro AC Avonlea com baixa resistência às condições de estresse ambiental foram utilizadas neste estudo. Essas sementes foram produzidas por Agriculture and Agri- Food Canada Seed Increase Unit Research Farm em 2006 em estufa, e foram recomendadas como livres de micróbios. As sementes foram mantidas em sacos ziplock estéreis e armazenadas em câmara fria a 4 °C até à sua utilização. Comparação de protocolos de esterilização de sementes

[00213] Vários métodos têm sido propostos para a esterilização da superfície de sementes de trigo. Aqui quatro métodos de esterilização de sementes amplamente reconhecidos foram comparados para identificar o melhor protocolo adequado que de forma eficiente esterilize superfície de semente sem afetar a qualidade das sementes e vitalidade nesta variedade de trigo. No primeiro método, as sementes foram esterilizadas na superfície com etanol a 95% durante 10 s, seguido de lavagem em água destilada estéril, três vezes durante 1 min [Zhang et al., 2007. BMC Genetics 8]. O segundo protocolo foi esterilização por branqueamento onde as sementes foram esterilizadas na superfície em hi- poclorito de sódio a 5% durante 3 minutos, seguido por lavagem completa em água estéril destilada três vezes durante 1 min. No terceiro protocolo, as sementes foram esterilizadas na superfície com etanol a 95% durante 10 segundos, lavadas em água destilada estéril, em seguida, submersas em hipoclorito de sódio a 5% por 3 minutos, enxaguadas três vezes em água destilada estéril e colocadas em ágar de dextrose de batata (PDA) para a germinação [Abdellatif et al. 2009]. O quarto método de esterilização era em fase de vapor das sementes com gás cloro [Desfeux et al., 2000]. Na câmara exaustora, um pequeno bé- quer com 20 mL de branqueador é colocado em uma caixa de snaptite de 5 litros. Sementes de trigo foram colocadas em uma placa de 96 poços e mantidas caixa snaptite. Em seguida, 3 mL de ácido clorídrico concentrado foram adicionados ao pequeno béquer para criar gás de cloro. A tampa foi mantida fechada durante 4 horas para manter as sementes em contato com cloro gasoso. Após a esterilização, a placa de 96 poços foi colocada durante 1 hora em uma câmara de fluxo laminar, para dispersar o gás de cloro residual. Sementes esterilizadas foram então lavadas três vezes em água destilada estéril e foram plaqueadas em placas de PDA. A comparação destes métodos de esterilização sugere que protocolo de esterilização por gás de cloro foi o método mais eficaz que mostrando germinação de 80%, sem contaminação enquanto que as sementes de controle tiveram maior percentagem de contaminação (Tabela 7). Apesar de métodos de branqueamento e etílicos inibirem com sucesso a contaminação, a germinação das sementes foi afetada consideravelmente. Portanto, o protocolo de gás de cloro é um método altamente eficiente de esterilização de sementes de trigo e foi selecionado para esterilizar as sementes necessárias para experimentos conduzidos no presente estudo. Estratificação fria e biológica

[00214] Para estratificação a frio, sementes com superfícies esterilizadas foram mantidas em papel de filtro umedecido em sala fria a 4 ° C por 48 horas [Mukhopadhyay et al., 2004; Wu et al., 2008 ] . Após 2 dias, as sementes estratificadas frias foram levadas até em temperatura ambiente onde foram rapidamente lavadas em água destilada esterilizada e colocadas em placas de ágar de dextrose de batata (PDA). Para estratificação biológica, sementes esterilizadas foram incubadas na presença de SMCD 2206. Endófito do fungo foi cultivado em PDA em temperatura ambiente no escuro durante pelo menos três dias antes da utilização. Para avaliar esta eficiência, sementes de trigo foram germinadas em contato direto e a uma certa distância do endófito de fungos. Um plugue de ágar (5 mm 2 ) do endófito dissecado a partir das margens de uma colônia parente foi colocada no centro de uma placa de petri de 90 cm com PDA. Em seguida, 10 sementes com superfície esterilizada foram colocadas na periferia da placa de petri que rodeia o plugue de ágar com fungos em aproximadamente 4 cm de distância. Todas as placas de petri foram seladas com 5 camadas de Parafilm® (Packaging Plastic Pechiny) para evitar qualquer contaminação biológica e a difusão de compostos voláteis/gasosos. O impacto do contato direto do endófito de fungo foi elucidado através da colocação de plu- gue de ágar de 3 mm 2 entre duas superfícies adjacentes de sementes de trigo esterilizadas e plugue de 5 mm 2 no centro das placas de PDA. Todos os tratamentos foram realizados com três repetições de placas de PDA com dez sementes esterilizadas na superfície em cada placa. As placas de Petri foram incubadas em uma incubadora de bancada em temperatura ambiente (~ 20 ° C) na escuridão. O tempo de incubação foi registrado e a coleta de dados e isolamento de coleorriza foram realizados após 24, 48, e 72 horas. Percentagem de germinação

[00215] Surgimento das primeiras radículas foi cuidadosamente monitorado. Percentagem de germinação foi calculada através da estimativa do número de sementes germinadas de 10 sementes de trigo em cada placa PDA. A taxa de germinação de 50% foi assumida como a energia de germinação. A eficácia de germinação em diferentes tratamentos foi calculada pela seguinte equação: Eficácia = % de germinação em um tratamento - % de germinação no controle [Eqn. 1]

[00216] Taxa de germinação foi observado em todas as amostras tratadas e repetições. Para amostras de Dia 2 e Dia 3, taxa de germinação foi monitorada desde o dia 1 para avaliar a vitalidade geral. As placas de PDA foram mantidas fechadas durante todo o período de coleta de dados. Isolamento de coleorriza

[00217] Depois de observar a taxa de germinação, placas de PDA foram imediatamente transferidas para uma capela de biossegurança estéril para isolamento de coleorriza. Sementes de trigo foram cuida- dosamente dissecadas sob microscópio composto e camadas de cole- orriza foram clivadas usando agulha esterilizada e bisturi. Coleorrizas isoladas foram armazenadas em um tubo de microcentrífuga esterilizado livre de RNase. Sementes de todas as réplicas biológicas de um tratamento foram combinadas e aproximadamente 20 a 30 coleorrizas foram isoladas para obter uma melhor quantidade de material vegetal para extração de RNA. Extração de RNA e síntese de cDNA

[00218] Para evitar qualquer degradação no material vegetal, a extração de RNA foi realizada imediatamente após o isolamento de cole- orriza em cada dia. Aproximadamente 20 mg de amostras de coleorri- za foram colhidas para extração de RNA. O RNA total foi extraído usando Aurum TM total RNA Mini Kit de acordo com as instruções do fabricante (Bio-Rad Laboratories). A concentração de RNA foi medida espectrofotometricamente por Nanodrop (Thermo Scientific). Imediatamente após a extração de RNA, a síntese de cDNA foi realizada utilizando o kit de síntese de cDNA iScript seguindo as instruções do fabricante (Bio-Rad Laboratories). Uma alíquota de 600 ng de RNA foi tomada por síntese de cDNA. A transcrição reversa foi realizada a 42 ° C durante 30 minutos com um final de desnaturação a 85 ° C durante 5 minutos. PCR quantitativo em tempo real

[00219] Expressão de genes funcionais giberelina e do ácido abscí- sico foi estimada por quantificação relativa usando PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). Vários genes catabólicos e biossintéticos foram selecionados para avaliar os seus respectivos papéis na estratificação fria e biológica. Gene da actina de trigo de 131 pb de comprimento do fragmento foi utilizado como controle interno [Nakamura et al., 2010 ] . QRT-PCR foi realizada utilizando um termociclador MJ-Mini Gradiente (Bio-Rad Laboratories) seguindo as instruções do fabricante. A condi- ção de PCR foi de 1 ciclo de 95 ° C durante 1 minuto e 40 ciclos de 94 ° C durante 20 s, 60 ° C durante 30 s, e 72 ° C durante 1 min. Para PCR em tempo real, foram utilizadas amostras de cDNA a partir de tratamentos e todas as reações foram realizadas em três repetições e dois controles negativos. Cada 25 μl de reação continha 18 μl de iQ TM SYBR ® Green Supermix (Bio-Rad Laboratories), 10 pmol do iniciador direto apropriado e iniciadores reversos, 2,5 μl de albumina de soro bovino, e 25 ng de molde cDNA. A quantificação relativa foi realizada de acordo com Zhang et al. [2007]. Os níveis de expressão foram calculados utilizando valor limiar de ciclo (CT) determinado de acordo com a linha de base ajustada manualmente. A diferença entre os valores de Ct para o gene alvo e actina (Ctalvo - Ctactina) foi estimada como XT ε, εμ αεyviδα, o \d raεX δε ε^πpεαα©o Φoi xαX/vXαδα /oμo 2 x\ Os valores médios de 2 - Xt foram usadas para avaliar diferenças na expressão entre os tratamentos de controle e de estratificação. Para assegurar a especificidade e consistência de amplicons, análise da curva de fusão e de eletroforese em gel de agarose foram realizados após cada execução de QRT-PCR. Sequenciamento

[00220] Os amplicons de actina e vários genes GA e ABA foram purificados utilizando kit BioBasic PCR Purification (Bio Basic Inc.). Para cada tratamento, amplicons purificadas foram enviados para o se- quenciamento no Plant Biotechnology Institute (NRC-PBI). Sequências de genes foram identificadas por análises de ferramenta de pesquisa de alinhamento local básico (BLAST) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).

Análise estatística

[00221] Uma análise de variância da percentagem de germinação e expressão gênica de dados foi realizada utilizando o software IBM SPSS Statistics versão 19. As diferenças entre os tratamentos de controle e de estratificação foram examinadas com o teste post-hoc de Duncan. Resultados e discussão Percentual e eficácia de germinação

[00222] Ambos tratamentos de estratificação a frio e estratificação biológica aumentaram significativamente a taxa de germinação com todos os três tratamentos apresentando percentagem de germinação superior ao controle (Figura 46A; Tabela 8). Endófito direto mostrou maior percentagem de germinação após cada dia e um aumento de 60% a partir do Dia 1 ao Dia 3. Durante todo o período de germinação (3 dias) este demonstrou significativamente ( P <0,05) maior capacidade de germinação do que os outros três tratamentos. Apenas os tratamentos de estratificação biológica produziu germinação superior a 50% após o dia 2. Curiosamente, tratamentos indiretos com endófitos não apresentaram germinação após o Dia 1, mas produziram uma notável germinação de 50% após o Dia 2. Tratamento com estratificação a frio não demonstrou nenhuma diferença significativa relativamente ao controle depois do Dia 1, e, em seguida, aumentou de forma constante, mostrando diferença significativa após o Dia 2 e Dia 3. Padrão de aumento na germinação também se reflete nos valores R 2 . Considerando que o controle mostrou um valor de R 2 de 0,40, estratificação a frio e tratamento direto com endófito mostrou 0,60 e 0,75, respectivamente. Por outro lado, devido ao seu aumento de 50% a partir do Dia 1 ao Dia 2, o tratamento com endófito indireto teve o mais alto valor de R 2 de 0,93, que é cerca de 2,5 vezes maior do que o controle. Energia de germinação é um parâmetro crítico que determina a capacidade das sementes para romper a dormência e iniciar a germinação. Energia de germinação é assumida como a percentagem de germinação de sementes depois de determinado período de tempo ou o núme-ro de dias necessários para alcançar 50% de germinação. Endófito direto mostrou a maior eficácia seguido por endófito indireto e estratificação a frio (Figura 46B). Como não houve germinação em sementes por endófitos indireto após o Dia 1, a eficácia da germinação foi negativa. Em geral, os tratamentos de estratificação mostraram resultado extremamente positivo ao atingir germinação de 50% após 48 horas.

[00223] Estratificação desempenha um papel ecológico importante na liberação de dormência primária e valorização de germinação das sementes [Bewley and Black 1982; Probert et al., 1989]. Alívio da dormência de sementes e melhoria da germinação através de estratificação a frio foram alcançados em muitas espécies, incluindo gramíneas [Schutz and Rave 1999], amora [Koyuncu 2005], pinho [Carpita et al., 1983], tabaco [Wu et al., 2008], arroz [Mukhopadhyay et al. 2004], e maçã [Bogatek and Lewak 1988]. A germinação também foi aumentada em estratificação a frio em 33 espécies de plantas daninhas anuais e estratificação foi proposta até mesmo ser capaz de anular as diferenças na capacidade de germinação de sementes entre as populações [Milberg e Andersson 1998]. No entanto, há pouca informação disponível sobre o impacto da estratificação a frio na germinação de sementes de trigo. Este estudo concluiu que o efeito de estratificação a frio requer um período inicial e, portanto, a germinação de sementes não foi significativamente diferente do controle no Dia 1. No entanto, demonstrou impacto considerável sobre a germinação de Dia 2 e a percentagem de germinação, aumentou tanto quanto 20% maior do que o controle. O período de estratificação a frio neste estudo foi selecionado a partir de relatos anteriores que mostraram um período de 48 horas é eficaz para a estratificação a frio na estratificação de tabaco [Wu et al., 2008 ] arroz e [Mukhopadhyay et al. 2004]. Estudos anteriores têm mostrado que os efeitos da estratificação a frio é proporcional ao seu tempo de comprimento [Baskin et al. 1992; Cavieres and Arroyo, 2000]. Os resultados suportam isso e ampliam ainda mais a noção de prever que pode um período ligeiramente mais longo de estratificação (~ 4 dias) pode ser requerido para o trigo para atingir máxima capacidade de germinação.

[00224] Vários relatórios mostram o aumento da germinação das sementes através da aplicação de endófitos de fungos [Vujanovic 2007b ; Hubbard et al. 2012; Vujanovic and Vujanovic 2007]. O presente estudo apoia o conceito de "micovitalismo", que é o aumento da vitalidade através da colonização de fungos. Fungos endófitos são bem conhecidos para a produção de compostos voláteis que afetam fenofases vegetais [Mitchell et al., 2009; Strobel et al., 2004]. Assim, endófitos podem ser susceptíveis de afetar a germinação das sementes, mesmo quando estas não estão em contato direto com as semen-tes, e este atributo é particularmente útil em condições de campo. Aqui também foi testado como a distância física pode influenciar a germinação de sementes sob estratificação biológica. Estes resultados sugerem que as sementes em contato direto com endófito de fungos são, sem dúvida, mais beneficiadas do que suas contrapartes. Endófito direto produziu maior percentual e a eficácia da germinação de sementes em cada dia do período de germinação. Semelhante ao contato de endófito direto, sementes colocadas a 4 cm do endófito também germinaram a uma taxa significativamente mais elevada do que o controle. No entanto, a percentagem de germinação e eficácia foram realmente afetadas de fato pela distância e sementes com contato indireto foram entre 14% e 27% menos de germinação do que as de contato direto. Além disso, nenhuma atividade de germinação foi observada no Dia 1, a qual foi seguida por um aumento acentuado (50%) no dia 2. A germinação das sementes é um processo extremamente complexo e seus mecanismos subjacentes são relativamente menos compreendidos [Nonogaki et al., 2010]. Assim, não está claro como fungos endófi- tos facilitam a liberação da dormência e início da germinação de sementes. Considerando que fungos são capazes de produzir uma gama de substâncias que promovem o crescimento das plantas, é possível que estas substâncias sejam mais eficazes na vizinhança próxima. Consequentemente, as sementes com endófitos diretos têm taxa de germinação significativamente maior do que outros tratamentos. Pelo contrário, as sementes com endófitos indiretos mostraram alta eficácia de germinação após 48 horas, este período pode ter permitido o acúmulo suficiente de substâncias promotoras do crescimento. Há uma diferença na percentagem de germinação (6,6%) entre tratamentos de controle e endófitos indiretos no dia 1, no entanto, não é substancial. Nível de expressão de genes de giberelina e ácido abscísico em cole- orriza

[00225] Os genes GA3-oxidase e 14-3-3 foram selecionados como gene biossintético GA e regulador negativo da via de biossíntese de GA, respectivamente [Ji et al, 2011 ; Zhang et al., 2007]. O gene NCED é bem conhecido por seu papel na via de biossíntese de ABA enquanto gene ABA 8'-hidroxilase está envolvido na via catabólica de ABA [Ji et al., 2011 ] . Análise em tempo real quantitativa de PCR indicou que os valores diferenciais (Figura 47) e proporção de expressão (Figura 48) de genes funcionais distintos variaram significativamente (P <0,05) entre os tratamentos. Exceto para o gene 14-3-3 no Dia 3, a expressão detectável foi observada para todos os quatro genes em cada dia. No dia 1, todos os genes foram regulados negativamente em comparação com o controle. Expressão do gene da biossíntese de GA, TaGA3ox2, foi consideravelmente maior no tratamento de estratificação fria do que a de estratificação biológica. Por outro lado, ex-pressão de 14-3-3 não variou significativamente entre os tratamentos frios e com endófitos embora a expressão de estratificação a frio foi um pouco maior do que as endofíticas. O nível de transcrição do gene de biossíntese ABA, TaNCED2, não variou entre controle e estratificação a frio, e foi significativamente regulado positivamente do que os tratamentos endofíticos. O gene 8'-hidroxilase ABA, TaABA8'OH1, mostrou regulação negativa significativa em todos os três tratamentos de estratificação, com menor expressão observado sob estratificação a frio. O padrão de expressão não variou entre os tratamentos de endófi- tos indiretos e endófitos diretos. No dia 2, expressão de TaGA3ox2 foi significativamente regulada para baixo em todos os tratamentos de estratificação que não o controle. Expressão não variou entre a estratificação a frio e tratamentos de endófitos indiretos, e menor expressão foi detectada em coleorrizas com endófito direto. Nenhuma diferença significativa foi observada para nível de transcrição de 14-3-3 entre todos os quatro tratamentos, embora a expressão tenha sido um pouco mais elevada sob estratificação a frio. A expressão de gene TaN- CED2 foi significativamente menor nos tratamentos endofíticos do que que controle e estratificação a frio. Da mesma forma, gene TaA- BA8'OH1 demonstrou considerável regulação negativa em tratamentos de estratificação do que o controle. A menor expressão foi detectada no tratamento com endófito indireto. O nível de transcrição de gene TaGA3ox2 também variou significativamente entre os tratamentos no Dia 3. Estratificação a frio apresentou expressão cerca de dez vezes maior do que o controle enquanto dois tratamentos endofíticos não variaram significativamente. Por outro lado, os genes TaNCED2 e TaA- BA8'OH1 foram significativamente regulados em todos os tratamentos de estratificação com menor expressão em tratamentos com endófitos diretos e endófitos indiretos, respectivamente. Nenhuma expressão detectável foi observada para o gene 14-3-3 no Dia 3.

[00226] A proporção de expressão gênica da biossíntese de GA e ABA, TaGA3ox2:TaNCED2, não mostra nenhuma diferença considerável entre os tratamentos no Dia 1, mas aumentou de forma constante desde então (Figura 48). Endófito indireto apresentou maior valor no dia 2, que é cerca de 5-10 vezes maior do que os outros tratamentos; no entanto, todos os três tratamentos de estratificação demonstraram valores semelhantes no Dia 3. Por outro lado, para a relação entre biossín- tese de GA e genes catabólicos (TaGA3ox2: 14-3-3), endófito direto mostrou valor mais alto no dia 1 seguido por endófito indireto, estratificação a frio, e controle, que é bastante semelhante à sua percentagem de germinação. A proporção de genes catabólicos de biossíntese de GA e ABA, TaGA3ox2: TaABA1, apresentou padrões semelhantes para todos os tratamentos no Dia 1, no entanto, endófito indireto foi consideravelmente maior do que outros no Dia 2. No Dia 3, a estratificação a frio e endófito indireto demonstraram nível de expressão semelhante e controle foi insignificante. A proporção entre genes catabólicos de biossín- tese ABA e (TaNCED2: TaABA1) não variou entre os tratamentos durante o período de germinação, embora a estratificação a frio tenha mostrado nível de expressão ligeiramente mais elevado no Dia 1.

[00227] Os genes que codificam enzimas da biossíntese de catabolismo GA e ABA mostram padrões de expressão diferenciais dependendo do acúmulo de transcrição [Hedden e Phillips, 2000 ] . Padrões de expressão de genes GA3ox1 foram estudados em grande número de espécies de plantas incluindo Arabidopsis [Phillips et al., 1995], arroz [Oikawa et al., 2004 ] , e trigo [ Zhang et al., 2007] . Considerando que outros genes da biossíntese de GA como GA-20ox estão associados com crescimento tecidos vegetativos, e flores, GA3ox < ( GA3ox2 ou GA4H ) é exclusivamente expresso em sementes durante germinação e supostamente desempenha um papel crucial [ Phillips et al., 1995; Yamaguchi et al., 1998; Hedden e Phillips, 2000 ] . Semelhante aos relatórios anteriores, este estudo também demonstrou alta expressão de gene GA3ox2 em coleorriza trigo durante todo o período de germinação. Potencialmente, sem querer estar limitado pela teoria, isso reflete uma produção consistente da molécula GA bioativa GA3 em coleorriza de trigo durante a germinação. Por outro lado, a baixa expressão de gene 14-3-3, um regulador negativo da biossíntese de GA, também foi detectada em coleorriza. Com o crescimento gradual de mudas e aumento do teor de GA endógeno, o nível de transcrição de 14-3-3 também caiu e, finalmente, diminuiu após o Dia 2. Curiosamente, controle teve maior nível de 14-3-3 seguido de estratificação a frio, endófito indireto, e endófito direto, que foi um pouco refletido em sua capacidade de germinação. Estes resultados estavam de acordo com o relatório anterior por Zhang et al. [ 2007], que mostrou genes da biossíntese de GA e catabólicos estreitamente ligados ao conteúdo de GA e crescimento de rebentos.

[00228] Os padrões de expressão dos genes da via ABA foram estudados em uma ampla gama de cereais e leguminosas incluindo arroz [Oliver et al., 2007], trigo [Ji et al., 2011; Nakamura et al., 2010], feijão [Qin e Zeevart de 1999]. Os resultados deste estudo mostram que, exceto o controle e estratificação a frio no dia 1, expressão de gene TaN- CED2 não variou entre os tratamentos. O ácido abscísico desempenha um papel fundamental nas vias de adaptação ao estresse [ Nakamura et al., 2010 ] . Dado que as sementes de estratificação a frio foram mantidas a 4 ° C durante 48 horas antes da sua incubação em temperatura ambiente, o teor de ácido abscísico pode ter sido superior. Por outro lado, a alta expressão de TaNCED2 no controle pode ter resultado em uma maior síntese de ABA e, assim, em mais lenta taxa de germinação. Relatos recentes sugerem que o catabolismo da ABA ocorre principalmente em coleorriza [Millar et al., 2006; Okamoto et al., 2006]. Além disso, Barrero et al. [ 2009] relataram o aumento da regulação e maior expressão de ABA8'OH-1 em coleorriza de cevada. Semelhante a esses relatórios, aqui alto padrão de expressão de gene TaABA8'OH1 foi encontrado em coleorriza de trigo. A proporção de genes da biossíntese de GA e ABA foi bastante ligada à percentagem de germinação. Embora, TaGA3ox2: TaNCED2 não variou notavelmente no dia 1, foi mais elevado em endófito indireto no dia 2 devido ao seu aumento significativo. Por outro lado, todos os três tratamentos de estratificação mostra- ram considerável regulação positiva de TaGA3ox2: TaNCED2 no Dia 3, que pode ter refletido em sua germinação.

[00229] Os mecanismos subjacentes da estratificação biológica são ainda relativamente desconhecidos, mas eles poderiam revelar como interações planta-fungo ocorrem nos primeiros estágios da germinação. O papel de fungos endófitos como biopotencializadores é amplamente reconhecido [Arnold et al., 2001; Hubbard et al. 2011; Saikkonen et al., 1998; Khan et al. 2012]. Neste estudo, foi demonstrado que fungos endófitos podem estimular a germinação de sementes significativamente, e esta micovitalidade é proporcional à distância física entre a semente e endófito de fungo. Além disso, o efeito de estratificação biológica mediada pelo endófito de fungo é consideravelmente mais elevado do que o pré-tratamento a frio. Estudos anteriores demonstraram que o início da germinação é proporcional ao tempo de estratificação a frio [Cavieres e Arroyo, 2000b], considerando isso, o estudo futuro pode estender o período de estratificação a frio (> 48 horas) para aumentar a capacidade de germinação de sementes em trigo. Embora a estratificação a frio tenha aumentado o nível de transcrição do gene da biossíntese ABA, fungos endófitos não estimulam diretamente a expressão de genes em fitohormônio coleorriza. No entanto, este estudo especificamente avaliou a expressão de quatro genes em coleorriza.

[00230] Nenhum estudo tinha comparado os padrões de germinação sob estratificação a fria e biológica, e elucidou biossíntese e expressão gênica catabólica de GA e ABA em coleorriza de trigo. Coleor- riza recentemente se monstrou como um componente altamente ativo das sementes em germinação [Barrero et al., 2009 ] . De acordo com este Exemplo, elevada expressão de vários genes funcionais em cole- orriza de sementes de trigo em germinação foi também demonstrada. Germinação da semente pode ser substancialmente aumentada por meio da aplicação de endófitos de fungos: 1) através de micovitalidade indireta ou sem o contato endófito-semente na distância testada (por exemplo, os 4 cm de distância foram usados neste Exemplo) e 2) através da micovitalidade direta ou uma vez o endófito tenha atingido a semente. Exemplo 13 Efeitos de estratificação endofíticas nos reguladores hormonais (RSG e KAO) e genes de resistência MYBs

[00231] A estratificação é a exposição de sementes a condições frias e úmidas, a fim de quebrar a dormência, ou melhorar a germinação das sementes. Como estratificação é atualmente limitada ao papel dos fatores abióticos, este estudo tem como objetivo tornar a definição mais abrangente, reconhecendo o papel dos fatores bióticos usando micovitalidade, ou uma simbiose fungo-semente como um modelo. Este reconhece a existência de ambas as estratificações a frio e biológica. A germinação das sementes de trigo submetida a estratificação a frio a 4 ° C foi comparada com a de sementes de trigo inoculadas, em temperatura ambiente. As sementes foram inoculadas com cepa endo- fítica SMCD2206. Mudanças no padrão de expressão da semente de genes reguladores de promoção do crescimento da planta (RSG e KAO) e giberelinas fitohormonais (GAs); e genes de resistência adquirida (MYBs) em condições abióticas vs. bióticas, durante a ruptura precoce da dormência de sementes e germinação, foram avaliadas. As medições foram realizadas nas células de coleorriza utilizando qRT- PCR (tal como descrito no Exemplo 12). Os resultados indicam que os genes RSG e KAO (Figura 49), codificam para enzimas que promovem a biossíntese de genes de resistência GAs, e os MYBs (Figura 49) estão regulado positivamente em sementes inoculadas. Micovitalidade, assim, demonstra um efeito de reprogramação em eventos pré e pós- germinação de sementes de trigo com vista a aumentar a ruptura de dormência e germinação, contribuindo de forma eficaz para o atendimento pré-natal de culturas de cereais. Material e métodos As amostras de RNA

[00232] Este estudo é a continuação do Exemplo 12. O mesmo material (trigo e SMCD 2206) e métodos in vitro, bem como as amostras de RNA extraídas foram utilizadas para avaliar fitohormônio e expressão de genes reguladores RSG e KAO e de resistência MYB por qRT - PCR.

[00233] Antes da extração de RNA iniciar, tubos contendo tecidos de coleorriza foram armazenados em nitrogênio líquido imediatamente logo que tecidos de Coleorriza foram isolados para preservar as células e evitar a desnaturação do RNA. Kit Aurum TM Total RNA Mini (BioRad Laboratories) foi usado na extração de RNA total a partir de tecidos de plantas, e sugere um mínimo de 20 mg de tecidos das plantas seriam adequados para cada amostra. Os passos de extração foram realizados rapidamente e todo o processo foi mantido em gelo, uma vez que o RNAs facilmente desnatura em temperatura ambiente. RNAs totais extraídos frescos são diretamente carregados com agentes de síntese de de cDNA pré-misturados obtidos a partir de Kit iScript cDNA Synthesis (Bio-Rad Laboratories). A transcrição reversa foi realizada a 42 ° C durante 30 minutos com uma desnaturação final de 85 ° C durante 5 minutos num termociclador. A concentração de cDNA foi medida por espectroscopia de Nanodrop (Thermo Scientific) e diluída ou concentrada até 100 ng/μl. RT-PCR quantitativa e Análise Estatística

[00234] A PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) foi realizada num Sistema de Detecção de PCR MiniOpticon™ em Tempo Real (BioRad Laboratories) com iQ TM SYBR ® Green Supermix Kit (Bio-Rad Laboratories). A fim de normalizar os dados de QRT-PCR, gene da actina (fragmento de 131 pb de comprimento) foi selecionado como um gene de referência e serviu como controle interno para evitar a polarização de flutuação da expressão do gene sob baixa concentração de cDNA [Zhang et al. 2007; Nicot 2005]. Iniciadores dos gene KAO e RSG de acordo com Zhang et al. [2007] foram testados neste experimento, enquanto iniciadores originais foram projetados para MYB1 e MYB2 baseados em sequências de Triticum aestivum disponíveis publicamente (http://compbio.dfci.harvard.edu/cgi-bin/tgi/geneprod_search.pl) Computational Biology and Functional Genomics Laboratory (Universidade de Harvard). Os iniciadores recém-concebidos de MBY (Tabela 9):

[00235] Fator de transcrição de RNAm Myb2 (158bp), que compreende as sequências como apresentado em SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 17 e o fator de transcrição de RNAm Myb1 (152bp), que compreende as sequências como apresentado em SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19 (Tabela 9).

[00236] 100 ng/μl de amostras de cDNA foram ainda diluídas para 10 ng/μl e 2 μl de cDNA foram usados para cada reação de 25 μl. Além disso, 12,5 μl de iQ TM SYBR ® Green Supermix, 8,5 μl de água estéril Milli-Q, 1 μl de cada iniciador direto e reverso (10 pmol) foram prepardos até uma mistura de reação de 25 μL. O protocolo de ciclo térmico foi sugerido como 95 0C durante 10 minutos e 40 ciclos de 94 0C durante 20 s, 60 0C durante 30 s, e 72 0C durante 1 min. Todas as amostras de cDNA a partir dos tratamentos foram realizadas em três repetições e dois controles negativos em QRT-PCR. Os níveis de expressão do gene referidos para as curvas quantitativas foram realizados por CFX Manager™ Software (Bio-Rad Laboratories). Valor de quantificação de ciclo (CQ) a partir das medições de fluorescência foi registrado e ajustado manualmente com os valores basais. Quantificação relativa é o método estatístico escolhido neste estudo [Gizinger 2002]. Gene de interesse em relação ao controle do gene endógeno foi usado para comparar com diferentes tratamentos. A quantificação (ΔCT) foi realizada em relação à subtração do valor Cq do gene de interesse ao valor Cq do gene de controle. ΔCT foi adicionalmente subtraído pelo valor do calibrador e valores ΔΔCT gerados correspondentes que foram transformados para log 2 (duplicação da função de PCR) para sintetizar os níveis de expressão gênica relativos [Jurado et al., 2010 ] . Genes amplificados de RSG, KAO e MYB foram purificados usando Kit BioBasic PCR Purification (Bio Basic Inc.) e enviados para o trabalho de sequência no Plant Biotechnology Institute (NRC- PBI). Sequências de genes foram identificadas por análises de ferramenta de pesquisa de alinhamento local básico (BLAST) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Alta identidade ou genes semelhantes correspondentes a diferentes organismos homólogos foram montados e alinhados por software MEGA5 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis). Uma árvore de filogenia foi feita com o método estatístico de Neighbour-Joining baseada nos genes alinhados. Exemplo 14 O óxido nítrico (NO) mostrou o efeito regulador sobre micovitalismo durante eventos de germinação de sementes precoce.

[00237] O óxido nítrico (NO) é uma molécula de sinal altamente reativa comum para sistemas fúngicos, vegetais e animais. NO é também conhecido como uma molécula de sinalização envolvida em sinalização hormonal de célula eucariótica [Guo et al. 2003] e resposta de planta aos estresses abióticos e bióticos [Hayat et al. 2010]. Embora não haja evidência de nenhum acúmulo de NO, aumento da ativação de SOD e prolina contribuindo para o atraso de acúmulo de O2- e H2O2 nas folhas de trigo sob estresse salino, não existe quase nenhuma informação para endófitos de fungos e há interação com a germinação das sementes (micovitalismo). Aqui, a ocorrência de NO nos estágios iniciais de germinação de sementes de trigo AC Avonlea foi investiga- da durante três dias - endófito SMCD 2206 em PDA, concentrando-se em resposta da radícula às moléculas difusíveis fúngicas. NO foi visualizado em radícula (órgão de raiz precoce) em cultura de germinan- tes por microscopia de fluorescência utilizando a sonda de 4,5- diaminofluorescência específica no diacetato; a avaliação foi realizada após cinco minutos de exposição ao exsudato fúngico, como suficiente para induzir acumulação significativa de NO [Calcagno et al. 2012]. Assim, exsudato de SMCD 2206 induziu uma produção significativa de NO nos tecidos de raiz do trigo; sem se pretender ficar limitado pela teoria, é possível que esta produção seja regulada por um diálogo molecular ocorrendo na simbiose de trigo. Material e métodos

[00238] O acúmulo de NO nos tecidos de radícula foi analisado em semente de germinação de trigo AC Avonlea (abordagem in vitro apresentada no Exemplo 12) usando a sonda específica DAF -2DA para NO permeável na célula de acordo com Calcagno et al. [2012] que é convertida no seu derivado triazol fluorescente DAF-2T após reação com o NO. A formação de DAF-2T foi visualizada por microscopia de fluorescência (Cari Zeiss Axioscop 2). Germinante de AC Avonlea foi avaliado em 5 min após o tratamento com o exsudado de SMCD 2206 de fungo após o procedimento proposto por Nakatsubo et al. [1998]

[00239] A especificidade desta resposta ao SMCD 2206 endofítico foi confirmada pela falta de resposta nas células de radicais não inoculados. As análises foram repetidas com três repetições biológicas in-dependentes. Resultados e discussão

[00240] O tratamento de sementes com o exsudato de fungo pode imitar, em certa medida, a abordagem de hifas endofíticas durante a fase pré-simbiótica da interação, tal como sugerido para AM micorriza em co-cultura com raízes de Arabidopsis [Calcagno et al. 2010]. O ex- sudado de fungo pode, portanto, ser utilizado com confiança para testar se os sinais fúngicas difusíveis provocam acumulação de NO nos tecidos de trigo hospedeiro (Figura 51) durante os eventos de germinação precoce que melhoram a micovitalidade.

[00241] Evidência celular, por conseguinte, sugere que o acúmulo de NO é um novo componente na via de sinalização que conduz a mico- simbiose relacionada com micovitalismo de sementes de trigo (Figura 51). Este achado tem ambos os valores teóricos e práticos na tentativa de melhorar cuidado pré-natal de planta usando simbiontes endofíticos. Exemplo 15 Estudo dos efeitos de endófitos na fitorremediação e fitorecuperação

[00242] A fitorremediação é uma técnica promissora ambiental. Foi demonstrada em termos de custos para recuperação de hidrocarbone- to/petróleo, sal, metal pesado e solos contaminados com radioisóto- pos. Neste estudo, os efeitos de árvores coníferas (Picea ou Pinus) e decídua (Salix ou Populus), arbustos (Caragana ou krascheninnikovia), e gramíneas (Festuca ou Elymus) infectadas (E +) e não infectadas (E) por organismos endofíticos (através de material de propagação vegetal, infecção de semente ou raiz e colonização) (SMCD 2204, 2206, 2208, 2210 e 2215) sobre a decomposição, transformação ou degradação de hidrocarbonetos de petróleo em solo contaminado com pe-tróleo serão investigados. As plantas serão cultivadas em vasos contendo solos contaminados por petróleo e solos não contaminados. Plantas serão inoculadas e incubadas durante 6 meses usando o método de estufa sugerido por Soleimani et al. (2010). Potes não plantados serão usados como controle. No final do experimento, a colonização de raiz de plantas (Abdellatif et al. 2009), hidrofobicidade do solo (Chau 2012), conteúdos de hidrocarbonetos de petróleo totais (TPHs), e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAHs) serão analisados (Germida et al. 2010). A diferença de raiz de plantas E+ vs. E- e bio- massa de rebento e fotossíntese de folha será comparada (Hubbard et al. 2012) com HAP e remoção de TPH no rizosfera das plantas. Potes não plantados serão utilizados como controle para calcular a eficácia de plantas simbióticas (E +) em degradação de hidrocarbonetos de petróleo (Soleimani et al. 2010). As plantas infectadas irão decompor, transformar ou degradar os hidrocarbonetos e os seus sais, absorver e acumular e limpar ou eliminar os metais pesados e radioisótopos no local contaminado, solo ou meio ambiente.

[00243] Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência ao que presentemente são considerados os exemplos, deve ser entendido que esta invenção não se limita aos exemplos revelados. Pelo contrário, a descrição pretende cobrir várias modificações e arranjos equivalentes incluídos dentro do espírito e escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente são aqui incorporados por referência na sua totalidade na mesma extensão como se cada publicação, patente ou pedido de patente individuais fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada por referência na sua totalidade.

Tabela 2: Frequência de colonização de raiz com SMCD endofítico avaliada em radículas germinativa trigo 3D.

Tabela 3 - Energia de germinação (EG) e tempo hidrotérmico (HTT) de sementes de trigo cultivadas sob calor (36°C), seca (meio ágar dextrose de batata (PDA) mais 8% de polietileno glicol (PEG) 8000), calor e seca combinados e condições controle in vitro . Dentro de uma coluna, dados seguidos por um asterisco (*) são significativamente diferentes do controle não endófito (p ≤ 0,05; ANOVA, seguida de um teste posthoc LSD). Nota: As sementes utilizadas na determinação de EG e HTT foram a partir da segunda rodada de experimentos, e, portanto, sujeitas a esterilização em solução de hipoclorito de sódio a 5% por um minuto, em vez de três; SMCD – Saskatchewan Microbial Collection and Database

Tabela 4 -. Endófitos aumentam a eficiência de tolerância à seca (DTE) e rendimento em cevada e trigo sob condições de estresse

‡ Eficiência de tolerância à seca (DTE) = (Rendimento sob estresse/Rendimento em condições sem estresse) x100; apresentada por ordem crescente dentro da tabela. Os genótipos com alta DTE são considerados como resistentes à seca; enquanto que genótipos com baixo DTE são considerados como suscetíveis à seca. Nota: Efeito da ausência do endófito (E-) ou presença (E +) no rendimento de genótipo foi calculado como uma média das três cepas SMCD 2206, SMCD 2210, e SMCD 2215 testadas.

[00244] Dentro das linhas, a média não é estatisticamente significativa a p > 0,05. Tabela 5 - Identidade de sequência máxima de Rhizobium contra a base de dados GenBank

Nodulador de Rhizobium nativo em interação com Streptomyces SMCD2215 16S F (Golden) Rhizobium sp.

Tabela 6 - Conjunto de iniciadores de SOD, MnSOD e Pro utilizados para avaliar expressão de genes de ervilha [Handel] exposta a estresse seca PEG/ osmótico por qPCR

Tabela 7 - Avaliação da eficiência de métodos de esterilização de sementes . As sementes foram germinadas em placas de ágar de dextrose de batata durante 4 dias em temperatura ambiente (20 ° C). Cada placa de Petri tinha 10 sementes de trigo.

Tabela 8 - Germinação média de sementes de trigo sob tratamentos de estratificação a frio e biológica

* Teste de Duncan foi realizado para testar a diferença significativa entre os tratamentos (Controle, estratificação a frio, endófito indireto, e endófito direto) no Dia 1 (a, b, c), Dia 2 (p, q), e no Dia 3 (x,y,z) ** Letras diferentes indicam diferença significativa em P <0,05

REFERÊNCIAS Abdellatif et al. 2009. Mycological Research, 113:782-791. Abdellatif et al. 2010. Can JPlant Pathol, 32: 468-480. Adriaensen et al. 2006. Mycorrhiza, 16: 553-558. Agius et al. 2006. PNAS, 103: 11796-11801. Ali et al. 1994. Annals of Applied Biology, 125: 367-375. Allen 1958. Forest Chron, 34: 266-298. Armas et al. 2004. Ecology, 85: 2682-2686. Arnold et al. 2001. Mycological Research, 105: 1502-1507. Bacon and White 2000. In: Bacon CW and White JFJ (Eds), Microbial endophytes. Marcel Dekker Inc; New York, NY, USA. 237-263. Bae et al. 2009. J Exp Bot 60: 3279-3295. Baird et al. 2010. Mycorrhiza. 20: 541-549. Barrero et al. 2009. Plant Physiology, 150: 1006-1021. Baskin et al. 1992. International Journal of Plant Sciences, 153: 239-243. Baskin and Baskin 2004. Sci. Res., 14: 1-16. Bewley and Black 1982. Physiology and Biochemistry of Seeds. 2. Viability, Dormancy, and Environmental Control. Springer-Verlag, Berlin. Bloom and Richard 2002. ASAE Paper No 027010. ASAE, St. Joseph, MI. Bogatek and Lewak 1988. Physiologia Plantarum, 73: 406-411. Boyko and Kovalchuk 2008. Environmental and Molecular Mutagenesis, 49: 61-72. Bradford 2002. In: J. Kigel J, Galili G (eds), Seed Develop and Germin. Marcel Dekker Inc, New York, pp. 351-396. Calcagno et al. 2012. Mycorrhiza, 22:259-69. Cao and Moss. 1989. Crop Sci, 29: 1018-1021. Carpita et al. 1983. Physiologia Plantarum 59: 601-606. Cavieres and Arroyo, 2000. Plant Ecology 149: 1-8. Cavieres and Arroyo, 2000b. Gayana Botanica 64: 40-45. Charlton et.al. 2008. Metabolomics, 4: 312-327. Chau et al. 2012. Fungal Biology, 116:1212-1218. Chipanshi et al. 2006. Clim Res, 30: 175-187. Choi and Sano, 2007. Molecular Genetics and Genomics, 277: 589-600. Davitt et al. 2010. New Phytol, 188: 824-834. de Bary 1866. Vol. II. Hofmeister's Handbook of Physiological Botany. Leipzig, Germany. Desfeux et al., 2000. Plant Physiology, 123: 895-904. Dong-dong et al. 2009. J Zhejiang Univ-Sci B, 9: 964-968. Farquhar and Richards 1984. Australian Journal Plant Physiology 11: 539-552. Farquhar et al. 1989 In: Jones HG, Flowers TJ and Jones MB (Eds) Plants under stress. Cambridge University Press, Cambridge, pp 47-69. Farquhar et al. 1989b. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 40: 503-537. Finnegan et al. 1998. Plant Molecular Biology 95: 5824-5829. Freeman 1904. Philosophical Transactions of the Royal Society London (Biology) 196: 1-27. Friend et al. 1962. Can J Bot, 40: 1299-1311. Gan et al. 2004. Can. J Plant Sci, 84: 697-704. Germida et al. 2010. Field-scale assessment of phytoremediation at a former oil tank battery in Bruderheim, Alberta. World Congress of Soil Science, Soil Solutions for a Changing World, 1-6 August 2010. Bris- bane, Australia. Available on-line at: http://www.iuss.org/19th%20WCSS/Symposium/pdf/0694.pdf Gizinger 2002. Experimental Hematology, 30: 503-512. Gornall et al. 2010. Phil. Trans. R. Soc. B, 365, 2973-2989. Grant et al. 2009. Tree Physiology, 29: 1-17. Gummerson 1986. J Exp Bot, 37: 729-741. Gundel et al. 2010. Evol Appl, 3: 538-546. Guo et al. 2003. Science, 302: 100-103. Hayat et al. 2010. Nitric Oxide in Plant Physiology, Issue 58, Willey- VCH Verlag, Germany. Hedden and Phillips, 2000. Trends in Plant Science, 5: 523-530. Hubbard et al. 2011. In: Wheat: Genetics, Crops and Food Production. Nova Science Publishers Hauppauge, NY, USA. pp. 333-345. Hubbard et al. 2012. Botany, 90(2): 137-149. Jame et al. 1998. Agric Forest Meteorol 92: 241-249. Ji et al., 2011. Plant Physiology, 156: 647-662. Johannes et al. 2009. Plos Genetics 5: e1000530. Johannes et al. 2011. Genetics, 188: 215-227. Johnson et al. 1990. Crop Science, 30: 338-343. Jost et al. 2001. Nucleic Acids Research, 29: 4452-4461. Jumpponen and Trappe 1998. New Phytologist, 140: 295-310. Jurado et al., 2010. Food Microbiology, 27: 50-57. Kane 2011. Environmental and Experimental Botany, 71: 337-344. Kang et al. 2008. International Journal of Sustainable Development and World Ecology, 15: 440-447. Karavata & Manetas 1999. Photosynthetica, 36: 41-49. Khan et al. 2010. Pakistan Journal of Botany, 42: 259-267. Khan et al. 2012. BMC Microbiol, 12; 12:3. Kiffer and Morelet 2000. Science Publisher Inc, Enfield, NH, Plymouth. Kochy and Tielborger 2007. Basic Appl Ecol 8: 171-182. Koyuncu 2005. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica, 47: 23-26. Labeda et al 2012. Antonie van Leeuwenhoek, 101:73-104. Lang-Mladek et al. 2010. Molecular Plant, 3: 594-602. Larran et al. 2002. World Journal of Microbial Biotechnology, 18: 683-686. Leone et al. 1994. Physiol Plantarum, 92: 21-30. Li et al. 2008. Ecological Research, 23: 927-930. Li et al. 2011. Agronomy Journal, 103: 1619-1628. Lu et al. 2007. Plant Biology, 49: 1599-1607. Lucht et al. 2002. Nature Genetics, 30: 311-314. Madsood et al. 2005. Engineering Applications of Artificial Intelligence, 18: 115-125. Margulis, 1991. In Symbiosis as a Source of Evolutionary Innovation, L. Margulis and R. Fester, ed. The MIT Press: Cambridge. pp. 1-14. Marquez et al. 2007. Science, 315: 513-515. McCormick MC, Siegel (eds.) 1999. Prenatal Care: Effectiveness and implementation. Cambridge University Press UK. McDonald 2009. Handbook of biological statistics. 2nd ed. Sparky House Publishing, Baltimore, Maryland. McMaster 2009. In: Carver BF (ed), Wheat, science and trade, Wiley- Blackwell, Iowa, USA, pp. 31-55. Milberg and Andersson 1998. Plant Ecology, 134: 225-234. Millar et al., 2006. Plant Journal, 45: 942-954. Miransari et al. 2011. Applied Microbiology and Biotechnology, 92: 875-885. Mitchell et al., 2009. Microbiology-SGM, 156: 270-277. Mühlmann and Peintner 2000. Mycorrhiza, 18: 171-180. Mukhopadhyay et al., 2004. PNAS, 101: 6309-6314. Nakatsubo et al. 1998. FEBS Lett, 427:263-266. Nakamura et al., 2010. Euphytica, 171: 111-120. Nelson, 2004. Annu Rev Phytopathol, 42: 271-309. Nicot 2005. Journal of Experimental Botany, 56: 2907-2914. Nonogaki et al., 2010. Plant Science, 179: 574-581. Oikawa et al., 2004. Plant Molecular Biology, 55: 687-700. Okamoto et al., 2006. Plant Physiology, 141:97-107. Oliver et al., 2007. Plant and Cell Physiology, 48: 1319-1330. Penterman et al. 2007. PNAS, 104: 6752-6757. Phillips et al., 1995. Plant Physiology, 108: 1049-1057. Probert et al., 1989. Journal of Experimental Botany, 40: 293-301. Qin and Zeevart, 1999. PNAS, 96: 15354-15361. Reynolds et al. 2007 Journal of Experimental Botany, 58: 177-186. Richards et al. 2002. Crop Science, 42: 111-121. Ries et al. 2000. Nature, 406: 98-101. Rivero et al. 2011. International Conference on Arabidopsis Research. June 22-25, Madison USA. Ruan et al. 2002. Seed Sci Technol, 30: 61-67. Ryan et al. 2008. FEMS Microbiol Lett, 278: 1-9. Saikkonen et al., 1998. Annual Review of Ecology and Systematics, 29: 319-343. Saze 2008. Seminars in Cell and Developmental Biology, 19: 527-536. Schrey and Tarkka 2008. Antonie van Leeuwenhoek, 94:11-19. Schutz and Rave 1999. Ecology, 144: 215-230. Semenov and Shewry 2011. Scientific Reports, 1: 66-71. Sinclair et al. 1984. BioScience, 34: 36-40. Singh et al. 2011. Plant Signal Behav, 6: 175-191. Smith and Read 2008. Mycorrhizal symbiosis, Third Edition. Elsevier Ltd. Mycorrhizas in acholorophyllous plants (mycoheterotrophs). Chapter 13: 458-507. Solaiman et al. 2010. Australian Journal of Soil Research, 48: 546-554. Soleimani et al. 2010. Chemosphere, 81: 1084-1090. Stone et al., 2000. In: Bacon, C. W. and White, J. F. eds., Microbial Endophytes, Marcel Dekker: New York Chap. 1: 3-29. Strobel et al., 2004. Journal of Natural Products, 67: 257-268. Sun et al. 2010. Journal of Plant Physiolog, 167: 1009-1017. Tan and Zou, 2001. Nat Prod Rep, 18: 448-45. Tokala et al. 2002. Appl Environ Microbiol, 68:2161-2171. Vaughn et al. 2007. PloS Biology, 5: 1617-1629. Verhoeven et al. 2010. New Phytologis, 185: 1108-1118. Vujanovic et al. 2000. Annals of Botany, 86: 79-86. Vujanovic and Brisson 2002. Mycological Progress. 1: 147-154. Vujanovic and Vujanovic 2006. Floriculture, Ornamental and Plant Biotech, 63: 563-569. Vujanovic and Vujanovic 2007. Symbiosis, 44: 93-99. Vujanovic 2007b. Can J Plant Pathol, 29: 451-451. Vujanovic 2008. 19th International Conference on Arabidopsis. Research Proceedings- ICAR13, July 23-27, Montreal, QC, Canada. Waller et al. 2005. PNAS, 102: 13386-13391. Wallin 1927. Symbionticism and the Origin of Species. London: Baillière, Tindall and Cox. Wang et al. 2011. Journal of Experimental Botany, 62: 1951-1960. Whalley et al. 2006. Plant and Soil, 280: 279-290. White and Torres 2010. Physiol. Plant, 138: 440-446. Wu et al. 2008. Plant Physiology, 148: 1953-1963. Wu and Sardo 2010. Lichtfouse E. (Ed.), Sociology, Organic Farming, Climate Change and Soil Science. Sustainable Agriculture Reviews. 3: DOI 10.1007/978-90-481-3333-8_3. Yamaguchi et al. 1998. Plant Cell, 10: 2115-2126 Yang et al., 2002. Planta, 215: 645-652. Zadoks et al. 1974. Weed Research, 14:415-421. Zhang et al., 2007. BMC Genet, 2007, 8: 40. Zhang et al. 2010. Journal of Cereal Science, 52: 263-269. Zhang et al. 2011. African Journal of Microbiology Research, 5: 55405547. Zhao et al. 2007. Journal of Plant Nutrition, 30: 947-963. Zhong et al. 2009. African Journal of Biotechnology, 8: 6201-6207. Zhu et al. 2007. Current Biology, 17: 54-59. Foresight. The future of food and farming: challenges and choices for global sustainability. Final Project Report. London: The Government Office for Science, UK, 2011. IPCC Climate Change 2007. In: Solomon S, Qin D, Manning M, Chen Z, Marquis M, Averyt KB, Tignor M and Miller HL (Eds). Cambridge University Press, Cambridge, UK. Saskatchewan Ministry of Agriculture 2008. Varieties of Grain Crops. SaskSeed guide. Regina, SK, Canad

[00245] Os depósitos originais de códigos SMCD2204, SMCD2204F, SMCD2206, SMCD2208, SMCD2210 e SMCD2215 foram depositados na Autoridade Depositária Internacional do Canadá (International Depositary Authority of Canada - IDAC) em 20.03.2012, 20.03.2012, 08.11.2011, 08.11.2011, 08.11.2011 e 08.11.2011. Os recibos dos depósitos foram emitidos pela Autoridade em 21.03.2012, 21.03.2012, 09.11.2011, 09.11.2011, 09.11.2011 e 09.11.2011. As declarações de viabilidade para cada depósito também foram emitidas pela Autoridade Depositária Internacional do Canadá, sendo que todos os depósitos foram considerados viáveis.

Claims (18)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um endófito isolado ou cultura, selecionado a partir do grupo consistindo em: uma cepa Streptomyces sp ou cultura da mesma, que é depositada sob IDAC 081111-06 ou que compreende a sequência de 16S rDNA como mostrada na SEQ ID NO: 6; uma cepa Para- conyothirium sp. ou cultura da mesma, que é depositada como IDAC 081111-03 ou que compreende a sequência ITS rDNA como mostrada na SEQ ID NO: 5; uma cepa Pseudeurotium sp. ou cultura da mesma, que é depositada sob IDAC 081111-02 ou que compreende a sequência ITS rDNA como mostrada na SEQ ID NO: 4; uma cepa Penicillium sp. ou cultura da mesma, que é depositada sob IDAC 081111-01 ou que compreende a sequência ITS rDNA como mostrada na SEQ ID NO: 3; uma cepa Cladosporium sp. ou cultura da mesma, que é depositada sob IDAC 200312-06 ou que compreende a sequência ITS rDNA como mostrada na SEQ ID NO: 1, uma cepa Cladosporium sp. ou cultura da mesma, que é depositada sob IDAC 200312-05 ou que compreende a sequência ITS rDNA como mostrada na SEQ ID NO: 2, e um veículo.

2. Método para melhorar a vitalidade de sementes, a saúde e/ou o rendimento de uma planta em relação a uma planta do tipo selvagem não inoculada, caracterizado pelo fato de que compreende inocular uma semente com pelo menos um endófito ou cultura, selecionado a partir do grupo consistindo em: uma cepa Streptomyces sp ou cultura da mesma, que é depositada sob IDAC 081111-06 ou que compreende a sequência de 16S rDNA como mostrada na SEQ ID NO: 6; uma cepa Para- conyothirium sp. ou cultura da mesma, que é depositada como IDAC 081111-03 ou que compreende a sequência ITS rDNA como mostrada na SEQ ID NO: 5; uma cepa Pseudeurotium sp. ou cultura da mesma, que é depositada sob IDAC 081111-02 ou que compreende a sequência ITS rDNA como mostrada na SEQ ID NO: 4; uma cepa Penicillium sp. ou cultura da mesma, que é depositada sob IDAC 081111-01 ou que compreende a sequência ITS rDNA como mostrada na SEQ ID NO: 3; uma cepa Cladosporium sp. ou cultura da mesma, que é depositada sob IDAC 200312-06 ou que compreende a sequência ITS rDNA como mostrada na SEQ ID NO: 1, uma cepa Cladosporium sp. ou cultura da mesma, que é depositada sob IDAC 200312-05 ou que compreende a sequência ITS rDNA como mostrada na SEQ ID NO: 2, e cultivar a semente em uma planta de primeira geração.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é para aumentar a germinação de sementes, para diminuir o tempo para atingir a energia de germinação, para reduzir o tempo requerido para a germinação hidrotérmica, para aumentar o vigor de germinação de sementes, para aumentar o peso fresco das plântulas, para melhorar características de nodulação de Rhizobium, para aumentar a produção de mudas, para reduzir os efeitos do estresse sobre a semente ou a planta cultivada, para reduzir os efeitos do estresse seco, por calor e/ou estresse biótico sobre a semente ou a planta cultivada, para reduzir os efeitos da infecção por Fusarium sobre a semente ou a planta cultivada, para melhorar a estratificação, romper a dormência e/ou reduzir os efeitos do estresse, modulando a expressão dos genes de ent -kaurenoic (KAO) hormonal, a repressão de genes de crescimento de rebentos (RSG), ácido abscísico (ABA), ácido giberélico (GA), 14-3-3 e moléculas de óxido nítrico (NO), e/ou de resistência ao estresse da superóxido dismutase (SOD), SOD de manganês (MnSOD), prolina (Pro) e genes MYB.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a planta é um cereal, leguminosa, linho, ou planta de canola.

5. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a semente é revestida com o endófito, cultivada com o endófito ou plantada perto do endófito.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a semente plantada perto do endófito está cerca de 4 cm de distância do endófito.

7. Método de melhorar a saúde de plantas e/ou o rendimento em relação a uma planta do tipo selvagem não inoculada, caracterizado pelo fato de que compreende tratar um material de propagação da planta com o endófito ou cultura, como definidos na reivindicação 1, e cultivar o material de propagação de planta em uma planta de primeira geração.

8. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o material de propagação da planta é uma semente, corte ou um bolbo.

9. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser para reduzir os efeitos do estresse.

10. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser para reduzir os efeitos do estresse, em que o estresse é por calor, estresse seco ou o estresse biótico.

11. Método para melhorar a saúde de uma planta e/ou rendimento de uma planta em relação a uma planta do tipo selvagem não inoculada, caracterizado pelo fato de que compreende tratar uma planta com pelo menos um endófito ou cultura, como definidos na reivindicação 1, e permitir que a planta cresça.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de ser para reduzir os efeitos do estresse.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de ser para reduzir os efeitos do estresse, em que o estresse é por calor, estresse seco ou o estresse biótico.

14. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o tratamento da planta compreende a aplicação foliar ou no solo.

15. Método de fitoremediação ou fitorecuperação de um local contaminado, caracterizado pelo fato de que compreende tratar um material de propagação da planta ou uma planta com pelo menos um endófito ou cultura, como definidos na reivindicação 1, e cultivar o material de propagação da planta em uma planta de primeira geração ou permitir que a planta cresça; assim, remediando ou recuperando o local.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o local é contaminado com um químico orgânico, um sal ou um metal.

17. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o local é contaminado com um químico orgânico e o produto químico orgânico é ou hidrocarboneto ou petróleo.

18. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o local é contaminado com um metal e o metal é o chumbo ou cádmio e/ou um radioisótopo.

Images