CN106010983B - 棉花内生真菌cef-559及其在棉花黄萎病防治中的应用 - Google Patents

棉花内生真菌cef-559及其在棉花黄萎病防治中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物领域，具体涉及棉花内生真菌CEF‑559及其在棉花黄萎病防治中的应用。其保藏编号是：CGMCC No.11314。本发明获得的菌株CEF‑559分离自棉花，对多数的作物不致病，解决了具有生防潜力的微生物可能转变为致病菌的问题，因此对人畜、昆虫和作物安全，环境友好。

Description

棉花内生真菌CEF-559及其在棉花黄萎病防治中的应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及棉花内生真菌CEF-559及其在棉花黄萎病防治中的应用。
背景技术
棉花是关系国计民生的重要战略物资。棉花黄萎病是由大丽轮枝菌引起的土传维管束真菌病害，是我国乃至世界棉花生产上的最主要病害，被称为棉花的“癌症”成为发展棉花生产的主要限制因子之一。
利用有益微生物控制植物病害的发生具有经济、环境友好的特点。生防菌通常可利用竞争、抗生、寄生和交叉保护等直接的拮抗机制抑制植物病害；同时某些生防菌还能促进植物生长,诱导植物对真菌、细菌和病毒引起的病害乃至对线虫和昆虫为害的抗性,称为诱导系统抗性(ISR)，又称获得性抗病性，是植物在一定的生物或非生物因子的刺激或作用下，产生对随后病原物侵染的抗性。诱导的系统抗病性(或免疫作用)优于化学防治和抗病育种，其优点如下:(l)免疫作用能有效地防治病毒、细菌和真菌病害。(2)免疫作用是稳定的，它决定几种不同的机制，而内吸杀菌剂往往具有单一的作用位点，容易产生新的抗药小种，因而是不稳定的。(3)免疫作用是系统的、持久的，瓜类中的免疫作用可通过嫁接，从砧木传导到接穗。(4)在感病植物中亦具有免疫能力，说明潜在的抗病基因存在于所有的植物中。(5)免疫物质，可从免疫植株的化学提取物中获得，可在田间喷施或种子处理。
目前利用拮抗微生物防治棉花黄萎病研究较多的是枯草芽孢杆菌，作用机理是产生杆菌肽等多种抗菌物质来抑制病原菌，对黄萎病的防治具有一定的效果，但是在生产应用中存在不少问题，其中最主要的问题是防治效果较低，国内登记的枯草芽孢杆菌剂型对棉花黄萎病的防治效果在45％左右，且在不同年份效果不稳定。例如2008年和2009年，由中国农业科学院棉花研究所承担国家农药登记试验中(任务来源于农业部农药鉴定所)，黑龙江强尔生化技术开发区有限公司生产的1000亿活芽孢/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对棉花黄萎病的防治效果为46.0％-52.9％，但在2010年大面积试验中防治效果只有32.7％。
植物内生真菌是那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部、不引发植物产生明显病症的真菌。因为能够产生次生代谢类物质防治植物病害,现已成为生物防治中重要的生防因子。棉花黄萎病是一种系统性维管束病害，病原菌从植株的根部入侵，沿维管束扩展蔓延，棉花的内生真菌与黄萎病菌同处植物体内，具有相同的微生态环境，内生真菌的代谢产物可直接作用于黄萎病菌，因此，从棉花的内生真菌入手，分离筛选对黄萎病菌具有抑制活性的菌株，获得对该病控制效果好的生防菌株，是值得探讨的棉花黄萎病防治的新途径。本发明从健康棉花的茎杆中获得一株内生真菌，经温室苗期试验对棉花黄萎病的防治效果达64.63％，对棉花黄萎病的防治具有巨大的潜能。
发明内容
本发明的发明人为解决现有的拮抗微生物防治棉花黄萎病效果较差的问题，提出并完成本发明。
本发明从棉花的内生真菌入手，通过分离、筛选、鉴定、抑菌测定及温室的生物测定，获得对棉花黄萎病具有显著控制作用的菌株CEF-559。
根据本发明的棉花内生真菌CEF-559，该菌株是一种尖孢镰刀菌。在分离时，首先要选择健康的棉株，最重要的是，在分离过程中，一定要保证样品的表面消毒彻底，确保分离到的是棉花的内生真菌。
本发明获得的生防菌株CEF-559来自棉株体内，将生防菌株经过查彼克液体培养基培养后，过滤菌丝及孢子，然后将滤液接到棉花根部，或者将生防菌的玉米沙粒培养物加入基质中培育棉苗。能够增强棉花对黄萎病的抗病性。
该菌株经鉴定是一株尖孢镰刀菌(Fusarium sp.)。从棉花中可以分离到丰富的内生真菌。由于微生物的培养性状容易受培养条件的影响，传统的以形态学为基础的分类鉴定有时候会受到限制。分子生物学的发展给微生物的分类鉴定提供了新的有效措施，因此，以传统的形态学鉴定为基础，结合分子生物学的手段，对筛选到的菌株进行鉴定，最后获得目的菌株。
利用棉花的内生真菌CEF-559来控制棉花黄萎病在以下五方面产生有益效果。
1、CEF-559能够在人工培养基上培养，容易获得和培养。用于生物防治的菌株必须能够在人工培养基上培养，以利于工厂化生产和推广应用。CEF-559是一株棉花的内生真菌，在土壤中广泛存在，该菌株在PDA、查彼克及玉米沙粒培养基上生长良好，有利于大量繁殖和推广应用。
2、CEF-559对棉花黄萎病菌具有较好的抑制效果。在PDA培养基上，CEF-559产生的非挥发性代谢物对黄萎病菌菌落生长的抑菌效果为100％，对分生孢子萌发的抑制率为100％，对分生孢子产量的抑制率为78.2％。
3、CEF-559对黄萎病控制效果好。在棉苗真叶初现时用CEF-559培养滤液预接种棉花(每钵50ml)，对黄萎病的防治效果为77.62％；将CEF-559的玉米沙粒培养物按2％接入基质中，对棉花黄萎病的防治效果为64.72％；两种方法平均防治效果为71.17％。
4、CEF-559对黄萎病菌具多种作用方式，施用方法灵活。CEF-559的培养滤液预接种棉花可以显著提高棉株内防御相关基因的表达，提高棉花的抗病性，从而有效控制黄萎病危害，该作用方式表明CEF-559可用于研制植物疫苗，采用滴灌方式防治棉花黄萎病；同时，将CEF-559的玉米沙粒培养物风干后(有效成分为菌丝体和孢子)，按2％接入基质后，对棉花黄萎病具有很好的控制作用，该作用方式可用于研制微生物肥料。
5、CEF-559为环境友好型生防菌株。CEF-559属于半知菌亚门、肉座菌目、瘤座孢科、镰刀菌属，并对土壤中的有害微生物产生拮抗作用。本发明获得的菌株CEF-559分离自棉花，对多数的作物不致病，解决了具有生防潜力的微生物可能转变为致病菌的问题，因此对人畜、昆虫和作物安全，环境友好。
附图说明
图1为CEF-559在PDA上的菌落形态及在显微镜下的菌丝和分生孢子，其中a为正面，b为反面，c为显微镜下观察到的菌丝及分生孢子。
图2圆盘虑膜法测定CEF-559对棉花黄萎病菌的抑制作用。a，对照，直接在PDA平板中央接种棉花黄萎病菌强致病力菌株Vd080(其保藏编号为：CGMCC No.5904)菌块(直径为5mm)，25℃恒温培养箱内培养15d；b，在平板中央接种CEF-559的菌块(直径为5mm),25℃恒温培养箱内培养7d后去玻璃纸，再在平板中央接种黄萎病菌Vd080菌块(直径为5mm),25℃恒温培养箱内培养15d。
图3CEF-559对棉花黄萎病菌孢子萌发的抑制作用。a，对照，直接在PDA平板上涂布100个Vd080分生孢子(50μL孢子悬浮液，浓度为2×103个/mL)，25℃恒温培养箱内培养15d；b，在平板中央接种CEF-559的菌块(直径为5mm),25℃恒温培养箱内培养7d后去玻璃纸，再在PDA平板上涂布约100个Vd080分生孢子(50μL孢子悬浮液，浓度为2×103个/mL),25℃恒温培养箱内培养15d。
图4CEF-559对棉花黄萎病的控制作用。a,真叶初现(播种后18天左右)，将查彼克培养基(不含CEF-559)50mL蘸根棉苗，4天后(一片真叶平展)接种大丽轮枝菌强致病力菌株Vd080；b，真叶初现(播种后18天左右)，蘸根接种CEF-559的查彼克培养滤液50mL，4天后接种大丽轮枝菌强致病力菌株Vd080。
本发明要求保护的棉花内生真菌：镰孢(Fusarium sp.)CEF-559，于2015年9月14日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏编号是：CGMCC No.11314。
具体实施方式
实施例1：菌株的分离
(1)样品采集
于6-8月份，选择健康棉株，取主茎的中上部及果枝15cm。
(2)菌株的分离
先将采集到的样品(棉花茎杆)用清水洗净，去皮，置于直径为9cm的灭菌的培养皿中，用75％的酒精消毒1min。再用5.0％的次氯酸钠进行消毒60s，用灭菌水洗3次，每次时间不少于3min。然后用灭菌的吸水纸沾干表面的水分，用消毒的剪刀剪成0.4cm长的小段，置于9cm的培养皿中，25℃培养。用最后一遍清洗液为对照，检查消毒是否彻底。每天检查内生真菌的生长情况，发现有菌落长出，及时转移至直径为6cm的培养皿中培养，然后观察其菌落大小、颜色、表面特征、质地。
(3)CEF-559的特征
1、形态特征在PDA平板上，刚开始为灰白色菌丝，匍匐生长，培养7天以后，菌落中央产生桔红色色素，继续培养颜色变深，呈褐色。显微镜下(400×)该菌株菌丝体透明，有分隔，产生大型分生孢子和小孢子，大型分生孢子呈镰刀状至纺锤形，3-5个分隔；小包子呈椭圆形，多数单孢，少数有1个分隔(图1)。
2、生理特征CEF-559在5-30℃条件下均能生长，最适生长温度是25℃。依据CEF-559形态特征、生理特征和分子鉴定结果，CEF-559被鉴定为镰刀菌(Fusarium sp.)，属于属于半知菌亚门、肉座菌目、瘤座孢科、镰刀菌属(图1)。
(4)培养基及培养条件
1.PDA培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，水1000ml，自然pH。称取削皮的200g马铃薯，切成小块置于锅中加水煮烂(煮沸20-30min)，用纱布过滤后，滤液中加入葡萄糖和琼脂继续加热搅匀，稍冷却后再补水至1000ml，分装到锥形瓶，加塞包扎后灭菌20min(0.235MPa，121℃)。25℃，黑暗培养7d。
2.查彼克(Czapek)液体培养基KNO3，2.00g；K2HPO4，1.31g；KCI，0.50g；MgSO4﹒7H2O，0.50g；FeSO4﹒7H2O，0.04g；蔗糖，30.00g；加水至1000ml，分装到锥形瓶，加塞包扎后灭菌20min(0.235MPa，121℃)。置摇床150rpm，25℃，黑暗条件震荡培养7d。
3.玉米沙粒培养基玉米和沙土质量比为1：1，混匀后，每1000g加入150ml水，搅拌均匀后，装入克氏瓶中，加塞包扎后灭菌20min(0.235MPa，121℃)。25℃，黑暗培养7d
实施例2：CEF-559对棉花黄萎病菌的抑制作用
1、试验方法
圆盘滤膜法测定CEF-559非挥发性代谢物对黄萎病菌的抑制作用。在直径为9cm的PDA平板上，平铺上直径略大于9cm的双层玻璃纸(硝酸纤维素膜)，在平板中央接种CEF-559菌块(直径为5mm),25℃恒温培养箱内培养7d后去玻璃纸，再在平板中央接种黄萎病菌Vd080(直径为5mm),25℃恒温培养箱内培养15d。以不含CEF-559代谢产物的PDA平板接种棉花黄萎病菌Vd080为对照。每个处理重复4次,用十字法测定菌落直径，计算抑制率。
CEF-559代谢物对黄萎病菌分生孢子产生的影响。将CEF-559的菌块接到经过高温灭菌的查彼克培养液中，150rpm震荡培养7天。再将混合物用三层滤纸过滤，后用0.22μm的微孔滤膜器过滤，然后用冷冻干燥器浓缩备用。将冷冻干燥浓缩两倍的CEF-559代谢物与Vd080孢子悬浮液(107CFU/ml，即107个分生孢子/ml)按体积比3：1加入到2ml离心管中，对照中以查彼克培养液代替CEF-559代谢物，液体总体积为800μl，25℃暗处培养，观察和记录16h的分生孢子产孢量。
CEF-559代谢物对黄萎病菌分生孢子萌发的影响。同样采用圆盘滤膜法收集CEF-559代谢产物，然后代替Vd080的菌块在平板上涂上约100个Vd080的分生孢子(50μL孢子悬浮液，浓度为2×103个/mL)，25℃培养3天，在体视显微镜下观察孢子萌发形成菌落情况，并记录萌发成菌落的个数，以直接在PDA平板上涂布相同数量的Vd080的分生孢子为对照。
2、试验结果
圆盘滤膜法培养结果表明，经CEF-559处理的棉花黄萎病菌Vd080停止生长，菌落直径为0.00cm，菌块上长有气生菌丝和黑色微菌核，未经CEF-559处理的对照菌落生长正常，菌落直径为6.46cm，CEF-559分泌的代谢产物对黄萎病菌的生长具有显著的抑制作用，抑制率达100％(表1，图2)。
添加CEF-559代谢物的处理中黄萎病菌分生孢子产量为0.442×107CFU/ml，对照处理中的孢子产量为2.203×107CFU/ml，CEF-559代谢物对黄萎病菌分生孢子产生具有显著的抑制作用，抑制率达70.5％。
在含有CEF-559代谢物的PDA平板上，棉花黄萎病菌Vd080分生孢子均未萌发，在对照PDA平板上，棉花黄萎病菌Vd080分生孢子的萌发数量为72.3/皿，抑制率达100％(图3)。
表1 CEF-559非挥发性代谢物对棉花黄萎病菌的抑制作用
注：各项测量值后面的不同字母，表示不同处理之间差异达显著水平(LSD，P＜0.01)
实施例3：CEF-559对棉花黄萎病的控制作用
1、试验方法试验采用两种方法探明CEF-559对棉花黄萎病的控制作用。
预接种法。CEF-559经查彼克液体培养基25℃，黑暗条件震荡培养7d后，用四层纱布过滤，后用0.22μm的微孔滤膜器过滤去除菌系、孢子，获得CEF-559的培养滤液备用。
将灭菌后的蛭石和沙子按6：4混合，然后做直径6cm的无底纸钵，放置于45cm×35cm的塑料盘内。以感病品种冀棉11为供试品种，将脱绒棉籽在清水中浸泡12h后，淋干备播。每钵播种棉花种子8粒，出苗后留苗5株，每处理15个钵，每5个钵为一个重复，3次重复，随机排列。棉花播种后，将塑料盘置温室中，待棉苗一片真叶初现时(播种后18天左右)，蘸根CEF-559的培养滤液，每钵50ml，4天后一片真叶平展时，接种棉花黄萎病大丽轮枝菌Vd080孢子悬浮液，每钵10ml，孢子浓度为1×107CFU/ml。蘸根CEF-559的培养滤液和接种黄萎病菌的方法为，将一定量的CEF-559培养滤液或黄萎病菌孢子悬浮液倒入直径10cm的培养皿中，将纸钵从塑料盘中取出放置在培养皿中40s，待培养滤液或孢子悬浮液被吸干后，将纸钵放回塑料盘中。棉苗置日光温室中培养，环境温度控制在20℃-32℃，土壤相对湿度控制在60％以上，光照良好。棉苗发病后，按5级分级标准进行病害的分级调查。计算病株率、病情指数和防治效果。
基质接种法。将灭菌后的蛭石和沙子按6：4混合作为育苗基质，处理组将CEF-559的玉米沙粒培养物按质量比2％接入蛭石沙子基质，混匀后制作营养钵；对照组将玉米沙粒培养基按质量比2％接入蛭石沙子基质，混匀后制作营养钵；两组处理均于一片真叶平展时蘸根接种棉花黄萎病菌强致病力菌株Vd080。试验用品种、播种方法、棉苗管理、Vd080接种方法、病害调查等同上。
2、试验结果
2014年和2015的培养滤液预接种法结果表明，用50ml CEF-559培养滤液处理的棉苗黄萎病均显著低于对照处理，其防治效果分别为79.46％和78.78％，平均为77.62％(表2，图4)。
2014年和2015玉米沙粒培养物基质接种法结果表明，播种后35天，CEF-559对黄萎病的控制效果分别为64.29％和65.14％，平均防治效果为64.72％(表2)
表2 CEF-559两种处理方法对棉花黄萎病的防治效果
注：各项测量值后面的不同字母，表示不同处理之间差异达显著水平(LSD，P＜0.01)
实施例4：CEF-559对棉花防御基因表达的影响
1、试验方法
棉苗培育及接种CEF-559和Vd080的方法同实施例3中培养滤液预接种法。在接种Vd080后1d、2d、3d、4d、7d取样，每个处理随机20棵苗，叶片进行液氮处理后，采用RNAprepPure Plant Kit(TIANGEN)提取棉花的总RNA，将RNA的浓度调到1μg/ml，采用Thermo公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一链，以棉花中高度保守的基因ubiquitin作内参，以β-1,3-glucanase、PAL、PPO、POD基因的特异引物(表3)，进行荧光定量PCR扩增，检测上述4个基因的表达量。
表3抗性相关基因的特异性引物序列
2、试验结果
经CEF-559培养滤液处理棉花根部后，β-1,3-glucanase、POD和PAL基因的表达量在特定的时间点均有增加，β-1,3-glucanase在3dpi时达到最大值，是对照的5.51倍，POD和PAL分别在2dpi和4dpi时达到最大值，分别是对照的2.06倍和2.26倍；PPO变化不明显(表4)。表明CEF-559培养滤液处理棉花根部后，可诱导棉苗防御性基因的表达，从而增强植株对黄萎病菌的抗性，降低病原菌的危害。
表4 β-1,3-glucanase、POD、PPO和PAL基因的相对表达量
实施例4：CEF-559对棉花出苗率和棉苗生长的影响
1、试验方法
将无菌的蛭石和沙子按6﹕4混合作为基质，将CEF-559的玉米沙粒培养物按2％接入基质，混匀后制作营养钵，每钵播种冀棉11种子10粒，后用无菌的沙子覆盖，沙子厚度约为2cm。试验以接种玉米沙粒培养基为对照，共两个处理，均不再接种棉花黄萎病菌。播种后7天，调查出苗数，之后每3天一次，至不再有新苗出现为止；出苗后20天，每处理随机选取25棵棉苗，测量株高、根长、棉苗鲜重和根鲜重。
2、试验结果
结果表明，接种CEF-559的处理出苗率为83.33％，与对照相当(85.67％)；接种CEF-559CF的处理对棉苗的株高、根长和棉苗鲜重都与对照没有显著差异，表明接种CEF-559能提高棉苗的出苗率，且对棉苗的生长发育没有负作用(表5)。
表5 CEF-559对棉花出苗及棉苗生长的影响
注：各项测量值后面的不同字母，表示不同处理之间差异达显著水平(LSD，P＜0.05)。

Claims (4)

1.棉花内生真菌CEF-559，其特征在于，其保藏编号是：CGMCC No.11314。
2.权利要求1所述棉花内生真菌CEF-559在棉花黄萎病防治中的应用。
3.一种防治棉花黄萎病的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1所述的棉花内生真菌CEF-559培养滤液预接种棉花的步骤。
4.一种防治棉花黄萎病的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：将权利要求1所述的棉花内生真菌CEF-559的玉米沙粒培养物风干后，按质量比例2％接入基质后施与棉花。
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