CN102367421A - 一株灰黄青霉xj-ep-058菌株及其抗香蕉枯萎病微生物制剂与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株灰黄青霉XJ-EP-058菌株及其抗香蕉枯萎病微生物制剂与应用，属微生物农药技术领域。所述的菌株是灰黄青霉（Penicilliumgriseofulvum）XJ-EP-058CGMCCNo.5467。含有该菌株的抗香蕉枯萎病微生物制剂通过试管种培养，菌株液体种子培养、菌株液体发酵培养得到。该菌株及含有该菌株的抗香蕉枯萎病微生物剂对香蕉枯萎病具有显著的离体和活体防效，对香蕉枯萎病菌孢子的萌发抑制率达到100%；对香蕉枯萎病菌的抑菌圈直径平均为14.5mm，温室盆栽活体试验结果表明：对香蕉枯萎病菌的平均防治效果达到74.38%。该微生物制剂的原料成本低，生产工艺简单易行。

Description

一株灰黄青霉XJ-EP-058菌株及其抗香蕉枯萎病微生物制剂与应用

技术领域

本发明涉及一株香蕉内生真菌及其抗香蕉枯萎病微生物剂、应用和该微生物制剂的制备方法，属微生物农药技术领域。

背景技术

香蕉枯萎病(Banana vascular wilt)又称巴拿马病、黄叶病，是由半知菌亚门丝孢纲瘤座孢目镰刀菌属尖镰孢菌古巴专化型[Fusarium oxysporum f.sp.cubense(E.F.Smith) Snyder]引起的一种维管束病害，是香蕉的一种毁灭性病害。2007年5月我国将香蕉枯萎病列入进境植物检疫性有害生物名录。目前，香蕉枯萎病广泛分布于亚洲、非洲、澳大利亚、南太平洋及热带美洲的香蕉产区。我国于1960年首次在广西的芭蕉上发现香蕉枯萎病，20世纪70年代末在广东、福建、海南、云南等省区陆续发生，主要为害粉蕉、越南蕉等品种。

对香蕉枯萎病的防治，除在农业防治方面采用轮作换茬、地块选择、清洁田园、加强田间管理等措施来减少病害的侵染外，目前在很大程度上主要还是依赖于化学农药的使用，化学防治以其高效、简便的特点，仍然是生产上采用的主要措施之一。但是长期或过量使用单一农药，易导致病害产生抗药性，使得防效大大下降，且使农药残留量增加，天敌被大量杀伤，农田微生态平衡被破坏和环境被污染，因此,目前国内外在研制高效低毒化学农药的同时，对生物农药的研制也给予了极大重视，目前在农业病虫害防治中生物防治被认为是最具有发展潜力的防治方法，其中微生物制剂是一种重要类型。

发明内容

本发明的目的是提供一株对香蕉枯萎病具有很好防治效果的灰黄青霉菌株及其抗香蕉枯萎病微生物制剂和应用，以及该该微生物制剂的制备方法。

本发明目的是通过以下技术方案来实现的：

1、本发明提供的一株灰黄青霉菌株是灰黄青霉（Penicillium griseofulvum ）XJ-EP-058 CGMCC No. 5467。

所述的灰黄青霉（Penicillium griseofulvum ）XJ-EP-058 CGMCC No. 5467于2011年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称：CGMCC），保藏号是CGMCC No. 5467，该普通微生物中心地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

所述的灰黄青霉（Penicillium griseofulvum ）XJ-EP-058 CGMCC No. 5467是从云南省西双版纳州勐腊县勐捧镇一株巴西蕉根部分离得到，其形态特征为：菌落白色，中央为青色，短绒毛状，基质为白色，中央为黄褐色；分生孢子梗不对称分枝，分生孢子串生，球形，顶端排成帚状。

2、一种抗香蕉枯萎病微生物制剂的制备方法，其步骤如下：

（1）试管种培养

将灰黄青霉（Penicillium griseofulvum ）XJ-EP-058 CGMCC No. 5467菌株接种到试管固体培养基斜面上，于28°C下培养7天，获得试管种；所述的固体培养基的配方为：马铃薯 200g；葡萄20g；琼脂15~20 g；蒸馏水1000ml；pH 7.0；

（2）液体种子培养

采用三角瓶摇瓶培养，方法是：

①配制液体种子培养基，按液体种子培养基配方所述的各成分及其含量混合而成液体种子培养基，所述的液体种子培养基的配方是：葡萄糖20.0g，蛋白胨10.0g，酵母浸膏5.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.0；

②在每个三角瓶中装入100ml所述的液体种子培养基，121°C灭菌30min，冷却后接入1cm²的试管种，28°C下于转速为220 rpm的摇床上培养2天；

（3）制备所述的抗香蕉枯萎病微生物制剂

采用三角瓶摇瓶培养，方法是：

①    配制液体发酵培养基，按液体发酵培养基配配方所述的各成分及其含量混合而成液体发酵培养基，液体发酵培养基配方是：马铃薯200g；葡萄糖20 g；自来水1000ml，pH 7.0；

②    在每个三角瓶中装入200ml液体发酵培养基，121°C灭菌30min，冷却后接入10ml步骤（2）培养得到的液体种子，28°C下于转速为220 rpm的摇床上培养7天得发酵液；

③    在发酵液中加入等体积的质量分数为95%的乙醇，经摇床振荡10 小时后，用转速为4000 rpm的离心机离心15min，取上清液并在旋转蒸发仪上55°C蒸去乙醇，用水稀释到原发酵液体积，即成为所述的抗香蕉枯萎病微生物制剂。

3、一种抗香蕉枯萎病微生物制剂，按以下步骤制备得到： 

（1）试管种培养

将灰黄青霉（Penicillium griseofulvum ）XJ-EP-058 CGMCC No. 5467菌株接种到试管固体培养基斜面上，于28°C下培养7天，获得试管种；所述的固体培养基的配方为：马铃薯 200g；葡萄20g；琼脂15~20 g；蒸馏水1000ml；pH 7.0；

（2）液体种子培养

采用三角瓶摇瓶培养，方法是：

①配制液体种子培养基，按液体种子培养基配方所述的各成分及其含量混合而成液体种子培养基，所述的液体种子培养基的配方是：葡萄糖20.0g，蛋白胨10.0g，酵母浸膏5.0g，蒸馏水1000ml；pH 7.0；

②在每个三角瓶中装入100ml所述的液体种子培养基，121°C灭菌30min，冷却后接入1cm²的试管种，28°C下于转速为220 rpm的摇床上培养2天；

（3）制备所述的抗香蕉枯萎病微生物制剂

采用三角瓶摇瓶培养，方法是：

④    配制液体发酵培养基，按液体发酵培养基配配方所述的各成分及其含量混合而成液体发酵培养基，液体发酵培养基配方是：马铃薯200g；葡萄糖20 g；自来水1000ml；pH 7.0；

⑤    在每个三角瓶中装入200ml液体发酵培养基，121°C灭菌30min，冷却后接入10ml步骤（2）培养得到的液体种子，28°C下于转速为220 rpm的摇床上培养7天得发酵液；

⑥    在发酵液中加入等体积的质量分数为95%的乙醇，经摇床振荡10 小时后，用转速为4000 rpm的离心机离心15min，取上清液并在旋转蒸发仪上55°C蒸去乙醇，用水稀释到原发酵液体积，即成为可供使用的抗香蕉枯萎病微生物制剂。

4、上述技术方案1所述的灰黄青霉（Penicillium griseofulvum ）XJ-EP-058 CGMCC No. 5467 在抗香蕉枯萎病中的应用。

5、上述技术方案3所述的抗香蕉枯萎病微生物制剂在抗香蕉枯萎病中的应用。

所述的自来水是指通过自来水处理厂净化、消毒后生产出来的符合中国饮用水标准的供人们生活、生产使用的水。

本发明将所述的抗香蕉枯萎病微生物剂，采用孢子萌发抑制法、菌丝生长抑制法及温室盆栽活体试验三种方法，试验该制剂对香蕉枯萎病的防治作用表明：

本发明所述的灰黄青霉（Penicillium griseofulvum ）XJ-EP-058 CGMCC No. 5467及其抗香蕉枯萎病微生物剂对香蕉枯萎病具有显著的离体和活体防效，防治香蕉枯萎病效果显著，可用于香蕉作物上枯萎病的防治。

在孢子萌发抑制法试验中，对香蕉枯萎病菌孢子的萌发抑制率达到100%；在菌丝生长抑制法试验中，对香蕉枯萎病菌的抑菌圈直径平均为14.5mm（5次重复），两项试验结果表明本发明灰黄青霉（Penicillium griseofulvum ）XJ-EP-058 CGMCC No. 5467及其抗香蕉枯萎病微生物制剂对香蕉枯萎病菌具有很强的抑制活性。

温室盆栽活体试验结果表明：本发明灰黄青霉（Penicillium griseofulvum ）XJ-EP-058 CGMCC No. 5467及其抗香蕉枯萎病微生物制剂对盆栽香蕉的香蕉枯萎病表现出了显著的防治效果，平均防治效果达到74.38%。

本发明具有原料成本低，生产工艺简单易行，防治效果好的优点，具有较好的应用前景。

具体实施方式：

以下实施例无特别说明为常规方法。

实施例1  灰黄青霉（Penicillium griseofulvum ）XJ-EP-058 CGMCC No. 5467的获得、鉴定和培养保存。

1、灰黄青霉（Penicillium griseofulvum ）XJ-EP-058 CGMCC No. 5467的获得。

1.1 材料

1.1 来源

采自云南省西双版纳州勐腊县勐捧镇的巴西蕉(Musa AAA Cavendish subgroup cv. Brazil)。

1.2 培养基

培养基配方：马铃薯200g；葡萄糖20 g；蒸馏水1000m l；自然pH7.0。

1.3 方法

样品消毒处理：预先取香蕉健康植株根部用自来水冲洗干净、晾干水分后，采用以下方法进行表面消毒：0.2%升汞消毒30s，无菌水冲洗后75%乙醇消毒60s，最后再用无菌水冲洗、晾干。所述的百分数是质量分数。

分离培养：上述香蕉组织样品经处理完毕后，在无菌条件下，切成0.2cm×0.2cm片段移植于培养基内，置于28℃培养箱中培养。5—10d后，培养基中可见有菌落形成，挑取植物组织周围的菌落转接入PDA斜面中，经纯化后即得到该内生真菌。

分类鉴定：采用真菌学插片培养方法，对分离获得的内生真菌进行显微形态特征的观察、分类鉴定。在显微镜下观察菌丝、有性或无性孢子、孢子着生状态等形态特征，确定所分离获得的内生真菌的分类地位。分类检索参照文献[1,2,3,4 ].

[1] 魏景超. 真菌鉴定手册[M] . 上海: 上海科学技术出版社,1979.

[2] H. L 巴尼特, B.B 亨特. 沈崇尧译. 半知菌属图解[M] . 北京: 科学出版社,1977.

[3]中国科学院微生物研究所. 常见与常用真菌[M].北京:科学出版社, 1978.

[4]邵力平, 沈瑞祥, 张素轩, 等.真菌分类学[M] 北京: 中国林业出版社, 1984.

上述得到的菌株的鉴定

对上述得到的菌株进行形态鉴定，菌落初白色，中央渐变为兰绿色，中央突起，背面黄色。载片镜检时发现，分生孢子梗从菌丝垂直生出，无足细胞，分生孢子梗有横隔膜，顶端排列成帚状间枝，分枝多次；分生孢子串呈不分枝的链状，单个孢子呈卵圆形，浅绿色，光滑，无菌核。因此初步鉴定为真菌门(Fungi)半知菌类(Fungi Imperfecti)从梗孢目(Moniliales)丛梗孢科(Dematiaceae ) 青霉属( Pencillium ) 。

用Mega软件对测序结果进行同源性分析，与参比序列一起构建系统发育树。从系统树上看，上述得到的菌株与灰黄青霉( Penicillium griseofulvum )的亲缘关系最为接近，相似性99.33%。

经上述鉴定表明所分离获得的菌株为灰黄青霉（Penicillium griseofulvum ），其代号为XJ-EP-058，所述的灰黄青霉（Penicillium griseofulvum ）XJ-EP-058于2011年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称：CGMCC），保藏号是CGMCC No. 5467，该普通微生物中心地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

该灰黄青霉（Penicillium griseofulvum ）XJ-EP-058 CGMCC No. 5467的保存方法：

（1）短期保存：将灰黄青霉（Penicillium griseofulvum ）XJ-EP-058菌株接种在PDA固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏；所述的PDA固体培养基的配方是马铃薯 200g；葡萄20g；琼脂15~20 g；蒸馏水1000ml；自然pH7.0；

（2）长期保存：

1）将滤纸剪成直径为0.5 cm的小片，装入0.6×8cm的安瓿管中，每管1—2张，塞以棉塞，121 ℃灭菌30分钟。 

2）将灰黄青霉（Penicillium griseofulvum ）XJ-EP-058菌株接种在PDA固体斜面培养基上培养，使充分生长。 

3）取灭菌脱脂牛乳1—2ml滴加在灭菌培养皿或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液。 

4）用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。 

5）将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至干。  

6）将棉花塞入管内，用火焰熔封，熔封后在-20℃低温保存。

实施例2：孢子萌发抑制法试验

1、抗香蕉枯萎病微生物制剂及其制备方法

抗香蕉枯萎病微生物制剂的制备方法，其步骤如下：

（1）试管种培养

将所述的灰黄青霉（Penicillium griseofulvum ）XJ-EP-058 CGMCC No. 5467菌株接种到试管固体培养基斜面上，于28°C下培养7天，获得试管种；所述的固体培养基的配方为：马铃薯 200g；葡萄20g；琼脂15~20 g；蒸馏水1000ml；自然pH7.0；

（2）液体种子培养

采用500ml三角瓶摇瓶培养，方法是：

①配制液体种子培养基，按液体种子培养基配方所述的各成分及其含量混合而成液体种子培养基，所述的液体种子培养基的配方是：葡萄糖20.0g，蛋白胨10.0g，酵母浸膏5.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.0；

②在每个三角瓶中装入100ml所述的液体种子培养基，121°C灭菌30min，冷却后接入1cm²的试管种，28°C下于转速为220 rpm的摇床上培养2天；

（3）制备所述的抗香蕉枯萎病微生物制剂

采用500ml三角瓶摇瓶培养，方法是：

⑦    配制液体发酵培养基，按液体发酵培养基配配方所述的各成分及其含量混合而成液体发酵培养基，液体发酵培养基配方是：马铃薯200g；葡萄糖20 g；自来水1000m l；自然pH 7.0；

⑧    在每个三角瓶中装入200ml液体发酵培养基，121°C灭菌30min，冷却后接入10ml步骤（2）培养得到的液体种子，28°C下于转速为220 rpm的摇床上培养7天得发酵液；

⑨    在发酵液中加入等体积的质量分数为？%的乙醇，经摇床振荡10 小时后，用转速为4000 rpm的离心机离心15min，取上清液并在旋转蒸发仪上55°C蒸去乙醇，用水稀释到原发酵液体积，即成为所述的抗香蕉枯萎病微生物制剂。

本发明所述的抗香蕉枯萎病微生物制剂可以通过上述方法制备得到。

2、制备香蕉枯萎菌分生孢子悬浮液

将香蕉枯萎病菌4号小种标准菌株（香蕉枯萎病菌4号小种标准菌株购自中国微生物菌种资源库，地址：北京北纳创联生物技术研究院，北京市朝阳区北三环东路北京外贸安贞大楼）接种到培养基上28℃下培养，培养基配方为常用的PDA培养基，PDA培养基的制备方法是：取马铃薯200g去皮后切成小块，加蒸馏水1000mL煮沸30分钟，过滤后得到1000ml滤液，然后加入葡萄糖20g，琼脂20g，pH 7.0。待菌丝长满培养基后用自来水洗去气生菌丝，于400nm日光灯照射下培养产分生孢子，2－3天待产生分生孢子后，用蒸馏水洗下分生孢子，并稀释成浓度为在10×10低倍镜下、每个视野30－40个分生孢子的香蕉枯萎病菌分生孢子悬浮液备用。

3、孢子萌发抑制试验

将制备的抗香蕉枯萎病微生物制剂供试样品与配制好的香蕉枯萎病菌分生孢子悬浮液等体积混合，取75μl加在凹玻片上，每处理5个重复，同时设清水为空白对照。在28°C下保湿培养24h后察看空白对照分生孢子的萌发情况，以芽管长度超过分生孢子小端直径一半时为萌发，当空白对照分生孢子的萌发率达到85%后，观察抗香蕉枯萎病微生物制剂供试样品对香蕉枯萎病菌分生孢子萌发的抑制情况。其中对照孢子萌发率是98.76%，处理的5个重复的孢子萌发率均为零，按以下公式计算孢子萌发抑制率为100%。

孢子萌发抑制率=（对照孢子萌发率－处理孢子萌发率）/（对照孢子萌发率）×100%

实验结果表明，用含有本发明所述的灰黄青霉（Penicillium griseofulvum ）XJ-EP-058的抗香蕉枯萎病微生物制剂供试样品对香蕉枯萎病菌分生孢子的萌发抑制率为100%。

实施例3：菌丝生长抑制试验

菌丝生长抑制试验：在内径为9cm的已灭菌培养皿中倒入8ml的水琼脂培养基，水琼脂培养基配方为：琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH7.0 。将实施例2所述的香蕉枯萎菌分生孢子悬浮液与10 ml PDA培养基(PDA培养基与实施例2所述的PDA培养基相同)充分混匀，倒入已盛有水琼脂培养基的培养皿中，制成双层带菌培养基。菌丝生长抑制实验采用常规的杯碟法，即在每个带菌双层平板上放置牛津杯，在牛津杯内加入实施例2所述的抗香蕉枯萎病微生物制剂0.2ml，以清水为空白对照，重复5个样品，置28℃恒温箱中培养72小时后，用十字交叉法测量抑菌圈直径。

实验数据：5次重复抑菌圈直径测量结果分别为14.7mm、 15.5 mm、 13.8 mm、 14.5 mm 、14.0 mm，平均为14.5 mm。实验结果表明：含有本发明所述的灰黄青霉（Penicillium griseofulvum ）XJ-EP-058的抗香蕉枯萎病微生物制剂对香蕉枯萎病菌菌丝生长具有较强的抑制作用。

实施例4：温室盆栽活体试验

温室盆栽防治效果试验：试验用香蕉苗的准备方法：在塑料大棚中，将组培的香蕉苗洗净根部的培养基后，移栽于育苗袋中，待香蕉苗长出3~4片叶（约1个月）后，再移植于直径30cm的育苗盆中。移栽后经常淋水保湿，每周施肥（每株2g/次复合肥溶于水中施用，以质量分数计，复合肥中的N-P₂O₅-K₂O为15-15-15）1~2次。待香蕉苗长出6~8片叶（约2个月）后，备用。配制浓度为1×10⁷个/ml的香蕉枯萎病菌分生孢子悬浮液。将5ml该分生孢子悬浮液用伤根灌菌液的方法接种。伤根灌菌液的接种方法为用玻璃棒在植株附近插入土壤中，使植株的根部部分受到损伤，然后将备用的香蕉枯萎病菌分生孢子悬浮液从玻璃棒插入的空隙中灌注。接种24h后，浇灌实施例2所述的抗香蕉枯萎病微生物制剂50ml，以空白清水为对照。接种5周后，调查发病情况，统计病情指数，计算防治效果。

病情调查分级标准：

          级别    发病情况

          1级     叶片健康，球茎不变色

          2级     下部叶片轻微黄化，根与球茎交接处变色

          3级     下部叶片大部分黄化，上部嫩叶开始变色，20%球茎变色

          4级     大部分或全部叶片黄化，50%球茎变色

          5级     死株，全部球茎变色

病情指数= [〔∑（病级株数×代表级数）〕/（调查总株数×最高代表级值）]×100

防治效果=[（对照组病情指数-处理组病情指数）/对照组病情指数]×100%

实验数据： 含有灰黄青霉（Penicillium griseofulvum ）XJ-EP-058的抗香蕉枯萎病微生物制剂对香蕉枯萎病3次重复的温室盆栽防治效果分别为76.24%、 70.39%、 77.51%，平均为74.38%。实验数据表明：含有本发明所述的灰黄青霉（Penicillium griseofulvum ）XJ-EP-058的抗香蕉枯萎病微生物制剂供试样品在盆栽香蕉上也表现出显著的防治效果，其对香蕉枯萎病的平均防治效果为74.38%，与其室内离体抑菌效果具有较好的相关性。本发明所述的灰黄青霉（Penicillium griseofulvum ）XJ-EP-058及其抗香蕉枯萎病微生物制剂能实际应用。

Claims (4)

1.灰黄青霉（Penicillium griseofulvum ）XJ-EP-058 CGMCC No. 5467。

2.一种抗香蕉枯萎病微生物制剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）试管种培养

将灰黄青霉（Penicillium griseofulvum ）XJ-EP-058 CGMCC No. 5467菌株接种到试管固体培养基斜面上，于28°C下培养7天，获得试管种；所述的固体培养基的配方为：马铃薯 200g；葡萄20g；琼脂15~20 g；蒸馏水1000ml；pH 7.0；

（2）液体种子培养

采用三角瓶摇瓶培养，方法是：

①配制液体种子培养基，按液体种子培养基配方所述的各成分及其含量混合而成液体种子培养基，所述的液体种子培养基的配方是：葡萄糖20.0g，蛋白胨10.0g，酵母浸膏5.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.0；

②在每个三角瓶中装入100ml所述的液体种子培养基，121°C灭菌30min，冷却后接入1cm²的试管种，28°C下于转速为220 rpm的摇床上培养2天；

（3）制备所述的抗香蕉枯萎病微生物制剂

采用三角瓶摇瓶培养，方法是：

①配制液体发酵培养基，按液体发酵培养基配配方所述的各成分及其含量混合而成液体发酵培养基，液体发酵培养基配方是：马铃薯200g；葡萄糖20 g；自来水1000ml，pH 7.0；

②在每个三角瓶中装入200ml液体发酵培养基，121°C灭菌30min，冷却后接入10ml步

骤（2）培养得到的液体种子，28°C下于转速为220 rpm的摇床上培养7天得发酵液；

③在发酵液中加入等体积的质量分数为95%的乙醇，经摇床振荡10 小时后，用转速为4000 rpm的离心机离心15min，取上清液并在旋转蒸发仪上55°C蒸去乙醇，用水稀释到原发酵液体积，即成为所述的抗香蕉枯萎病微生物制剂。

3.一种抗香蕉枯萎病微生物制剂，其特征在于，按权利要求2所述的一种抗香蕉枯萎病微生物制剂的制备方法制备得到。

4.权利要求1所述的灰黄青霉（Penicillium griseofulvum ）XJ-EP-058 CGMCC No. 5467   

或权利要求3所述的一种抗香蕉枯萎病微生物制剂在抗香蕉枯萎病中的应用。