CN102172249A

CN102172249A - 防治香蕉枯萎病的海洋细菌2bs12

Info

Publication number: CN102172249A
Application number: CN2011100711601A
Authority: CN
Inventors: 郭坚华; 郑颖
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2011-03-24
Filing date: 2011-03-24
Publication date: 2011-09-07
Anticipated expiration: 2031-03-24
Also published as: CN102172249B

Abstract

本发明涉及一种防治香蕉枯萎病的海洋细菌2BS12，属于植物保护技术领域。该菌是解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens），将该菌在PDA培养液37℃180rpm振荡培养20-24小时，然后6000rpm离心10分钟，取湿菌与本实验室的菌体保藏液按1∶40(g/ml)配成菌剂，成品中活菌总浓度为1×10⁹-1×10¹²CFU/ml。在不同香蕉品种上，对香蕉枯萎病的温室防效为52.37-77.78%，促生效果为17.08-51.19%，田间防效达到35.96%。该菌剂可以喷雾使用，做成堆肥使用，也可稀释后在移栽时灌根使用。

Description

防治香蕉枯萎病的海洋细菌2BS12

一、技术领域

本发明涉及一种防治香蕉枯萎病的海洋生防菌株2BS12，属于作物防病治病技术领域，专用于香蕉枯萎病的无公害防治。

二、背景技术

香蕉枯萎病又称巴拿马病、香蕉黄叶病，是由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）引起的维管束萎蔫病害。病原菌从寄主根部的伤口入侵，通过维管束经球茎、假茎向上部叶片蔓延，病原菌堵塞木质部导管，给植株的水分运输带来障碍，导致植株枯萎死亡。这种毁灭性的土传病害，一旦一个地块发病，病菌很快蔓延开来，很难根治，因而被称为“香蕉癌症”。因此对香蕉枯萎病进行防治迫在眉睫。

目前对该病还尚无有效的防治方法，没有理想的化学药剂和优质的抗病品种问世。一些栽培管理措施也只能起到局部的控制作用。并且长期使用一些化学杀菌剂、改良剂，极易导致病原菌抗药性问题突出，且破坏土壤的生态环境，对人类不安全。而微生物源农药可以利用微生物产生抗病物质，与病原菌竞争营养、空间位点，诱导植物产生抗病性等方式，安全、有效地防治植物病害，在植物病害的防治中具有重要的应用价值。

综上所述，这种环境友好型的高效、安全的微生物杀菌剂在香蕉枯萎病的防治中具有广阔的发展空间，同时也是农业安全可持续发展的需要。现有技术中按照本实验室的菌体保藏液专利（公开专利号CN1358838，公开日：2002年7月17日）方法，菌体可室温保存2-3年。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是针对目前尚无对香蕉枯萎病具有较好防治效果的生防制剂的现状，提供开发一种防治香蕉枯萎病的生防菌株，该菌为海洋细菌，从海洋植物秋茄（Kandelia candel (L.) Druce）根围分离获得。对香蕉枯萎病具有较好的防治效果，并具有促进植物生长的功能。

技术方案

一种防治香蕉枯萎病的海洋细菌2BS12，为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），2010年8月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.4045。

2BS12在LB培养基上培养10小时后产生单菌落，菌落为乳白色，圆形，边缘有细齿，中间隆起，表面光滑，菌体为短直杆状，革兰氏阳性菌，可产生芽孢。可分泌蛋白酶、纤维素酶及嗜铁素。

生防菌株2BS12制备生防菌剂的方法为：

将上述防治香蕉枯萎病的菌株2BS12在PDA培养液30℃ 180 rpm振荡培养20-24小时，然后6000 rpm离心10分钟，取2BS12湿菌与菌体保藏液（专利号ZL02112559.7，公开专利号CN1358838，公开日：2002年7月17日），按质量体积比为1：40配成菌剂，菌剂成品种活菌总浓度为1×10⁹-1×10¹² CFU/ml。所用PDA培养液配制方法为：用200克土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30分钟，接着用四层纱布过滤，滤液加20克蔗糖，定容至1000 ml，调节pH至7.2-7.4，121℃灭菌20分钟。菌体保藏液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液，还含有浓度为0.001mol/L的Tween20非离子型表面活性剂。

有益效果

本发明的优点和积极效果表现在：本发明是专门针对香蕉枯萎病开发的生防制剂。由于是生物制剂，对环境友好，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，对人无害，有利于无公害生产、有机生产。同时，该菌剂还有增产功能，可为农民增加收入。

离体试验表明，2BS12菌剂对香蕉枯萎病病原菌的生长有很好的抑制作用（图1）。温室实验表明：该菌制剂能显著降低由香蕉枯萎病1号、4号生理小种引起的病害的发生，并兼有促进香蕉生长的作用（表1，2）。田间试验表明：使用该菌剂对香蕉枯萎病的防治效果可达35%以上，显著优于化学农药多菌灵（表3）。

该菌剂用湿菌与本实验室的菌体保藏液（属本实验室已授权专利，专利号ZL02112559．7，公开专利号CN1358838，公开日：2002年7月17日）按1：40(g/ml)配成菌剂，可室温保存2-3年。

该菌剂可以在移栽时灌根使用，也可以在移栽前倒入有机肥中制成堆肥，然后随肥料在整地过程中埋到土里。

四附图说明

图1 2BS12菌剂对尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的生长抑制情况

图2 温室试验中2BS12菌剂处理35天后对香蕉枯萎病的防治效果（巴西蕉）

图3 温室试验中2BS12菌剂处理50天后对香蕉苗的促生效果（巴西蕉）

五具体实施方式

1．2BS12生防菌剂的制备

本发明涉及一种防治香蕉枯萎病的海洋细菌2BS12，为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），从海洋植物秋茄（Kandelia candel (L.) Druce）根围分离得到。2BS12在LB培养基上培养10小时后产生单菌落，菌落为乳白色，圆形，边缘有细齿，中间隆起，表面光滑，菌体为短直杆状，革兰氏阳性菌，可产生芽孢。可分泌蛋白酶、纤维素酶及嗜铁素。

将上述防治香蕉枯萎病的菌株2BS12在PDA培养液30℃ 180 rpm振荡培养20-24小时，然后6000 rpm离心10分钟，取2BS12湿菌与菌体保藏液，按质量体积比为1：40配成菌剂，菌剂成品种活菌总浓度为1×10⁹-1×10¹² CFU/ml。所用PDA培养液配制方法为：用200克土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30分钟，接着用四层纱布过滤，滤液加20克蔗糖，定容至1000 ml，调节pH至7.2-7.4，121℃灭菌20分钟。菌体保藏液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液，还含有浓度为0.001mol/L的Tween20非离子型表面活性剂。

．2BS12菌剂对香蕉枯萎病病原菌的生长抑制试验

将1 ml 浓度为10⁸ CFU/ml的2BS12菌剂加入200 ml PDA培养基中，混匀，倒平板，以不加2BS12菌剂的PDA培养基作对照，在每个平板的中心接上一个直径为5 mm的香蕉枯萎病病原菌菌块，在25℃恒温培养箱中培养5天，测定病原菌的生长情况。图1为2BS12菌剂对香蕉枯萎病病菌的抑制作用。

．2BS12菌剂的温室防效试验

病原菌孢子悬浮液的制备：香蕉枯萎病病原菌1号生理小种（Foc-R1）、4号生理小种（Foc-R4）（R. Morpurgo et al., 1994, Selection parameters for resistance to Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 1 and race 4 on diploid banana (Musa acuminate Colla)），分别用PDA培养液在25°C，150 rpm/min条件下培养7-10天，用无菌纱布滤去菌丝得孢子悬浮液。用血球计数板测定孢子悬浮液的浓度，并将孢子悬浮液浓度调至10⁷个孢子/ml，备用。

选用4-5叶期的香蕉苗，生防菌处理组，每株苗用30 ml浓度为10⁸ CFU/ml的2BS12菌液灌根处理，对照组用清水处理，每个处理6棵苗，每处理重复3次。待生防菌处理5天后，每株苗浇30 ml病原菌孢子悬浮液。“广粉1号”浇灌Foc-R1，“巴西蕉”和“农科1号”浇灌Foc-R4。待蕉苗开始发病后，观察记录叶片黄化状况，病原菌处理45天后统计最终结果。

按Ploetz（Ploetz, 1999）的病情统计分级，根据植株黄化、萎蔫状况进行病情统计：

0级--植株健康；

1级--轻度褪绿和萎蔫，叶柄不下垂；

2级--中度褪绿、萎蔫，少数叶柄下垂和（或）茎基部开裂；

3级--严重褪绿、萎蔫，叶柄下垂，植株矮化；

4级--死亡。

病害严重度（%）= [∑（病级数×该病级植株数）/（最高病级×总植株数）]×100%

生防效果（%）= [（对照1病害严重度-处理组病害严重度）/对照1病害严重度]×100%

温室防效试验结果表明（表1，图2），2BS12菌剂处理组能够很好的抑制香蕉枯萎病的发生，其防治效果达到52.37-77.78%。

4．2BS12菌剂的温室促生试验

生防菌处理组，每株苗用30 ml浓度为10⁸ CFU/ml的菌液灌根处理，对照组用清水处理，每个处理6棵苗，每处理重复3次。接种50天后测量蕉苗株高、茎围及鲜重等指标。

生物量增加（%）=（处理组植株鲜重-对照植株鲜重）/ 对照植株鲜重×100%

温室促生试验结果表明（表2，图3），2BS12菌剂对不同品种的香蕉苗均有促生作用，植株生物量增加为17.08-51.19%，对农科1号的香蕉苗促生作用最好。

5．2BS12菌剂的田间防效试验

试验设3个处理，Ⅰ 生防菌处理组，移栽前一个月，每株苗浇灌50 ml浓度为10⁸CFU/ml的2BS12菌液。移栽时，按照6升/亩的用量，将菌液稀释10倍后浇灌蕉苗。之后按相同方法每月处理一次，直至香蕉抽蕾；Ⅱ 多菌灵处理组，80%多菌灵可湿性粉剂1000倍稀释，移栽时灌根，之后按相同方法每月处理一次，直至香蕉抽蕾；Ⅲ 对照组，用清水浇灌作为对照。每个处理为一个小区，每个小区70 m²，双行种植10株香蕉。

0级--植株健康；

1级--轻度褪绿和萎蔫，叶柄不下垂；

2级--中度褪绿、萎蔫，少数叶柄下垂和（或）茎基部开裂；

3级--严重褪绿、萎蔫，叶柄下垂，植株矮化；

4级--死亡。

生防效果（%）= [（对照1病害严重度-处理组病害严重度）/ 对照1病害严重度]×100%

田间试验结果显示（表3），2BS12菌剂在两地对香蕉枯萎病的防治效果达53.94%和42.58%，显著优于化学农药多菌灵处理。

Claims

1.一种防治香蕉枯萎病的海洋细菌2BS12，为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），2010年8月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.4045。

2.用权利要求1所述生防菌株2BS12制备的生防菌剂。

3.权利要求2所述生防菌剂在防治香蕉枯萎病方面的应用。

4.权利要求1所述生防菌株2BS12用于制备生防菌剂的方法，其特征在于：

将权利要求1所述生防菌株2BS12在PDA培养液30℃ 180 rpm振荡培养20-24小时，然后6000 rpm离心10分钟，取2BS12湿菌与菌体保藏液，按质量体积比为1：40配成菌剂，菌剂成品种活菌总浓度为1×10⁹-1×10¹² CFU/ml，菌体保藏液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液，还含有浓度为0.001mol/L的Tween20非离子型表面活性剂。

5.根据权利要求4所述的生防菌株2BS12用于制备生防菌剂的方法，其特征在于，所用PDA培养液配制方法为：

用200克土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后至少煮20分钟以上，接着用四层医用纱布过滤，滤液加20克普通蔗糖，定容至1000毫升，pH值调至7.2-7.4，然后121℃灭菌20分钟。