CN102604839A - 一种燕麦镰孢菌及其菌剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业微生物领域，本发明公开了一种燕麦镰孢菌（Fusarium.avenaceum）菌株GD-2，其保藏编号为CGMCCNo.5579。本发明还公开了利用GD-2制备的微生物菌剂。本发明燕麦镰孢菌GD-2及其菌剂对于油菜田野燕麦的抑制效果好，田间防治效果达到74.37%；其次本发明微生物菌剂制备方法简单、成本低、易于推广应用；此外，本发明属于生物防治方法，无污染，无公害，低残留，对环境友好。

Description

一种燕麦镰孢菌及其菌剂和应用

技术领域

本发明属于农业微生物领域，具体涉及一种燕麦镰孢菌，以及利用该燕麦镰孢菌生产的微生物菌剂和应用。 

背景技术

野燕麦（Avena fatua L.）属于禾本科（Poaceae）、燕麦属（Avena），是一年生草本植物，又称铃铛麦。中国各省均有分布。该属有34种。株高30～150厘米。须根；茎丛生；叶鞘松弛，叶舌大而透明；圆锥花序；颖果纺锤形。野燕麦是小麦的伴生杂草，由于发生的环境条件一致，苗期形态相似，难以防除，危害极大。野燕麦的生长习性不仅与小麦相似，而且出苗不一致，长势凶猛，繁殖率高。成熟比小麦早。小麦因野燕麦危害后，株高降低；分孽数减少，穗粒数减少，千粒重降低，导致大幅度减产。在我国野燕麦发生严重的地区，小麦一般减产20～30%，重者达40～50%，更重者造成绝产。在小麦地，每平方米30～40株野燕麦的草害程度，每公顷造成300～600公斤损失，每平方米146株的严重草害情况下，导致损失高达每公顷90O斤。据报导，田间野燕麦穗数每亩0～127.8万个密度下，野燕麦穗数每增加1万穗，小麦产量损失2.7公斤。目前防除野燕麦的方法主要是采用耕作、栽培技术措施或使用化学药剂。但是由于野燕麦种子产生量大，种子在土壤中持续4～5年均能发芽，有的经过火烧和牲畜胃、肠后仍能发芽，使得现有技术措施的防除效果非常差。 

利用杂草的病原微生物研制专化性强、对目标杂草以外的植物影响小、环境负效应少、安全性高的生物除草剂，有可能成为防除杂草的有效途径。 

张宗俭（张宗俭等《中国生物防治》1996.12（4）：171-173）从自然罹病的野燕麦植株分离到一株燕麦叶枯菌，用该菌丝体接种整株幼苗或离体叶片试验表明，该菌只侵染野燕麦而不感染小麦，是一种潜在的防除野燕麦的真菌除草剂菌株。燕麦镰孢菌GD-2（朱海霞等.中国生物防治.2010.26（增刊）：84-89）对野燕麦的种子萌发具有显著的抑制作用，并造成野燕麦种子萌芽管损伤，温室接种试验表现对野燕麦较强的致病作用，表现叶片失水黄化、植株矮小，鲜重抑制率高，对油菜表现安全。“燕麦B”（程亮.作物杂志.2008.6：52-55）菌株在孢子浓度1×10⁷个/mL对野燕麦的发病率和病情指数分别为70%和40以上。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于野燕麦生物防治的燕麦镰孢菌菌株，该菌株可高效、长效抑制在小麦田的野燕麦，并且对环境友好。 

本发明的另一目的在于提供利用上述燕麦镰孢菌菌株生产的微生物菌剂及其制备方法。 

本发明第三个目的在于提供上述燕麦镰孢菌及其微生物菌剂在防治油菜田野燕麦上的应用。 

为实现上述目的，本发明的技术方案如下： 

一种燕麦镰孢菌（Fusarium.avenaceum）菌株GD-2，已于2011年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5579；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；分类命名：Fusarium  avenaceum。

利用上述燕麦镰孢菌GD-2生产的微生物菌剂，其活性成份为菌体和/或它的胞外代谢产物。 

上述微生物菌剂可以为液体制剂。 

上述微生物菌剂可以为可湿性粉剂。 

上述微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤： 

（1）菌种活化：将低温保存的菌株GD-2在PDA平板培养基上活化扩繁备用；

（2）种子液的制备：按常规方法制作PDB液体培养基，高压湿热灭菌后，接入步骤（1）活化的菌株GD-2，在24～28℃下振荡培养48～72h，得种子液；

（3）发酵培养：将以葡萄糖和尿素分别作为碳、氮源（C/N为6:1～5:1）。其它组份用量同查彼（Czapek）培养液，121℃高压湿热灭菌灭菌30分钟，待灭菌培养液冷却至室温时，将步骤（2）的种子液按按5～10%的比例接入发酵液，24～28℃振荡黑暗培养5～7天。

（4）检测发酵液中的分生孢子数量，待发酵液中分生孢子数量达到10⁸个/mL，停止发酵培养，得到菌株发酵液。 

（5）菌剂的制备：将液体发酵获得的菌液与吐温-80、水按1:0.005：1（V/V）混匀，即得液体制剂。 

GD-2可湿性粉剂的制备 

将所得的GD-2菌株的发酵液过滤除去菌丝，然后滤液经过石油醚提取，提取液用旋转蒸发仪减压浓缩得到浸膏，称取浸膏1.5克，加入分散剂羧甲基纤维素钠（0.111克）、十二烷基苯磺酸钠（0.115克）、硅藻土（2.008克）混合均匀，继续研磨至325目筛即得到GD-2菌剂的可湿性粉剂。

所述的燕麦镰孢菌菌株GD-2在防治油菜田野燕麦上的应用。 

上述微生物菌剂在防除油菜田野燕麦上的应用。 

本发明菌剂的使用方法：将上述所得微生物菌剂的可湿性粉剂于野燕麦3～4叶期喷雾或将上述所得的微生物菌剂的液体制剂稀释成孢子悬浮液于野燕麦3～4叶期进行植株喷雾，即可达到防控野燕麦的目的。 

菌株GD-2的分离过程： 

菌株GD-2是青海省农林科学院植物保护研究所从患病野燕麦植株分离得到的。2008年从青海省贵德县河东地区采集患病野燕麦植株，表面消毒后切取感病植株叶部组织摆放于PDA培养基上培养得到真菌微生物菌株，对这些菌株进行纯化，将菌株分别接种到野燕麦上进行致病性筛选，从中得到一株对野燕麦具有明显的防治效果的菌株，定名为GD-2。

GD-2菌株的分类鉴定： 

（1）GD-2菌株形态特征

菌株GD-2在PDA培养基上25℃培养72h后，菌落直径为3.6cm，平均生长速率为12mm/d。菌落中央稍凸起，基物表面苋菜红，后夹有土黄色，培基无色，菌丝生长致密，菌落表面棉絮状；分生孢子镰刀形，略弯曲，两端渐尖,3～7个分隔，多3隔，大小(24～70)μm×(3.5～4)μm。产孢细胞单瓶梗。

将以上菌株GD-2的形态特征与镰孢菌鉴定手册相比较，根据镰孢菌鉴定手册《The Fusarium Laboratory Manual》（John F等.Summerell, Blackwell Publishing,2006）和《Laboratory Manual for Fusarium Research 3^rd Edition》（Lester W Burgess等.University of Sydeny,1994）, GD-2的形态特征和燕麦镰孢菌(Fusarium avenaceum)的形态特征符合，说明菌株GD-2属于燕麦镰孢菌。 

本发明所具有的优点和有益效果：（1）本发明为防治农田杂草野燕麦提供了一种有效方法；（2）本发明对野燕麦的抑制效果好，在温室对野燕麦40天防效达到73.95%，田间防治效果达到74.37%；（3）本发明微生物菌剂制备方法简单、成本低、易于推广应用；（4）本发明无污染，无公害，低残留对环境友好。 

具体实施方式

下面以具体实施例来进一步清楚解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量百分含量。 

实施例1：GD-2微生物菌剂的液体制剂的制备 

（1）菌种活化：将低温保存的菌株GD-2在PDA平板培养基上进行活化（25℃），并扩繁备用；

（2）种子液的制备：按常规方法制作PDB液体培养基，在500mL三角瓶中装入150mLPDB培养液（PDB培养基：马铃薯200g，葡萄糖20.0g，蒸馏水1000mL），高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶接入步骤（1）活化好的GD-2菌株，直径为0.5cm的菌片3片，在24～28℃、转速150rpm的摇床上进行振荡培养48～72h，得种子液；

（3）液体发酵培养基：以葡萄糖和尿素分别作为碳、氮源（C/N为6:1～5:1），其它组分及用量同查彼（Czapek）培养液，121℃高压湿热灭菌30分钟，待灭菌培养液冷却至室温时，将步骤（2）中的种子液按5～10%的比例接入发酵液，24～28℃振荡黑暗培养5～7天；

（4）检测发酵液中的分生孢子数量，待发酵液中分生孢子数量达到10⁸个/mL，停止发酵培养，得到菌株发酵液。

（5）菌剂的制备：将液体发酵获得的菌液与吐温-80、水按1:0.005：1（V/V）混匀，即得液体制剂。 

实施例2：GD-2微生物菌剂的可湿性粉剂的制备 

步骤（1）～(4)和实施例1相同，然后将所得的GD-2菌株的发酵液过滤除去菌丝，然后滤液经过石油醚提取，提取液用旋转蒸发仪减压浓缩得到浸膏，称取浸膏1.5克，加入分散剂羧甲基纤维素钠（0.111克）、十二烷基苯磺酸钠（0.115克）、硅藻土（2.008克）混合均匀，继续研磨至325目筛即得到GD-2菌剂的可湿性粉剂。

实施例3：燕麦镰孢菌GD-2温室防效试验 

本试验在青海省农林科学院植物保护研究所温室内进行，首先对野燕麦进行催芽，待野燕麦种子露白时，分别向每盆种30粒种子，待种子幼苗长到2～3片叶时。根据所施用的实施例1制备的GD-2液体制剂的稀释浓度的不同，分为3个浓度处理：

处理1：约1.0×10⁶个分生孢子/mL

处理2: 约1.0×10⁷个分生孢子/mL

处理3：约1.0×10⁸个分生孢子/mL

CK：不加入GD-2液体制剂为对照

每盆中分别喷施以上不同处理的GD-2液体制剂60mL，每处理4次重复，接种后20天、40天调查野燕麦的株数和鲜重。结果（表1）20天时3个处理的防效平均达66.7%，40天时3个处理的平均株防效和鲜重效分别达到66.7%和73.95%。而且施用高浓度生防菌10⁸个分生孢子/mL较低浓度生防菌10⁶个分生孢子/mL防效高。

表1 燕麦镰孢菌GD-2菌剂对野燕麦的温室防治试验结果 

实例4：燕麦镰孢菌GD-2胞外代谢物抑制野燕麦种子萌发试验

本实验在青海省农林科学院植物保护研究所实验室进行，将实施实例1中制备的菌株GD-2液体制剂在10000rpm下离心10min，去掉菌体，取上清液即得到GD-2胞外代谢产物。分别在9cm培养皿内平铺灭菌滤纸，在滤纸上摆100粒野燕麦种子，分别加入上述胞外代谢产物的原液、稀释2倍和稀释10倍各2ml，25℃保湿培养，每天打开培养皿盖通气1h,隔天每个培养皿补充相应处理液2ml，对照用清水处理，于第5～7天后调查野燕麦种子萌发率。结果（见表2）GD-2胞外代谢物原液、稀释2倍和稀释10倍能够小朱抑制野燕麦种子的萌发，抑制率分别为99.75%、96.25%和94.50%。说明GD-2菌株产生的胞外代谢产物能够抑制野燕麦种子萌发。

种子萌发率%=萌发的野燕麦种子/供试野燕麦种子总数×100 

抑制率%=（对照处理中野燕麦种子萌发数-毒素处理野燕麦种子数）/对照处理中野燕麦种子萌发数×100

表2 GD-2胞外代谢产物对野燕麦种子萌发的抑制试验结果

注：小写字母表示在0.05水平上的差异显著性。

实例5：燕麦镰孢菌GD-2油菜地田间防治试验 

本实验在青海省农林科学院植物保护研究所试验地内进行，将实施例2中制备的可湿性粉剂于油菜地野燕麦3～4叶期喷施，试验设2个难度处理，分别为处理1:100克/小区和处理2：200克/小区，每小区面积约3M²，三次重复，接种后20天、40天调查野燕麦的株数和鲜重。结果（见表3）各处理40天时平均株防效和鲜重效分别为63.79%和74.37%。说明GD-2菌株对油菜田野燕麦具有很好的防治效果。

表3 GD-2菌剂对油菜地野燕麦的田间防治效果结果 

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

  

Claims (8)

1.一种燕麦镰孢菌（Fusarium.avenaceum）菌株GD-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5579。

2.利用权利要求1所述的燕麦镰孢菌GD-2生产的微生物菌剂，其特征在于其活性成分为燕麦镰孢菌GD-2菌体和/或它的胞外代谢产物。

3.按照权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于为液体制剂。

4.按照权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于为可湿性粉剂。

5.权利要求3所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1) 菌种活化：将低温保存的菌株GD-2在PDA平板培养基上活化扩繁备用；

(2) 种子液的制备：按常规方法制作PDB液体培养基，高压湿热灭菌后，接入步骤(1)活化的菌株GD-2，在24～28℃下震荡培养48～72h，得种子液；

(3) 液体发酵培养基：以葡萄糖和尿素分别作为碳、氮源（C/N为6:1～5:1），其它组分及用量同查彼（Czapek）培养液，121℃高压湿热灭菌30分钟，待灭菌培养液冷却至室温时，将步骤（2）中的种子液按8%的比例接入发酵液，24～28℃振荡黑暗培养5～7天；

(4) 检测发酵液中的分生孢子数量，待发酵液中分生孢子数量达到10⁸个/mL，停止发酵培养，得到菌株发酵液；

(5) 菌剂的制备：将液体发酵获得的菌液与吐温-80、水按1:0.005：1（V/V）混匀，即得液体制剂。

6.权利要求4所述微生物菌剂的制备方法，其特征在于将所得的GD-2菌株的发酵液过滤除去菌丝，然后滤液经过石油醚提取，提取液用旋转蒸发仪减压浓缩得到浸膏，称取浸膏1.5克，加入分散剂羧甲基纤维素钠（0.111克）、十二烷基苯磺酸钠（0.115克）、硅藻土（2.008克）混合均匀，继续研磨至325目筛即得到GD-2菌剂的可湿性粉剂。

7.权利要求1所述的燕麦镰孢菌菌株GD-2在防治油菜田野燕麦上的应用。

8.权利要求2、3或4所述的微生物菌剂在防治油菜田野燕麦上的应用。