CN102604857B - 一株烟草普通花叶病毒生防蒙氏假单胞菌菌株 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株烟草普通花叶病毒生防蒙氏假单胞菌菌株(Pseudomonas monteilii)，菌株代号为4A1，该菌株于2011年9月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.5229。该菌株能够抑制烟草普通花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)的侵染，生防实验表明能够防治烟草普通花叶病毒。同时本发明还提供了一种从该菌株中得到发酵上清液中分离活性物质，在烟草普通花叶病毒防治方面，具有很高的应用价值。

Description

一株烟草普通花叶病毒生防蒙氏假单胞菌菌株

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一株烟草普通花叶病毒生防蒙氏假单胞菌菌株，该菌株以及从该菌株中得到发酵上清液中分离活性物质在烟草普通花叶病毒防治方面的应用。

背景技术

烟草普通花叶病毒病由烟草普通花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)引起，最显著的症状是形成黄绿相间的斑驳花叶，病叶边缘有时向背面卷曲。此病自苗床至大田整个生育期均可连续发生，病叶经调制后颜色不均匀，吃味较差，品质下降。烟草普通花叶病毒广泛分布于我国各烟区，以黑龙江、吉林、辽宁、山东、河南、安徽、广东等省受害较重。尤其近年来由烟草普通花叶病毒与烟草黄瓜花叶病毒、烟草马铃薯Y病毒混合侵染的危害呈上升趋势，症状加重，造成烟田严重减产。目前生产上尚没有特效抗病毒剂，而Mulvania于1926年就发现被细菌污染的植物病毒汁液很快丧失侵染活力，因此利用拮抗细菌来抑制植物病毒的侵染是植物病毒病防治的有效策略之一。

烟草是我国重要的经济作物，中国烤烟的主要产区分布在云南、贵州、四川、湖北、湖南、陕西、河南、安徽、山东、辽宁、吉林、黑龙江等20多个省区的近900个县市。其中，云南省是我国烟草种植面积最大的省。中国烟叶的质量在不断提高，全国良种化面积达到90％以上，是世界上最大的烟草生产国。

烟草普通花叶病毒是烟草生产上的主要病毒病害，其寄主范围广，可侵染30个种199种植物(Shew & Luas，1991)，它的独立和抗逆性都很强，含病毒的新鲜汁液稀释到100万倍仍有致病力，在汁液中病毒的钝化温度为93℃、10min或75℃、40d；干病叶120℃处理30min仍有侵染活力。烟草普通花叶病毒在自然界存在很多株系，而不同株系在先后侵入烟株时往往存在交叉保护作用。烟草花叶病毒主要通过汁液摩擦传播，侵入后引起花叶、坏死、畸形、矮化、变色等组织病变，不仅造成烟草产量损失，而且使烟草品质下将，特别是上等烟比例和内在质量下降，占所有烟草病害损失一半以上。2007年全国烟叶生产因病毒病产值损失44795.08万元，2008年产值损失达到65174.94万元。

微生物之间的拮抗作用在自然界中普遍存在，是生物农药研制的依据。微生物源抗病毒物质以细菌及其代谢产物、真菌及其代谢产物、放线菌及其代谢产物为主。微生物代谢产生的有抗病毒作用的活性物质，具有活性强、安全高效的优点。从微生物资源中筛选，经分离后获得多糖、蛋白类、核酸类、小分子等抗植物病毒物质，已经成为研究的热点，有的已经形成产品，在农业生产中发挥重要作用，尤其是抗病毒型农用抗生素的研制已取得了突破性进展，如宁南霉素是一种胞嘧啶核苷肽型抗生素，具有广谱和高效的抑制作用，并且低毒、低残留等优点。1995年向固西等从诺尔斯链霉菌西昌变种(s.nourseivar.xiehangensis)的发酵液中提取的胞嘧啶核苷肽型抗生素一宁南霉素(ningnanmyein)，对TMV的复制有抑制作用，防效在65％以上，已形成2％宁南霉素水剂，1997年获得了临时登记图。2001年我国又新增了嗜肤霉素，用于植物病毒病害防治的新型农用抗生素。

随着全球食品安全生产的日益重视，随着人们对吸烟健康的日益关注和重视，随着烟草可持续发展以及化学农药抗性和污染问题的日益严重，生物农药越来越受到重视，并成为综合防治的主要部分。生物农药选择性强，对人畜安全；无污染，对生态环境安全；效果好，防治期更长；种类繁多，开发利用途径多。具有诱导烟草抗性的生物及化学激发子制剂农药是基于诱导增强植物抗病性、抗逆性而研制的新型农药，产品安全无毒，不会引起植物的抗性，对植物有显著抗病增产作用，同时能提高作物的品质，生产上可以减少或不使用化学农药，生产的产品可以达到绿色产品和有机食品的要求，特别是在无公害烟叶生产中将发挥重要的作用，符合当前我国对烟叶质量的要求，有利于提高烟叶质量，增加农民收入，具有非常广阔的市场前景和良好的市场竞争能力，具有较好的综合效益。具有诱导抗性的生物及化学激发子生物农药将成为21世纪农业可持续发展的重要内容，具有十分广阔的应用前景。

目前成功应用的植物病害生防细菌有Agrobacterium、Bacillus、Pseudomonas、Erwinia、Xanthomonas等属的一些菌株。生防细菌防治植物病害发生发展的一个重要机制是产生拮抗物质，大致包括以下几类：细菌素(bacteriocins)、荧光素(fluorescein)、土壤杆菌素(agrocin)、酚类物质、多肽类抗生素(polypeptides)、蛋白质类等，在植物病害生物防治中起着关键的作用。由生防细菌产生的拮抗物质种类多，作用范围广谱，同一种拮抗物质可以由多种细菌菌株产生，而同一种细菌菌株也可以产生多种不同结构的拮抗物质。

目前生物农药的研发已经在原有微生物制剂开发的基础上，向新功能、分子设计或重组生物农药方向发展。微生物源农药是利用微生物或其代谢物作为防治农业有害物质的生物制剂，主要包括微生物杀菌剂、微生物杀虫剂和微生物除草剂。微生物杀虫剂包括昆虫病原细菌、昆虫病毒、昆虫真菌、昆虫病原线虫和微孢子虫。微生物除草剂我国首次将真菌用于杂草生物防治的研究是1963年利用炭疽病“鲁保一号”防治大豆菟丝子，1966年以后生物除草剂“鲁保一号”推广到全国20多个省、市、自治区，防治效果稳定在80％以上。在活体微生物除草剂中，以真菌所占比重最大，真菌除草剂的研究和开发最为活跃。美国成功开发了用于防治水稻、麦类等作物菌期杂草的盘长孢状刺盘孢；日本烟草株式会社开发的黑腐病菌，用于防治草坪内的杂草早熟禾及剪股颖，但目前尚无规模应用。农用抗生素主要指用于防治病、虫、草等有害生物的微生物代谢产物，可分为抗菌素、杀虫素和杀草素。开发抗植物病毒病的农用抗生素：农用抗生素因其具有内吸活性强、安全、低毒、高效、速效等诸多优点，成为各国研究的热点，谁首先开发成功，谁就掌握了市场的主动权。因此，开发抗病毒型农用抗生素已迫在眉睫。从植物中获取天然抗病毒物质：目前已从中草药中开发出若干行之有效的抗病毒制剂，并且在筛选模式上也有所突破。进一步的研究和开发将会给病毒病的防治带来新的生机。开发复配制剂：多种抗病毒型生物农药之间或生物农药与化学农药之间进行复配，以期能达到好的防治效果。

研究已有的抗病毒型农用抗生素的作用机理，明确其作用位点、作用时间，为进一步开发更为高效的新型抗病毒型生物农药提供理论依据和研究手段。了解拮抗菌的抗病毒机理是增强拮抗菌生防效力和确定拮抗菌筛选标准的重要前提，拮抗菌对植物病毒主要有3种作用机制：即体外钝化作用、抑制作用(包括抑制侵染和抑制增殖)、诱导抗性，其中以体外钝化作用最为显著。

因此本发明将从生物防治方面进行探索，筛选防效促生效果好的拮抗菌株，并对其抗病毒机理进行研究，为将来通过常规和分子生物学途径，利用这些拮抗细菌及其拮抗物质防治烟草普通花叶病毒病提供研究基础和实验材料。

在植物的根围、叶围及其它微生态区系中，拮抗细菌广泛存在，且由于培养方便、生长周期短、作为新拮抗菌来源具有很大的开发潜力。

国内对烟草普通花叶病毒病生物防治已有报道，但多数仅限于对生防菌的筛选和盆栽试验阶段，而对其产生抗菌物质的提取、生理生化特性和生防菌的防病机制等诸多方面国内尚未深入研究。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术所存在的上述不足，而提供一株烟草普通花叶病毒生防蒙氏假单胞菌菌株，用于烟草普通花叶病毒病的生物防治，为烟草普通花叶病毒病的防治提供了新的微生物资源。

其技术方案为：

本发明所述菌株是从青岛即墨试验农场、烟田土样中分离获得的，经鉴定该菌株为蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)。该菌株的培养条件为28℃，LB培养基，pH7.0。该菌株为假单胞杆菌属(Pseudomonas)、蒙氏假单胞菌种，菌株代号为4A1，该菌株于2011年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.5229。

本发明所述方法，包括以下步骤：

1)将活化的4A1菌株接种于LB培养基中，28℃恒温，140rpm振荡培养48h，4℃离心10min，去菌体，制成胞外代谢物的发酵上清液；

2)用3倍体积的乙酸乙酯萃取发酵上清液，收集有机相和水相，分别在旋转蒸发仪上旋转蒸发，有机相温度45℃，水相60℃，有机相蒸干的结晶用少量无菌的蒸馏水溶解，水相剩余30ml时停止蒸发，加入等体积乙醇，140rpm震荡10min萃取，重复3次；

3)萃取后旋蒸物中蛋白乳化沉淀，固相液相自然分离，取上清再次旋转蒸发，结晶后用无菌的蒸馏水溶解，所得成分即为生防菌剂。

本发明的有益效果：

本发明获得的拮抗烟草普通花叶病毒病的生防蒙氏假单胞菌菌株4A1，可应用于对烟草普通花叶病毒病的防治，采用接种枯斑寄主的生物学测定表明，其发酵液对TMV的抑制率为98.0％，4A1菌株分泌的拮抗物质萃取后的活性物质，对TMV的抑制率为99.1％。4A1菌株对植株有促进生长的作用，能有效的对剪叶剪刀进行消毒，防止病毒传播，抑制侵染和增殖，菌株分泌的拮抗物质对TMV具有破坏病毒粒体的作用，具有实际的应用价值。

附图说明

图1为4A1菌株发酵液对TMV的抑制作用(半叶法)效果图；

图2为透射电镜下病毒粒体及菌株形态图，其中A：完整的病毒粒体(100K)，B：病毒粒体与菌株混合(25K)；

图3为4A1发酵液灌根对NC89的促生作用(末次灌根3d)效果图；

图4为4A1系统发育树(FN812753)。

具体实施方式

下面结合具体和实施例对本发明的方法作进一步详细地说明。

实施例1

1、1防治TMV拮抗细菌4A1菌株的筛选

挑取纯化菌株接种于LB液体培养基，28℃恒温，140rpm振荡培养48h，取20ml与等体积40倍TMV汁液混合15min后，摩擦接种TMV的枯斑寄主三生-NN烟，每株接种上部2片叶，以无菌水与TMV混合为对照，3～5d调查枯斑抑制率。经初步测试有拮抗活性的菌株采用相同方法重复测试，每处理3株，三次重复。

枯斑抑制率计算公式：

枯斑抑制率调查显示菌株4A1对TMV的抑制效果最好，对TMV的枯斑抑制率达到98.0％，生防细菌在生长代谢过程中产生了具有抑制病毒活性的抗生物质。(见表1、图1)

表1不同菌株对烟草普通花叶病毒的抑制作用

1、24A1菌株发酵上清液及乙醇提取物对TMV的抑制作用

发酵上清液及乙醇提取物

将活化的4A1菌株接种于LB培养基中，28℃恒温，140rpm振荡培养48h，4℃离心10min，去菌体，制成胞外代谢物的发酵上清液。

用3倍体积的乙酸乙酯萃取发酵上清液，收集有机相和水相。分别在旋转蒸发仪上旋转蒸发，有机相温度45℃，水相60℃。有机相蒸干的结晶用少量无菌的蒸馏水溶解，成分为A，抗病毒实验备用。水相剩余30ml左右时停止蒸发，加入等体积乙醇，140rpm震荡10min充分萃取，重复3次。萃取后旋蒸物中蛋白乳化沉淀，同相液相自然分离，取上清再次旋转蒸发，结晶后用少量无菌的蒸馏水溶解，成分为B，进行抗病毒实验。

发酵上清液及萃取物对TMV活性检测

取2ml发酵上清液和萃取后的水相、有机相浓缩物各2ml，分别与等体积40倍TMV混合15min，接种三生-NN烟，以无菌水与等体积TMV混合为对照，检测其枯斑抑制率。(表2)

表24A1发酵上清液及萃取物对TMV的抑制作用

从表2可知，4A1菌株发酵上清液对TMV的枯斑抑制率分别为89.3％，说明菌株产生的次生代谢产物对病毒具有抑制作用。乙酸乙酯萃取后的有机相防效达到86.5％，乙酸乙酯萃取后的水相成分又经乙醇萃取效果可达到99.1％，效果理想，说明有效成分主要是存在于水相中，而且与乙醇极性相近。而不接菌LB培养基对TMV几乎不存在抑制作用。因此可以初步认定4A1产生的主要抑病毒物质是乙酸乙酯萃取后水相中乙醇萃取物。在此基础上，可以进行进一步分离提取，确定最后的有效成分。

实施例2

透视电镜下观察4A1菌株活性物质对TMV病毒粒体的影响

(1)TMV粒体的粗提纯

参照PEG法(胡伟贞等，1989)提纯TMV粒体，具体操作步骤如下：

TMV活体毒源叶片100g，加等量无菌水，充分研磨至匀浆，尼龙纱布过滤后，1000rpm离心10min，弃去沉淀；

上清液60℃，水浴加热10min，4000rpm离心20min，弃去沉淀；

上清液加入4％PEG₆₀₀₀(0.1M NaCl)或2％PEG₆₀₀₀(0.3M NaCl)，弃去上清液；

所得沉淀为TMV提纯病毒。

(2)负染法电镜样品的制备与观察

将4A1发酵上清液与等量的TMV提纯液混合，室温下(25℃)孵育30min，用无菌水与TMV提纯液等量混合，作空白对照。

用带膜样品载网膜面向下吸附3min左右，用一片干净滤纸从网边吸去液体；

稍干后用镊子将载膜网转移到磷钨酸(2％，pH6.7)中，染色1～2min，取出后用滤纸吸干染液，放在垫有滤纸的平皿中，干燥；

在JEM-100X透射电镜下，观察TMV病毒粒体、4A1菌体形态。

负染法提纯TMV病毒粒体后，在透射电镜下观察，病毒粒体呈典型的杆状，长度在400-500nm，排列整齐笔直有序，病毒粒体完整；4A1发酵液与病毒粒体的混合处理后，TMV粒体发生明显的断裂，长度10nm-200nm，排列杂乱。菌株周围粒体形态尤为明显。菌株4A1形态呈短杆状，无芽孢，能运动。

实施例3

3.1菌株4A1与其他抗病毒药剂效果的对比

选取生产上经常使用的病毒抑制剂：宁南霉素(200倍)、吗啉胍乙铜(400倍)，肥皂水(20％)与4A1抗病毒效果的对比。每种病毒抑制剂与40倍病毒汁液均匀混合15min，以无菌水与TMV混合为对照，半叶法接种到三生-NN烟上，每株接种上部2片叶，每处理3株，三次重复，3～5d调查枯斑抑制。具体见表3.

表3多种病毒抑制剂的抗病效果

从表3中可以看出，常用的抗病毒剂吗啉胍乙铜和宁南霉素的防效不足70％，肥皂水的抑制率只有11.6％，4A1的病毒抑制率达到了98.1％，远高于以上处理。说明4A1有开发成抗生素农药的生防潜质。

3.2促生作用

将滤纸修剪适当大小，置于培养皿中，发酵液(1x10⁸cfu/ml)离心去菌体后，分别稀释1倍、5倍、25倍、125倍、625倍，湿润滤纸。选取饱满圆润的绿豆，每个培养皿十粒，并以灭菌LB培养基做对照，每天观察并保证滤纸湿润。考察发芽率，考察鲜重、根长、株高。

2-3叶期普通烟NC89，移栽至直径10cm的小花盆，移栽时用稀释125倍的4A1发酵液灌根，每株10ml，间隔3d，再连续灌根2次，以LB培养基、无菌水灌根为对照，每处理6株，3次重复。末次灌根3d后，调查鲜重，最大叶长、宽。

由表4看出，绿豆经稀释的发酵液处理后，其鲜重，根长、株高明显高于LB培养基处理，未经稀释的菌液抑制绿豆的生长，发芽率仅有50％，并且芽长度仅有0.5cm。稀释5倍的菌液对绿豆的生根有抑制作用，但是对株高的增加有促进作用。稀释1倍的菌液处理绿豆没有发芽，稀释125倍对烟株的生长最为有利。

由表5看出，普通烟NC89，连续三次灌根，4A1发酵液处理其鲜重，最大叶长、宽均高于LB培养基和清水处理，与清水处理差异极显著。(见图3)。

表44A1发酵液灌根对绿豆的促生作用

表54A1发酵液灌根对NC89的促生作用

3.3对剪刀的消毒作用

灭菌剪刀在80倍TMV汁液中浸泡1min，取出后分别在下述①～④液体中浸泡30sec，在5～6叶期普通烟N89上，剪上部3片叶。每处理9株，3次重复。15d调查病情指数。①4A1发酵液，②LB培养基，③清水，④不浸泡，直接剪N89叶片。

表64A1发酵液对剪叶剪的消毒作用

由表6看出，剪刀浸泡在TMV汁液中，沾取了病毒汁液，再在4A1发酵液中浸泡，能杀死全部病毒，发病率为0，因此，生产上可以用4A1发酵液来消毒剪叶剪等操作器械。试验中还观察到浸泡在LB培养基和清水中的处理，发病率也低于④不浸泡的处理，是因为稀释了沾取在剪刀上的病毒浓度，降低了侵染力。

3.4田间试验

(1)菌液处理。挑取纯化后的4A1菌株接种到LB培养基中，发酵50L备用(3.2x10⁸cfu/ml)。无毒烟株假植之后4-5叶期，进行接种。按含病毒的新鲜叶片与接种缓冲液质量与体积比为1∶40配制病毒汁液。3个处理：处理I菌液和病毒汁液混合10min后接种。处理II先喷菌液，两小时后再接种病毒汁液。处理III先接种病毒汁液，两小时后再喷施菌液。

(2)小区设置。2011年4月20日选择在中国农业科学院烟草研究所即墨试验基地土质、肥力、水肥管理一致的烟区进行，分为两个区域，分别进行抗TMV、PVY病毒试验。每个抗病毒实验设3个菌液处理，并且以LB培养基与等体积病毒汁液混合为阳性对照CK，每个处理3次重复，每小区50棵烟株，小区间设保护行。

(3)调查时间和方法。烟株移栽30天后调查发病率及病情指数。TMV及PVY分级标准按全国烟草行业烟草病害调查分级标准Yc/T39-1996进行，以株为单位。

试验结果如表6。菌液与病毒汁液混合抑制效果最好，菌液可钝化绝大部分病毒的活性，TMV的抑制效果可达到94.7％，PVY抑制率达到95.3％；其次是先喷菌液，2小时后接种病毒，菌液可在烟叶表面定殖，预防病毒侵染，TMV防效是66.7％，PVY防效是63.3％；而接种后喷菌液的防治TMV、PVY效果均不足15％，没有经过菌液处理的对照组发病率达到99.3％。所以，不同菌液处理方式的抗病毒效果依次为：菌液与病毒混合接种＞先喷菌液再接种＞先接种后喷菌液＞不用菌液处理。菌株4A1在田间生产上用于抗病毒剂，可以有效预防田间病毒病的发生。

表74A1在田间对TMV和PVY的抑制活性

4A1的分类地位分子鉴定

参照文献(林万明主编细菌分子遗传学分类鉴定方法[M].上海，上海科学技术出版社1990)方法提取总体DNA，PCR扩增参照(.W.迪芬巴赫，G.S.德维克斯勒著，黄培堂等译.PR实验技术实验指南[M]，北京科学技术出版社，2000)方法进行。以4A1菌体基因组DNA为模板，经PCR反应扩增，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条1.0kb以上的特异性片段，测定该片段序列(PCR产物由北京华大中生生物科技有限公司测序)，结果表明，测得4A1菌株为1403bp。将测得的16s rDNA全序列(见序列表)提交GenBank(www.LBi.nlm.nlh.Gov)，应用其中的BLAST软件和DNAMAN软件进行分析，发现，4A1菌株测得的序列与蒙氏假单胞菌16s rDNA部分序列相同(图4)。因此鉴定4A1菌株为蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)。同时将4A1登陆GenBank，登陆号为FN812753，系统发育树显示4A1与蒙氏假单胞菌同源性99％

附：本发明所涉及的核苷酸序列

SEQ ID NO1(4A1菌株16S rDNA全序列)：

aacacacgagcggatgacgggagcttgctccttgattcagcgggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcgtagtgggggacaacgtttcgaaaggaacgctaataccgcatacgtcctacgggaggcaggggaccttcgggccttgcgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtggggtaatggctcaccaaggcgacgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcctacggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggcagtaagttaataccttgctgttttgacgttaccgacaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgtaggtggttcgttaagttggatgtgaaagccccgggctcaacctgggaactgcataaactggagctagtacggtagagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtaataggaaaacaccagtggcgaaggcgaccacctggactgatactgacactgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcaactagccgttggaatccttgagattttagtggcgcagctaacgcattaagttgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggccttgacatgcagagaactttccagagatggattggtgccttcgggaactctgacacaggtgctatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtccttagttaccagcacgtaatggtgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacggcctgggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggttgccaagccgcgaggtggagctaatctcacaaaaccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgtcggaatcgctagtaatcgcgaatcagaatgtcgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaccagaagtagctagtctaaccttcgggaggacggttaccacggtgtgattcatgactggggtgtcgtaa

Claims (4)

1.一株烟草普通花叶病毒生防蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)菌株，菌株代号为4A1，该菌株于2011年9月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.5229。

2.权利要求1所述菌株4A1在防治烟草普通花叶病毒中的应用。

3.一种用权利要求1所述的烟草普通花叶病毒生防蒙氏假单胞菌菌株得到活性物质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将活化的4A1菌株接种于LB培养基中，28℃恒温，140rpm振荡培养48h，4℃离心10min，去菌体，所得为胞外代谢物的发酵上清液；

2)用3倍体积的乙酸乙酯萃取发酵上清液，收集有机相和水相，分别在旋转蒸发仪上旋转蒸发，有机相温度45℃，水相60℃，有机相蒸干的结晶用少量无菌的蒸馏水溶解，水相剩余30ml时停止蒸发，加入等体积乙醇，140rpm震荡10min萃取，重复3次；

3)萃取后旋蒸物中蛋白乳化沉淀，固相液相自然分离，取上清再次旋转蒸发，结晶后用无菌的蒸馏水溶解，成分即为抗病毒剂。

4.权利要求3所述制备方法获得的活性物质在烟草普通花叶病毒防治中的应用。

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