CN102160553A

CN102160553A - 一种抗植物病毒病Ba制剂及其应用

Info

Publication number: CN102160553A
Application number: CN2011100447295A
Authority: CN
Inventors: 王凤龙; 申莉莉; 马强; 杨金广; 王志华; 钱玉梅; 刘常荣; 陈丹; 孙惠青; 董小卫; 李晓; 周显升; 刘伟; 卜晓东; 赵砚棠; 刘宝平; 朱战营; 耿宝峰
Original assignee: Tobacco Research Institute of CAAS; China Tobacco Shandong Industrial Co Ltd
Current assignee: Tobacco Research Institute of CAAS; China Tobacco Shandong Industrial Co Ltd
Priority date: 2011-02-24
Filing date: 2011-02-24
Publication date: 2011-08-24

Abstract

本发明公开了抗植物病毒病Ba制剂，是由以下组分组成的：解淀粉芽孢杆菌Ba培养液和硅藻土，其中，解淀粉芽孢杆菌Ba培养液中，Ba的活菌数为1000亿cfu/ml，硅藻土的质量占制剂总质量的8％；所述解淀粉芽孢杆菌Ba命名为Bacillus amyloliquefaciens，已于2010年08月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNO.4127。本发明的抗植物病毒制剂具有钝化病毒颗粒、抑制病毒复制增殖和诱导寄主抗性的能力；温室防效80％以上，大田防效49.09％。在作物(烟草为主)病毒病防治方面，具有很高的应用价值。

Description

一种抗植物病毒病Ba制剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种抗植物病毒病Ba制剂及其应用。

背景技术

病毒病是农作物的重要病害之一。目前，抗植物病毒剂的防治效果，远远不能满足农业生产的需求，急需开发新型抗病毒制剂。尽管化学农药现在仍占主体，但从可持续发展的角度考虑，发展能产生高效、高活性的生物源抗病毒剂是实现产业化生物防治的关键。

中国文献“生防菌Ba33抑制烟草花叶病毒RNA在叶片内积累的研究，植物保护，2010，36(3)：82-84.”以及“解淀粉芽孢杆菌Ba33对烟草的促生及抗TMV作用，吉林农业大学学报，2010，32(4)：383-386.”记载了解淀粉芽孢杆菌Ba33对烟草花叶病毒(TMV)具有抑制作用，但其仅是机理研究，并未将其制成适用于工业化生产和应用的制剂，其实际应用存在难题。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种抗植物病毒病Ba制剂，及其应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种抗植物病毒病Ba制剂，是由以下组分组成的：解淀粉芽孢杆菌Ba培养液和硅藻土，其中，解淀粉芽孢杆菌Ba培养液中，Ba的活菌数为1000亿cfu/ml，硅藻土的质量占制剂总质量的8％；所述解淀粉芽孢杆菌Ba命名为Bacillus amyloliquefaciens，已于2010年08月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNO.4127。

所述抗植物病毒病Ba制剂的制备方法为：将解淀粉芽孢杆菌Ba培养液添加到硅藻土中，混匀即可。

所述抗植物病毒病Ba制剂能够用于防治作物病毒病，特别是烟草的TMV病毒病。

所述抗植物病毒病Ba制剂还能够对农事操作工具上的病毒进行消杀，降低病害传播。

所述抗植物病毒病Ba制剂还能够促进作物的生长，尤其是烟草。

本发明所涉及的解淀粉芽孢杆菌Ba33，其培养方法、生物特性、活性物质等，已经公开，记载在中国文献“生防菌Ba33抑制烟草花叶病毒RNA在叶片内积累的研究，植物保护，2010，36(3)：82-84.”以及“解淀粉芽孢杆菌Ba33对烟草的促生及抗TMV作用，吉林农业大学学报，2010，32(4)：383-386.”上，在此不再赘述。

本发明的抗植物病毒制剂具有钝化病毒颗粒、抑制病毒复制增殖和诱导寄主抗性的能力；温室防效80％以上，大田防效49.09％。在作物(烟草为主)病毒病防治方面，具有很高的应用价值。虽然解淀粉芽孢杆菌Ba33能够抗TMV的特性已经公开，但本发明将其制备成适于工业化应用的制剂，配方中，硅藻土对Ba33有较好的吸附作用，Ba33在硅藻土中以芽孢形式存在，活性稳定。室温下可放置8个月，对TMV仍有60％的防效。

附图说明

本发明的解淀粉芽孢杆菌Ba33命名为Bacillus amyloliquefaciens，已于2010年08月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNO.4127，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，邮编：100101。图1为实施例1中Ba33菌株对TMV的抑制作用示意图，其中，左：无菌水；右：Ba33。图2为实施例3中Ba制剂对TMV的抑制作用示意图。

图3为实施例4中Ba制剂对三生NN烟诱导1-6d的枯斑抑制症状示意图，其中，A：Ba-1d：B：Ba-2d；C：Ba-3d；D：Ba-4d；E：Ba-5d；F：Ba-6d；G：NB-1d；H：NB-2d；I：NB-3d；J：NB-4d；K：NB-5d；L：NB-6d；M：CK-1d；N：CK-2d；O：CK-3d；P：CK-4d；Q：CK-5d；R：CK-6d。

图4为实施例5中Ba灌根对NC89的促生作用示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1防治TMV拮抗细菌Ba33菌株的筛选

挑取纯化菌株接种于NB液体培养基，28℃恒温，140rpm振荡培养48h，取20ml与等体积80倍TMV汁液混合15min后，摩擦接种TMV的枯斑寄主三生NN烟，每株接种上部2片叶，以无菌水与TMV混合为对照，3～5d调查枯斑抑制率。经初步测试有拮抗活性的菌株采用相同方法重复测试，每处理3株，三次重复。结果如表1、图1所示。

表1不同菌株对烟草普通花叶病毒的抑制作用

枯斑抑制率调查显示：菌株Ba33对TMV的抑制效果最好，对TMV的枯斑抑制率达到91.3％，生防细菌在生长代谢过程中产生了具有抑制病毒活性的抗生物质(见表1、图1)。

实施例2抗植物病毒病Ba制剂的配置

粉剂流程图：Ba33菌种活化、培养液制备---种子液接种---菌体发酵3次---与填料硅藻土混合---喷雾干燥去水分---菌体原粉---添加填料---菌体制剂(10亿/克)。所得菌体制剂中，填料硅藻土的质量占制剂总质量的8％。

Ba制剂稀释150倍，与80倍TMV汁液等体积混合15min后，摩擦接种三生NN烟，每株接种上部2片叶，以无菌水与TMV混合为对照，同时以Ba33培养液、NB培养基代替Ba制剂液为比较。计算枯斑抑制率。

表2不同硅藻土添加量对制剂抑制TMV作用的影响

通过表2看出，硅藻土含量8％时，即不影响发酵液的活性，又能很好的吸附菌液，对TMV的防效达到86.77％。说明选择硅藻土作为填料，不影响Ba33活菌对TMV的抑制作用，硅藻土作为填料，具有吸附性好、价格便宜等优点，可以在生产上使用。

实施例3Ba制剂对TMV的抑制作用

5-6叶期三生NN烟，做如下处理：①叶面喷雾制剂150倍稀释液，每株10ml，24h后，接种160倍TMV汁液；②80倍的TMV汁液与等体积的制剂液混合，摩擦接种；③接种160倍TMV汁液，24h后，叶面喷雾制剂液，每株10ml。以上每处理3株，接种上部3片叶。分别以NB培养基、清水代替Ba制剂液为对照CK。统计平均枯斑数。结果如表3、图2所示。

表3生防菌Ba制剂对TMV的作用方式(平均枯斑数)

通过表3看出，生防菌制剂Ba对TMV的①预防、②钝化、③治疗，三种作用方式的枯斑数均显著小于NB培养基和CK(清水)处理。与CK相比，Ba对TMV的预防、钝化和治疗作用分别为89.6％、96.3％和54.4％。以钝化作用最为显著，其次为预防作用和治疗作用，NB培养基对TMV没有抑制作用(表3、图2)。

实例4Ba制剂对三生NN烟的诱导抗性

5-6叶期三生NN烟，接种160倍TMV前1d、2d、3d、4d、5d、6d，叶面喷雾制剂150倍稀释液，每株10ml。以喷清水为对照，每处理3株，接种上部3片叶，统计枯斑数，计算枯斑抑制率，结果如表4、图3所示。

表4Ba制剂对植株的诱导抗性

通过表4看出，喷施Ba制剂150倍稀释液，有提高三生NN烟抗TMV侵染的作用。三生NN烟接种TMV前1-6d喷施Ba制剂，平均枯斑数为8.0，均显著低于NB(59.4)和清水(61.1)处理。与CK相比，接种前1-6d，喷施Ba制剂，对TMV的诱导抗性在78.1～89.9％，说明在接种TMV前一周内喷施Ba制剂均能提高三生NN烟的抗性，是一种良好的病毒预防剂(表4、图3)。

实施例5Ba制剂对植株的促生作用

2-3叶期普通烟NC89，移栽至直径10cm的小花盆，移栽时用Ba制剂液灌根，每株10ml，间隔3d，再连续灌根2次，以NB培养基、无菌水灌根为对照，每处理6株，3次重复。末次灌根3d后，调查鲜重，最大叶长、宽(如表5、图4所示)。

表5Ba制剂液灌根对NC89的促生作用

备注：小写字母表示5％水平差异，大写字母表示1％水平的差异

由表5看出，普通烟NC89，连续三次灌根，Ba处理其鲜重，最大叶长、宽均高于NB培养基和清水处理，与清水处理差异极显著。其中Ba制剂150倍稀释液、NB培养基灌根处理其烟株生长好于清水处理，以Ba制剂150倍稀释液处理的植株长势最好(图4)。

实施例6Ba制剂对剪叶剪刀的消毒作用

灭菌剪刀在80倍TMV汁液中浸泡1min，取出后分别在下述①～④液体中浸泡30sec，在5～6叶期普通烟NC89上，剪上部3片叶。每处理9株，3次重复。15d调查病情指数。①Ba制剂150倍稀释液，②NB培养基，③清水，④不浸泡，直接剪NC89叶片，结果如表6所示。

表6Ba制剂对剪叶剪的消毒作用

由表6看出，剪刀浸泡在TMV汁液中，沾取了病毒汁液，再在Ba制剂150倍稀释液中浸泡，能杀死绝大部分病毒，发病率仅为7.41％，病情指数也远低于其他处理，因此，生产上可以用Ba制剂液来消毒剪叶剪等操作器械。试验中还观察到浸泡在NB培养基和清水中的处理，发病率也低于④不浸泡的处理，是因为溶液稀释了沾取在剪刀上的病毒浓度，降低了侵染力。

实施例7Ba制剂的温室和大田防效

温室防效：3-4叶期普通烟NC89(三生NN烟)，喷施Ba制剂150倍稀释液3次，间隔6天，末次喷施后6h接种160倍TMV稀释液。NC89每处理25株，2次重复，15d后调查病情指数。三生NN烟，每处理10株，2次重复，调查枯斑抑制率，结果表7、8所示。

大田防效：普通烟NC89，移栽在即墨试验农场，移栽后1周叶面喷雾150倍稀释液，间隔1周，连续喷雾3次，每处理40株，3次重复，以宁南霉素为对照药剂，以清水为空白对照。调查病情指数，结果如表9所示。

表7Ba制剂在NC89对TMV的温室防效(病情指数)

表8Ba制剂在三生NN对TMV的温室防效(枯斑抑制率)

表9Ba对TMV的大田防效

通过表8、表9看出，普通烟NC89和三生NN烟，连续喷施Ba制剂能提高植株对TMV的抗性。Ba处理NC89的病情指数为20.23，低于CK处理43.56，抑制率为53.56％；Ba处理三生NN烟的平均枯斑数为14.65，低于CK处理79.75，枯斑抑制率为81.63％。

通过表10大田试验看出，Ba制剂对TMV的大田平均病指为17.40，与宁南霉素500倍的病指17.18无显著差异，而显著低于清水对照的病指34.18，防效为49.09％。

实施例7菌体制剂的稳定性试验

Ba制剂，室温下放置，每隔30d，稀释150倍，与TMV等体积混合，温室接种三生NN烟，检测对病毒的枯斑抑制率，结果如表11所示。

表11Ba制剂室温下活性降解规律

时间	30d	60d	90d	120d	135d	180d	210d	240d	270d	300d	330d	360d
													Ba枯斑数	5	7	13	14	10	23	31	35	45	40	60	74
CK枯斑数	86	93	84	105	110	99	86	89	112	88	96	120
													抑制率	94.19	92.47	84.52	86.67	90.91	76.77	63.95	60.67	59.82	54.55	37.5	38.33

通过表11看出，Ba制剂在室温下保存，随着时间的延长，活性逐渐降解，保存6个月，活性降解为76.77％，保存8个月，仍有60.67％的活性，保存12个月，对TMV的活性下降到38.33％。说明，Ba制剂在室温下，降解缓慢，可能主要是形成了芽孢，易于贮存和运输，具有开发为生防制剂的潜质。

Claims

1.一种抗植物病毒病Ba制剂，其特征在于，是由以下组分组成的：解淀粉芽孢杆菌Ba培养液和硅藻土，其中，解淀粉芽孢杆菌Ba培养液中，Ba的活菌数为1000亿cfu/ml，硅藻土的质量占制剂总质量的8％；所述解淀粉芽孢杆菌Ba命名为Bacillus amyloliquefaciens，已于2010年08月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNO.4127。

2.权利要求1所述的一种抗植物病毒病Ba制剂在防治作物病毒病中的应用。

3.权利要求1所述的一种抗植物病毒病Ba制剂在促进作物生长中的应用。