CN103937727A - 一种抗烟草普通花叶病毒的解淀粉芽孢杆菌 - Google Patents

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一种抗烟草普通花叶病毒的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Z5菌株，已于2014年3月24日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2014102。本发明菌株Z5的发酵液对烟草普通花叶病毒(TMV)具有抑制作用，利用局部枯斑法测得其无菌发酵液对TMV体外抑制率达到96％以上；利用上述发酵液沉淀制得的粗蛋白液对烟草普通花叶病毒同样具有抑制作用，抗病毒效果佳，田间防效较为显著，能有效降低烟草普通花叶病毒的发生。

Description

一种抗烟草普通花叶病毒的解淀粉芽孢杆菌
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种抗烟草普通花叶病毒的解淀粉芽孢杆菌，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Z5菌株，同时涉及由该菌株发酵液得到的拮抗粗蛋白成分在烟草普通花叶病毒防治方面的应用。
背景技术
烟草普通花叶病毒(Tobacco mosaic virus，简称TMV)，是目前为止在烟草生产上分布最广且发生普遍的一大类病害。我国已发现的烟草病毒病有16种，其中TMV、CMV、PVY等3种病毒是引致烟草花叶病的主要病毒。它们能在植物细胞中寄生、复制，所需的物质、能量和场所也来源于寄主。烟草感染病毒后，叶绿素被破坏，光合作用减弱，叶片生长受抑制，防治较为困难，减产幅度为20％-80％，全球每年烟草花叶病毒造成的损失可达1亿多美元。
近年来，由于农作物布局的改变以及蔬菜等经济作物的发展，导致病毒毒源作物和传播介体的数量增加，增加了病毒的侵染和危害，使其危害呈逐年上升的趋势，给烟叶生产造成巨大的损失，病毒病已成为目前烟草生产的主要限制因子。
长期以来，防治病毒病以化学防治和培育抗病毒品种为主，在化学药剂防治方面，目前令人满意的抗植物病毒剂实用化品种还不多，尤其特效的治疗性药剂更少，所报道的药剂在田间实际应用防效大多在60％以下。而且化学防治也存在着许多的问题，大量施用化学农药，造成农药残留、食品安全、有害生物再猖獗和严重的生态环境污染问题。选育抗病品种被认为是防治烟草花叶病毒病的经济而有效的途径。但目前尚无优质高抗的品种可以大面积推广。
生物防治因其活性物质源于自然，使用成本低、不杀伤天敌、无残留、病虫害不易产生抗药性，与环境的相容性高，对人畜较安全，符合绿色无公害烟叶生产的要求。
自1926年Mulvania发现被细菌污染的植物病毒会丧失侵染能力后，微生物及其代谢产物对TMV的抑制作用的研究迅速发展起来并取得了不少成果。因此本发明将从生物防治方面进行探索，筛选出对TMV具有拮抗作用的生防菌并进行室内盆栽试验，对其拮抗活性物质、拮抗作用方式、大田拮抗效果进行较为深入的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗烟草普通花叶病毒的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Z5菌株，为烟草普通花叶病毒的生物防治提供新的微生物资源。
本发明所述的解淀粉芽孢杆菌Z5(Bacillus amyloliquefaciens)Z5菌株，已于2014年3月24日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2014102。
本发明的菌株Z5具有如下特性：
本发明的菌株Z5于28℃在NA培养基平板上生长，菌落呈白色不透明，无光泽，边缘不规则，结合参见图1，初期水渍状、较粘，后期褶皱状。革兰氏染色阳性，内生芽孢(见图2A)，具荚膜(见图2B)和鞭毛(见图2C)，为两端钝圆的短杆状菌体。
提取本发明菌株的细菌基因组DNA，16S rDNA片段采用通用引物27F/1492R进行PCR扩增，扩增片段由上海生物工程有限公司测序，测得的序列于NCBI上进行同源性比较。结果显示其16S rDNA序列与解淀粉芽孢杆菌同源性最高，达到98％以上。经Biolog检测，拮抗菌株Z5与Bacillus amyloliquefaciens B相似性为0.543，远大于其他菌株相似度，符合鉴定条件。通过形态观察和ITS序列分子鉴定，确定本发明菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的一新种，命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)Z5菌株。
将本发明的菌株Z5以4-5％接种重量接入NB培养基中发酵培养可制得发酵液，发酵培养条件为：温度28-37℃、pH6.5-7.5、时间48-72h及转速150-220r/min，最佳发酵培养条件为：温度32℃、pH7.0、时间64h及转速180r/min。该发酵液对烟草普通花叶病毒(TMV)具有抑制作用，利用局部枯斑法测得其无菌发酵液对TMV体外抑制率达到96％以上；涂抹菌液6h和24h后预防效果仍有71.43％和42.86％，但治疗作用微小。
利用上述发酵液沉淀可制得粗蛋白液，该粗蛋白液对烟草普通花叶病毒具有抑制作用，粗蛋白液抗病毒效果为87.21％；田间防效较为显著，能有效降低烟草普通花叶病毒的发生。
附图说明
图1是本发明的菌株Z5的单菌落图。
图2是本发明的菌株Z5的芽孢、荚膜和鞭毛图。
其中，A：芽孢；B：荚膜；C：鞭毛。
图3为本发明菌株Z5无菌发酵液对TMV的拮抗效果图。
其中，A：对照组；B：处理组。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步地详细说明。
实施例1
从湖南省长沙市湖南农业大学烟草基地取表土以下5cm处发病烟草根基土壤500g，称取供试土壤5g放入盛有45ml无菌水的三角瓶中，震荡1h后，28℃恒温培养箱孵育静置过夜。抽滤除去沉淀，即为10-1菌悬液。用无菌水将菌悬液按10-2、10-3、10-4、10-5、10-6进行梯度稀释后，分别涂布于NA培养基中，在28℃恒温培养箱倒置培养1d，观察菌落生长情况，及时挑取不同单菌落划线纯化2-3次，即得本发明菌株，-80℃保存。
实施例2本发明菌株Z5对烟草普通花叶病毒的抑制作用
挑取本发明菌株Z5以4％接种重量接种到25ml NB培养基中，32℃，180r/min培养64h，所得发酵液于10500r/min离心15min除去菌体，细菌过滤器(0.45um)过滤得无菌发酵液。
取TMV感病干叶片0.1g研磨成匀浆，按1:200(W/V)加入PBS缓冲液配制成20倍病毒接种液。选取健康、长势一致4-6叶期心叶烟进行摩擦接种，左半叶接种NB培养基与病毒等体积混合液为对照组，右半叶接种无菌发酵液与病毒液等体积混合为处理组(混合时间均为10min)，接种5min后用水喷洒叶面。每株接种3-5个叶片，重复3次，每天喷水2-3次。3d后统计枯斑个数，计算抑制率，结果见下表1，并结合参见图3。
与TMV作用方式：采用局部枯斑法，设钝化作用(10min)；预防和治疗作用(6h、24h)三个处理。
抑制率＝(对照枯斑数-处理枯斑数)/对照枯斑数×100％。
表1本发明菌株Z5发酵液对烟草普通花叶病毒的抑制作用
由上表可知，与TMV作用是表现出明显的钝化作用，体外钝化10min的抑制率为96.57％，分别涂抹无菌发酵液6h和24h后接种TMV病毒液，其预防作用为71.43％和42.86％，分别接种病毒6h和24h后涂抹发酵液，治疗作用分别为45％和20.33％。
实施例3本发明菌株Z5的发酵上清液粗蛋白抗TMV活性检测
按100：56.1(V/W)于冰水浴中向无菌发酵液中缓慢加入硫酸铵，边加边搅拌，沉淀发酵液中的蛋白，4℃静置12h，8000r/min，4℃离心15min，PBS溶解沉淀，然后置于透析袋中(截留分子量：8000-14000)，透析除盐得粗蛋白液(由于是采用常规硫酸铵沉淀蛋白质的方法，加入硫酸铵后于发酵液中析出了物质，也就说明析出的物质应该是粗蛋白质)。
以上述粗蛋白液、无菌发酵液及去蛋白液分别处理TMV感病干叶片，结果见下表2。可知，相比无菌发酵液来说，粗蛋白液抗病毒效果有所降低，只有87.21％。但远比去蛋白液26.32％高，据此可初步确定本发明菌株Z5抗TMV有效成分为蛋白类。
表2本发明菌株Z5提取的粗蛋白成分对TMV的抑制作用
处理液 无菌发酵液 粗蛋白液 去蛋白液
抑制率 95.95％ 87.21％ 26.32％
实施例4本发明菌株Z5用于大田防治烟草普通花叶病毒(TMV)
湖南省长沙市宁乡烟草基地中历年发病较重的烟田，烟苗3月18日移栽，不覆盖地膜，行株距为1.2×0.5m。选取健康、长势、土壤肥力均等的K326烟株共12行，每行40株，自然发病。标记1-6行为空白组(喷施清水)，7-12行为处理组(喷施本发明菌株Z5发酵液，菌液浓度为6.1×106cfu/mL)。分别于2013年3月27日、4月1、4月5日用药3次，30d后，调查TMV发病率，结果见下表3。
调查各小区的烟株，按病情分级标准分级，计算各处理病情指数。病情分级标准及公式如下：
0级：全株无病；
1级：心叶脉明或轻微花叶或上部三分之一花叶但不变形，植株无明显矮化；
2级：三分之一至二分之一叶片花叶，或少数叶片变形、或主脉变黑，植株矮化为正常株高的三分之二以上；
3级：二分之一至三分之二叶片花叶，或变形或主侧脉坏死，或植株矮化为正常株高的二分之一至三分之二；
4级：全株叶片花叶，严重变形或坏死，矮化为正常株高的三分之一至二分之一。
表3本发明菌株Z5发酵液对TMV的田间防效
通过三次用药处理，于5月5日进行烟株发病情况调查。由上表3可知，本发明菌株Z5发酵液较清水CK不论是发病率还是病情指数都有所减弱，且防效较为显著。本发明菌株Z5发酵液对TMV田间防效达到52.01％。因此，本发明菌株Z5发酵液具有抗TMV有效成分，对TMV的防治有一定的参考价值。

Claims (9)

1.一种抗烟草普通花叶病毒的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)Z5菌株，于2014年3月24日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2014102。
2.如权利要求1所述的菌株在抑制烟草普通花叶病毒中的应用。
3.如权利要求1所述的菌株在防治烟草普通花叶病毒中的应用。
4.一种制备抗烟草普通花叶病毒发酵液的方法，其特征在于，该方法是将权利要求1所述的菌株以4-5％接种量接入NB培养基中发酵培养。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养条件为：温度28-37℃、pH6.5-7.5、时间48-72h及转速150-220r/min。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养条件为：温度32℃、pH7.0、时间64h及转速180r/min。
7.利用权利要求4-6中任一项所述的发酵液制得粗蛋白液。
8.如权利要求4-6中任一项所述的发酵液在抑制烟草普通花叶病毒中的应用。
9.如权利要求7所述的粗蛋白液在防治烟草普通花叶病毒中的应用。
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