CN105875652B - 一种防治烟草花叶病毒烟草花叶尔灭的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防治烟草花叶病毒烟草花叶尔灭的制备方法。其菌种组分为：光合菌5％、黑曲霉2％、细黄链霉菌3％、淡紫拟青霉2％、枯草芽孢杆菌15％、胶质芽孢杆菌15％、巨大芽孢杆菌15％、多粘芽孢杆菌10％、地衣芽孢杆菌10％、绿僵菌3％、蜡状芽孢杆菌15％、侧孢短芽孢杆菌5％；其制备方法为：先进行微生物试管斜面种子培养和微生物液体种子培养；再将液体种子接入发酵培养基中，通过液体发酵，获得大量的菌体及其代谢物即液体菌剂。由于本发明选用多种有益菌组合，采用科学培养、复配及同罐复合发酵工艺，因而具有原料成本低，生产工艺先进，菌剂质量高、防治效果好等优点。

Description

一种防治烟草花叶病毒烟草花叶尔灭的制备方法

技术领域：本发明属生物农药技术领域，涉及主要用于防治烟草、番茄、瓜类等多种作物的花叶病毒病的一种防治烟草花叶病毒烟草花叶尔灭的生物菌剂的制备方法。

背景技术：烟草花叶病在河南乃至全国大多数烟区发生较为普遍且日益严重，流行年份田间发病率能达到50％以上。烟草花叶病不仅影响烟草生长发育、降低烟叶产量，而且严重烟叶的外观质量和内在品质，降低烟农的经济效益，使烟叶的可利用性变差，已成为烟草生产的重大阻碍因素。预防和防治花叶病一直是烟草生产中的重大课题。对烟草花叶病的防治，国内外已做了大量研究，但目前，市场上推广的防治烟草花叶病的农药的防效均不甚理想。

由于植物病毒特殊的胞内寄生性，使病毒自身的增殖与寄主的代谢融为一体；加之植物缺乏完整的免疫系统，病毒一旦侵染植物，就可在植物细胞内无期限存活，直至寄主死亡。此外，植物病毒种类多，传播种类广以及存在转化成新型病毒和整合到寄主基因组的风险，也加大了植物病毒防治的难度。目前，除了免疫品种外，在植物病毒病的药剂防治上，国内外已经进行了多年的研究，虽然一些抗病毒药剂已经开始进入实用化阶段，但化学合成的药剂具有周期长、成本高、毒性大、环境污染严重等特点，远远不能满足农业可持续发展的要求。而且长期连续高剂量地施用单一的农药制剂，容易造成农药的残留、环境污染以及耐药性发展等问题。

在防治烟草普通花叶病的生产应用中，烟农把烟草花叶病称为“烟癌”，常用抗生素药物化学防治，防治效果比较差，同时造成二次污染。目前国内大多数复合菌产品都是单菌培养，最终再混合在一起的勾兑混合菌产品，对于混合菌施入土壤后的共生、互生情况，了解的不够，或者经混合后的“复合菌”本身就拮抗，所以造成防治效果差或者施入土壤后的“复合菌”之间相互拮抗，互相残杀，造成根系有益菌减少，防效降低。

发明内容：本发明的目的正是针对上述现有技术所存在问题而提供发明目的在于提供一种采用国内外先进的液体深层发酵技术，科学配方，博采众长，非常巧妙地将以上十二种有益微生物混菌同罐发酵复合培养，使他们互不拮抗，互生或共存，在发酵罐中和谐生长，混合菌系中微生物之间协同或抑制，提高烟株的抗病能力、达到防治烟草普通花叶病良好效果的一种防治烟草花叶病毒烟草花叶尔灭的生物菌剂的制备方法。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案是：一种防治烟草花叶病毒烟草花叶尔灭的生物菌剂的制备方法。的菌种组分为：光合菌5％、黑曲霉2％、细黄链霉菌3％、淡紫拟青霉2％、枯草芽孢杆菌15％、胶质芽孢杆菌15％、巨大芽孢杆菌15％、多粘芽孢杆菌10％、地衣芽孢杆菌10％、绿僵菌3％、蜡状芽孢杆菌15％、侧孢短芽孢杆菌5％；其制备方法为：先进行微生物试管斜面种子培养和微生物液体种子培养；再将液体种子接入发酵培养基中，通过液体发酵，获得大量的菌体及其代谢物即液体菌剂。

本发明的有益效果是：由于采用国内外先进的液体深层发酵技术，科学配方，博采众长，配方独特，非常巧妙地将以上十二种有益微生物混菌同罐发酵复合培养，使他们互不拮抗，互生或共存，在发酵罐中和谐生长。施入土壤后，成为优势菌群，协同抗“敌”，对烟株和土壤无毒无害，防效明显，防治效果达85％以上。共同享用一种复合培养基，从而降低生产成本，与同行业的产品相比，节约十倍以上的成本，且绿色环保。

由于利用有益微生物的生长繁殖和生命活动中产生的多种酶系和抗生物质，在烟草根际土壤及植株叶片微生态系统形成优势种群，限制了其它病原微生物的繁殖机会，同时可诱导植物的过氧化酶，多酚氧化酶，葡聚糖酶等参与烟草植株对有害微生物的防御反应，增强烟草的自身免疫力，并对烟草“普通花叶病”病毒有较好的抗性。另一方面，“烟草花叶尔灭”菌剂施入土壤后，迅速繁殖，成为优势菌群；控制了烟草根际的营养和其它资源，致使病原微生物在相当程度上丧失生存空间和条件，使烟草有关组织、细胞壁增厚、纤维化、木质化程度提高，并在表皮层外形成角质的双层硅层，形成一道阻止烟草花叶病毒侵袭的屏障，并使烟草花叶病菌失去活性和生存空间、阻止烟草普通花叶病病毒“核酸和蛋白质”的重组，从而提高烟株的抗病能力，达到防治烟草普通花叶病良好效果。本菌剂含有丰富的有机碳源、氮源、磷源和微生物在生命活动中产生的氨基酸、活性肽、生长素、赤霉素、吲哚乙酸、多种维生素等，同时产生调节刺激植物生长的活性物质，烟草吸收后，结合自身的碳源、氮源促进光合代谢、植株通过自我调节而健壮，提高烟株抗逆能力和抗旱能力。

本发明的菌种来源简要说明：

本发明所采用的菌种，均购买于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，并于2015年01月09日和中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心签订了微生物遗传资源提供利用协议书(CGMCC/2007/4.00附录1)及数据利用协议(CGMCC/2007/4.00附录2)。

具体实施方式：实施例1：一种防治烟草花叶病毒烟草花叶尔灭的制备方法的菌种组分为：光合菌5％、黑曲霉2％、细黄链霉菌3％、淡紫拟青霉2％、枯草芽孢杆菌15％、胶质芽孢杆菌15％、巨大芽孢杆菌15％、多粘芽孢杆菌10％、地衣芽孢杆菌10％、绿僵菌3％、蜡状芽孢杆菌15％、侧孢短芽孢杆菌5％；其制备方法为：先进行微生物试管斜面种子培养和微生物液体种子培养；再将液体种子接入发酵培养基中，通过液体发酵，获得大量的菌体及其代谢物即液体菌剂。

实施例2：所述一种防治烟草花叶病毒烟草花叶尔灭的制备方法为：①斜面培养：将上述原始菌种在无菌条件下分别接种于对应的培养基上活化，使用的斜面培养基为培养黑曲霉、绿僵菌、淡紫拟青霉的PDA-葡萄糖培养基，培养温度设定在28℃条件下培养4天、培养枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌的营养琼脂培养基培养温度设在30℃培养3天、培养细黄链霉菌的高氏一号培养基控制培养温度30℃培养5天，牛肉膏蛋白胨培养基加10g/L葡萄糖培养光合细菌温度设在34℃培养3天；

②种子培养：将斜面培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体扩增培养基中，液体扩增培养基有培养黑曲霉、绿僵菌、淡紫拟青霉的PDA-葡萄糖培养基，培养温度设定在28℃条件下150r/min摇床中培养2天，培养细黄链霉菌的高氏一号培养基，培养温度设定在30℃条件下150r/min摇床中培养2天，培养枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌的营养琼脂培养基，培养温度设在30℃条件下150r/min摇床中培养1天，牛肉膏蛋白胨培养基加10g/L葡萄糖培养光合细菌温度设在34℃条件下150r/min摇床中培养1天；

③发酵培养基培养：采用液体混菌发酵培养，按配比制备的摇床种子按5-10％接入发酵培养基中混菌培养，发酵培养基配比为：红糖0.6％、葡萄糖0.3％、玉米淀粉1.8％、豆粕粉1.5％、硫酸镁0.03％、尿素0.12％、磷酸二氢钾0.04％、蛋白胨0.1％、酵母粉0.05％、碳酸钠调节pH7.0、微量元素液5mL；培养条件：接种量5-10％，培养温度控制30℃，转速150-200r/min，通气量1∶0.5-0.8，发酵培养18-30小时，经检测有效活菌数120亿/ml即为液体菌剂。

实施例3：所述的一种防治烟草花叶病毒烟草花叶尔灭制备方法为：

①斜面培养：将上述原始菌种在无菌条件下分别接种于对应的培养基上活化，使用的斜面培养基为培养黑曲霉、绿僵菌、淡紫拟青霉的PDA-葡萄糖培养基，培养温度设定在28℃条件下培养4天、培养枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌的营养琼脂培养基设定在28℃条件下培养4天、培养枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌的营养琼脂培养基培养温度设在30℃培养3天、培养细黄链霉菌的高氏一号培养基控制培养温度30℃培养5天，牛肉膏蛋白胨培养基加10g/L葡萄糖培养光合细菌温度设在34℃培养3天；

②种子培养：将斜面培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体扩增培养基中，液体扩增培养基有培养黑曲霉、绿僵菌、淡紫拟青霉的PDA-葡萄糖培养基，培养温度设定在28℃条件下150r/min摇床中培养2天，培养细黄链霉菌的高氏一号培养基，培养温度设定在30℃条件下150r/min摇床中培养2天，培养枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌的营养琼脂培养基，培养温度设在30℃条件下150r/min摇床中培养1天，牛肉膏蛋白胨培养基加10g/L葡萄糖培养光合细菌温度设在30℃条件下180r/min摇床中培养1天。

种子液按体积比配置比：光合菌5％；黑曲霉2％；细黄链霉菌3％；淡紫拟青霉2％；枯草芽孢杆菌15％；胶质芽孢杆菌15％；巨大芽孢杆菌15％；多粘芽孢杆菌10％；地衣芽孢杆菌10％；绿僵菌3％；蜡状芽孢杆菌15％；侧孢短芽孢杆菌5％。

③发酵培养基培养：把培养好的液体种子在无菌条件下接到经高压灭菌的发酵培养基中，接种量为5％。发酵培养基组成：红糖0.6％；葡萄糖0.3％；玉米淀粉1.8％；豆粕粉1.5％；硫酸镁0.03％；尿素0.12％；磷酸二氢钾0.04％；蛋白胨0.1％；酵母粉0.05％；碳酸钠调节PH7.0。微量元素液：5mL。培养条件：培养温度控制在30℃，转速180r/min，通气量1∶0.5，发酵培养28小时经检测有效活菌数110亿/ml即为烟草花叶尔灭的液体菌剂。

实施例4：所述一种防治烟草花叶病毒烟草花叶尔灭的制备方法的微生物菌体发酵制备好以后作为液体菌剂直接使用。

所述一种防治烟草花叶病毒烟草花叶尔灭的制备方法的生物菌剂含量和发酵液的液体菌剂含量≥100亿/ml。

实施例5：所述一种防治烟草花叶病毒烟草花叶尔灭的制备方法的田间效果试验为：

1、材料和方法

①参试品种为云烟87

②试验地点基本情况

试验在社旗县苗店镇进行，年日照总时数平均为2003.8小时，年平均气温14.8℃。全年无霜期226天，年平均降水量838.11mm，土壤类型为黄褐土，肥力中等，有灌溉条件。

③试验设计

试验设3个处理，3次重复，随机区组排列，共9个小区，小区面积0.2亩，各小区留2行保护行，需土地2亩。各处理于4月23日移栽，行距120cm，株距55cm。田间栽培管理按当地最佳措施进行。处理如下：

CK，对照，常规栽培，不用抗病毒制剂。

T1，常规栽培，在移栽时和团棵期喷施20％盐酸吗啉胍可湿性粉剂。

T2移栽+团棵期使用烟草花叶尔灭。移栽时使用烟草花叶尔灭2L，稀释50倍，于有机肥拌匀后，在移栽时穴施。于移栽后30d将烟草花叶尔灭制剂稀释700倍叶面喷施一次。

2、试验结果与分析：

①不同处理对烟株农艺性状的影响

②烟草花叶而灭防治花叶病效果

③不同处理烤烟经济性状分析

初步研究表明，与对照和施用盐酸吗啉胍抗病毒制剂相比，施用烟草花叶尔灭对烟株的田间长势影响不大，但能够增大烟叶的长和宽，提高烟叶产量。对花叶病的防效高于盐酸吗啉胍。施用烟草花叶尔灭，能提高烤烟上等烟比例、均价和产值，烟叶产量、上等烟比例、均价和产值显著高于对照和施用盐酸吗啉胍处理。

3、使用方法为：在烟草育苗时拌基质或移栽时穴施使用，移栽后和团棵期在烟草花叶病将进入发病期时叶面喷施施用。利用本发明生产的菌剂对烟草花叶病毒有很好的防治效果。①烟苗在移栽后5-7d，将烟草花叶尔灭菌剂稀释100-150倍喷施一次，烟草团棵期将菌剂稀释100-150倍再喷施一遍；②稀释50倍与腐熟好的有机肥等混匀在烟草育苗时拌基质或移栽时穴施使用。

2012年至2013年在洛阳市洛宁县豫西烟草科技园进行多次试验，2013年在云南省文山州麻栗坡烟草实验基地进行多点实验，2014年又在国家烟草栽培生理生化研究基地：河南省南阳市社旗县、河南省许昌市襄城县进行重点试验。对防治烟草普通花叶病效果明显，特别在2014年严重干旱导致烤烟花叶病发生较为严重的情况下，施用“烟草花叶尔灭”菌剂显著降低了烟草花叶病发病率和病情指数，提高烟株的抗旱性，促进烤烟旺长期的生长及叶片开展(能够增大烟叶的长和宽)。显著提高了烤烟的产量、上等烟比列和产值。经试验花叶尔灭对烟草花叶病的防效高于盐酸吗啉胍等化学试剂。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种防治烟草花叶病毒烟草花叶尔灭的制备方法，其特征在于：其菌种组分为：光合菌5％、黑曲霉2％、细黄链霉菌3％、淡紫拟青霉2％、枯草芽孢杆菌15％、胶质芽孢杆菌15％、巨大芽孢杆菌15％、多粘芽孢杆菌10％、地衣芽孢杆菌10％、绿僵菌3％、蜡状芽孢杆菌15％、侧孢短芽孢杆菌5％；其制备方法为：先进行微生物试管斜面种子培养和微生物液体种子培养；再将液体种子接入发酵培养基中，通过液体发酵，获得大量的菌体及其代谢物即液体菌剂。

2.根据权利要求1所述的一种防治烟草花叶病毒烟草花叶尔灭的制备方法，其特征是：所述的制备方法为：①斜面培养：将上述原始菌种在无菌条件下分别接种于对应的培养基上活化，使用的斜面培养基为培养黑曲霉、绿僵菌、淡紫拟青霉的PDA-葡萄糖培养基，培养温度设定在28℃条件下培养4天、培养枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌的营养琼脂培养基培养温度设在30℃培养3天、培养细黄链霉菌的高氏一号培养基控制培养温度30℃培养5天，牛肉膏蛋白胨培养基加10g/L葡萄糖培养光合细菌温度设在34℃培养3天；

②种子培养：将斜面培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体扩增培养基中，液体扩增培养基有培养黑曲霉、绿僵菌、淡紫拟青霉的PDA-葡萄糖培养基，培养温度设定在28℃条件下150r/min摇床中培养2天，培养细黄链霉菌的高氏一号培养基，培养温度设定在30℃条件下150r/min摇床中培养2天，培养枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌的营养琼脂培养基，培养温度设在30℃条件下150r/min摇床中培养1天，牛肉膏蛋白胨培养基加10g/L葡萄糖培养光合细菌温度设在34℃条件下150r/min摇床中培养1天；

③发酵培养基培养：采用液体混菌发酵培养，按配比制备的摇床种子按5-10％接入发酵培养基中混菌培养，发酵培养基配比为：红糖0.6％、葡萄糖0.3％、玉米淀粉1.8％、豆粕粉1.5％、硫酸镁0.03％、尿素0.12％、磷酸二氢钾0.04％、蛋白胨0.1％、酵母粉0.05％、碳酸钠调节pH7.0、微量元素液5mL；培养条件：接种量5-10％，培养温度控制30℃，转速150-200r/min，通气量1∶0.5-0.8，发酵培养18-30小时，经检测有效活菌数120亿/ml即为液体菌剂。

3.根据权利要求1或2所述的一种防治烟草花叶病毒烟草花叶尔灭的制备方法，其特征是：所述的微生物菌体发酵制备好以后作为液体菌剂直接使用。

4.根据权利要求1或2所述的一种防治烟草花叶病毒烟草花叶尔灭的制备方法，其特征是：所述的生物菌剂含量和发酵液的液体菌剂含量≥100亿/ml。