CN107646878A - 防治烟草花叶病毒的菌剂及其制备方法 - Google Patents

防治烟草花叶病毒的菌剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物农药技术领域，尤其涉及一种防治烟草花叶病毒的菌剂及其制备方法，包括以下步骤：A：斜面培养，将菌种烟曲霉、绿色木霉、毕赤酵母、哈茨木霉在不同培养基中斜面培养，B：液体种子培养，将A步骤斜面培养的菌种进行液体环境下在培养基中培养种子液；C：种子液配比，将B步骤的种子也配比；D：制取发酵培养基，原料为：糖蜜，葡萄糖，玉米淀粉，豆粕粉，硫酸镁，木醋酸，尿素，磷酸二氢钾，蛋白胨，酵母粉，余量为水；E：将步骤C的液体种子接种于D步骤的发酵培养基中，进行配置菌剂；F：将步骤E中的菌剂配置成固体粉剂；本发明采用液体深层发酵技术，将有益微生物混菌同罐发酵复合培养，提高了防治效果。

Description

防治烟草花叶病毒的菌剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物农药技术领域，尤其涉及一种防治烟草花叶病毒的菌剂及其制备方法。
背景技术
烟草花叶病在河南乃至全国大多数烟区发生较为普遍且日益严重，流行年份田间发病率达到50%以上，烟草花叶病不仅影响烟草生长发育、降低烟叶产量，而且严重烟叶的外观质量和内在品质，降低烟农的经济效益，使烟叶的可利用性变差，已成为烟草生产的重大阻碍因素。预防和防治花叶病一直是烟草生产中的重大课题。对烟草花叶病的防治，国内外已做了大量研究，但目前，市场上推广的防治烟草花叶病的农药效果均不理想。
由于植物病毒特殊的胞内寄生性，使病毒自身的增殖与寄生的代谢融为一体，加之植物缺乏完整的免疫系统，病毒一旦侵染植物，就可在植物细胞内无期限存活，直至寄生主死亡。此外，植物病毒种类多，传播种类广，存在转化转化成新型病毒和整合到寄主基因组的风险，加大了植物病毒防治的难度。目前，除了免疫品种外，在植物病毒的药剂防治上，国内外已经进行了多年的研究，虽然一些抗病毒药剂已经开始进入使用化阶段，但化学合成的药剂具有周期长、成本高、毒性大、环境污染严重等特点，远远不能满足农业可持续发展的要求，而且长期连续高剂量的施用单一的抗病毒农药制剂，容易造成农药的残留、环境二次污染以及耐药性发展等问题，人们尚未开发出对病毒有高度的选择性而对寄主五毒或低度的理想制剂。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足， 避免对烟草花叶病毒的防治不够理想，而提供给了一种防治烟草花叶病毒的菌剂的制备方法，本发明采用液体深层发酵技术，将有益微生物混菌同罐发酵复合培养，最终达到良好的防治烟草花叶病毒的效果。
本发明的目的是通过如下措施来实现的：一种防治烟草花叶病毒的菌剂的制备方法，包括以下步骤：
A：斜面培养，将菌种烟曲霉、绿色木霉、毕赤酵母、哈茨木霉在无菌条件下分别接种于PDA-葡萄糖培养基中，进行斜面培养，温度设定在28℃-30℃，培养4-5天；将菌种荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、球形芽孢杆菌在无菌条件下分别接种于营养琼脂培养基中，进行斜面培养，温度设定在30℃-34℃，培养2-3天；将菌种抗生链霉菌接种于高氏一号培养基中进行斜面培养，温度设定在30℃-34℃，培养2-3天；将菌种沼泽红假单胞菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，并加入牛肉膏蛋白胨培养基体积的1.8%-2.2%浓度为10g/L的葡萄糖进行斜面培养，温度设定在30℃-34℃，培养3-4天，备用；
B：液体种子培养，将A步骤斜面培养的菌种烟曲霉、绿色木霉、毕赤酵母、哈茨木霉在无菌条件下分别接种于装有PDA-葡萄糖培养基的液体三角瓶中，温度设定在28℃-30℃，置于140-160r/min的摇床中培养1-2天；将A步骤斜面培养的菌种荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、球形芽孢杆菌在无菌条件下分别接种于装有营养琼脂培养基的液体三角瓶中，温度设定在30℃-34℃，置于140-160r/min的摇床中培养1-2天；将A步骤斜面培养的菌种抗生链霉菌在无菌条件下接种于装有高氏一号培养基的液体三角瓶中，温度设定在28℃-30℃，置于140-160r/min的摇床中培养1-2天；将A步骤斜面培养的菌种沼泽红假单胞菌在无菌条件下接种于装有牛肉膏蛋白胨培养基的液体三角瓶中，并加入牛肉膏蛋白胨培养基体积的1.8%-2.2%浓度为10g/L葡萄糖进行培养，温度设定在30℃-34℃，置于140-160r/min的摇床中培养2-3天；
C：种子液配比，将B步骤中培养出的种子液按照如下重量百分比进行称量：沼泽红假单胞菌3%-7%，烟曲霉1%-3%，抗生链霉菌2%-4%，荧光假单胞菌1%-3%，枯草芽孢杆菌13%-17%，胶质芽孢杆菌8%-12%，巨大芽孢杆菌8%-12%，多黏芽孢杆菌8%-12%，地衣芽孢杆菌8%-12%，绿色木霉2%-4%，蜡状芽孢杆菌8%-12%，侧孢短芽孢杆菌3%-7%，球形芽孢杆菌3%-7%，毕赤酵母3%-7%，哈茨木霉3%-7%；
D：制取发酵培养基，将发酵罐在80-100℃条件下烘干灭菌处理30-50min，然后按照以下体积百分数向发酵罐中置入原料：糖蜜0.8%-1.4%，葡萄糖0.6%-1.0%，玉米淀粉1.4%-1.8%，豆粕粉1.3%-1.7%，硫酸镁0.02%-0.04%，木醋酸1.3%-1.7%，尿素0.1%-0.14%，磷酸二氢钾0.03%-0.05%，蛋白胨0.08%-0.12%，酵母粉0.03%-0.07%，余量为水，再向发酵罐中滴入占发酵培养基总体积0.05%-0.07%的微量元素营养液，在110-130℃环境下对发酵培养基进行灭菌处理30-90min，最后将发酵培养基冷却至25-35℃，备用；
E：配制液体菌剂，将步骤D制取好的发酵培养基PH调至PH7.0，将步骤C中配比好的液体种子与步骤D制取好的发酵培养基接种到液体发酵罐中，接种量为8%-12%，接种条件为：培养温度为28℃-30℃，转速150-200r/min，液体种子与发酵培养基通气量为1：0.5-0.8，发酵培养24-36小时，即得液体菌剂；
F：固体粉剂制备：步骤D制备好的液体菌剂作为原药，与粉碎的灭菌有机肥、白炭黑做载体混合，载体有机肥和白炭黑的比例为2.7-3.3:1，混合后产物放入干燥室进行常温风干干燥至水分低于8%进行粉碎，粉碎至70-85目，包装即得固体粉状生物菌剂。
基于以上技术方案，防治烟草花叶病毒的菌剂的制备方法，包括如下步骤：
A：斜面培养，将菌种烟曲霉、绿色木霉、毕赤酵母、哈茨木霉在无菌条件下分别接种于PDA-葡萄糖培养基中，进行斜面培养，温度设定在28℃，培养4天；将菌种荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、球形芽孢杆菌在无菌条件下分别接种于营养琼脂培养基中，进行斜面培养，温度设定在30℃，培养3天；将菌种抗生链霉菌接种于高氏一号培养基中进行斜面培养，温度设定在34℃，培养3天；将菌种沼泽红假单胞菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，并加入牛肉膏蛋白胨培养基体积的2%浓度为10g/L的葡萄糖进行斜面培养，温度设定在32℃，培养3天，备用；
B：液体种子培养，将A步骤斜面培养的菌种烟曲霉、绿色木霉、毕赤酵母、哈茨木霉在无菌条件下分别接种于装有PDA-葡萄糖培养基的液体三角瓶中，温度设定在28℃，置于150r/min的摇床中培养2天；将A步骤斜面培养的菌种荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、球形芽孢杆菌在无菌条件下分别接种于装有营养琼脂培养基的液体三角瓶中，温度设定在30℃，置于150r/min的摇床中培养2天；将A步骤斜面培养的菌种抗生链霉菌在无菌条件下接种于装有高氏一号培养基的液体三角瓶中，温度设定在29℃，置于150r/min的摇床中培养2天；将A步骤斜面培养的菌种沼泽红假单胞菌在无菌条件下接种于装有牛肉膏蛋白胨培养基的液体三角瓶中，并加入牛肉膏蛋白胨培养基体积的2.0%浓度为10g/L葡萄糖进行培养，温度设定在34℃，置于150r/min的摇床中培养2天；
C：种子液配比，将B步骤中培养出的种子液按照如下重量百分比进行称量：沼泽红假单胞菌3%-7%，烟曲霉1%-3%，抗生链霉菌2%-4%，荧光假单胞菌1%-3%，枯草芽孢杆菌13%-17%，胶质芽孢杆菌8%-12%，巨大芽孢杆菌8%-12%，多黏芽孢杆菌8%-12%，地衣芽孢杆菌8%-12%，绿色木霉2%-4%，蜡状芽孢杆菌8%-12%，侧孢短芽孢杆菌3%-7%，球形芽孢杆菌3%-7%，毕赤酵母3%-7%，哈茨木霉3%-7%；
D：制取发酵培养基，将发酵罐在90℃条件下烘干灭菌处理40 min，然后按照以下体积百分数向发酵罐中置入原料：糖蜜0.8%-1.4%，葡萄糖0.6%-1.0%，玉米淀粉1.4%-1.8%，豆粕粉1.3%-1.7%，硫酸镁0.02%-0.04%，木醋酸1.3%-1.7%，尿素0.1%-0.14%，磷酸二氢钾0.03%-0.05%，蛋白胨0.08%-0.12%，酵母粉0.03%-0.07%，余量为水，再向发酵罐中滴入占发酵培养基总体积0.06%的微量元素营养液，在120℃环境下对发酵培养基进行灭菌处理60min，最后将发酵培养基冷却至30℃，备用；
E：配制液体菌剂，将步骤D制取好的发酵培养基PH调至PH7.0，将步骤C中配比好的液体种子与步骤D制取好的发酵培养基接种到液体发酵罐中，接种量为10%，接种条件为：培养温度为29℃，转速180r/min，液体种子与发酵培养基通气量为1：0.6，发酵培养30小时，即得液体菌剂；
F：固体粉剂制备：步骤D制备好的液体菌剂作为原药，与粉碎的灭菌有机肥、白炭黑做载体混合，载体有机肥和白炭黑的比例为3:1，混合后产物放入干燥室进行常温风干干燥至水分低于8%进行粉碎，粉碎至80目，包装即得固体粉状生物菌剂。
基于以上技术方案，所述C步骤的种子配比的各菌种的百分比为：沼泽红假单胞菌5%，烟曲霉2%，抗生链霉菌3%，荧光假单胞菌2%，枯草芽孢杆菌15%，胶质芽孢杆菌10%，巨大芽孢杆菌10%，多黏芽孢杆菌10%，地衣芽孢杆菌10%，绿色木霉3%，蜡状芽孢杆菌10%，侧孢短芽孢杆菌5%，球形芽孢杆菌5%，毕赤酵母5%，哈茨木霉5%，所述D步骤同罐发酵的培养基的各组分百分比为：糖蜜1.2%，葡萄糖0.8%，玉米淀粉1.6%，豆粕粉1.5%，硫酸镁0.03%，木醋酸1.5%，尿素0.12%，磷酸二氢钾0.04%，蛋白胨0.1%，酵母粉0.05%，余量为水。
本发明的有益效果是：本发明的原料成本低，工艺简单，通过斜面培养、液体种子培养再发酵复合培养基，多重培养，将十五种有益微生物混菌同罐发酵复合培养，使他们互生或共存。
本发明中的利用有益微生物的生长繁殖和生命活动中生产的多种酶系和抗生物质，在烟草根际土壤及植株叶片微生态系统形成优势种群，限制了其它病原微生物的繁殖机会，同时可诱导植物的过氧化酶、多酚氧化酶、葡聚糖酶等参与烟草植株对有害微生物的防御反应，增强烟草的自身免疫力，并对烟草“普通花叶病”病毒有较好的抗性。本发明中的菌剂施入土壤后，迅速繁殖，成为优势菌群；控制了烟草根际的营养和其它资源，致使病原微生物在相当程度上丧失生存空间和条件；使烟草有关组织、细胞壁增厚，纤维化、木质化程度提高，并在表皮层外形成角质的双层硅层，形成一道阻止烟草普通花叶病毒侵袭的屏障，并使烟草花叶病菌失去活性和生存空间、组织烟草普通花叶病病毒“核酸和蛋白质”的重组，从而提高植株的抗病能力、达到防治烟草普通花叶病的良好效果。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明作进一步详述。
实施例1：一种防治烟草花叶病毒的菌剂的制备方法，包括以下步骤：
A：斜面培养，将菌种烟曲霉、绿色木霉、毕赤酵母、哈茨木霉在无菌条件下分别接种于PDA-葡萄糖培养基中，进行斜面培养，温度设定在28℃，培养4天；将菌种荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、球形芽孢杆菌在无菌条件下分别接种于营养琼脂培养基中，进行斜面培养，温度设定在30℃，培养2天；将菌种抗生链霉菌接种于高氏一号培养基中进行斜面培养，温度设定在30℃，培养2天；将菌种沼泽红假单胞菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，并加入牛肉膏蛋白胨培养基体积的1.8%浓度为10g/L的葡萄糖进行斜面培养，温度设定在30℃，培养3天，备用；
B：液体种子培养，将A步骤斜面培养的菌种烟曲霉、绿色木霉、毕赤酵母、哈茨木霉在无菌条件下分别接种于装有PDA-葡萄糖培养基的液体三角瓶中，温度设定在28℃，置于140r/min的摇床中培养1天；将A步骤斜面培养的菌种荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、球形芽孢杆菌在无菌条件下分别接种于装有营养琼脂培养基的液体三角瓶中，温度设定在30℃，置于140r/min的摇床中培养1天；将A步骤斜面培养的菌种抗生链霉菌在无菌条件下接种于装有高氏一号培养基的液体三角瓶中，温度设定在28℃，置于140r/min的摇床中培养1天；将A步骤斜面培养的菌种沼泽红假单胞菌在无菌条件下接种于装有牛肉膏蛋白胨培养基的液体三角瓶中，并加入牛肉膏蛋白胨培养基体积的1.8%浓度为10g/L葡萄糖进行培养，温度设定在30℃，置于140r/min的摇床中培养2天；
C：种子液配比，将B步骤中培养出的种子液按照重量进行称量如下百分比：沼泽红假单胞菌3%，烟曲霉1%，抗生链霉菌2%，荧光假单胞菌1%，枯草芽孢杆菌13%，胶质芽孢杆菌8%，巨大芽孢杆菌8%，多黏芽孢杆菌12%，地衣芽孢杆菌12%，绿色木霉4%，蜡状芽孢杆菌12%，侧孢短芽孢杆菌7%，球形芽孢杆菌7%，毕赤酵母7%，哈茨木霉3%；
D：制取发酵培养基，将发酵罐在80℃条件下烘干灭菌处理30min，然后按照以下体积百分数向发酵罐中置入原料：糖蜜0.8%，葡萄糖0.6%，玉米淀粉1.4%，豆粕粉1.3%，硫酸镁0.02%，木醋酸1.3%，尿素0.1%，磷酸二氢钾0.03%，蛋白胨0.08%，酵母粉0.03%，余量为水，再向发酵罐中滴入占发酵培养基总体积0.05%的微量元素营养液，在110℃环境下对发酵培养基进行灭菌处理30min，最后将发酵培养基冷却至25℃，备用；
E：配制液体菌剂，将步骤D制取好的发酵培养基PH调至PH7.0，将步骤C中配比好的液体种子与步骤D制取好的发酵培养基接种到液体发酵罐中，接种量为8%，接种条件为：培养温度为28℃，转速150r/min，液体种子与发酵培养基通气量为1：0.5，发酵培养24小时，即得液体菌剂；
F：固体粉剂制备：步骤D制备好的液体菌剂作为原药，与粉碎的灭菌有机肥、白炭黑做载体混合，载体有机肥和白炭黑的比例为2.7:1，混合后产物放入干燥室进行常温风干干燥至水分低于8%进行粉碎，粉碎至70目，包装即得固体粉状生物菌剂。
实施例2：一种防治烟草花叶病毒的菌剂的制备方法，包括以下步骤：
A：斜面培养，将菌种烟曲霉、绿色木霉、毕赤酵母、哈茨木霉在无菌条件下分别接种于PDA-葡萄糖培养基中，进行斜面培养，温度设定在30℃，培养5天；将菌种荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、球形芽孢杆菌在无菌条件下分别接种于营养琼脂培养基中，进行斜面培养，温度设定在34℃，培养3天；将菌种抗生链霉菌接种于高氏一号培养基中进行斜面培养，温度设定在34℃，培养3天；将菌种沼泽红假单胞菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，并加入牛肉膏蛋白胨培养基体积的2.2%浓度为10g/L的葡萄糖进行斜面培养，温度设定在34℃，培养4天，备用；
B：液体种子培养，将A步骤斜面培养的菌种烟曲霉、绿色木霉、毕赤酵母、哈茨木霉在无菌条件下分别接种于装有PDA-葡萄糖培养基的液体三角瓶中，温度设定在30℃，置于160r/min的摇床中培养2天；将A步骤斜面培养的菌种荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、球形芽孢杆菌在无菌条件下分别接种于装有营养琼脂培养基的液体三角瓶中，温度设定在34℃，置于160r/min的摇床中培养2天；将A步骤斜面培养的菌种抗生链霉菌在无菌条件下接种于装有高氏一号培养基的液体三角瓶中，温度设定在30℃，置于160r/min的摇床中培养2天；将A步骤斜面培养的菌种沼泽红假单胞菌在无菌条件下接种于装有牛肉膏蛋白胨培养基的液体三角瓶中，并加入牛肉膏蛋白胨培养基体积的2.2%浓度为10g/L葡萄糖进行培养，温度设定在34℃，置于160r/min的摇床中培养3天；
C：种子液配比，将B步骤中培养出的种子液按照如下重量百分比进行称量：沼泽红假单胞菌7%，烟曲霉3%，抗生链霉菌4%，荧光假单胞菌3%，枯草芽孢杆菌17%，胶质芽孢杆菌12%，巨大芽孢杆菌12%，多黏芽孢杆菌8%，地衣芽孢杆菌8%，绿色木霉2%，蜡状芽孢杆菌8%，侧孢短芽孢杆菌3%，球形芽孢杆菌3%，毕赤酵母3%，哈茨木霉7%；
D：制取发酵培养基，将发酵罐在100℃条件下烘干灭菌处理50min，然后按照以下体积百分数向发酵罐中置入原料：糖蜜1.4%，葡萄糖1.0%，玉米淀粉1.8%，豆粕粉1.7%，硫酸镁0.04%，木醋酸1.7%，尿素0.14%，磷酸二氢钾0.05%，蛋白胨0.12%，酵母粉0.07%，余量为水，再向发酵罐中滴入占发酵培养基总体积0.07%的微量元素营养液，在130℃环境下对发酵培养基进行灭菌处理90min，最后将发酵培养基冷却至35℃，备用；
E：配制液体菌剂，将步骤D制取好的发酵培养基PH调至PH7.0，将步骤C中配比好的液体种子与步骤D制取好的发酵培养基接种到液体发酵罐中，接种量为12%，接种条件为：培养温度为30℃，转速200r/min，液体种子与发酵培养基通气量为1：0.8，发酵培养36小时，即得液体菌剂；
F：固体粉剂制备：步骤D制备好的液体菌剂作为原药，与粉碎的灭菌有机肥、白炭黑做载体混合，载体有机肥和白炭黑的比例为3.3:1，混合后产物放入干燥室进行常温风干干燥至水分低于8%进行粉碎，粉碎至85目，包装即得固体粉状生物菌剂。
实施例3：一种防治烟草花叶病毒的菌剂的制备方法，包括以下步骤：
A：斜面培养，将菌种烟曲霉、绿色木霉、毕赤酵母、哈茨木霉在无菌条件下分别接种于PDA-葡萄糖培养基中，进行斜面培养，温度设定在28℃，培养4天；将菌种荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、球形芽孢杆菌在无菌条件下分别接种于营养琼脂培养基中，进行斜面培养，温度设定在30℃，培养3天；将菌种抗生链霉菌接种于高氏一号培养基中进行斜面培养，温度设定在34℃，培养3天；将菌种沼泽红假单胞菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，并加入牛肉膏蛋白胨培养基体积的2%浓度为10g/L的葡萄糖进行斜面培养，温度设定在32℃，培养3天，备用；
B：液体种子培养，将A步骤斜面培养的菌种烟曲霉、绿色木霉、毕赤酵母、哈茨木霉在无菌条件下分别接种于装有PDA-葡萄糖培养基的液体三角瓶中，温度设定在28℃，置于150r/min的摇床中培养2天；将A步骤斜面培养的菌种荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、球形芽孢杆菌在无菌条件下分别接种于装有营养琼脂培养基的液体三角瓶中，温度设定在30℃，置于150r/min的摇床中培养2天；将A步骤斜面培养的菌种抗生链霉菌在无菌条件下接种于装有高氏一号培养基的液体三角瓶中，温度设定在29℃，置于150r/min的摇床中培养2天；将A步骤斜面培养的菌种沼泽红假单胞菌在无菌条件下接种于装有牛肉膏蛋白胨培养基的液体三角瓶中，并加入牛肉膏蛋白胨培养基体积的2.0%浓度为10g/L葡萄糖进行培养，温度设定在34℃，置于150r/min的摇床中培养2天；
C：种子液配比，将B步骤中培养出的种子液按照如下重量百分比进行称量：沼泽红假单胞菌5%，烟曲霉2%，抗生链霉菌3%，荧光假单胞菌2%，枯草芽孢杆菌15%，胶质芽孢杆菌10%，巨大芽孢杆菌10%，多黏芽孢杆菌10%，地衣芽孢杆菌10%，绿色木霉3%，蜡状芽孢杆菌10%，侧孢短芽孢杆菌5%，球形芽孢杆菌5%，毕赤酵母5%，哈茨木霉5%；
D：制取发酵培养基，将发酵罐在90℃条件下烘干灭菌处理40 min，然后按照以下体积百分数向发酵罐中置入原料：糖蜜1.2%，葡萄糖0.8%，玉米淀粉1.6%，豆粕粉1.5%，硫酸镁0.03%，木醋酸1.5%，尿素0.12%，磷酸二氢钾0.04%，蛋白胨0.1%，酵母粉0.05%，余量为水，再向发酵罐中滴入占发酵培养基总体积0.06%的微量元素营养液，在120℃环境下对发酵培养基进行灭菌处理60min，最后将发酵培养基冷却至30℃，备用；
E：配制液体菌剂，将步骤D制取好的发酵培养基PH调至PH7.0，将步骤C中配比好的液体种子与步骤D制取好的发酵培养基接种到液体发酵罐中，接种量为10%，接种条件为：培养温度为29℃，转速180r/min，液体种子与发酵培养基通气量为1：0.6，发酵培养30小时，即得液体菌剂；
F：固体粉剂制备：步骤D制备好的液体菌剂作为原药，与粉碎的灭菌有机肥、白炭黑做载体混合，载体有机肥和白炭黑的比例为3:1，混合后产物放入干燥室进行常温风干干燥至水分低于8%进行粉碎，粉碎至80目，包装即得固体粉状生物菌剂。
实施例4：一种防治烟草花叶病毒的菌剂的制备方法，包括以下步骤：
A：斜面培养，将菌种烟曲霉、绿色木霉、毕赤酵母、哈茨木霉在无菌条件下分别接种于PDA-葡萄糖培养基中，进行斜面培养，温度设定在27℃，培养4天；将菌种荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、球形芽孢杆菌在无菌条件下分别接种于营养琼脂培养基中，进行斜面培养，温度设定在30℃，培养3天；将菌种抗生链霉菌接种于高氏一号培养基中进行斜面培养，温度设定在31℃，培养3天；将菌种沼泽红假单胞菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，并加入牛肉膏蛋白胨培养基体积的2.0%浓度为10g/L的葡萄糖进行斜面培养，温度设定在34℃，培养3天，备用；
B：液体种子培养，将A步骤斜面培养的菌种烟曲霉、绿色木霉、毕赤酵母、哈茨木霉在无菌条件下分别接种于装有PDA-葡萄糖培养基的液体三角瓶中，温度设定在30℃，置于140r/min的摇床中培养2天；将A步骤斜面培养的菌种荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、球形芽孢杆菌在无菌条件下分别接种于装有营养琼脂培养基的液体三角瓶中，温度设定在34℃，置于150r/min的摇床中培养1天；将A步骤斜面培养的菌种抗生链霉菌在无菌条件下接种于装有高氏一号培养基的液体三角瓶中，温度设定在30℃，置于160r/min的摇床中培养2天；将A步骤斜面培养的菌种沼泽红假单胞菌在无菌条件下接种于装有牛肉膏蛋白胨培养基的液体三角瓶中，并加入牛肉膏蛋白胨培养基体积的1.8%浓度为10g/L葡萄糖进行培养，温度设定在34℃，置于160r/min的摇床中培养3天；
C：种子液配比，将B步骤中培养出的种子液按照如下重量百分比进行称量：沼泽红假单胞菌6%，烟曲霉2%，抗生链霉菌2%，荧光假单胞菌3%，枯草芽孢杆菌17%，胶质芽孢杆菌8%，巨大芽孢杆菌10%，多黏芽孢杆菌8%，地衣芽孢杆菌8%，绿色木霉4%，蜡状芽孢杆菌12%，侧孢短芽孢杆菌5%，球形芽孢杆菌4%，毕赤酵母5%，哈茨木霉6%；
D：制取发酵培养基，将发酵罐在80℃条件下烘干灭菌处理40min，然后按照以下体积百分数向发酵罐中置入原料：糖蜜1.4%，葡萄糖0.6%，玉米淀粉1.6%，豆粕粉1.5%，硫酸镁0.02%，木醋酸1.7%，尿素0.14%，磷酸二氢钾0.04%，蛋白胨0.08%，酵母粉0.06%，余量为水，再向发酵罐中滴入占发酵培养基总体积0.07%的微量元素营养液，在115℃环境下对发酵培养基进行灭菌处理70min，最后将发酵培养基冷却至27℃，备用；
E：配制液体菌剂，将步骤D制取好的发酵培养基PH调至PH7.0，将步骤C中配比好的液体种子与步骤D制取好的发酵培养基接种到液体发酵罐中，接种量为10%，接种条件为：培养温度为29℃，转速150r/min，液体种子与发酵培养基通气量为1：0.7，发酵培养36小时，即得液体菌剂；
F：固体粉剂制备：步骤D制备好的液体菌剂作为原药，与粉碎的灭菌有机肥、白炭黑做载体混合，载体有机肥和白炭黑的比例为3.0:1，混合后产物放入干燥室进行常温风干干燥至水分低于8%进行粉碎，粉碎至80目，包装即得固体粉状生物菌剂。
目前国内混菌同罐发酵技术相对落后，三个以上的细菌培养还在研究中，若把十种以上，细菌、放线菌、真菌、霉菌等同罐培养、和谐生长、目前在国内是空白，而本发明的菌剂是有十五种有益菌同罐发酵，复合培养而成。目前国内大多数复合菌产品都是单菌培养，最终再混合在一起的勾兑混合菌产品，对于混合菌施入土壤后的共生、互存情况，了解的不够，或者经混合后的“复合菌”本身就拮抗，所以造成防治效果差或者施入土壤后的“复合菌”之间相互拮抗，互相残杀，造成根系有益菌减少，仿效降低。由于本发明的菌剂是由始终以上的有益菌同罐培养，与国内其他产品的混菌技术相比节约了大量的成本，使产品利润最大化。本菌剂含有丰富的有机碳源、氮源、磷源和微生物在生命活动中产生的氨基酸、活性肽、生长素、赤霉素、吲哚乙酸、多种维生素等，同时产生调节刺激植物生长的活性物质，烟草吸收后，结合自身的碳源、氮源促进光合代谢、植株通过自我调节而健壮，提高烟株抗逆能力和抗旱能力，同时在土壤中的优势种群稳定的保持其优势地位，实践证明；任何一种单菌的作用没有复合菌群的防效明显。
以下是对本发明中的菌剂进行试验分析与研究：
1、1.1 试验基本情况
试验于2014年在许昌市襄城县王洛镇和南阳市社旗县苗店镇进行。襄城县试验地土壤为黄褐土，土壤肥力中等，地势平坦，具有灌溉条件。供试品种为中烟100,4月29日移栽，行距119cm，株距55cm。试验肥料用量与施用方法、田间栽培管理按当地最佳措施进行。
社旗县品种为云烟87， 行距55cm。要求试验地土壤肥力中等且均匀，有灌溉条件。试验设5个处理，3次重复，随机区组排列，小区面积0.2亩。田间栽培管理按当地最佳措施进行。
1.2 试验设计
襄城县试验设5个处理，3次重复，随机区组排列，共15个小区面积0.5亩，各小区留2行保护行。试验处理设置如下：
Ck，常规栽培，不用抗病毒制剂。
T1，常规栽培，在移栽时和团根期喷施20%盐酸吗啉胍可湿性粉剂。
T2，育苗时使用。将“花叶多抗灵”制剂稀释100倍，喷洒在漂浮育苗基质上，均匀装盘，播种。
T3，移栽时使用。将“花叶多抗灵”制剂2L，稀释50倍，与有机肥（一亩用有机肥量）拌匀后，在移栽时穴施。
T4，移栽+团根时使用。移栽时使用方法同T2；团根期时（移栽后30d），将“烟草花叶多抗灵”制剂稀释700倍，叶面喷施。
社旗县试验设5个处理，3次重复。随机区组排列，共15个小区，小区面积0.1亩，各小区留2行保护行。田间栽培管理按当地最佳措施进行。
T1，对照，常规栽培，不用抗病毒制剂。
T2，常规栽培，在移栽时和团根期喷施20%盐酸吗啉胍可湿性粉剂。
T3，育苗时使用本发明中的“烟草花叶多抗灵”菌剂。将（烟草花叶多抗灵）制剂稀释100倍，喷洒在漂浮育苗基质上，均匀装盘，播种。
T4，移栽时使用本发明的“烟草花叶多抗灵”菌剂。将“烟草花叶多抗灵”制剂2L，稀释50倍，与有机肥（一亩用有机肥量）拌匀后、在移栽时穴施。
T5，移栽+团根期使用本发明中的“烟草花叶多抗灵”菌剂。移栽时使用方法同t2；将“烟草花叶多抗灵”制剂稀释700倍，于移栽后30d叶面喷施。
1.3 测定指标与方法
1.3.1花叶病发病率、病情指数、相对仿效
于团根期、旺长期、圆项期调查花叶病发病率，按照GB/T23222-20008《烟草病害分级标准》进行分级，以病情指数计算相对仿效，调查分级标准（以株为单位）。
0级：全株无病；
1级：心叶脉明或轻微花叶，病株植株无明显矮化；
3级：1/3叶片花叶但不变形，或植株矮化为正常株高的3/4以上；
5级：1/3~1/2叶片花叶，或少数叶片变形，或主脉变黑，或植株矮化为正常植株株高的2/3~3/4；
7级：1/2~2/3叶片花叶，或叶片变形，或主脉坏死，或病株矮化为正常株高的1/2~2/3。
9级；全株叶片花叶，严重变形或坏死，或病株矮化为正常株高的1/2以上。
根据田间调查的病株数和病害严重程度，计算发病率、病情指数和防治效果：
发病率（%）=（发病植株/调查株数）*100%
病情指数=【（各级病株数*相对级数值）/总调查株数*发病最高级代表值】
防治效果（%）=【(对照区病情指数-防治区病情指数)/对照区病情指数】*100
1.3.2 农艺性状调查
于移栽后30、50、70d调查不同处理烟株株高、茎围、节粗、叶片数。叶片长宽（移栽后50d后部位测定）、叶片面积。
1.3.3烟叶经济指标
烟叶成熟后分小区采收绑、同炕烘烤，分小区储存。烘烤结束后，进行分级并称重，统计各小区烟叶产量、各等级烟叶比例、均价、产值。
1.3.4 烟叶品质评价
1.3.4.1 化学成分 取不同处理C3F、B2F烟叶分析其总氮、烟碱，总糖，还原糖、钾氯含量。
1.3.4.2 吸食品质 取不同处理中部叶（C3F）、上部叶 (B2F)平衡水分后切丝，卷制成单料烟，聘请河南中烟评吸专家进行评吸。
2 结果与分析
2.1 不同处理大田烟株农艺性状比较分析
表1 不同处理烟株农艺性状比较（襄城县）
表2 烟草花叶多抗灵防治花叶病效果（襄城）
表3 不同处理对烟株花叶病病情的影响（社旗）
以上研究表明，与对照和使用盐酸吗啉胍抗病毒制剂对比，使用本发明的菌剂对烟株的田间长势影响不大，但能够增大烟叶的长和宽，提高烟叶产量，对花叶病的防效高于盐酸吗啉胍，使用本发明中的菌剂后，能提高烤烟上等烟比例、均价和产值，烟叶产量、上等烟比例、均价和产值显著高于对照和使用盐酸吗啉胍处理。

Claims (3)

1.一种防治烟草花叶病毒的菌剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
A：斜面培养，将菌种烟曲霉、绿色木霉、毕赤酵母、哈茨木霉在无菌条件下分别接种于PDA-葡萄糖培养基中，进行斜面培养，温度设定在28℃-30℃，培养4-5天；将菌种荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、球形芽孢杆菌在无菌条件下分别接种于营养琼脂培养基中，进行斜面培养，温度设定在30℃-34℃，培养2-3天；将菌种抗生链霉菌接种于高氏一号培养基中进行斜面培养，温度设定在30℃-34℃，培养2-3天；将菌种沼泽红假单胞菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，并加入牛肉膏蛋白胨培养基体积的1.8%-2.2%浓度为10g/L的葡萄糖进行斜面培养，温度设定在30℃-34℃，培养3-4天，备用；
B：液体种子培养，将A步骤斜面培养的菌种烟曲霉、绿色木霉、毕赤酵母、哈茨木霉在无菌条件下分别接种于装有PDA-葡萄糖培养基的液体三角瓶中，温度设定在28℃-30℃，置于140-160r/min的摇床中培养1-2天；将A步骤斜面培养的菌种荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、球形芽孢杆菌在无菌条件下分别接种于装有营养琼脂培养基的液体三角瓶中，温度设定在30℃-34℃，置于140-160r/min的摇床中培养1-2天；将A步骤斜面培养的菌种抗生链霉菌在无菌条件下接种于装有高氏一号培养基的液体三角瓶中，温度设定在28℃-30℃，置于140-160r/min的摇床中培养1-2天；将A步骤斜面培养的菌种沼泽红假单胞菌在无菌条件下接种于装有牛肉膏蛋白胨培养基的液体三角瓶中，并加入牛肉膏蛋白胨培养基体积的1.8%-2.2%浓度为10g/L葡萄糖进行培养，温度设定在30℃-34℃，置于140-160r/min的摇床中培养2-3天；
C：种子液配比，将B步骤中培养出的种子液按照如下重量百分比进行称量：沼泽红假单胞菌3%-7%，烟曲霉1%-3%，抗生链霉菌2%-4%，荧光假单胞菌1%-3%，枯草芽孢杆菌13%-17%，胶质芽孢杆菌8%-12%，巨大芽孢杆菌8%-12%，多黏芽孢杆菌8%-12%，地衣芽孢杆菌8%-12%，绿色木霉2%-4%，蜡状芽孢杆菌8%-12%，侧孢短芽孢杆菌3%-7%，球形芽孢杆菌3%-7%，毕赤酵母3%-7%，哈茨木霉3%-7%；
D：制取发酵培养基，将发酵罐在80-100℃条件下烘干灭菌处理30-50min，然后按照以下体积百分数向发酵罐中置入原料：糖蜜0.8%-1.4%，葡萄糖0.6%-1.0%，玉米淀粉1.4%-1.8%，豆粕粉1.3%-1.7%，硫酸镁0.02%-0.04%，木醋酸1.3%-1.7%，尿素0.1%-0.14%，磷酸二氢钾0.03%-0.05%，蛋白胨0.08%-0.12%，酵母粉0.03%-0.07%，余量为水，再向发酵罐中滴入占发酵培养基总体积0.05%-0.07%的微量元素营养液，在110-130℃环境下对发酵培养基进行灭菌处理30-90min，最后将发酵培养基冷却至25-35℃，备用；
E：配制液体菌剂，将步骤D制取好的发酵培养基PH调至PH7.0，将步骤C中配比好的液体种子与步骤D制取好的发酵培养基接种到液体发酵罐中，接种量为8%-12%，接种条件为：培养温度为28℃-30℃，转速150-200r/min，液体种子与发酵培养基通气量为1：0.5-0.8，发酵培养24-36小时，即得液体菌剂；
F：固体粉剂制备：步骤D制备好的液体菌剂作为原药，与粉碎的灭菌有机肥、白炭黑做载体混合，载体有机肥和白炭黑的比例为2.7-3.3:1，混合后产物放入干燥室进行常温风干干燥至水分低于8%进行粉碎，粉碎至70-85目，包装即得固体粉状生物菌剂。
2.根据权利要求1所述的防治烟草花叶病毒的菌剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
A：斜面培养，将菌种烟曲霉、绿色木霉、毕赤酵母、哈茨木霉在无菌条件下分别接种于PDA-葡萄糖培养基中，进行斜面培养，温度设定在28℃，培养4天；将菌种荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、球形芽孢杆菌在无菌条件下分别接种于营养琼脂培养基中，进行斜面培养，温度设定在30℃，培养3天；将菌种抗生链霉菌接种于高氏一号培养基中进行斜面培养，温度设定在34℃，培养3天；将菌种沼泽红假单胞菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，并加入牛肉膏蛋白胨培养基体积的2%浓度为10g/L的葡萄糖进行斜面培养，温度设定在32℃，培养3天，备用；
B：液体种子培养，将A步骤斜面培养的菌种烟曲霉、绿色木霉、毕赤酵母、哈茨木霉在无菌条件下分别接种于装有PDA-葡萄糖培养基的液体三角瓶中，温度设定在28℃，置于150r/min的摇床中培养2天；将A步骤斜面培养的菌种荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、球形芽孢杆菌在无菌条件下分别接种于装有营养琼脂培养基的液体三角瓶中，温度设定在30℃，置于150r/min的摇床中培养2天；将A步骤斜面培养的菌种抗生链霉菌在无菌条件下接种于装有高氏一号培养基的液体三角瓶中，温度设定在29℃，置于150r/min的摇床中培养2天；将A步骤斜面培养的菌种沼泽红假单胞菌在无菌条件下接种于装有牛肉膏蛋白胨培养基的液体三角瓶中，并加入牛肉膏蛋白胨培养基体积的2.0%浓度为10g/L葡萄糖进行培养，温度设定在34℃，置于150r/min的摇床中培养2天；
C：种子液配比，将B步骤中培养出的种子液按照如下重量百分比进行称量：沼泽红假单胞菌3%-7%，烟曲霉1%-3%，抗生链霉菌2%-4%，荧光假单胞菌1%-3%，枯草芽孢杆菌13%-17%，胶质芽孢杆菌8%-12%，巨大芽孢杆菌8%-12%，多黏芽孢杆菌8%-12%，地衣芽孢杆菌8%-12%，绿色木霉2%-4%，蜡状芽孢杆菌8%-12%，侧孢短芽孢杆菌3%-7%，球形芽孢杆菌3%-7%，毕赤酵母3%-7%，哈茨木霉3%-7%；
D：制取发酵培养基，将发酵罐在90℃条件下烘干灭菌处理30-50min，然后按照以下体积百分数向发酵罐中置入原料：糖蜜0.8%-1.4%，葡萄糖0.6%-1.0%，玉米淀粉1.4%-1.8%，豆粕粉1.3%-1.7%，硫酸镁0.02%-0.04%，木醋酸1.3%-1.7%，尿素0.1%-0.14%，磷酸二氢钾0.03%-0.05%，蛋白胨0.08%-0.12%，酵母粉0.03%-0.07%，余量为水，再向发酵罐中滴入占发酵培养基总体积0.06%的微量元素营养液，在120℃环境下对发酵培养基进行灭菌处理60min，最后将发酵培养基冷却至30℃，备用；
E：配制液体菌剂，将步骤D制取好的发酵培养基PH调至PH7.0，将步骤C中配比好的液体种子与步骤D制取好的发酵培养基接种到液体发酵罐中，接种量为10%，接种条件为：培养温度为29℃，转速180r/min，液体种子与发酵培养基通气量为1：0.6，发酵培养30小时，即得液体菌剂；
F：固体粉剂制备：步骤D制备好的液体菌剂作为原药，与粉碎的灭菌有机肥、白炭黑做载体混合，载体有机肥和白炭黑的比例为3:1，混合后产物放入干燥室进行常温风干干燥至水分低于8%进行粉碎，粉碎至80目，包装即得固体粉状生物菌剂。
3.一种如权利要求1所述的防治烟草花叶病毒的菌剂，其特征在于：所述C步骤的种子配比的各菌种的百分比为：沼泽红假单胞菌5%，烟曲霉2%，抗生链霉菌3%，荧光假单胞菌2%，枯草芽孢杆菌15%，胶质芽孢杆菌10%，巨大芽孢杆菌10%，多黏芽孢杆菌10%，地衣芽孢杆菌10%，绿色木霉3%，蜡状芽孢杆菌10%，侧孢短芽孢杆菌5%，球形芽孢杆菌5%，毕赤酵母5%，哈茨木霉5%；所述D步骤同罐发酵的培养基的各组分百分比为：糖蜜1.2%，葡萄糖0.8%，玉米淀粉1.6%，豆粕粉1.5%，硫酸镁0.03%，木醋酸1.5%，尿素0.12%，磷酸二氢钾0.04%，蛋白胨0.1%，酵母粉0.05%，余量为水。
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