CN103342604B

CN103342604B - 一种生防菌素叶面肥及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103342604B
Application number: CN201310288911.4A
Authority: CN
Inventors: 唐八生; 曹典军; 陈伟; 彭群; 朱丽; 苏丰菲; 蔡浩
Original assignee: HUNAN TAIGU BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: Hunan Huigu Agricultural Ecology Research Institute Co ltd
Priority date: 2013-07-10
Filing date: 2013-07-10
Publication date: 2014-10-08
Anticipated expiration: 2033-07-10
Also published as: CN103342604A

Abstract

本发明提供一种生防菌素叶面肥及其制备和应用。所述生防菌素叶面肥由核心生防菌素1～3份、生化黄腐酸钾35～85份、活性SiO₂10～50份、酶活物质2～6份及植物表面活性剂2～6份组成。核心生防菌素中含有生防促生菌和蛋白分解菌，生防促生菌为枯草芽孢杆菌和哈茨木霉。生防菌素叶面肥中的核心菌素能迅速在植物表面定植生长并形成“生防膜”，防止植物表面病原菌的侵染，并在与病原菌互作和重寄生过程中产生抗生素和植物生长等物质，能预防、拮抗或直接杀死农作物多种病害，具有坚固植物细胞璧组织，增强植物表皮直接抵抗病原菌及虫害的侵入能力，促进农作物健康生长，实现少用或不用农药用，减少环境污染，从而提高产量，改善品质。

Description

一种生防菌素叶面肥及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于肥料领域，具体涉及一种含有生防菌素的肥料及其制备方法和应用。

背景技术

稻瘟病菌［Magnaporthe grisea（Hebert）Barr］，无性态为［Pyricularia grisea（Cook）Sacc］，是稻梨孢属真菌，由其引起的水稻稻瘟病是我国水稻三大病害之一。据报道，全球每年因稻瘟病造成的水稻产量损失约占总产量的10％-15％，经济损失达数十亿美元。在我国，稻瘟病每年都有不同程度的发生，特别是近几年，在西南、长江中游和东北等稻作区持续大发生，年发病面积达330万-570万ha，损失稻谷数亿公斤，给我国水稻安全生产带来了巨大隐患。目前，稻瘟病的防治主要通过化学防治和种植抗病品种。但是，由于水稻稻瘟病菌生理小种的多样性和易变性，导致化学防治在病害流行年份收效甚微，且存在环境污染的弊端；也导致抗病品种在推广2-3年后就逐渐丧失抗性。因此，开展水稻稻瘟病菌防治研究十分必要。

从20世纪50年代起,人们开始寻求控制稻瘟病的生物防治方法,国内外先后对多种生防微生物进行了研究。在众多被研究的植病生防微生物中,以枯草芽孢杆菌Bacillus sub-tilis为代表的芽孢杆菌属Bacillusspp.独树一帜,人们发现它不仅对植物病害有很好的防治效果,同时还有一定的增产作用，近年来逐渐成为研究热点，且已有很多成功的先例。枯草芽孢杆菌是一种嗜温的好氧性产芽孢杆状细菌(G+),在原核生物中，人们对它的了解程度仅次于大肠杆菌Escherichiacoli，已成为多种研究的模式菌，这也为对该菌进行深入研究提供了有利的条件。但是与哈茨木霉复配的研究尚无先例。

发明内容

有鉴于本领域的现状，特提出本发明，以便进一步明确枯草芽孢杆菌菌株和叶面肥混用对水稻稻瘟病的综合生防价值，并为该菌株的实际应用提供可行性依据。

针对本领域的不足之处，本发明的目的是提供一种生防菌素叶面肥。

本发明的另一目的是提出生防菌素叶面肥的应用。

实现本发明上述目的的技术方案为：

一种生防菌素叶面肥，其含有以下重量份的成分：

生防菌素1～3份；生化黄腐酸钾35～85份；活性SiO₂10～50份；酶活物质2～6份；表面活性剂2～6份；

其中，所述生防菌素为枯草芽孢杆菌和哈茨木霉。所述生防菌素中枯草芽孢杆菌含有3.0～9.0×10⁹cfu/g，哈茨木霉含有1.0～2.0×10⁹cfu/g；优选为所述生防菌素素中枯草芽孢杆菌含有6.0×10⁹cfu/g，哈茨木霉含有1.5×10⁹cfu/g。

其中，所述的生化黄腐酸钾，是一种多价酚型芳香族化合物与氮化合物的缩聚物，是应用现代生物技术，以植物渣体为原料，经生物发酵，成功制取类煤化黄腐酸物质即高活性生化黄腐酸钾。其中的黄腐酸是腐殖酸中分子量最小，活性最大的组分，系腐植酸有效成分中的精华。该生化黄腐酸钾全溶于水、耐酸碱、抗二价离子，可与多种微量元素和大量元素共溶复配，不絮沉，也可直接施用作物。其含有硫、钙、镁、锌、铁、钼、硼等中微量元素，以及大量的B族维生素、维生素C、肌醇、多糖等，还含有多种维生素、微量元素、菌体蛋白、核酸、表面活性物及促生长因子（生物活性物质）等。这些营养物质能直接被叶片吸收利用，有的直接成为了作物机体的一部分，从而促进作物健康生长，进一步增强了抗逆能力。生化黄腐酸钾外观为棕褐色粉末，香甜气味，系纯天然发酵品，无任何毒副作用。主要成分：生化黄腐酸含量≥45%；全氮≥3.0%；全磷（P₂O₅）≥0.5%；全钾（k₂O）≥10%；氨基酸含量＞2%；粗蛋白含量≥19%；有机质含量≥50%；pH值5.7。

其中所述纳米SiO₂为纳米级气相二氧化硅，粒径为30～40纳米。气相二氧化硅比表面积为300～400m²/g，表观密度为25～60g/L，二氧化硅含量≥99.0%，干燥减量为45℃10min减量≤1.5%，其4%悬浮液的pH值为3.6～4.5，有含硅量高、水溶性好、吸收利用率高、速溶速效等特点，24小时吸收率达90%以上，在水稻生长需硅高峰期能够快速补充硅素。作物吸收硅后，有利于促进光合作用和有机物积累，增加茎秆的机械强度，抑制叶片的水分蒸腾作用，并在植株体内和茎叶表面形成一种较坚硬的硅化细胞，显著提高作物的抗虫抗病、抗倒伏、抗旱、抗低温等抗逆能力，减少各种病虫害的发生，很好的调节作物对氮磷钾等各元素的平衡吸收，提高磷肥的利用率，强化钙、镁的吸收和利用，促进农作物分蘖与灌浆，提高结实率和千粒重，改善农产品品质，增加产量。

其中所述酶活物质由蛋白粉和活性酶组成，蛋白粉：活性酶的质量比例为300:1～100:1；优选蛋白粉：活性酶的质量比例为200:1。所述活性酶是用常规分离纯化法从大豆青夹中提取的活性酶。

所述表面活性剂为植物源表面活性剂，采用油茶枯饼粉碎后，用2倍重量的水浸泡48h所得的浸提物经过滤后所得的上清液。油茶枯饼的水浸提物主要成分是皂苷类化合物。

其中所述生防菌素由以下方法制备得到：

将枯草芽孢杆菌的原始菌种在无菌条件下依次进行斜面培养、摇床培养、发酵罐培养后，将得到的发酵液经过浓缩干燥制备成枯草芽孢杆菌孢子粉；

将哈茨木霉的原始菌种在无菌条件下依次进行斜面培养、摇床培养、发酵罐培养、固体发酵产孢后，将得到的完全产孢的培养基浸泡在清水中制成孢子悬浮液，从而得到哈茨木霉孢子悬浮液，然后将得到的哈茨木霉孢子悬浮液浓缩干燥制备成哈茨木霉孢子粉。

将制得的枯草芽孢杆菌孢子粉和哈茨木霉孢子粉按照3.0～9.0:1.0～2.0的重量比混合，得到生防菌素。

本发明选择的两个菌种均从如下单位购买：

①枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心，保藏号ACCC10618；

②哈茨木霉（Trichoderma harzianum）中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心，保藏号ACCC30371。

其主要有效成分为枯草芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种嗜温的好氧性产芽孢杆状细菌(G⁺),在原核生物中,人们对它的了解程度仅次于大肠杆菌(Escherichia coli),已成为多种研究的模式菌。本发明所使用的枯草芽孢杆菌菌株,据已有的实验结果表明,对稻瘟病菌的生长及抱子萌发都有很强的抑制作用,是极具有生防潜力的菌株。哈茨木霉菌，它广泛存在于自然界中。哈茨木霉菌是木霉菌中应用最早最广的一个菌种，哈茨木霉菌对叶部立枯丝核菌源病害的防治能力强。

所述枯草芽孢杆菌孢子粉的具体制备方法为：

1）斜面培养：将枯草芽孢杆菌的原始菌种在无菌条件下接种于斜面培养基上，在29±1℃条件下培养36～48h；斜面培养基的配方如下：葡萄糖15g、鱼蛋白胨5g、酵母膏5g、水1000mL、琼脂15g；

2）摇床培养：将步骤1）培养得到的菌种接种于液体培养基，在pH6.5～7.0、温度为30±2℃条件下，140～160r/min摇床培养36～48h；液体培养基配方如下：玉米粉13g，葡萄糖5g，豆饼粉20g，鱼粉5g，CaCO₃6g，(NH₄)₂SO₄1g，K₂HPO₄0.3g，MgSO₄7H₂O0.2g，MnSO₄·H₂O0.2g，水1000ml；

3）发酵罐培养：将步骤2）培养得到的菌种接种于发酵罐培养基，在pH7.5～8.0、罐压0.5kg、温度为30±2℃、通风量1:0.8～1.1条件下，至菌数大于1.0～1.2×10¹⁰/mL时下罐，得到发酵液，将发酵液经过浓缩干燥制备成枯草芽孢杆菌孢子粉；发酵罐培养基配方如下：玉米粉26kg、豆饼粉16kg、硫酸铵4kg、葡萄糖8kg、酵母粉2.5kg、蛋白胨1.7kg、加水至600kg；通常培养48～56h。

所述哈茨木霉孢子粉的制备方法为：

1）将哈茨木霉的原始菌种在无菌条件下接种于斜面培养基上，在28±1℃条件下培养48h；斜面培养基的配方如下：葡萄糖20g、土豆汁200g、琼脂20g、水1000mL。土豆汁的制备方法为：将切好的土豆片加入到1200～1300mL水中，先用大火煮至开锅后计时，再用文火煮10min后停火，冷却过滤。经4层纱布过滤，将煮出的土豆营养液充分的过滤出来，并排除其他杂质。通过纱布过滤出超过1000mL营养汁。

2）摇床培养：将步骤1）培养得到的菌种接种于液体培养基，在pH6.5～6.8、温度为30±1℃条件下，160～200r/min摇床培养24h；液体培养基配方如下：白糖20g、酵母膏0.5g、淀粉20g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁0.2g、氯化钠0.2g、水1000mL；

3）发酵罐培养：将步骤2）培养得到的菌种接种于发酵罐培养基，在pH6.5～6.8、罐压0.5kg、温度为27～28℃、通风量为1:0.7，至菌丝体占总体积的15～25%时停止；发酵罐培养基配方如下：淀粉12kg、豆饼粉1.2kg、玉米粉3kg、白糖12kg、酵母膏0.3kg、硫酸镁0.12kg、氯化钠0.12kg、加水至600kg；通常培养40-50h。

4）固体发酵产孢：将步骤3）发酵罐培养得到的菌丝体接种到固体发酵培养基上，培养至85～95%菌体转成芽孢；固体发酵培养基配方如下：固体料中棉籽壳占25%、玉米粉占10%、麸皮占65%；固体料与加水的重量比为1:0.8。

5）将步骤4）得到的固体发酵产孢的培养基浸泡在清水中制成悬浮液，即为哈茨木霉孢子悬浮液，浓缩干燥制备成哈茨木霉孢子粉。

优选地，将制得的枯草芽孢杆菌孢子粉和哈茨木霉孢子粉按照6.0:1.5的重量比混合，得到生防菌素。

其中，所述生防菌素叶面肥的剂型为粉剂或水剂。

本发明所述的生防菌素叶面肥在防治农作物病虫害中的应用。优选地，应用于防治水稻的病虫害，尤其是应用于防治由稻梨孢属真菌、立枯丝核菌、镰刀菌、灰葡萄孢菌、黑根霉等病原菌引起的植物病害，包括稻瘟病、水稻纹枯病、灰霉病等。本领域技术人员可以预见采用本发明所述的生防菌素素叶面肥与合适的辅料可以制备出具有显著杀菌效果的粉剂或颗粒或液体剂型。

该生防菌素素叶面肥可在多种作物地上部喷施，也可进行土壤消毒或者浸种处理。本发明所述的生防菌素素叶面肥其中的核心菌素能迅速在植物表面定植生长并形成一层“生防膜”，以防止植物表面病原菌的侵染，并在与病原菌互作和重寄生过程中产生抗生素和植物生长等物质，能显著预防、拮抗或直接杀死农作物多种病害，同时具有坚固植物细胞璧组织，增强植物表皮直接抵抗病原菌及虫害的侵入能力，促进农作物健康生长，实现少用或不用农药用，减少环境污染，从而提高产量，改善品质。

本发明的有益效果在于：

1、本发明的微生物种类搭配合理，枯草芽孢杆菌和哈茨木霉组合，通过叶面喷施能迅速在植物地上部分定植生长并形成“生防膜”，产生的阻隔、拮抗及杀菌作用互补性更强；枯草芽孢杆菌和哈茨木霉搭配后，能增强该发明产品的蛋白酶活性，从而进一步提高拮抗农作物病原菌的能力，起到生防促生作用。

2、本发明的有效菌制备方法先进科学，简便可行，其孢子数含量高，存活时间长。加入酶活物质和植物源表面活性剂能使孢子在植物表面迅速定植生长，加入营养成分能为孢子在叶面快速定殖提供能量。

3、本发明的施肥菌素叶面肥技术处在国际领先前沿。优势作用在于能在植物叶面定植并迅速生长，抢占植物体表面位点，形成一个“生防膜”。在与病原菌互作的过程中形成重寄生作用，分泌胞外酶溶解病原菌的细胞壁，穿透寄主菌丝，吸取营养，进而将病原菌杀死。同时还分泌一部分抗生素和植物生长调节物质，促进作物健康生长，增强植物的抗病能力。

4、本发明的生防菌素素叶面肥是粉状或颗粒状或液体状剂型，完全能溶于水。施用方法简便实用，除叶面喷施外，也可做土壤消毒处理，或者做浸种处理。

5、本发明的生防菌素素叶面肥，除了直接提供作物所需营养外，可以用来预防由稻梨孢属真菌、立枯丝核菌、镰刀菌、灰葡萄孢菌、黑根霉等病原菌引起的植物病害（稻瘟病等），其主要有效成分为枯草芽孢杆菌和哈茨木霉，在生产上应用效果好：用本发明的生防菌素素叶面肥对种植水稻进行处理,通过对水稻不同生育期的农艺性状、经济性状、产量和病害发展情况的考察,研究其生物防治效果及促生作用。结果表明,本发明的生防菌素素叶面肥对水稻稻瘟病、纹枯病等有很好的生物防治效果；同时对水稻有显著的促生作用,能增加水稻的有效穗数,提高结实率和千粒重，能显著提高蔬菜产量和改善品质;稻瘟病是水稻上的第一大病害，也是水稻生产上重要的流行性病害。在流行暴发年份，轻者减产20%～30%，重者减产50%以上，甚至颗粒无收。稻瘟病可分为苗瘟、叶瘟、节瘟、穗颈瘟和谷粒瘟等，一般以穗颈瘟对产量影响最大。利用本发明的生防菌素素叶面肥防治防治水稻稻瘟病效果极显著。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。

实施例和实验例中相关成分：

酶活物质由蛋白粉和活性酶组成，蛋白粉：活性酶的质量比例为300:1～100:1；优选蛋白粉：活性酶的质量比例为200:1。活性酶中的纤维素酶活≥32u/g，蛋白酶活≥35u/g。活性酶是用常规分离纯化法从大豆青夹中提取：首先将大豆上等好的青荚进行植物组织细胞的破碎。采用磷酸缓冲液（Ph值6.0）按照料液比1：5混合于器皿中，得到的混合液进行过滤(过滤2～3次)，除掉固体杂质，得到酶的粗提取液。然后对得到的粗提取液58℃水浴加热，10分钟后取出器皿，静置5分钟（切忌过长），器皿底部沉淀出大豆青夹中含有固体杂质蛋白质，取上清液于另一器皿中，用硫酸铵进行沉淀（pH值5.8）。最后用磷酸缓冲液（pH值5.7）对沉淀溶解得到的酶液进行分离纯化。

表面活性剂制备方法为：油茶枯饼粉碎后，用2倍重量的水浸泡48h所得的浸提物经过滤后所得的上清液。

实施例1：

生防菌素叶面肥的组成：生防菌素2份、黄腐酸钾60份、纳米气相SiO230份、酶活物质4份（蛋白粉：活性酶质量比例200:1混合）、表面活性剂4份。所用蛋白粉含蛋白质%≥50，水分%≤9.0，脂肪%≤2.0，细度100目筛上物≤1%；

其中，枯草芽孢杆菌孢子粉的制备：

①斜面培养：将枯草芽孢杆菌原始菌种在无菌条件下接种于斜面培养基上，在30℃条件下培养48h；斜面培养基的配方如下：葡萄糖15g、鱼蛋白胨5g、酵母膏5g、水1000mL、琼脂15g。

②摇床培养：将步骤①培养的菌种在无菌条件下接种于液体培养基，在pH6.5、温度为30℃条件下，160r/min摇床培养36h；液体培养基配方如下：玉米粉13g，葡萄糖5g，豆饼粉20g，鱼粉5g，CaCO₃6g，(NH₄)₂SO₄1g，K₂HPO₄0.3g，MgSO₄7H₂O0.2g，MnSO₄·H₂O0.2g,水1000ml；

③发酵罐培养：将步骤②培养的菌种在无菌条件下接种于发酵罐培养基，在pH8.0、罐压0.5kg、温度为30℃、通风量1:0.8条件下，培养56h后，菌数大于1.0×1010/mL，80%菌体转成芽孢时下罐，得到发酵液；发酵罐培养基配方如下：玉米粉26kg、豆饼粉16kg、硫酸铵4kg、葡萄糖8kg、酵母粉2.5kg、蛋白胨1.7kg、加水至600kg。

④将步骤③中得到的枯草芽孢杆菌发酵液浓缩干燥制备成枯草芽孢杆菌孢子粉；

哈茨木霉孢子粉的制备：

①将哈茨木霉原始菌种在无菌条件下接种于斜面培养基上，在29℃条件下培养48h；斜面培养基的配方如下：葡萄糖20g、土豆汁200g、琼脂20g、水1000mL，pH自然。

②摇床培养：将上述步骤①培养的菌种在无菌条件下接种于液体培养基，在pH6.6、温度为29℃条件下，160r/min摇床培养24h；液体培养基配方如下：白糖20g、酵母膏0.5g、淀粉20g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁0.2g、氯化钠0.2g、水1000mL。

③发酵罐培养：将上述步骤②培养的菌种在无菌条件下接种于发酵罐培养基，在pH6.6、罐压0.5kg、温度为28℃、通风量为1:0.7，在培养48h后，菌丝体约占总体积的20%时终止发酵，进行固体发酵产孢；发酵罐培养基配方如下：淀粉12kg、豆饼粉1.2kg、玉米粉3kg、白糖12kg、酵母膏0.3kg、硫酸镁0.12kg、氯化钠0.12kg、加水至600kg。

④固体发酵产孢：将上述步骤③经过发酵罐培养后的菌丝体接种到固体发酵培养基上，培养48h，90%菌体转成芽孢；固体发酵培养基配方如下：固体料：棉籽壳25kg、玉米粉10kg、麸皮65kg。固体料与水的重量比为1:0.8。

⑤将上述步骤④中完全产孢的培养基浸在清水中制成孢子悬浮液，从而得到哈茨木霉孢子悬浮液；

⑥将上述步骤⑤得到的哈茨木霉孢子悬浮液浓缩干燥制备成哈茨木霉孢子粉。

将上述制得的枯草芽孢杆菌孢子粉和哈茨木霉孢子粉按照6：1.5的重量比混合，得到生防菌素。该生防菌素中含有：枯草芽孢杆菌6.0×10⁹cfu/g；哈茨木霉1.5×10⁹cfu/g，有效菌总含量≥7.5×10⁹cfu/g。

将所得生防菌素2份、黄腐酸钾60份、纳米SiO₂30份、酶活物质4份及植物表面活性剂4份充分搅拌混匀，制得产品即为本发明的粉状生防菌素素叶面肥。

实施例2

与实施例1相比，区别在于本实施例生防菌素叶面肥的组成为：

生防菌素1份、黄腐酸钾37份、纳米SiO₂50份、酶活物质（蛋白粉：活性酶质量比例200:1混合）6份及表面活性剂6份。

其中，枯草芽孢杆菌孢子粉的制备：

①斜面培养：将枯草芽孢杆菌原始菌种在无菌条件下接种于斜面培养基上，在29℃条件下培养48h；

②摇床培养：将上述步骤①培养的菌种在无菌条件下接种于液体培养基，在pH6.5、温度为29℃条件下，160r/min摇床培养36h；

③发酵罐培养：将上述步骤②培养的菌种在无菌条件下接种于发酵罐培养基，在pH8.0、罐压0.5kg、温度为30℃、通风量1:0.8条件下，培养56h后，菌数大于1.0×10¹⁰/mL，80%菌体转成芽孢时下罐，得到发酵液；

哈茨木霉孢子粉的制备：

①将哈茨木霉原始菌种在无菌条件下接种于斜面培养基上，在30℃条件下培养48h；

②摇床培养：将上述步骤①培养的菌种在无菌条件下接种于液体培养基，在pH6.6、温度为30℃条件下，160r/min摇床培养24h；

③发酵罐培养：将上述步骤②培养的菌种在无菌条件下接种于发酵罐培养基，在pH6.6、罐压0.5kg、温度为28℃、通风量为1:0.7，在培养52h后，菌丝体约占总体积的20%时终止发酵，进行固体发酵产孢；

④固体发酵产孢：将上述步骤③经过发酵罐培养后的菌丝体接种到固体发酵培养基上，培养52h，90%菌体转成芽孢；

各步骤培养基同实施例1。

将制得的枯草芽孢杆菌孢子粉和哈茨木霉孢子粉按照5.5：2.0的重量比混合，得到生防菌素。该生防菌素素中含有：枯草芽孢杆菌5.5×10⁹cfu/g；哈茨木霉2.0×10⁹cfu/g，有效菌总含量≥7.5×10⁹cfu/g。

将所得生防菌素1份、黄腐酸钾37份、纳米SiO₂50份、酶活物质6份及表面活性剂6份充分搅拌混匀，制得产品即为本发明的粉状生防菌素素叶面肥。

实施例3

生防菌素3份、黄腐酸钾70份、纳米SiO₂17份、酶活物质（蛋白粉：活性酶质量比例200:1混合）5份及表面活性剂5份。

其中，上述核心生防菌素素由以下步骤制得：

枯草芽孢杆菌孢子粉的制备：

①斜面培养：将枯草芽孢杆菌原始菌种在无菌条件下接种于斜面培养基上，在30℃条件下培养48h；

②摇床培养：将上述步骤①培养的菌种在无菌条件下接种于液体培养基，在pH6.5、温度为29℃条件下，160r/min摇床培养48h；

③发酵罐培养：将上述步骤②培养的菌种在无菌条件下接种于发酵罐培养基，在pH7.5、罐压0.5kg、温度为30℃、通风量1:0.8条件下，培养56h后，菌数大于1.0×10¹⁰/mL，80%菌体转成芽孢时下罐，得到发酵液；

哈茨木霉孢子粉的制备：

①将哈茨木霉原始菌种在无菌条件下接种于斜面培养基上，在29℃条件下培养52h；

②摇床培养：将上述步骤①培养的菌种在无菌条件下接种于液体培养基，在pH6.6、温度为29℃条件下，160r/min摇床培养30h；

③发酵罐培养：将上述步骤②培养的菌种在无菌条件下接种于发酵罐培养基，在pH7.5、罐压0.5kg、温度为28℃、通风量为1:0.7，在培养48h后，菌丝体约占总体积的20%时终止发酵，进行固体发酵产孢；

⑥将上述步骤⑤得到的哈茨木霉孢子悬浮液浓缩干燥制备成哈茨木霉孢子粉

各步骤培养基同实施例1。

将制得的枯草芽孢杆菌孢子粉和哈茨木霉孢子粉按照6.5：1.0的重量比混合，得到生防菌素。该生防菌素中含有：枯草芽孢杆菌6.5×109cfu/g；哈茨木霉1.0×109cfu/g，有效菌总含量≥7.5×109cfu/g。

将所得生防菌素3份、黄腐酸钾70份、纳米SiO₂17份、酶活物质5份及表面活性剂5份充分搅拌混匀，制得产品即为本发明的粉状生防菌素素叶面肥。

实施例4

与实施例3相比，区别仅在于本实施例生防菌素叶面肥的组成为：

生防菌素2份、黄腐酸钾50份、纳米SiO₂38份、酶活物质3份及植物表面活性剂3份。

其中，上述核心生防菌素素由以下步骤制得：

枯草芽孢杆菌孢子粉的制备：

②摇床培养：将上述步骤①培养的菌种在无菌条件下接种于液体培养基，在pH6.5、温度为29℃条件下，160r/min摇床培养42h；

③发酵罐培养：将上述步骤②培养的菌种在无菌条件下接种于发酵罐培养基，在pH8.0、罐压0.5kg、温度为29℃、通风量1:1条件下，培养56h后，菌数大于1.0×10¹⁰/mL，80%菌体转成芽孢时下罐，得到发酵液；

哈茨木霉孢子粉的制备：

③发酵罐培养：将上述步骤②培养的菌种在无菌条件下接种于发酵罐培养基，在pH6.6、罐压0.5kg、温度为29℃、通风量为1:0.8，在培养48h后，菌丝体约占总体积的20%时终止发酵，进行固体发酵产孢；

④固体发酵产孢：将上述步骤③经过发酵罐培养后的菌丝体接种到固体发酵培养基上，培养48h，90%菌体转成芽孢；

各步骤培养基同实施例1。

将制得的枯草芽孢杆菌孢子粉和哈茨木霉孢子粉按照5.7：1.8的重量比混合，得到生防菌素。该生防菌素中含有：枯草芽孢杆菌5.7×10⁹cfu/g；哈茨木霉1.8×10⁹cfu/g，有效菌总含量≥7.5×10⁹cfu/g。

将生防菌素素2份、黄腐酸钾50份、纳米O₂38份、酶活物质3份及表面活性剂3份充分搅拌混匀，制得粉状产品。

为了进一步验证本发明所述的生防菌素素叶面肥的优越性能，发明人对此展开了一系列研究试验，篇幅所限，此处仅例举个别实施例的试验数据，本领域技术人员能够理解以本发明其他实施例重复下述试验，也能够得到相同或相近的试验结论。

实验例1 生防菌素素叶面肥防治水稻稻瘟病效果试验

1 试验目的

为验证本发明实施例1的生防菌素叶面肥对水稻稻瘟病的防治效果和最佳施用量，特设置本试验。

2 试验地基本情况

2.1试验地安排在湖南省永州市零陵区菱角塘社公山村，面积2.2亩。地处低洼地，常年积水，为水稻稻瘟病常发区。土壤为鸭屎泥粘重土，有机质含量3.2%，pH值6.5，肥水条件一般。

2.2试验水稻品种为金优899水稻(湘审稻2004007)适宜湘南稻瘟病轻发区作早稻种植，全生育期113d，于4月3日播种，4月28日移栽大田。移栽时底施碳酸氢铵40kg、过磷酸钙35kg。于6月23日施药。

3 供试药剂

3.1试验材料为本发明实施例1的生防菌素素叶面肥；对照药剂为75%三环唑可湿性粉剂，浙江龙湾化工有限公司;

3.23WBD-18A型背负式手动喷雾器,台州市路桥区达远机械配件厂生产。

4、试验设计与安排

4.1试验设置5个处理，4次重复。处理1～3均用本发明实施例1的生防菌素素叶面肥，施用量分别为7500g/hm²、15000g/hm²、22500g/hm²,兑水675kg/hm²喷雾；处理4为75%三环唑可湿性粉剂，施药剂量为412.5g/hm²，兑水675kg/hm²；处理5对照为清水675kg/hm²。各小区随机区组排列，小区面积33.3m²，各小区之间筑有小埂。

4.2施用时间和次数：手动喷雾器喷雾，以混合液均匀喷湿叶片且欲滴未滴为度。两次喷施分别于6月29日、7月8日进行，施用期间正值水稻始穗期和齐穗期。施用剂量为675kg/hm²。6月10日用辛硫磷颗粒剂全面防治二化螟。

5 调查、记录和计算方法

5.1调查时间和次数：共调查了3次，6月29日进行二次施用后防效调查。

5.2调查方法每个小区按对角线5点取样，每点调查50株，每株调查剑叶及剑叶以下两片叶，统计各级病叶数。对调查的病叶进行分级。0级：无病。1级：叶片病斑少于5个，长度小于1厘米。3级：叶片有病斑6～10个，部分病斑长度大于1厘米。5级：叶片有病斑11～25个，部分病斑连成片，占叶面积的10%～25%。7级：叶片有病斑26个以上，病斑连成片，占叶面积的26%～50%。9级：病斑连成片，占叶面积的50%以上或全叶枯死。

5.3药效计算方法

病情指数＝∑［各级病叶（穗）数×相对级数值］×100/调查总叶（穗）数×9

防治效果(%)＝［1-(CK0×PT1/CK1×PT0)］×100

上式中，CK0、CK1分别为空白对照区施用前、后病情指数，PT0、PT1分别为处理区施用前、后病情指数。

6 结果与分析

表1 生防菌素素叶面肥防治稻瘟病效果（两次施用后）

对两次施用后9d各小区防效，采用邓肯氏新复极差法（DMRT），利用DPS软件系统对试验数据进行统计分析，结果表明：处理3防效最高，与处理2间差异显著，与处理1、处理4间差异极显著；处理2与处理1、处理4间差异极显著（见表1）；处理1防效最差，且与处理4间差异不显著。说明本发明实施例1的生防菌素素叶面肥对稻瘟病的防治效果很好，且用量15000g/hm²与10000g/hm2的效果相当，因此推荐用量为10000g/hm²，兑水675kg/hm²喷雾，在水稻始穗期和齐穗期各一次。

试验例2 生防菌素叶面肥防治稻瘟病药效对比试验

本发明实施例1的生防菌素叶面肥防治稻瘟病，主要是通过竞争性生长繁殖占居生存空间，在植物表面迅速形成一层高密保护膜，阻止植物病原真菌的生长，保护农作物免受病原菌为害，其分泌抑菌物质，抑制病菌孢子发芽和菌丝生长，达到预防与治疗的目的。为了验证其防治效果，特设计本试验。

1 供试材料及方法

1.1供试药剂①本发明实施例1的生防菌素素叶面肥;②40%稻瘟灵，重庆东方农药有限公司生产;③25%使百克乳油，江苏辉丰农药厂生产。

1.2防治试验采取大田小区药效试验与大区示范相结合的方法。小区试验设3次重复，大区不设重复。发病初期，第一次施用前调查病情基数，第二次（施用后9d，下一次施用前）调查水稻叶瘟，第三次（第二次施用后9d）调查水稻穗颈瘟，共调查3次。每次调查后，根据病情指数计算防治效果。

1.3试验设计及使用剂量①处理1：本发明实施例1的生防菌素素叶面肥7500g/hm²；②处理2：本发明实施例1的生防菌素素叶面肥15000g/hm²；③处理3本发明实施例1的生防菌素素叶面肥22500g/hm²；④处理4：40%稻瘟灵1200g/hm²；⑤处理5：25%使百克1500g/hm²；⑥处理6：空白对照。

2 施药及防效调查

2.1施药器械选用3WF-2.6型机动式弥雾机。半干粉兑水750kg/hm²喷雾。

2.2试验调查第一次施用3～7d调查安全性。平均防效调查见表2。

表2 生防菌素素叶面肥平均防效调查

3 调查结果分析

3.1安全性调查在施药后3～7d通过目测观察，处理①～处理⑤与对照区比植株生长正常，对水稻安全无药害。

3.2防效调查从防效调查表中可见，小区试验中使用不同剂量本发明实施例1的生防菌素素叶面肥对水稻稻瘟病均有优异防效，处理②和处理③大田示范中表现防效稳定，叶瘟防效、穗颈瘟防效均好于40%稻瘟灵，与25%使百克效果相当。从经济效益讲当以处理2为最好。

4 结论

4.1本发明实施例1的生防菌素素叶面肥对水稻安全无药害。

4.2本发明实施例1的生防菌素素叶面肥对水稻稻瘟病具有较好的预防和治疗效果，防治效果与25%使百克防治稻瘟病效果接近。

4.3本发明实施例1的生防菌素素叶面肥防治水稻稻瘟病使用剂量15000g/hm²为宜。

4.4本发明实施例1的生防菌素素叶面肥用于防治水稻稻瘟病，为生产绿色食品水稻提供了安全防治手段。

4.5本发明实施例1的生防菌素素叶面肥活芽孢不易产生抗药性，丰富了水稻稻瘟病防治药剂的种类。

4.6因本发明实施例1的生防菌素素叶面肥为活芽孢，所以最好单用，不与其他化学药剂混用，需使用其他药剂时，应间隔7d左右，以免影响活芽孢效果。

实验例3 生防菌素叶面肥防治稻瘟病效果试验

近几年生产中存在大面积种植单一品种、品种多为优质米、肥水管理不当等问题，造成水稻稻瘟病连年上升，化学农药用量越来越大，且很难防治。本发明实施例1的生防菌素素叶面肥防治水稻稻瘟病防效较好，为进一步验证其效果特设计本实验。

1 材料与方法

1.1试验地点：湖南省永州市零陵区菱角塘镇画眉山村3组。

1.2土壤状况：潴肓型水稻土白磁泥，试前检测土壤有机质25.6g/㎏，碱解氮153mg/㎏，有效磷13.2mg/㎏，速效钾94mg/㎏，pH值5.1。

1.3试验材料：供试材料：本发明实施例1的生防菌素素叶面肥；40％稻瘟灵乳油（重庆中邦药业有限公司）；早稻金优899，全生育期113d，湖南省种子公司生产。

1.3试验设计：试验设5个处理，处理①：生防菌素素叶面肥始穗期7500g/hm²，齐穗期7500g/hm²；处理②：生防菌素素叶面肥始穗期15000g/hm²，齐穗期15000g/hm²；处理③：生防菌素素叶面肥始穗期22500g/hm²，齐穗期150g/hm²；处理④：40％稻瘟灵乳油拔始穗期600g/hm²，齐穗期600g/hm²；⑤以清水作对照（CK）。施用日期分别为始穗期6月27日，齐穗期7月12日。试验采取大区对比法，不设重复，面积各为33.3m²。

1.4试验方法：采用0.01g电子秤量取试验药剂，采用机动弥雾机兑水675kg/hm²喷雾，并于7月5日用10％吡虫啉450g/hm²对水稻潜叶蝇进行防治。各小区管理条件一致。

1.5调查内容与方法：试验共调查3次，分别为第1次施药前（5月26日），最后1次施药前（6月27日）和最后1次施药后14d（7月10日）。叶瘟病采用5点取样法，每点取50株；穗瘟病采用5点取样法，每点取样50穗。于7月23日进行测产。

叶瘟病分级标准：0级：无病；1级：叶片病斑少于5个，长度小于1cm；3级：叶片病斑6～10个，病斑长度大于1cm；5级：叶片病斑11～25个，部分病斑连成片，占叶面积10%～25％；7级：叶片病斑26个以上，病斑连成片，占叶面积26%～50％；9级：病斑连成片，占叶面积50％以上或全叶枯死。穗颈瘟病分级标准：0级：无病；1级：每穗损失5%以上（个别枝梗发病）；3级：每穗损失6%～20%（1/3左右枝梗发病）；5级：每穗损失21%～50%（穗颈或主轴发病，谷粒半瘪）；7级：每穗损失51%～70%（穗颈发病，大部半瘪）；9级：每穗损失71%～100%（穗颈发病造成白穗）。用新复极差（DMRT）法对试验数据进行方差分析，其计算公式如下：

病情指数=∑[各级病叶（穗）数×相对级数]×100/调查总叶（穗）数×最高级数。

防效（%）=(空白对照区病情指数-处理区病情指数)×100/空白对照区病情指数。

2 结果与分析

2.1对水稻的安全性通过观察发现，供试药剂在试验剂量范围内未发现对作物产生药害，各处理均未出现蹲苗、畸形等药害症状，各处理秧苗长势与空白对照无明显差别，对水稻安全。

2.2不同处理对水稻稻瘟病的防效由表3可知，第1次施药前稻瘟病没有发生，没有调查数据。末次施药前调查，处理①～④对水稻稻瘟病叶瘟的防效分别为80.17%、83.97%、89.57%、84.60%，按照防效高低顺序排列为：处理③＞处理④＞处理②＞处理①；未次施药后14d调查，处理①～④对水稻穗瘟的防效分别为80.36％、88.57％、90.46％、93.21％，按防效高低排列为：处理④＞处理③＞处理②＞处理①。虽然从数据上看各处理间防效有一定差

表3 不同处理对水稻稻瘟病的防效

别，方差分析表明，2次调查各处理之间对水稻稻瘟病的防效差异均不显著。

2.3不同处理对水稻产量的影响由表4可以看出，处理①～④的产量分别为8500.00、8710.00、9008.33、8735.83kg/hm²，处理①～④分别较CK增产7.41％、10.07％、13.84％、10.39％。

表4 不同处理对水稻产量的影响

注：小区测产面积为30m²。

3 结论

试验结果表明：本发明实施例1的生防菌素素叶面肥，在试验用量范围内对水稻安全，对水稻稻瘟病防治效果好，增产效果明显，可以在生产中推广使用。推荐以抽穗始期及齐穗期各用1次本发明实施例1的生防菌素素叶面肥茎叶均匀喷雾，用量以15000g/hm²为宜。

实验例4 生防菌素素叶面肥防治稻瘟病大田示范总结

1示范目的：通过试验，探讨生防菌素素叶面肥对稻瘟病的田间防治效果和应用技术，为大面积推广提供科学依据。

2示范材料：生防菌素素叶面肥，本发明实施例1的生防菌素素叶面肥；每亩用量15000g/hm²；对照药材料：25%使百克乳油750ml/hm²，上海迪拜农药有限公司生产。

3示范作物及防治对象：示范作物：陆两优996水稻(湘审稻2005008)全生育期112d左右；防治对象：水稻稻瘟病。

4示范设计：大区对比，不设重复。选自然丘块，每个处理安排1hm²以上，空白对照面积50m²。于田间水稻始穗期和齐穗期各喷雾一次，用量15000kg/hm²，兑水675kg/hm²喷液均匀周到。

5示范地基本情况：示范地点设在湖南省零陵区菱角塘镇罗家桥村，播种4月1～5日，定植时间4月22～26日，土壤类型沙泥田，肥力中等，试前检测土壤有机质25.6g/㎏，碱解氮153mg/㎏，有效磷13.2mg/㎏，速效钾94mg/㎏，pH值5.1。基肥45%（15:15:15）复混肥450kg/hm²，另加135kg/hm2尿素做追肥。

6示范方法：选用生产常用的器械背负式喷雾器，于水稻始穗期、齐穗期各喷雾一次；调查时间施用前、第一次施用后10d，第二次施用后10d各调查一次；示范田采用5点平行取样，每点调查10蔸，共调查50蔸。示范前调查发病基数，施用后10d调查药效；效果计算方法按照国家《农药田间药效试验准则》有关标准进行。

7结果与分析

7.1安全性分析：水稻喷施生防菌素素叶面肥，对水稻安全，株高、叶色、结实正常，无药害症状。

7.2防治效果：喷施生防菌素素叶面肥前调查发病程度为0、第一次喷施后10d，每个处理调查10蔸，调查结果对稻瘟病防效达到88.2%；第二次喷施后10d进行调查，生防菌素素叶面肥防治稻瘟病防效达到86.9%（见表6）。测产调查，喷施生防菌素素叶面肥比空白对照平均增产816kg/hm²（见表5）效果极显著。

表5 生防菌素叶面肥防治稻瘟病第一次喷施后10d调查

表6：生防菌素叶面肥防治稻瘟病第二次施药后10d调查

表7 生防菌素素叶面肥防治稻瘟病测产表

8结论

8.1喷施生防菌素素叶面肥对水稻安全，无药害症状。

8.2喷施生防菌素素叶面肥后进行定点调查，对稻瘟病防效达到88.2%—86.9%，增产效果极显著。

8.3推荐用量生防菌素素叶面肥15000g/hm²。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种生防菌素叶面肥，其特征在于，含有以下重量份的成分：

生防菌素1～3份；黄腐酸钾35～85份；纳米SiO₂10～50份；酶活物质2～6份；表面活性剂2～6份；

其中所述生防菌素为枯草芽孢杆菌和哈茨木霉；

其中，所述酶活物质由蛋白粉和活性酶组成，蛋白粉：活性酶的质量比例为300～100:1；所述活性酶是从大豆青荚中提取的活性酶，提取方法为：首先将大豆上等好的青荚进行植物组织细胞的破碎，采用pH值6.0的磷酸缓冲液按照料液比1：5混合于器皿中，得到的混合液进行过滤，过滤2～3次，除掉固体杂质，得到酶的粗提取液；然后对得到的粗提取液58℃水浴加热，10分钟后取出器皿，静置5分钟，器皿底部沉淀出大豆青夹中含有的固体杂质蛋白质，取上清液于另一器皿中，用pH值5.8的硫酸铵进行沉淀，最后用pH值5.7的磷酸缓冲液对沉淀溶解得到的酶液进行分离纯化；

所述表面活性剂为植物源表面活性剂，采用油茶枯饼粉碎后，用2倍重量的水浸泡48h所得的浸提物经过滤后所得的上清液。

2.根据权利要求1所述的生防菌叶面肥，其特征在于，所述生防菌素中枯草芽孢杆菌含有3.0～9.0×10⁹cfu/g，哈茨木霉含有1.0～2.0×10⁹cfu/g。

3.根据权利要求1所述的生防菌素叶面肥，其特征在于，其中所述纳米SiO₂为纳米级气相二氧化硅，粒径为30～40纳米。

4.根据权利要求1所述的生防菌叶面肥，其特征在于，所述酶活物质由蛋白粉和活性酶组成，蛋白粉：活性酶的质量比例为200:1。

5.根据权利要求1-4任一所述的生防菌素叶面肥，其特征在于，所述生防菌由以下方法制备得到：

将哈茨木霉的原始菌种在无菌条件下依次进行斜面培养、摇床培养、发酵罐培养、固体发酵产孢后，将得到的完全产孢的培养基浸泡在清水中制成孢子悬浮液，从而得到哈茨木霉孢子悬浮液，然后将得到的哈茨木霉孢子悬浮液浓缩干燥制备成哈茨木霉孢子粉；

6.根据权利要求5所述的生防菌素叶面肥，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌孢子粉的制备方法为：

1)斜面培养：将枯草芽孢杆菌的原始菌种在无菌条件下接种于斜面培养基上，在29±1℃条件下培养36～48h；

2)摇床培养：将步骤1)培养得到的菌种接种于液体培养基，在pH6.5～7.0、温度为30±2℃条件下，140～160r/min摇床培养36～48h；

3)发酵罐培养：将步骤2)培养得到的菌种接种于发酵罐培养基，在pH7.5～8.0、罐压0.5kg、温度为30±2℃、通风量1:0.8～1.1条件下，至菌数大于1.0～1.2×10¹⁰/mL时下罐，得到发酵液，将发酵液经过浓缩干燥制备成枯草芽孢杆菌孢子粉；

所述哈茨木霉孢子粉的制备方法为：

1)将哈茨木霉的原始菌种在无菌条件下接种于斜面培养基上，在28±1℃条件下培养48h；

2)摇床培养：将步骤1)培养得到的菌种接种于液体培养基，在pH6.5～6.8、温度为30±1℃条件下，160～200r/min摇床培养24h；

3)发酵罐培养：将步骤2)培养得到的菌种接种于发酵罐培养基，在pH6.5～6.8、罐压0.5kg、温度为27～28℃、通风量为1:0.7，至菌丝体占总体积的15～25％时停止；

4)固体发酵产孢：将步骤3)发酵罐培养得到的菌丝体接种到固体发酵培养基上，培养至85～95％菌体转成芽孢；

5)将步骤4)得到的固体发酵产孢的培养基浸泡在清水中制成悬浮液，即为哈茨木霉孢子悬浮液，浓缩干燥制备成哈茨木霉孢子粉。

7.根据权利要求1-4任一所述的生防菌素叶面肥，其特征在于，所述生防菌素叶面肥的剂型为水剂或粉状剂型。

8.权利要求1-7任一所述的生防菌叶面肥在防治农作物病虫害中的应用。