CN106007967A - 一种微生物叶面肥的制备方法 - Google Patents

一种微生物叶面肥的制备方法 Download PDF

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白志辉
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Abstract

本发明涉及微生物肥料制备技术领域，特别涉及一种微生物叶面肥的制备方法。该微生物叶面肥的制备方法包括如下操作步骤：(1)培养基配制；(2)菌种活化；(3)液体种子制备；(4)液态发酵；(5)烟末浸出液制备；(6)叶面肥制备。该制备方法简单操作简单，成本低，制得的微生物叶面肥既能防治植物病害，又能促进植物生长，大大减少了化肥和农药的使用量，改善了农田环境质量，提高了农产品品质；通过在发酵底物中添加钼酸铵，提升了发酵产物中枯草芽孢杆菌数量，通过枯草芽孢杆菌的代谢产物与钼酸铵螯合，将钼元素固定在微生物体内；通过烟末和海藻液的加入，与活菌体培养物有机结合，优势互补，充分发挥出更好的杀虫效果和促生长效果。

Description

一种微生物叶面肥的制备方法
(一)技术领域
本发明涉及微生物肥料制备技术领域，特别涉及一种微生物叶面肥的制备方法。
(二)背景技术
叶面肥是植物吸收营养成分的一种重要补充，可弥补根系吸收养分的不足，其特点是营养吸收快、作用强、用量省、效率高、环境友好。然而，随着植物生长过程中各种病虫害的影响的加剧，现有叶面肥已无法满足既能促进植物生长又能拮抗植物病害的要求，不利于植物、作物的增产增收，无法满足农业产业化及农户效益，损害了农户经济利益。
现有叶面肥应用上，有报道采用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)制备的菌剂用于防治多种作物的白粉病、霜露病、疫病、灰霉病等病害；然而，作为新型菌种，筛选过程繁琐、周期长，获得功效稳定且高产的菌株成本较高。通过现有研发的优良菌株，进行叶面肥制作原料及制备方法上的改进，获取既能促进植物生长又能拮抗植物病害要求的微生物叶面肥成为当前节约成本、综合利用资源的科研创新新渠道。
(三)发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种应用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SZX11制备微生物叶面肥的方法，制得的微生物叶面肥既能防治植物病害，又能促进植物生长，解决了现有技术中存在的问题。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种微生物叶面肥的制备方法，包括如下操作步骤：
(1)培养基配制：分别配制菌种活化培养基、种子培养基和发酵培养基，高温灭菌后备用；
所述菌种活化培养基为：糖蜜20g，酵母膏5g，钼酸铵1-3g，加水至1L，pH 7.0-7.5；
所述种子培养基为：MgSO4 1.0g，KH2PO4 5.0g，NaC1 5.0g，K2HPO4 15.0g，糖蜜200g，酵母膏50g，钼酸铵20-50g，加水至10L，pH 7.0-7.5；
所述发酵培养基为：MgSO4 20g，KH2PO4 100g，NaC1 100g，K2HPO4 300g，(NH4)2SO4 0.5kg，糖蜜6kg，豆饼粉3kg，钼酸铵0.5-1.2kg，加水至200L，pH7.0-7.5；
(2)菌种活化：挑取斜面保藏的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SZX11接种于步骤(1)制得的菌种活化培养基中，于35℃，150-200r/min摇床振荡培养16-24h，得活化枯草芽孢杆菌菌液；
(3)液体种子制备：按3％-8％(体积百分数)的接种量将步骤(2)活化的枯草芽孢杆菌菌液接种于步骤(1)制得的种子培养基中，于45-55℃，通空气培养16-24h，得到液体种子；
(4)液态发酵：按3％-8％(体积百分数)的接种量将步骤(3)制得的液体种子接种于步骤(1)制得的发酵培养基中，于35-45℃，通无菌空气培养15-24h，经平板细菌计数，活菌数达3×109-9×109CFU/mL，即得活菌体培养物；
(5)烟末浸出液制备：将45-55kg的废次烟末放入桶中，加入45-55kg的水浸提20-24h，期间每隔2h进行搅拌；将浸出液用纱布反复过滤后得到清液，即为烟末浸出液，备用；
(6)叶面肥制备：向步骤(4)制得的活菌体培养物中分别加入步骤(5)制得的烟末浸出液和市售海藻液以及质量分数为0.5％的甘氨酸、质量分数为0.5％的尿素和质量分数为0.5％-2％的吐温80，搅拌均匀；其中，活菌体培养物与烟末浸出液、海藻液、甘氨酸、尿素和吐温的体积配比为60-70：15-20：5-10：0.5-1:3-5:1-5，即得微生物叶面肥。
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SZX11，已于2013年9月16号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.8188，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
上述微生物叶面肥的使用方法：使用时用水稀释100-200倍，在农作物的苗期和蕾期叶面喷施。
本发明的有益效果是：
1、本发明枯草芽孢杆菌兼具促进植物生长和拮抗植物病原菌功能，经其发酵制备所得的微生物叶面肥兼具促进作物生长和防治植物叶面的病害的双重作用，大大减少了化肥和农药的使用量，改善了农田环境质量，提高了农产品的品质。本发明枯草芽孢杆菌可成功定殖于植物根际、体表或体内，同病原菌竞争植物周围的营养、分泌抗菌物质抑制病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而具有生防的效果；枯草芽孢杆菌还能够产生类似细胞分裂素、植物生长激素的物质，促进植物的生长，对于多种作物的白粉病、霜露病、疫病、灰霉病等病害有很好的防治效果。
2、在本发明制备方法中，通过在发酵底物中添加钼酸铵，提升了发酵产物中枯草芽孢杆菌的数量；通过微生物的代谢以及微生物代谢产物与钼酸铵的螯合作用，将钼元素固定在微生物体内，钼是固氮酶和硝酸还原酶的组成元素，因此，含钼叶面肥可以促进叶际微生物的固氮作用，促进植物中硝酸盐的转化，能降低叶菜类的硝酸盐含量，提高蔬菜品质，钼还能促进作物对磷的吸收和无机磷向有机磷的转化，从而促进有机磷农药的降解，降低农药残留，此外，钼在维生素C和碳水化合物的生成、运转和转化中都有重要作用，能够显著提高作物产量和品质。该制备方法所制备的叶面肥喷在叶面后能使钼元素缓慢释放，减少雨水冲刷等带来的流失，提升钼酸铵的利用率及微生物叶面肥的作用。
3、本发明制备方法在活菌体培养物中加入了烟末浸出液、市售海藻液以及甘氨酸、尿素和吐温，烟末是香烟工业的副产物，目前多数作为垃圾处理，本方法不仅充分利用了烟末资源，而且利用了烟末中残余的烟碱、果胶、烟酸等物质，发挥出更好的杀虫效果；海藻液中含有天然植物生长调节剂、酚类多聚化合物、甜菜碱、海藻酸及天然抗生素等物质，具有显著的抑菌抗病毒、驱虫效果，真正起到肥药作用，大幅增强作物的抗寒、抗旱、抗病、抗倒伏、抗盐碱能力；通过上述各成分的有机结合，在充分发挥活菌体促植物生长的同时，能保证植物或作物的整个生长周期内发挥最有效的生物杀虫剂作用，增强植物或作物抵抗病虫害的能力，降低土壤施肥量、提高利用率高、减少流失，从而大大降低了环境污染的风险。
(四)具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于此。
实施例1：
一种微生物叶面肥的制备方法，包括如下操作步骤：
(1)培养基配制：分别配制菌种活化培养基、种子培养基和发酵培养基，高温灭菌后备用；
所述菌种活化培养基为：糖蜜20g，酵母膏5g，钼酸铵1g，加水至1L，pH7.0-7.5；
所述种子培养基为：MgSO4 1.0g，KH2PO4 5.0g，NaC1 5.0g，K2HPO4 15.0g，糖蜜200g，酵母膏50g，钼酸铵20g，加水至10L，pH 7.0-7.5；
所述发酵培养基为：MgSO4 20g，KH2PO4 100g，NaC1 100g，K2HPO4 300g，(NH4)2SO4 0.5kg，糖蜜6kg，豆饼粉3kg，钼酸铵0.5kg，加水至200L，pH 7.0-7.5；
(2)菌种活化：挑取斜面保藏的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SZX11接种于步骤(1)制得的菌种活化培养基中，于35℃，150r/min摇床振荡培养16h，得活化枯草芽孢杆菌菌液；
(3)液体种子制备：按3％(体积百分数)的接种量将步骤(2)活化的枯草芽孢杆菌菌液接种于步骤(1)制得的种子培养基中，于45-55℃，通空气培养16h，得到液体种子；
(4)液态发酵：按3％(体积百分数)的接种量将步骤(3)制得的液体种子接种于步骤(1)制得的发酵培养基中，于35-45℃，通无菌空气培养15h，经平板细菌计数，活菌数达9×109CFU/mL，即得活菌体培养物；
(5)烟末浸出液制备：将50kg的废次烟末放入桶中，加入50kg的水浸提22h，期间每隔2h进行搅拌；将浸出液用纱布反复过滤后得到清液，即为烟末浸出液，备用；
(6)叶面肥制备：取60L步骤(4)制得的活菌体培养物，分别加入15L步骤(5)制得的烟末浸出液、5L市售海藻液、0.5L质量分数为0.5％的甘氨酸、3L质量分数为0.5％的尿素和1L质量分数为0.5％的吐温80，搅拌均匀，即得微生物叶面肥。
上述市售海藻液购自青岛海大生物集团。
上述方法制得的微生物叶面肥的使用方法：使用时用水稀释100-200倍，在农作物的苗期和蕾期叶面喷施。
实施例2：
一种微生物叶面肥的制备方法，包括如下操作步骤：
(1)培养基配制：分别配制菌种活化培养基、种子培养基和发酵培养基，高温灭菌后备用；
所述菌种活化培养基为：糖蜜20g，酵母膏5g，钼酸铵3g，加水至1L，pH7.0-7.5；
所述种子培养基为：MgSO4 1.0g，KH2PO4 5.0g，NaC1 5.0g，K2HPO4 15.0g，糖蜜200g，酵母膏50g，钼酸铵50g，加水至10L，pH 7.0-7.5；
所述发酵培养基为：MgSO4 20g，KH2PO4 100g，NaC1 100g，K2HPO4 300g，(NH4)2SO4 0.5kg，糖蜜6kg，豆饼粉3kg，钼酸铵1.2kg，加水至200L，pH 7.0-7.5；
(2)菌种活化：挑取斜面保藏的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SZX11接种于步骤(1)制得的菌种活化培养基中，于35℃，200r/min摇床振荡培养24h，得活化枯草芽孢杆菌菌液；
(3)液体种子制备：按8％(体积百分数)的接种量将步骤(2)活化的枯草芽孢杆菌菌液接种于步骤(1)制得的种子培养基中，于45-55℃，通空气培养24h，得到液体种子；
(4)液态发酵：按8％(体积百分数)的接种量将步骤(3)制得的液体种子接种于步骤(1)制得的发酵培养基中，于35-45℃，通无菌空气培养24h，经平板细菌计数，活菌数达7×109CFU/mL，即得活菌体培养物；
(5)烟末浸出液制备：将45kg的废次烟末放入桶中，加入45kg的水浸提24h，期间每隔2h进行搅拌；将浸出液用纱布反复过滤后得到清液，即为烟末浸出液，备用；
(6)叶面肥制备：取70L步骤(4)制得的活菌体培养物，分别加入20L步骤(5)制得的烟末浸出液、10L市售海藻液、1L质量分数为0.5％的甘氨酸、5L质量分数为0.5％的尿素和5L质量分数为1％的吐温80，搅拌均匀，即得微生物叶面肥。
上述市售海藻液购自青岛海大生物集团。
上述方法制得的微生物叶面肥的使用方法同实施例1制得的微生物叶面肥的使用方法。
实施例3：
一种微生物叶面肥的制备方法，包括如下操作步骤：
(1)培养基配制：分别配制菌种活化培养基、种子培养基和发酵培养基，高温灭菌后备用；
所述菌种活化培养基为：糖蜜20g，酵母膏5g，钼酸铵2g，加水至1L，pH7.0-7.5；
所述种子培养基为：MgSO4 1.0g，KH2PO4 5.0g，NaC1 5.0g，K2HPO4 15.0g，糖蜜200g，酵母膏50g，钼酸铵35g，加水至10L，pH 7.0-7.5；
所述发酵培养基为：MgSO4 20g，KH2PO4 100g，NaC1 100g，K2HPO4 300g，(NH4)2SO4 0.5kg，糖蜜6kg，豆饼粉3kg，钼酸铵0.8kg，加水至200L，pH 7.0-7.5；
(2)菌种活化：挑取斜面保藏的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SZX11接种于步骤(1)制得的菌种活化培养基中，于35℃，150r/min摇床振荡培养20h，得活化枯草芽孢杆菌菌液；
(3)液体种子制备：按5％(体积百分数)的接种量将步骤(2)活化的枯草芽孢杆菌菌液接种于步骤(1)制得的种子培养基中，于42℃，通空气培养20h，得到液体种子；
(4)液态发酵：按5％(体积百分数)的接种量将步骤(3)制得的液体种子接种于步骤(1)制得的发酵培养基中，于35-45℃，通无菌空气培养20h，经平板细菌计数，活菌数达6×109CFU/mL，即得活菌体培养物；
(5)烟末浸出液制备：将55kg的废次烟末放入桶中，加入55kg的水浸提20h，期间每隔2h进行搅拌；将浸出液用纱布反复过滤后得到清液，即为烟末浸出液，备用；
(6)叶面肥制备：取62L步骤(4)制得的活菌体培养物，分别加入16L步骤(5)制得的烟末浸出液、6L市售海藻液、0.8L质量分数为0.5％的甘氨酸、4L质量分数为0.5％的尿素和2L质量分数为2％的吐温80，搅拌均匀，即得微生物叶面肥。
上述市售海藻液购自青岛海大生物集团。
上述方法制得的微生物叶面肥的使用方法同实施例1制得的微生物叶面肥的使用方法。
实施例4
一种微生物叶面肥的制备方法，包括如下操作步骤：
(1)培养基配制：分别配制菌种活化培养基、种子培养基和发酵培养基，高温灭菌后备用；
所述菌种活化培养基为：糖蜜20g，酵母膏5g，钼酸铵1.5g，加水至1L，pH 7.0-7.5；
所述种子培养基为：MgSO4 1.0g，KH2PO4 5.0g，NaC1 5.0g，K2HPO4 15.0g，糖蜜200g，酵母膏50g，钼酸铵25g，加水至10L，pH 7.0-7.5；
所述发酵培养基为：MgSO4 20g，KH2PO4 100g，NaC1 100g，K2HPO4 300g，(NH4)2SO4 0.5kg，糖蜜6kg，豆饼粉3kg，钼酸铵1kg，加水至200L，pH 7.0-7.5；
(2)菌种活化：挑取斜面保藏的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SZX11接种于步骤(1)制得的菌种活化培养基中，于35℃，150r/min摇床振荡培养22h，得活化枯草芽孢杆菌菌液；
(3)液体种子制备：按6％(体积百分数)的接种量将步骤(2)活化的枯草芽孢杆菌菌液接种于步骤(1)制得的种子培养基中，于45-50℃，通空气培养22h，得到液体种子；
(4)液态发酵：按5％(体积百分数)的接种量将步骤(3)制得的液体种子接种于步骤(1)制得的发酵培养基中，于40℃，通无菌空气培养20h，经平板细菌计数，活菌数达8×109CFU/mL，即得活菌体培养物；
(5)烟末浸出液制备：将50kg的废次烟末放入桶中，加入50kg的水浸提23h，期间每隔2h进行搅拌；将浸出液用纱布反复过滤后得到清液，即为烟末浸出液；
(6)叶面肥制备：取65L步骤(4)制得的活菌体培养物，分别加入18L步骤(5)制得的烟末浸出液、8L市售海藻液、0.7L质量分数为0.5％的甘氨酸、4L质量分数为0.5％的尿素和3L质量分数为0.5％的吐温80，搅拌均匀，即得微生物叶面肥。
上述市售海藻液购自青岛海大生物集团。
上述方法制得的微生物叶面肥的使用方法同实施例1制得的微生物叶面肥的使用方法。
将采用本发明方法制得的微生物叶面肥应用于黄瓜种植，具体试验如下：
采用蔬菜大棚小区实验，在常年种植蔬菜的大棚中设置12个条件完全相同的实验小区，每个小区100m2，3个小区为1组平行试验，共分成4组，种植黄瓜。在黄瓜幼苗期，第1组的3个小区喷施200倍稀释的本发明制备的微生物叶面肥，每10天左右喷施1次，直到结果期停止喷施，共喷施4-5次。第2组的3个小区不喷施叶面肥，与第1组相同方法喷水作为对照。第3组的3个小区喷施不含钼酸铵的培养基发酵的枯草芽孢杆菌稀释液，稀释倍数与第1组相同。第4组的3个小区喷施钼酸铵的水溶液，钼酸铵含量与第1组相同。其他管理方式与常规大棚黄瓜管理方式相同。由于蔬菜大棚中湿度较高，温度适宜，黄瓜叶片非常容易感染各种病害，如：白粉病、霜霉病、黑星病等。在实验过程中，第1组和第3组黄瓜的病情指数比第2组和第4组显著降低，期间，第1组和第3组减少了2次化学防治(喷施杀菌剂)。在黄瓜的收获期，检测黄瓜中硝酸盐的含量，第1组比第2组降低33％左右，第3组和第4组黄瓜中硝酸盐含量与第2组差别不显著。黄瓜的总产量第1组和第3组比第2组提高17％左右，第4组与第2组产量相当。
由试验结果可见，施加本发明制备的微生物叶面肥所种植的黄瓜，较不施加肥料、施加不含钼酸铵培养基发酵的叶面肥以及喷施钼酸铵水溶液的黄瓜，病情指数显著降低，化肥使用量及施用次数降低；所收获的黄瓜中硝酸盐含量明显降低，黄瓜总产量明显提高。

Claims (2)

1.一种微生物叶面肥的制备方法，其特征是：包括如下操作步骤：
(1)培养基配制：分别配制菌种活化培养基、种子培养基和发酵培养基，高温灭菌后备用；
所述菌种活化培养基为：糖蜜20g，酵母膏5g，钼酸铵1-3g，加水至1L，pH 7.0-7.5；
所述种子培养基为：MgSO4 1.0g，KH2PO4 5.0g，NaC1 5.0g，K2HPO4 15.0g，糖蜜200g，酵母膏50g，钼酸铵20-50g，加水至10L，pH 7.0-7.5；
所述发酵培养基为：MgSO4 20g，KH2PO4 100g，NaC1 100g，K2HPO4 300g，(NH4)2SO4 0.5kg，糖蜜6kg，豆饼粉3kg，钼酸铵0.5-1.2kg，加水至200L，pH7.0-7.5；
(2)菌种活化：挑取斜面保藏的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SZX11接种于步骤(1)制得的菌种活化培养基中，于35℃，150-200r/min摇床振荡培养16-24h，得活化枯草芽孢杆菌菌液；
(3)液体种子制备：按3％-8％(体积百分数)的接种量将步骤(2)活化的枯草芽孢杆菌菌液接种于步骤(1)制得的种子培养基中，于45-55℃，通空气培养16-24h，得到液体种子；
(4)液态发酵：按3％-8％(体积百分数)的接种量将步骤(3)制得的液体种子接种于步骤(1)制得的发酵培养基中，于35-45℃，通无菌空气培养15-24h，经平板细菌计数，活菌数达3×109-9×109CFU/mL，即得活菌体培养物；
(5)烟末浸出液制备：将45-55kg的废次烟末放入桶中，加入45-55kg的水浸提20-24h，期间每隔2h进行搅拌；将浸出液用纱布反复过滤后得到清液，即为烟末浸出液，备用；
(6)叶面肥制备：向步骤(4)制得的活菌体培养物中分别加入步骤(5)制得的烟末浸出液和市售海藻液以及质量分数为0.5％的甘氨酸、质量分数为0.5％的尿素和质量分数为0.5％-2％的吐温80，搅拌均匀；其中，活菌体培养物与烟末浸出液、海藻液、甘氨酸、尿素和吐温的体积配比为60-70：15-20：5-10：0.5-1:3-5:1-5，即得微生物叶面肥。
2.根据权利要求1所述的一种微生物叶面肥的制备方法，其特征是：步骤(5)所述活菌体培养物与烟末浸出液、海藻液、甘氨酸、尿素和吐温的体积配比为65:18:8:0.7:4:3。
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