CN104744112A - 一种复合叶面肥及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明实施例提供了一种复合叶面肥及其制备方法，涉及生物制剂领域，可以达到增产增收效果和抗病作用。所述复合叶面肥按照重量配比包括以下成分：由植物乳杆菌制成的植物乳杆菌发酵液200份-350份，由枯草芽孢杆菌制成的枯草芽孢杆菌发酵液200份-350份，以及复合氨基酸粉30份-50份；所述植物乳杆菌于2014年2月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.8833；所述枯草芽孢杆菌于2014年2月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.8834。所述复合叶面肥可用于各种植株的叶面施肥。

Description

一种复合叶面肥及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物制剂领域，尤其涉及一种复合叶面肥及其制备方法。

背景技术

“肥料是植物的粮食”。中国是世界上作物残茬堆肥、人畜粪尿再循环利用最好的国家。但是仅仅依靠生态系统内部的物质循环使用，难以大幅度的提高作物单产，且长期的高密度耕作使得土壤肥力日渐下降。面对日益增加的粮食需求，化肥的出现为农作物的生长提供了新的养分来源，使得农业生产进入了新的时代，化肥对粮食增产的贡献率达到30％-50％。2012年全国粮食总产量58957万吨，比2011年增加1836万吨，增长3.2％，我国粮食生产实现了连续九年增产。然而化肥的过量使用使得土壤品质日益退化、基础肥力下降和严重的环境污染，传统的根际施肥模式所带来的增产潜力已近极限，迫切需要开发绿色环保高效的新型肥料。

大多数陆生依靠根系吸收营养物质供给植物体的生长发育。传统的施肥方法是把肥料施于根际土壤中，由植物的根系从土壤中营养。但是除了根以外，植物还可以通过茎叶(主要是叶)吸收营养物质，这种现象称为植物根外营养。一般将通过植物根系以外的营养体表面施用肥料的措施叫根外施肥，可用做植物叶面施肥的肥料叫做叶面肥。自1844年格里斯发现钙诱导的缺铁症的叶片在施用铁可以恢复，说明植物能够通过其地上部吸收养分。除了根际施肥，叶面施肥提供了另外一条有效的施肥途径。叶面施肥打破了传统根际施肥的固有模式，是构筑立体施肥模式的重要元素，为进一步提高作物产量、减少环境污染、实现农业的可持续发展带来了曙光。

叶面肥喷施于叶片之后，其中的养分主要通过三种途径进入叶片内部。一种是通过植物叶片表皮细胞外面角质层，角质层由一种带有羟基和羧基的长链脂肪酸聚合物组成，这种聚合物的分子间隙及分子上的羟基、羧基亲水基团可以让水溶液渗透进入叶内，对于离子和小分子活性物质可以自由通过亲水小孔渗透进入叶片内部。另一途径是通过叶片表面的气孔，叶面上气孔很多，达到100-200个/mm²。另外 叶片细胞的质外连丝可以像根系一样通过主动吸收把营养物质转运至叶片内部。

与传统的土壤施肥相比，叶面施肥有其显著的优势和特点：

(1)吸收快。不需要经过根和茎的长距离运输，可以直接转运至叶片内部，可以迅速矫正作物养分缺乏症状。如苹果叶面喷施尿素，1-4小时即可吸收50％所施养分。

(2)避免土壤的固定作用，提高肥料利用效率。肥料施入土壤后，因土壤反硝化、淋失等作用导致的养分损失或土壤酸碱度的变化形成沉淀物，以及元素间的相互影响使作物无法利用。叶面肥直接喷于叶片表面，基本上不存在土壤对养分的固定作用，可以提高肥效。

(3)针对性强。可以根据作物叶片缺素特征或者在作物生长的不同生育阶段对某种养分需求较多，针对性的喷施所需营养元素。

(4)用量小，成本低廉。叶面施肥与土壤施肥相比，达到相同效果叶面施肥所需用量仅为土壤施肥的1/10-1/5。

研究表明，施用叶面肥可以提高作物根系活力和光合速率，抑制叶绿素的降解，提高还原酶活性并降低细胞膜脂过氧化水平，起到促进作物生长、防止早衰的作用，在促进作物增产、改善品质及增强作物抗逆性方面有显著效果。叶面施肥已成为农业生产中一项不可缺少的技术措施。因此，开发新型环保高效叶面肥，对于农业的可持续发展具有重要的意义。

发明内容

本发明的实施例提供一种复合叶面肥及其制备方法，可以达到增产增收效果和抗病作用。

为达到上述目的，本发明的实施例采用如下技术方案：

一种复合叶面肥，按照重量配比，所述复合叶面肥包括以下成分：由植物乳杆菌制成的植物乳杆菌发酵液200份-350份，由枯草芽孢杆菌制成的枯草芽孢杆菌发酵液200份-350份，复合氨基酸粉30份-50份；

其中，所述植物乳杆菌(Lactoballus planetarum)于2014年2月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.8833；所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)于2014 年2月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.8834。

优选的，所述植物乳杆菌制成的植物乳杆菌发酵液中有效菌数大于1×10⁹cfu/ml，所述枯草芽孢杆菌发酵液中有效菌体浓度为1-3×10⁹cfu/ml。

进一步优选的，按照所述重量配比，所述复合叶面肥还包括，轻稀土5份-10份，腐植酸20份-50份，尿素15份-30份，磷酸二氢钾10份-25份，硼酸钠2份-5份，硫酸锌1份-3份。

一种复合叶面肥的制备方法，根据上述的复合叶面肥中各成分的重量配比，将植物乳杆菌发酵液和枯草芽孢杆菌发酵液混合均匀，然后将复合氨基酸粉、轻稀土、腐植酸、尿素、磷酸二氢钾、硼酸钠、硫酸锌加入，混合均匀后分装。

可选的，所述植物乳杆菌发酵液的获得方法包括：

将冻干保存的植物乳杆菌粉剂接入MRS培养基中，在37℃下培养24小时；然后1％接种量接种于发酵培养基，在37℃下发酵16-18小时；其中，所述MRS培养基为：牛肉蛋白粉10g、鱼肉提取物10g、酵母提取物10g、葡萄糖10g、醋酸钠5g、柠檬酸铵2g、吐温801g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、四水硫酸锰0.05g、七水硫酸镁0.2g、定容至1000ml、pH6.2；所述发酵培养基包括：蛋白胨10g、酵母粉5g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、柠檬酸二铵2g、吐温801ml、K₂HPO₄2g、MnSO₄·4H₂O0.25g、MgSO₄·7H₂O0.58g、NaAc5g、CaCO₃15g，定容至1000ml，pH6.4；

所述枯草芽孢杆菌发酵液的获得方法包括：

将所述枯草芽孢杆菌划线接种于LB固体培养基37℃培养48h；接种环挑取菌体接种于液体LB培养基中，180rpm、37℃培养24h；以1％接种量接种于玉米粉豆粕培养基，进行发酵培养；发酵条件为：温度37℃，罐压0.1Mpa，通风0.8-1vvm，转速180rpm，培养时间为2-3天，获得枯草芽孢杆菌发酵液；其中，所述LB固体培养基包括：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂20g、去离子水1000ml、pH7.0；所述玉米粉豆粕培养基包括：玉米粉2％，豆粕粉7％，磷酸氢二钠0.4％，磷酸二氢钾0.03％，MgSO₄·7H₂O0.1％，消泡剂0.02-0.005％，pH6.8-7.0。

上述技术方案提供的复合叶面肥及其制备方法，通过由植物乳杆 菌发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液以及复合氨基酸制成复合叶面肥，由于枯草芽孢杆菌菌体和植物乳杆菌生长过程中产生多种具有特殊生理作用的次生代谢产物，如有机酸、吡嗪类、抗菌环状肽、卡糖胺等活性物质可以抑制致病菌的繁殖，减少病害发生；发酵液中还含有丰富的胞外多糖、氨基酸、植物激素和多种维生素，可以刺激作物生长，提高抗逆性，增加作物产量。故本发明实施例提供的复合叶面肥可以达到增产增收效果和抗病作用。

另外，本发明实施例提供的复合叶面肥还可以添加轻稀土、腐植酸、尿素、磷酸二氢钾、硼酸钠、硫酸锌等，通过补充植株所需营养元素和特殊生理活性物质，促进植物根系发育和光合作用，调节酶促反应，诱导植物抗性，进一步达到防止植株早衰、增强植物抗性、增加作物产量的目的。

保藏说明：所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)于2014年2月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏号CGMCC No.8833；所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)于2014年2月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.8834。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅用于说明本发明而不用于限止本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。

本发明实施例提供了一种复合叶面肥，按照重量配比，所述复合叶面肥包括以下成分：由植物乳杆菌制成的植物乳杆菌发酵液200份-350份，由枯草芽孢杆菌制成的枯草芽孢杆菌发酵液200份-350份，复合氨基酸粉30份-50份。

其中，所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)于2014年2月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.8833；所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)于2014年2月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.8834。

在这里需要说明的是，本发明实施例中所述的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)和所述枯草芽孢杆菌(Bacillus  subtilis)都是从山东省莱芜市黄萎病和枯萎病高发地块健壮棉花植株的根际土壤黄萎病发病严重地块中生长健壮的植株根际土壤中分离的。所述植物乳杆菌命名为LP-1。所述枯草芽孢杆菌命名为BS-1。

上述两种菌株的分离方法：平板划线法(中国科学院南京土壤所微生物室.土壤微生物研究法[M].北京：科学出版杜，1985)，其中LP-1分离所用培养基为MRS(乳酸细菌培养基)培养基(牛肉蛋白粉10g、鱼肉提取物10g、酵母提取物10g、葡萄糖10g、醋酸钠5g、柠檬酸铵2g、吐温801g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、四水硫酸锰0.05g、七水硫酸镁0.2g、定容至1000ml、pH6.2)，BS-1分离所用培养基为LB培养基(胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂20g、去离子水1000ml、pH7.0)。

上述两种菌株的鉴定方法为：形态学特征鉴定和16S rDNA基因片段序列测序。

BS-1鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。BS-1形态学特征：芽孢杆菌属。单个细胞0.7-0.8×2-3微米，芽孢中生，椭圆，胞囊不膨大，无荚膜，周生鞭毛，能运动，革兰氏染色阳性。NA培养基培养24小时后，菌落表面平整不光滑，白色，无光泽，边缘不整齐，在液体培养集中生长时形成皱醭。

LP-1鉴定为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)。LP-1形态学特征：菌落乳白色，中央隆起成小泡状，表面粗糙，边缘不整齐。菌体形态为：杆状，杆较长，两头较圆，成对或链状排列。LP-1菌株的生理生化检验结果显示，LP-1可以产生乳酸，无法发酵糖类物质产气，无运动性，过氧化氢酶试验阴性，革兰氏染色阳性。

所述植物乳杆菌发酵液的获得方法是：将冻干保存的植物乳杆菌粉剂接入MRS培养基(牛肉蛋白粉10g、鱼肉提取物10g、酵母提取物10g、葡萄糖10g、醋酸钠5g、柠檬酸铵2g、吐温801g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、四水硫酸锰0.05g、七水硫酸镁0.2g、定容至1000ml、pH6.2)37℃培养24小时，为种子培养基；然后1％接种量接种于发酵培养基(蛋白胨10g、酵母粉5g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、柠檬酸二铵2g、吐温801ml、K₂HPO₄2g、MnSO₄·4H₂O0.25g、MgSO₄·7H₂O0.58g、NaAc5g、CaCO₃15g，定容至1000ml，pH6.4)，在37℃下发酵16-18小时。发酵结束后，获得植物乳杆菌发酵液。优选的，需要测试保证 发酵液中有效菌数大于1×10⁹cfu/ml，

所述枯草芽孢杆菌发酵液的获得方法是：将保藏的枯草芽孢杆菌菌种划线接种于LB固体培养基(胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂20g、去离子水1000ml、pH7.0)37℃培养48h；接种环挑取菌体接种于液体LB培养基中，180rpm、37℃培养24h；以1％接种量接种于玉米粉豆粕培养基(玉米粉2％，豆粕粉7％，磷酸氢二钠0.4％，磷酸二氢钾0.03％，MgSO₄·7H₂O0.1％，消泡剂0.02-0.005％，pH6.8-7.0)，进行发酵培养。发酵条件为：温度37℃，罐压0.1Mpa，通风0.8-1vvm，转速180rpm，培养时间为2-3天，获得枯草芽孢杆菌发酵液。优选的，需要测试保证有效菌体浓度为1-3×10⁹cfu/ml。

所述复合氨基酸粉是以各种海鱼加工厂下脚料、蒸煮浆水为原料，经微生物发酵、酸碱水解处理后，喷雾干燥加工而成的，可为植物提供更全面的营养。

优选的，按照所述重量配比，所述复合叶面肥还包括，轻稀土5份-10份，腐植酸20份-50份，尿素15份-30份，磷酸二氢钾10份-25份，硼酸钠2份-5份，硫酸锌1份-3份。

其中，所述轻稀土是镧、铈、镨和钕等稀土元素的总称，所述尿素，磷酸二氢钾，硼酸钠，硫酸锌等常见物质，可以提供满足植物生长的各种营养元素。所述腐植酸腐植酸含有多种植物生长调节剂、病毒抑制剂等多种营养成分，可以螯合矿质元素，提高矿质元素的可溶性，激发植物生物活性，提高植物对营养的吸收，促进植物生长。

当然，所述复合叶面肥中还可以包括其他有利于植株健康生长的物质，如生长素或赤霉素等本领域人员清楚了解的物质，可以根据植株的具体情况进行添加，在此不一一例举。

依据生产和施肥经验，并同时兼顾加工和使用中的多种因素，本发明实施例还提供了一种复合叶面肥的制备方法，按照上述各成分的重量配比，将植物乳杆菌发酵液和枯草芽孢杆菌发酵液混合均匀，然后将复合氨基酸粉、轻稀土、腐植酸、尿素、磷酸二氢钾、硼酸钠、硫酸锌加入，混合均匀后分装。

本发明实施例还提供了上述复合叶面肥的使用方法，包括：在作物不同生长时期叶面喷施。

以下提供了上述的一种复合叶面肥(成分为发酵液中有效菌数大 于1×10⁹cfu/ml的植物乳杆菌发酵液、有效菌体浓度为1-3×10⁹cfu/ml的枯草芽孢杆菌发酵液、复合氨基酸粉、轻稀土、腐植酸、尿素、磷酸二氢钾、硼酸钠、硫酸锌)在各种植物上的应用试验。

试验1：试验地供试土壤为沙壤土，有机质19.5g/kg，碱解氮118.3mg/kg，有效磷41.6mg/kg，有效钾79.3mg/kg，pH值6.35，小区面积为100m²。供试作物为玉米，品种为郑单958。试验共设3个处理：叶面肥200倍稀释液喷施(处理组1)；叶面肥400倍稀释液喷施(处理组2)；喷施等量清水(对照组)。前期底肥和后续追肥处理相同，喷施时间为拔节期、大口期、抽雄前期。结果如表1所示，施用本产品后，郑单958穗行数、行粒数、千粒重、产量均有不同程度增加，其产量增产幅度为15％和16％，表明本发明实施例提供的叶面肥可以促进玉米生产，增加籽粒重量，进而提高玉米单产。

表1为叶面肥对夏玉米产量的影响

表1

试验2：叶面肥对济麦20产量的影响(山东章丘)

试验于2011年10月到2012年6月在山东章丘进行，供试土壤0-20cmm土层基础养分状况：有机质11.5g/kg，碱解氮72.3mg/kg，有效磷36.4mg/kg，有效钾115.3mg/kg，pH值6.43。供试作物为小麦，品种为济麦20，日常管理为当地惯用模式。试验设3个处理，同期喷施等量清水(对照组)；叶面肥200倍稀释液喷施(处理组1)；叶面肥400倍稀释液喷施(处理组2)。试验方法为在小麦分蘖期和抽穗期喷施叶面肥。结果如表2所示，施用本发明后，济麦20穗数、穗粒数、千粒重均有不同程度增加，颗粒饱满。本产品可以促进小麦光合作用，提高小麦分蘖率，增加穗粒数和千粒重，提高小麦产量。

表2叶面肥对济麦20产量的影响

表2

试验3：叶面肥对甜瓜品质和产量的影响(山东招远)

试验地供试土壤基本理化性质为：有机质10.8g/kg，碱解氮86.2mg/kg，速效磷26.6mg/kg，速效钾78.5mg/kg，pH值6.35。供试作物为甜瓜，品种为日本甜宝。试验设3个处理：叶面肥400倍稀释液喷施(处理组1)；市售叶面肥400倍稀释液喷施(微量元素叶面肥，含铁、硼、砷、锰、铜等)(处理组2)；喷施清水(对照组)。试验方法为在甜瓜定苗后、花芽出现前期、果实膨大期叶面喷施，喷施时间为下午4点以后，其他田间管理相同。结果如表3所示，喷施本发明产品和市售微量元素叶面肥后甜瓜产量明显增加，甜瓜的果实商品率、单果重和可溶性固形物含量等指数也有提高，改善了甜瓜品质，且本发明的效果优于市售微量元素叶面肥。

表3叶面肥对甜瓜品质和产量的影响

表3

试验4：叶面肥对水稻产量和品质的影响(浙江金华)

试验地块位于浙江省金华市，供试土壤为黄沙泥田，理化性质为：有机质30.5g/kg，碱解氮145.3mg/kg，速效磷86.5mg/kg，速效钾125.1mg/kg，pH值5.3，排灌条件良好。供试作物为水稻，品种为两优培九。试验共设3个处理，分别为清水对照、叶面肥300倍稀释液 喷施(处理组1)、叶面肥600倍稀释液喷施(处理组2)。叶面肥用法为在水稻秧苗期、分蘖期、拔节孕穗期叶面喷施，喷施时间为下午4点以后。结果如表4所示，施用本发明后，水稻产量和大米内蛋白质含量明显提高。

表4叶面肥对水稻产量和品质的影响

表4

试验5：叶面肥对辣椒农艺性状和产量的影响(山东寿光)

试验地块土壤为黄棕壤，有机质含量11.9g/kg，碱解氮78.6mg/kg`速效磷13.9mg/kg，速效钾83.6mg/kg，PH为6.2。供试作物为辣椒，品种为金富早椒8号，施肥管理模式为当地常用方式。试验共设3个处理，分别为清水对照(对照组)、叶面肥200倍稀释液喷施(处理组1)、叶面肥400倍稀释液喷施(处理组2)。叶面肥用法为在辣椒幼苗期、坐果期各喷施一次，喷施时间为下午4点以后。结果如表5所示，喷施本发明后叶面光合作用增强，辣椒产量提高，并且果实中维生素C和糖含量明显增加。

表5为叶面肥对辣椒农艺性状和产量的影响

表5

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并 不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

Claims (5)

1.一种复合叶面肥，其特征在于，按照重量配比，所述复合叶面肥包括以下成分：由植物乳杆菌制成的植物乳杆菌发酵液200份-350份，由枯草芽孢杆菌制成的枯草芽孢杆菌发酵液200份-350份，以及复合氨基酸粉30份-50份；

其中，所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)于2014年2月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.8833；所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)于2014年2月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.8834。

2.根据权利要求1所述的复合叶面肥，其特征在于，所述植物乳杆菌制成的植物乳杆菌发酵液中有效菌数大于1×10⁹cfu/ml，所述枯草芽孢杆菌发酵液中有效菌体浓度为1-3×10⁹cfu/ml。

3.根据权利要求1或2所述的复合叶面肥，其特征在于，按照所述重量配比，所述复合叶面肥还包括：轻稀土5份-10份，腐植酸20份-50份，尿素15份-30份，磷酸二氢钾10份-25份，硼酸钠2份-5份，硫酸锌1份-3份。

4.一种复合叶面肥的制备方法，其特征在于，根据权利要求3所述的复合叶面肥中各成分的重量配比，将植物乳杆菌发酵液和枯草芽孢杆菌发酵液混合均匀，然后将复合氨基酸粉、轻稀土、腐植酸、尿素、磷酸二氢钾、硼酸钠、硫酸锌加入，混合均匀后分装。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述植物乳杆菌发酵液的获得方法包括：

将冻干保存的植物乳杆菌粉剂接入MRS培养基中，在37℃下培养24小时；然后1％接种量接种于发酵培养基，在37℃下发酵16-18小时；其中，所述MRS培养基为：牛肉蛋白粉10g、鱼肉提取物10g、酵母提取物10g、葡萄糖10g、醋酸钠5g、柠檬酸铵2g、吐温801g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、四水硫酸锰0.05g、七水硫酸镁0.2g、定容至1000ml、pH6.2；所述发酵培养基包括：蛋白胨10g、酵母粉5g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、柠檬酸二铵2g、吐温801ml、K₂HPO₄2g、MnSO₄·4H₂O0.25g、MgSO₄·7H₂O0.58g、NaAc5g、CaCO₃15g，定容至1000ml，pH6.4；

所述枯草芽孢杆菌发酵液的获得方法包括：

将所述枯草芽孢杆菌划线接种于LB固体培养基37℃培养48h；接种环挑取菌体接种于液体LB培养基中，180rpm、37℃培养24h；以1％接种量接种于玉米粉豆粕培养基，进行发酵培养；发酵条件为：温度37℃，罐压0.1Mpa，通风0.8-1vvm，转速180rpm，培养时间为2-3天，获得枯草芽孢杆菌发酵液；其中，所述LB固体培养基包括：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂20g、去离子水1000ml、pH7.0；所述玉米粉豆粕培养基包括：玉米粉2％，豆粕粉7％，磷酸氢二钠0.4％，磷酸二氢钾0.03％，MgSO₄·7H₂O0.1％，消泡剂0.02-0.005％，pH6.8-7.0。