CN104962496B - 一株对灰霉病菌有抑制作用的嗜麦芽假单胞菌菌株qba‑5及其应用 - Google Patents

一株对灰霉病菌有抑制作用的嗜麦芽假单胞菌菌株qba‑5及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株对灰霉病菌有抑制作用的嗜麦芽假单胞菌菌株QBA‑5及其应用，本发明通过筛选获得的菌株QBA‑5其分类命名为嗜麦芽假单胞菌Pseudomonas maltophilia，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2015403。本发明具体经过对灰霉病菌孢子、芽管伸长和离体叶片的实验，证明本发明获得的菌株QBA‑5具有对灰霉病菌的强抑制作用，可以将其制备成防治灰霉病菌的生防制剂，具有良好的市场应用前景。

Description

一株对灰霉病菌有抑制作用的嗜麦芽假单胞菌菌株QBA-5及 其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株对灰霉病菌有抑制作用的嗜麦芽假单胞菌菌株QBA-5及其应用。
背景技术
灰霉病菌是一种世界范围内广泛分布的重要植物病原真菌，该病菌寄主种类繁多，可侵染番茄、黄瓜等蔬菜以及葡萄、草莓水果等235种植物的茎、叶、花和果实引起灰霉病。该病害不仅在寄主植物生长季节可以发生，还可以在农产品的储藏期间发生，因此危害严重。尤其是近年来设施栽培方式的大面积推广，导致该病菌侵染来源广，传播速度快，灰霉病的发生越来越严重，其发生与流行往往造成严重的经济损失。据报道北方设施番茄灰霉病的发生普遍较重，一般年份造成的经济损失可达20％--30％，严重的年份50％以上甚至绝收。
灰霉病菌繁殖速度非常快，产生分生孢子的数量非常多，因此很容易发生变异而产生抗药性，目前已对农业生产上常用的苯丙咪唑类、二甲酰亚胺类、氨基甲酸酯类等多种杀菌剂产生抗性，因此不仅导致防效的降低，而且导致药剂使用量不断加大。化学药剂的过度使用，不仅造成农产品农残超标，危害消费者的身体健康，还导致环境污染，破坏生态平衡，影响农业的可持续健康发展。
生物防治是植物病害防治的重要措施之一，生防菌通过诱导寄主植物抗病性的产生或者通过对灰霉病菌的拮抗作用而到达防治或减轻病害的目的。目前已有木霉菌、枯草芽胞杆菌、沙雷氏菌、链霉菌等多种微生物对灰霉病菌拮抗作用的相关报道。生物菌剂或制剂可以减少或替代化学农药的使用，从而既能有效防治病害，又可避免化学农药的使用带来的负面效应。
发明内容
本发明的目的在于提供了一株对灰霉病菌有抑制作用的嗜麦芽假单胞菌菌株QBA-5及其应用。本发明筛选获得了一株能够强烈抑制灰霉病菌分生孢子萌发的嗜麦芽假单胞菌菌株QBA-5，通过接种实验，该菌株发酵物的滤液对番茄灰霉病的防治效果为80％。该研究获得了一个新菌株QBA-5，实验结果证明该菌株或其制剂对灰霉病的防治具有广阔的应用前景。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一株对灰霉病菌有抑制作用的嗜麦芽假单胞菌菌株QBA-5，其分类命名为嗜麦芽假单胞菌Pseudomonas maltophilia，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO: M 2015403。
所述嗜麦芽假单胞菌菌株QBA-5具有鞭毛。
本发明还提供了所述的嗜麦芽假单胞菌菌株QBA-5在制备防治灰霉病菌的生防制剂中的应用。
对上述技术方案的进一步改进：所述嗜麦芽假单胞菌菌株QBA-5的菌液和发酵滤液对灰霉病菌孢子和芽管伸长均具有抑制作用。
对上述技术方案的进一步改进：所述嗜麦芽假单胞菌菌株QBA-5的菌液中菌含量为OD600＝0.339-0.663时对灰霉病菌分生孢子的萌发具有较强抑制作用。
对上述技术方案的进一步改进：所述嗜麦芽假单胞菌菌株QBA-5的发酵滤液的制备步骤为：将所述菌株QBA-5接种到液体YEPD培养基中在30℃-40℃下震荡培养36-72h，然后离心，过滤，获得含有QBA-5菌的发酵滤液。
对上述技术方案的进一步改进：所述菌株QBA-5接种到培养基中在130rpm条件下进行震荡培养。
对上述技术方案的进一步改进：离心后滤液经直径为0.22um的过滤器进行过滤。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明筛选到对灰霉病菌具有抑制作用的菌株QBA-5，经分类鉴别为嗜麦芽假单胞菌，并经过对灰霉病菌孢子、芽管伸长和离体叶片的实验，证明本发明获得的菌株QBA-5具有对灰霉病菌的强抑制作用，可以将其制备成防治灰霉病菌的生防制剂，具有良好的市场应用前景。
附图说明
图1是本发明所述嗜麦芽假单胞菌QBA-5菌株的发酵滤液对灰霉病菌孢子萌发抑制的实验结果。
图2是本发明所述嗜麦芽假单胞菌QBA-5菌株的发酵滤液对灰霉病菌芽管伸长抑制的实验结果。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的描述。
实施例1
一、菌株的分离与筛选
2013年3月19日于莱阳市温室采集番茄叶片样品20份，每叶片经75％酒精浸泡10秒钟，然后在0.1％的升汞中浸泡30秒，无菌水冲洗3次，转入灭菌处理的研钵中研磨，加无菌水稀释成10ml，继续用无菌水稀释至10-5倍，分别取100ul涂LB平板(胰蛋白胨10克/升，酵母提取物5克/升，氯化钠5克/升，pH7.0)，30℃条件下培养。
挑取单菌落，并将细菌单菌落接种于YEPD培养基中(酵母提取物3克/升,蛋白胨10克/升,葡萄糖20克/升)25℃120rpm条件下震荡培养24h，然后25℃12000rpm条件下离心，上清经直径为0.22um的过滤器过滤，将灰霉病菌的分生孢子接种到滤液中静置培养，以灰霉病菌的分生孢子接种到YEPD中作对照，当对照分生孢子萌发率达90％时检测细菌滤液中灰霉病菌分生孢子的萌发率，计算出细菌滤液对灰霉病菌分生孢子萌发的抑制率，筛选出一株对灰霉病菌分生孢子的萌发具有很强抑制力的菌株QBA-5。
二、QBA-5菌株的分类鉴定
1、分子鉴定：
1)、引物：27f/1492r
27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(SEQ ID No:1)；
1492r：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′(SEQ ID No:2)；
2)、PCR反应体系如下：2×PCR Master Mix：12.5ul；引物27f：1ul；引物1492r：1ul；模板：1ul；ddH2O：9.5ul；
PCR反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸1.5min；30个循环，72℃复性；
胶回收PCR产物，进行TA克隆，挑取单菌落送测序公司测序。
3)、经测序，菌株16SDNA片段序列如下(SEQ ID No:3)：
AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAGAGAGAAGCTTGCTTCTCTTGAGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTTCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTTACCTAATACGTGATTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTAGTTAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCAAAACTGACTGACTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCTAGAGATAGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGGGGACGGTTACCACGGTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTA；
4)、结论：经过NCBI数据库比对，待检测细菌QBA-5与假单胞菌YJQ-12 16S DNA，GenBank:gb|AY569288.1|的序列一致性为99％。
2、生理生化鉴定：
参照《常见细菌系统鉴定手册》中所描述的有关假单孢菌的生理生化特征，选择18种生理生化试验对目的菌株QBA-5进行鉴定，实验结果如表1所示，经鉴定确认本发明筛选的菌株QBA-5为嗜麦芽假单胞菌。
表1 菌株QBA-5的生理生化特征参数
注：N＝未报道 ∨＝不定
将本发明筛选到的嗜麦芽假单胞菌菌株QBA-5进行菌种保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学保藏中心；保藏日期：2015年6月25日，嗜麦芽假单胞菌Pseudomonas maltophilia的保藏编号为CCTCC NO: M2015403。
三、QBA-5菌株对灰霉病菌的生防实验
1、QBA-5菌的发酵滤液对孢子萌发的抑制作用
实验方法：将挑取的单菌落接种到液体3mlYEPD培养基中(酵母提取物3克/升,蛋白胨10克/升,葡萄糖20克/升)，30℃130rpm条件下震荡培养12h。取培养的菌液按2％的体积浓度接种于15ml YEPD培养基中，40℃130rpm条件下震荡培养72h，然后25℃12000rpm条件下离心，上清经直径为0.22um的过滤器过滤，获得含有QBA-5菌发酵物的发酵滤液(发酵滤液中不含有QBA-5菌，仅为QBA-5菌的发酵产物)。
对所述发酵滤液进行不同浓度的稀释(具体的稀释浓度为10％、25％、50％、75％、100％)，采用凹玻片法(在灭菌的凹玻片中分别加入不同浓度的滤液30ul，其中灰霉病菌分生孢子的浓度为6×05/ml，25℃保湿培养，对照分生孢子萌发率达90％时检测不同滤液浓度的处理中分生孢子的萌发率并计算滤液对分生孢子萌发的抑制率)。
实验结果如图1所示，25％-100％浓度的滤液都具有抑制灰霉病菌孢子萌发的作用，并且随着滤液浓度的提高，对灰霉病菌分生孢子萌发的抑制率明显提高，即对灰霉病菌分生孢子萌发的抑制率呈剂量依赖性。
2、QBA-5菌的发酵滤液对芽管伸长的抑制作用
实验方法：采用凹玻片法，同1，培养6h-12h后，显微镜观察并测量。实验结果如图2所示，在所述发酵滤液含量分别为0-100％的处理中，在同一时间点，随着滤液浓度的提高，对芽管伸长的抑制率越高，即对灰霉病菌分生孢子芽管伸长的抑制率呈剂量依赖性。
3、QBA-5菌的发酵滤液的离体叶片实验：
实验方法：分别用不同浓度的滤液喷雾处理长势一致的健康番茄叶片，对照CK用无菌水处理，待叶片上滤液完全晾干后，点接灰霉病菌的分生孢子5×105个/ml，23℃保湿处理，3天后调查发病情况，计算病情指数，结果如表2所示，接种实验的结果表明，QBA-5发酵滤液对番茄灰霉病的防治效果为80％，能够有效防治番茄灰霉病。
表2 QBA-5菌株发酵滤液对番茄灰霉病菌的防治实验结果
4、含有QBA-5菌的菌液对灰霉病菌的抑制作用
本实施例还进行了含有QBA-5菌株的菌液对灰霉病菌孢子萌发的抑制实验、对芽管伸长的抑制实验和离体叶片实验，实验结果表明当菌液中QBA-5的菌含量为OD600＝0.339-0.663时对灰霉病菌分生孢子的萌发和芽管的伸长均具有明显的抑制作用，当OD600＝0.517时抑制效果最好，抑制率达97.5％。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛农业大学
<120> 一株对灰霉病菌有抑制作用的嗜麦芽假单胞菌菌株QBA-5及其应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tacggctacc ttgttacgac tt 22
<210> 3
<211> 1501
<212> DNA
<213> 嗜麦芽假单胞菌
<400> 3
agagtttgat cctggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc 60
ggtagagaga agcttgcttc tcttgagagc ggcggacggg tgagtaatgc ctaggaatct 120
gcctggtagt gggggataac gttcggaaac ggacgctaat accgcatacg tcctacggga 180
gaaagcaggg gaccttcggg ccttgcgcta tcagatgagc ctaggtcgga ttagctagtt 240
ggtgaggtaa tggctcacca aggcgacgat ccgtaactgg tctgagagga tgatcagtca 300
cactggaact gagacacggt ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca 360
atgggcgaaa gcctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggtcttcg gattgtaaag 420
cactttaagt tgggaggaag ggcagttacc taatacgtga ttgttttgac gttaccgaca 480
gaataagcac cggctaactc tgtgccagca gccgcggtaa tacagagggt gcaagcgtta 540
atcggaatta ctgggcgtaa agcgcgcgta ggtggttagt taagttggat gtgaaatccc 600
cgggctcaac ctgggaactg cattcaaaac tgactgacta gagtatggta gagggtggtg 660
gaatttcctg tgtagcggtg aaatgcgtag atataggaag gaacaccagt ggcgaaggcg 720
accacctgga ctgatactga cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat 780
accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc aactagccgt tgggagcctt gagctcttag 840
tggcgcagct aacgcattaa gttgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca 900
aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg 960
aagaacctta ccaggccttg acatccaatg aactttctag agatagattg gtgccttcgg 1020
gaacattgag acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1080
gtcccgtaac gagcgcaacc cttgtcctta gttaccagca cgttatggtg ggcactctaa 1140
ggagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat catggccctt 1200
acggcctggg ctacacacgt gctacaatgg tcggtacaga gggttgccaa gccgcgaggt 1260
ggagctaatc ccataaaacc gatcgtagtc cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga 1320
agtcggaatc gctagtaatc gcgaatcaga atgtcgcggt gaatacgttc ccgggccttg 1380
tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gttgcaccag aagtagctag tctaaccttc 1440
ggggggacgg ttaccacggt gtgattcatg actggggtga agtcgtaaca aggtaaccgt 1500
a 1501

Claims (6)

1.一株对灰霉病菌有抑制作用的嗜麦芽假单胞菌菌株QBA-5，其特征在于：其分类命名为嗜麦芽假单胞菌Pseudomonas maltophilia，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2015403；所述嗜麦芽假单胞菌菌株QBA-5具有鞭毛，25%-100%浓度的含有QBA-5菌发酵物的发酵滤液都具有抑制灰霉病菌孢子萌发的作用。
2.权利要求1所述的嗜麦芽假单胞菌菌株QBA-5在制备防治灰霉病菌的生防制剂中的应用，其特征在于：所述嗜麦芽假单胞菌菌株QBA-5的菌液和发酵滤液对灰霉病菌孢子和芽管伸长均具有抑制作用。
3.根据权利要求2所述的嗜麦芽假单胞菌菌株QBA-5在制备防治灰霉病菌的生防制剂中的应用，其特征在于：所述嗜麦芽假单胞菌菌株QBA-5的菌液中菌含量为OD600=0.339-0.663时对灰霉病菌分生孢子的萌发具有较强抑制作用。
4.根据权利要求2所述的嗜麦芽假单胞菌菌株QBA-5在制备防治灰霉病菌的生防制剂中的应用，其特征在于：所述嗜麦芽假单胞菌菌株QBA-5的发酵滤液的制备步骤为：将所述菌株QBA-5接种到液体YEPD培养基中在30℃-40℃下震荡培养36-72h，然后离心，过滤，获得含有QBA-5菌的发酵滤液。
5.根据权利要求4所述的嗜麦芽假单胞菌菌株QBA-5在制备防治灰霉病菌的生防制剂中的应用，其特征在于：所述菌株QBA-5接种到培养基中在130rpm条件下进行震荡培养。
6.根据权利要求4所述的嗜麦芽假单胞菌菌株QBA-5在制备防治灰霉病菌的生防制剂中的应用，其特征在于：离心后滤液经直径为0.22um的过滤器进行过滤。
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CN103109870A (zh) * 2013-01-08 2013-05-22 华中农业大学 一种假单胞菌发酵上清液的应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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土壤产几丁质酶菌株的筛选鉴定及产酶条件;张荣奎等;《华侨大学学报（自然科学版）》;20070430;第28卷(第2期);第178-181页，尤其是摘要，第179页第1.5节 *
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