CN110862936B - 一株有抑菌作用的融合魏斯氏菌mp4菌株及其应用 - Google Patents

一株有抑菌作用的融合魏斯氏菌mp4菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株具有抑菌作用的融合魏斯氏菌MP4菌株及其应用，本发明通过筛选获得了对灰霉病菌和尖孢镰刀菌引起的植物枯萎病有抑制作用的MP4菌株，其具体分类命名为融合魏斯氏菌MP4 Weissella confuse MP4，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2019701。本发明经过对灰霉病菌和尖孢镰刀菌孢子、芽管伸长和离体叶片的实验，证明本发明获得的MP4菌株具有对灰霉病菌和尖孢镰刀菌有较强的抑制作用，可以将其制备成防治灰霉病菌和植物枯萎病菌的生防制剂，具有良好的市场应用前景。

Description

一株有抑菌作用的融合魏斯氏菌MP4菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株有抑菌作用的融合魏斯氏菌MP4菌株及其应用。
背景技术
灰霉病菌是一种重要的植物病原真菌，该病菌在世界范围内广泛分布，被称为第二大破坏性植物病原体，该病菌能够感染番茄、黄瓜、葡萄、草莓等500多种重要的经济作物，可以引起果蔬灰霉病。该病害不仅在寄主植物生长季节可以发生，还可以在农产品的储藏期间发生，因此危害严重。尤其是近年来设施栽培方式的大面积推广，导致该病菌侵染来源广，传播速度快，灰霉病的发生越来越严重，其发生与流行往往造成严重的经济损失。据报道北方设施番茄灰霉病的发生普遍较重，一般年份造成的经济损失可达20％--30％，严重的年份 50％以上甚至绝收。
植物枯萎病的病原为尖孢镰刀菌，尖孢镰刀菌是一种世界性分布的土传病原真菌，寄主范围广泛，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种镰刀菌枯萎病的发生。寄主被镰刀菌侵染后，症状表现多种多样，一般导致维管束褐变，植株萎蔫枯死，球茎和根腐烂，植株生长衰弱等。镰刀菌枯萎病是近年来对农业生产造成危害的一种重要的真菌性土传病害，在很多地区已有发生，尤其在作物重荏地发生程度更为严重，直接影响了农作物产量及其经济效益。
灰霉病菌和尖孢镰刀菌繁殖速度非常快，产生分生孢子的数量非常多，因此很容易发生变异而产生抗药性，目前已对农业生产上常用的苯丙咪唑类、二甲酰亚胺类、氨基甲酸酯类等多种杀菌剂产生抗性，因此不仅导致防效的降低，而且导致药剂使用量不断加大。化学药剂的过度使用，不仅造成农产品农残超标，危害消费者的身体健康，还导致环境污染，破坏生态平衡，影响农业的可持续健康发展。
生物防治是植物病害防治的重要措施之一，生防菌通过诱导寄主植物抗病性的产生或者通过对灰霉病菌和尖孢镰刀菌的拮抗作用而到达防治或减轻病害的目的。目前已有木霉菌、枯草芽胞杆菌、沙雷氏菌、链霉菌等多种微生物对灰霉病菌和尖孢镰刀菌有拮抗作用的相关报道。生物菌剂或制剂可以减少或替代化学农药的使用，从而既能有效防治病害，又可避免化学农药的使用带来的负面效应。
发明内容
本发明的目的在于提供了一株有抑菌作用的融合魏斯氏菌MP4菌株及其应用。本发明通过筛选获得了一株能够强烈抑制灰霉病菌和尖孢镰刀菌分生孢子萌发的MP4菌株。通过接种实验，该菌株发酵物的发酵滤液对番茄灰霉病的防治效果为超过93.61％。实验结果证明该菌株或其制剂对灰霉病和尖孢镰刀菌引起的枯萎病防治具有广阔应用前景。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一株具有抑菌作用的融合魏斯氏菌MP4菌株，其分类命名为融合魏斯氏菌MP4 Weissella confuse MP4，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学保藏中心；其保藏编号为CCTCC NO：M 2019701。
进一步的：所述MP4菌株在20℃-40℃范围内生长良好，菌落呈圆形，呈白色，菌落扁平，边缘光滑，表面黏液状，湿润，菌落直径1-3毫米。
本发明还提供了所述的MP4菌株在制备防治植物病原菌的生防制剂中的应用。
进一步的：所述植物病原菌为灰霉病菌和尖孢镰刀菌。
进一步的：所述MP4菌株的菌液和发酵滤液对灰霉病菌和尖孢镰刀菌的孢子萌发和芽管伸长均具有抑制作用。
进一步的：所述MP4菌株的菌液和发酵滤液对灰霉病菌和尖孢镰刀菌的孢子萌发和芽管伸长的抑制率呈剂量依赖性。
进一步的：所述MP4菌株的菌液OD600＝0.337-0.691时，对灰霉病菌和尖孢镰刀菌的分生孢子的萌发和芽管的伸长均具有较强抑制作用。
进一步的：所述MP4菌株的菌液OD600＝0.487时对灰霉病菌和尖孢镰刀菌的分生孢子的萌发和芽管的伸长均具有最强抑制作用。
进一步的：所述MP4菌株的发酵滤液的制备步骤为：将所述MP4菌株接种到液体MRS培养基中在25-30℃下静置培养，然后离心，过滤，获得含有MP4菌株发酵物的发酵滤液。
进一步的：所述过滤为使用直径为0.22um的过滤器进行过滤。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明筛选到对灰霉病菌和尖孢镰刀菌具有抑制作用的MP4菌株，经分类鉴别为Weissella confuse，并经过对灰霉病菌和尖孢镰刀菌分生孢子、芽管伸长和离体叶片的实验，证明本发明获得的MP4菌株具有对灰霉病菌和尖孢镰刀菌的强抑制作用，可以将其制备成防治灰霉病菌和植物枯萎病菌的生防制剂，具有良好的市场应用前景。
附图说明
图1是是本发明所述MP4菌株的平板培养照片。
图2是本发明所述MP4菌株的发酵滤液对灰霉病菌和尖孢镰刀菌分生孢子萌发抑制的实验结果；
图3是本发明所述MP4菌株的发酵滤液对灰霉病菌孢子芽管伸长的实验结果。
图4是本发明所述MP4菌株的发酵滤液对尖孢镰刀菌孢子芽管伸长的实验结果。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的描述。
实施例1
一、菌株的分离与筛选
2017年6月15日于青岛大泽山采集葡萄根样品30份，将样品转入灭菌处理的研钵中研磨，加无菌水稀释成10ml，然后用无菌水稀释至10-3-10-4倍，分别取200ul涂PDA平板(马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l，pH自然)，26℃条件下静置培养。
挑取单菌落，并将细菌单菌落接种于MRS(蛋白胨10.0g/l，牛肉提取物10.0g/l，酵母提取物5.0g/l，葡萄糖20.0g/l，柠檬酸三铵2.0g/l，乙酸钠5.0g/l，MgSO4 0.1g/l，MnSO40.05g/l，K2HPO4 2.0g/l，pH 6.5)液体培养基中26℃下静置培养48h，然后4℃12,000rpm 条件下离心，上清经直径为0.22um的过滤器过滤备用。
按照不同比例将滤液加入到MRS培养基，并接入灰霉病菌和尖孢镰刀菌的分生孢子接种进行静置培养，以分生孢子接种到MRS中作对照，当对照分生孢子萌发率达90％时检测发酵液滤液中灰霉病菌和尖孢镰刀菌分生孢子的萌发率，计算出细菌滤液对灰霉病菌和尖孢镰刀菌分生孢子萌发的抑制率，筛选出一株对灰霉病菌和尖孢镰刀菌分生孢子的萌发具有很强抑制力的MP4菌株。其平板培养照片如图1所示，菌落呈圆形，呈白色，菌落扁平，边缘光滑，表面黏液状，湿润，菌落直径1-3毫米。
二、MP4菌株的分类鉴定
1、分子鉴定：
1)、引物：通用引物27F/1492R
27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID No：2)；
1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID No：3)；
2)、PCR反应体系如下：2×PCR Master Mix：25ul；引物27F：2ul；引物1492R：2 ul；模板：2ul；ddH2O：19ul；
PCR反应程序如下：94℃预变性10min；94℃变性40s、55℃退火40s、72℃延伸1.5min；32个循环，72℃延伸10min；16℃∞。
胶回收方法回收PCR产物，然后将其进行TA克隆，挑取单菌落送测序公司测序。
3)、经测序，所述MP4菌株的16S rDNA片段序列如下(SEQ ID No:1)：
Figure RE-GDA0002356056670000041
4)、结论：经过NCBI数据库比对，待检测MP4菌株与Weissella confusa strainSM32 16S rDNA，GenBank：KU060296.1的序列一致性为99.93％。
2、生理生化鉴定：
参照细菌系统鉴定手册中所描述的生理生化特征方法，选择21种生理生化试验对目的 MP4菌株进行鉴定，实验结果如表1所示，确定所筛选到的MP4菌株为Weissellaconfuse。
表1 MP4菌株的生理生化特征参数
Figure RE-GDA0002356056670000051
注：+：阳性；-：阴性；W：微弱。
将本发明筛选到的MP4菌株进行菌种保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学保藏中心；保藏日期：2019年9 月9日，融合魏斯氏菌MP4 Weissella confuse MP4的保藏编号为CCTCC NO：M 2019701。
三、MP4菌株对灰霉病菌和尖孢镰刀菌的生防实验
1、MP4菌株的发酵滤液对孢子萌发的抑制作用
实验方法：将挑取的单菌落接种到液体5ml MRS(蛋白胨10.0g/l，牛肉提取物10.0g/l，酵母提取物5.0g/l，葡萄糖20.0g/l，柠檬酸三铵2.0g/l，乙酸钠5.0g/l，MgSO40.1g/l，MnSO4 0.05g/l，K2HPO4 2.0g/l，pH 6.5。)26℃，培养48h。取培养的菌液按5％的体积浓度接种于50ml MRS培养基中，26℃，培养48h，然后4℃，12000rpm条件下离心10min，上清经直径为0.22um的过滤器过滤，获得含有MP4菌发酵物的发酵滤液(所述发酵滤液中不含有MP4菌，仅为MP4菌株的发酵产物)。
对所述发酵滤液进行不同浓度的稀释(具体的滤液浓度为0％，5％，10％，15％，25％)，采用凹玻片法检测(在灭菌的凹玻片中分别加入不同浓度的滤液50ul，其中灰霉病菌分生孢子的浓度为5.8×105个/ml，尖孢镰刀菌分生孢子的浓度为6.2×105个/ml，26℃保湿培养，对照分生孢子萌发率达90％时检测不同浓度的发酵滤液处理中分生孢子的萌发率并计算滤液对分生孢子萌发的抑制率)。
实验结果如图2所示，随着发酵滤液含量的增加，对灰霉病菌和尖孢镰刀菌分生孢子萌发的抑制率明显提高。当含量超过5％时，就可以基本抑制两种分生孢子的萌发。表明MP4菌株的发酵产物对灰霉病菌和尖孢镰刀菌孢子的萌发均具有较强的抑制作用。
2、MP4菌的发酵滤液对芽管伸长的影响：
实验方法：采用同上的凹玻片法进行检测，培养2h-9h后，显微镜观察并测量。实验结果如图3、图4所示，在同一时间点，随着滤液浓度的提高，对芽管伸长的抑制率越高，即对灰霉病菌和尖孢镰刀菌分生孢子芽管伸长的抑制率呈剂量依赖性。
3、MP4菌的发酵滤液对离体叶片的灰霉病防治实验：
实验方法：分别用所述不同浓度的发酵滤液喷雾处理长势一致的健康番茄叶片，对照 CK用无菌水处理，待叶片上滤液完全晾干后，点接灰霉病菌的分生孢子6.2×105个/ml， 25℃保湿处理，3天后调查发病情况，计算病情指数，接种实验的结果如表2所示，MP4菌株的发酵滤液对番茄灰霉病的防治效果可达93.61％，能够有效地对番茄灰霉病进行有效防治。
表2 MP4菌株发酵滤液对灰霉病菌的防治实验结果
Figure RE-GDA0002356056670000061
4、含有MP4菌的菌液对灰霉病菌和尖孢镰刀菌的抑制作用
本实施例还进行了含有MP4菌株的菌液对灰霉病菌和尖孢镰刀菌孢子萌发的抑制实验、对芽管伸长的抑制实验和离体叶片实验，实验结果表明当菌液中MP4的菌含量为OD600＝0.337-0.691时对灰霉病菌和尖孢镰刀菌分生孢子的萌发、芽管的伸长均具有明显的抑制作用，当OD600＝0.487时，抑制效果最好，抑制率达99.6％。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一株有抑菌作用的融合魏斯氏菌MP4菌株及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1453
<212> DNA
<213> 融合魏斯氏菌(Weissella confuse)
<400> 1
atacatgcag tcgaacgctt tgtggttcaa ctgatttgaa gagcttgctc agatatgacg 60
atgaacattg caaagagtgg cgaacgggtg agtaacacgt gggaaaccta cctcttagca 120
ggggataaca tttggaaaca gatgctaata ccgtataaca atgacaaccg catggttgtt 180
atttaaaaga tggttctgct atcactaaga gatggtcccg cggtgcatta gctagttggt 240
aaggtaatgg cttaccaagg cgatgatgca tagccgagtt gagagactga tcggccacaa 300
tgggactgag acacggccca tactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg 360
ggcgaaagcc tgatggagca acgccgcgtg tgtgatgaag ggtttcggct cgtaaaacac 420
tgttgtaaga gaagaatgac attgagagta actgttcaat gtgtgacggt atcttaccag 480
aaaggaacgg ctaaatacgt gccagcagcc gcggtaatac gtatgttcca agcgttatcc 540
ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcagac ggttatttaa gtctgaagtg aaagccctca 600
gctcaactga ggaattgctt tggaaactgg atgacttgag tgcagtagag gaaagtggaa 660
ctccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct 720
ttctggactg taactgacgt tgaggctcga aagtgtgggt agcaaacagg attagatacc 780
ctggtagtcc acaccgtaaa cgatgagtgc taggtgtttg agggtttccg cccttaagtg 840
ccgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacga ccgcaaggtt gaaactcaaa 900
ggaattgacg gggacccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa 960
gaaccttacc aggtcttgac atcccttgac aactccagag atggagcgtt cccttcgggg 1020
acaaggtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 1080
cccgcaacga gcgcaaccct tattactagt tgccagcatt cagttgggca ctctagtgag 1140
actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga 1200
cctgggctac acacgtgcta caatggcgta tacaacgagt tgccaacccg cgagggtgag 1260
ctaatctctt aaagtacgtc tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct acatgaagtc 1320
ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcacgc cgcggtgaat acgttcccgg gtcttgtaca 1380
caccgcccgt cacaccatga gagtttgtaa cacccaaagc cggtggggta accttcggga 1440
gccagccgtc taa 1453
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tacggctacc ttgttacgac tt 22

Claims (8)

1.一株具有抑菌作用的融合魏斯氏菌（Weissella confuse）MP4菌株，其特征在于：所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO: M 2019701。
2.权利要求1所述的融合魏斯氏菌MP4菌株在制备防治植物病原菌的生防制剂中的应用，其特征在于：所述植物病原菌为灰霉病菌（Botrytis cinerea）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。
3.根据权利要求2所述的融合魏斯氏菌MP4菌株在制备防治植物病原菌的生防制剂中的应用，其特征在于：所述MP4菌株的菌液和发酵滤液对灰霉病菌和尖孢镰刀菌的孢子萌发和芽管伸长均具有抑制作用。
4.根据权利要求3所述的融合魏斯氏菌MP4菌株在制备防治植物病原菌的生防制剂中的应用，其特征在于：所述MP4菌株的菌液和发酵滤液对灰霉病菌和尖孢镰刀菌的孢子萌发和芽管伸长的抑制率呈剂量依赖性。
5.根据权利要求4所述的融合魏斯氏菌MP4菌株在制备防治植物病原菌的生防制剂中的应用，其特征在于：所述MP4菌株的菌液OD600=0.337-0.691时，对灰霉病菌和尖孢镰刀菌的分生孢子的萌发和芽管的伸长均具有较强抑制作用。
6.根据权利要求5所述的融合魏斯氏菌MP4菌株在制备防治植物病原菌的生防制剂中的应用，其特征在于：所述MP4菌株的菌液OD600=0.487时对灰霉病菌和尖孢镰刀菌的分生孢子的萌发和芽管的伸长均具有最强抑制作用。
7.根据权利要求3所述的融合魏斯氏菌MP4菌株在制备防治植物病原菌的生防制剂中的应用，其特征在于：所述MP4菌株的发酵滤液的制备步骤为：将所述MP4菌株接种到液体MRS培养基中在25-30℃下静置培养，然后离心，过滤，获得含有MP4菌株发酵物的发酵滤液。
8.根据权利要求7所述的融合魏斯氏菌MP4菌株在制备防治植物病原菌的生防制剂中的应用，其特征在于：所述过滤为使用直径为0.22 um的过滤器进行过滤。
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