CN112029686B - 一株提高番茄灰霉病抗性的贝莱斯芽孢杆菌qse-21及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株提高番茄灰霉病抗性的贝莱斯芽孢杆菌QSE‑21及其应用。所述贝莱斯芽孢杆菌QSE‑21分类名为Bacillus velezensis，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020295。该菌株的菌落为白色圆形、不透明、表面褶皱，边缘不整齐、产生褶皱的薄皮，质地干燥；菌体为杆状，单个、成对或呈链状排列。所述贝莱斯芽孢杆菌QSE‑21可以制备用于防治番茄灰霉病的生物制剂，其显著抑制灰霉菌的孢子萌发、菌丝生长、产孢及菌核的萌发，以及诱导茉莉酸途径相关基因的表达，提高对灰霉菌的抗性，具有良好的市场应用前景。

Description

一株提高番茄灰霉病抗性的贝莱斯芽孢杆菌QSE-21及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株提高番茄灰霉病抗性的贝莱斯芽孢杆菌QSE-21及其应用。

背景技术

灰霉菌引起的灰霉病是一种毁灭性的植物真菌病害，而且其寄主十分广泛，可侵染超过200多种植物，包括番茄、黄瓜等蔬菜以及葡萄、草莓等水果。灰霉病可发生在植物的整个地上器官和组织，包括茎、叶、花和果实，同时在植物的整个生长周期都可发病。此外，该病害不仅在寄主植物的生长季节发生，还可在农产品的储藏期间发生，因此灰霉病危害严重，会造成重大的经济损失。近年来，设施栽培农业大面积推广，温暖潮湿的环境导致灰霉病整年循环发生，危害越来越严重，而防治药剂和措施更新滞缓，灰霉病的防治问题亟待解决。

灰霉菌以菌丝和所产生的分生孢子进行传播和侵染，生长和繁殖速度快，产生的分生孢子数量非常多，因此极易造成病害的扩散和传播。此外，灰霉菌的分生孢子可在病残体中存活4-6个月，而由菌丝形成的菌核可存活长达数年，是病原菌初侵染的主要来源。同时，分生孢子和菌核具有极强的环境耐受能力，可在极端条件下仍保持萌发或生长的能力，因此控制分生孢子和菌核的产生及萌发是防治灰霉病的重要途径。

目前，仍主要以化学药剂对灰霉病进行防治，但由于有效药剂种类较少，长时间使用单一药剂，灰霉菌已产生严重的抗药性。此外，化学防治极易造成环境污染，产生药害，威胁人类健康。而生物防治具有专一性强、环境友好、不易产生抗药性等优点，因而在植物病害防治中逐渐被重视。生物药剂不仅可以直接作用于病原菌，还可诱导植物产生抗病性，从而提高植物对病原的抵御能力而达到防治或减轻病害的目的。目前已有木霉菌、枯草芽胞杆菌、沙雷氏菌、链霉菌等多种微生物被用于灰霉病的生物防治，这些微生物主要是通过直接作用于灰霉菌来抑制其生长发育，而通过诱导番茄抗病性而提高对灰霉病的抗性的微生物未见报道。

发明内容

本发明提供了一株提高番茄灰霉病抗性的贝莱斯芽孢杆菌QSE-21及其应用。所述贝莱斯芽孢杆菌QSE-21能够显著抑制灰霉菌的生长及提高番茄对灰霉病的抗病性。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一株提高番茄灰霉病抗性的贝莱斯芽孢杆菌QSE-21，其分类名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M 2020295。

进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌QSE-21菌落为白色圆形、不透明、表面褶皱，边缘不整齐、产生褶皱的薄皮，质地干燥；菌体为杆状，单个、成对或呈链状排列。

进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌QSE-21提取自温室番茄植株。

进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌QSE-21的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

本发明还提供了所述的贝莱斯芽孢杆菌QSE-21在用于制备防治番茄灰霉病的生物制剂中的应用。

进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌QSE-21能够抑制灰霉菌的菌丝生长、孢子的产生和萌发以及菌核萌发。

进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌QSE-21抑制灰霉菌菌丝生长的浓度为2-8％(v/v)。

进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌QSE-21抑制灰霉菌菌丝生长的最佳浓度为8％(v/v)。

进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌QSE-21不抑制灰霉菌灰霉菌菌丝生长而抑制灰霉菌孢子的产生的浓度为0.5-1％(v/v)。

进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌QSE-21抑制灰霉菌抑制灰霉菌孢子的萌发以及菌核的萌发的浓度为6％(v/v)

进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌QSE-21能够诱导番茄叶片茉莉酸途径相关基因的表达。

进一步的，所述基因包括茉莉酸合成途径关键基因SlLoxC、SlAOS1和SlAOC，茉莉酸途径下游响应基因SlPI-I、SlPI-II和SlERF2。

进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌QSE-21能够提高番茄灰霉病抗性。

进一步的，在应用时，将所述贝莱斯芽孢杆菌QSE-21制备成贝莱斯芽孢杆菌QSE-21发酵液。

进一步的，所述莱斯芽孢杆菌QSE-21发酵液可以单独使用或与其他材料制备成生物制剂。

进一步的，所述生物制剂中包含贝莱斯芽孢杆菌QSE-21发酵液。

进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌QSE-21发酵液的制备方法为：将贝莱斯芽孢杆菌QSE-21接种到LB液体培养基中，在25℃，180rpm条件下震荡培养72h，培养液经10000rpm离心，上清液再经0.45μm无菌过滤器过滤，获得不含菌体的贝莱斯芽孢杆菌QSE-21发酵液。

进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌QSE-21发酵液在生物制剂中的添加体积比为0.5-8％。

进一步的，所述生物制剂的使用方法为：制成溶液后均匀喷洒在整个番茄植株上。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌QSE-21是提取自温室番茄植株，其对灰霉菌具有显著的抑制作用，不仅能够抑制灰霉菌菌丝生长，还能抑制灰霉菌的孢子的产生和萌发以及菌核萌发，从而全方位的抑制番茄灰霉菌在植株上的生长；除此之外，贝莱斯芽孢杆菌QSE-21又能诱导番茄产生抵抗灰霉菌的抗病性，并诱导茉莉酸合成途径相关基因表达，进而增强了番茄对灰霉菌的抵御能力，因此贝莱斯芽孢杆菌QSE-21在番茄灰霉病的防治中具有双重功能。将贝莱斯芽孢杆菌QSE-21制成菌株发酵液，可以单独使用或与其他材料制备成防治番茄灰霉病的生物制剂，且生物菌剂使用简单、效果好、安全可靠，因此具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1是贝莱斯芽孢杆菌QSE-21在NA培养基上的菌落形态图；

图2是贝莱斯芽孢杆菌QSE-21在显微镜下的形态图；

图3是贝莱斯芽孢杆菌QSE-21的系统发育树；

图4是贝莱斯芽孢杆菌QSE-21发酵液抑制PDA平板上灰霉菌的菌丝生长，横坐标表示PDA平板中含QSE-21菌株发酵液的浓度，纵坐标表示对灰霉菌菌丝生长的抑制率；

图5是贝莱斯芽孢杆菌QSE-21发酵液抑制PDA平板上灰霉菌的产孢，PDA平板中QSE-21发酵液浓度为0.5％和1％，CK表示不含QSE-21发酵液，纵坐标表示每个平板的产胞数量平均值；

图6是贝莱斯芽孢杆菌QSE-21发酵液抑制灰霉菌孢子萌发，孢子液中含QSE-21发酵液浓度为6％；

图7是贝莱斯芽孢杆菌QSE-21发酵液抑制PDA平板上灰霉菌菌核的萌发，PDA平板中QSE-21发酵液浓度为6％，CK表示不含QSE-21菌株发酵液；

图8是贝莱斯芽孢杆菌QSE-21发酵液诱导番茄叶片茉莉酸-乙烯途径响应基因相对表达量，横坐标表示QSE-21发酵液处理后取样时间，0H表示处理前，纵坐标表示相对表达量，以番茄Actin基因为内参；

图9是贝莱斯芽孢杆菌QSE-21发酵液提高番茄叶片对灰霉菌的抗病性，QSE-21发酵液处理叶片下部后在叶片上部接种灰霉菌孢子液，CK表示用H₂O代替QSE-21菌株发酵液处理叶片；

图10是贝莱斯芽孢杆菌QSE-21发酵液对番茄灰霉病的防治效果，QSE-21发酵液处理整个叶片后接种灰霉菌菌饼，接种2d后测量病斑直径，CK表示用H₂O代替QSE-21菌株发酵液处理叶片。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的描述。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：

一、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的分离与筛选

2019年12月21日于青岛市温室采集番茄植株5份，切下茎基部(土表面处上下各0.5cm范围)，用0.1％的次氯酸钠消毒3min，70％的乙醇消毒1min，无菌水清洗三次；然后放置在无菌研钵中研磨出汁液，将汁液用无菌水连续梯度稀释；分别取100倍和1000倍稀释的组织悬液各100μl，用涂布器均匀涂布在LB平板(配方为：酵母提取物5g，蛋白胨10g，氯化钠10g/L，琼脂粉15g，加水至1L，121℃高压灭菌20min)上，置于28℃培养箱中培养24-48h。

挑取LB平板上长出的单菌落，接种到已培养24h的灰霉菌PDA平板上(配方为：马铃薯200g切块后于沸水中煮15min，三层纱布过滤后取上清，葡萄糖20g，琼脂粉15g，加水至1L，121℃高压灭菌20min)，置于25℃培养箱中进行对峙生长实验，培养2-3d后观察灰霉菌菌丝生长受抑制情况。选择对灰霉菌生长抑制效果好的的菌株，挑取菌落于100μl无菌水中，用移液枪吸打成菌悬液，用无菌水连续梯度稀释，分别取10^-4倍和10^-5倍稀释液各100μl，涂布于NA平板(配方为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂粉15g，加水至1L，121℃高压灭菌20min)上，置于28℃培养箱中培养24h，获得单菌落。挑取单菌落再次通过平板对峙实验验证纯化后的菌株对灰霉菌的抑制作用，获得对灰霉菌具有较好抑制效果的单菌落菌株。

将纯化后的菌株接种到LB培养基(配方为：酵母提取物5g，蛋白胨10g，氯化钠10g/L，加水至1L，121℃高压灭菌20min)中，在25℃，180rpm条件下震荡培养72h，培养液经10000rpm离心，上清液再经0.45μm无菌过滤器过滤，获得不含菌体的发酵液。在已培养24h的灰霉菌PDA平板上，距离菌落边缘4cm处放置牛津杯，吸取200μl发酵液加到牛津杯中，25℃培养箱中继续培养2-3d，观察灰霉菌菌丝生长受抑制情况，获得发酵液对灰霉菌菌丝生长具有很强抑制作用的菌株，命名为QSE-21。

二、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的分类鉴定

1、形态及生理生化鉴定：

QSE-21菌株在NA培养基上生长24h后形成的菌落为白色圆形、不透明、表面褶皱，边缘不整齐、产生褶皱的薄皮，质地干燥(图1)；在显微镜下观察，QSE-21菌体为杆状，单个、成对或呈链状排列(图2)；革兰氏染色反应呈阳性，因此初步判断QSE-21菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)。

2、分子鉴定：

提取QSE-21菌株的基因组DNA，并以此为模板，使用特异性引物进行PCR扩增；

扩增的特异性基因及引物如表1所示；

表1扩增的基因及使用引物

PCR反应体系如下：

PCR反应程序如下：

PCR产物跑胶后切胶回收，回收产物送测序公司测序。

经测序，所述菌株QSE-21的16S rDNA序列以及gyrB、recA和rpoB 3个基因的片段序列如SEQ ID No：1-SEQ ID No：4所示。将测序获得的序列分别与NCBI数据库中的序列进行比对，待检测菌株QSE-21的3个基因(gyrB、recA和rpoB)片段以及16S rDNA序列与贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis菌株CACC 316的序列同源性最高。根据4个不同基因片段的序列比对，构建了系统发育进化树(图3)，通过综合分析，菌株QSE-21确定为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis。

将本发明筛选到的贝莱斯芽孢杆菌QSE-21进行菌种保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2020年7月8日；贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis QSE-21的保藏编号为CCTCC NO：M 2020295。

实施例2：QSE-21发酵液对灰霉菌生长发育的抑制作用

将贝莱斯芽孢杆菌QSE-21接种到LB液体培养基中，在25℃，180rpm条件下震荡培养72h，培养液经10000rpm离心，上清液再经0.45μm无菌过滤器过滤，获得不含QSE-21菌体的QSE-21发酵液。

1、QSE-21发酵液对灰霉菌菌丝生长的抑制作用

将QSE-21发酵液按2％，4％，6％，8％的比例加到PDA培养基中，制备含有不同浓度QSE-21发酵液的PDA平板，以不添加QSE-21发酵液的PDA平板作为对照(CK)，CK及4个不同QSE-21发酵液浓度的平板各5个。在平板中心接种灰霉菌孢子液(3μl，10⁶cfu)，25℃培养箱中培养4d，采用十字交叉法测量平板上灰霉菌的菌落直径(a和b)，按照椭圆面积公式(S＝πab/4)计算菌落面积，根据面积按公式1计算不同浓度的QSE-21发酵液对灰霉菌菌丝生长的抑制率。

其中，S_CK表示对照组中灰霉菌菌落面积平均值，S_QSE-21表示添加了QSE-21发酵液的处理组中灰霉菌菌落面积平均值。

结果如图4所示，4个浓度的QSE-21发酵液对灰霉菌菌丝的生长都有抑制作用，并且随着浓度的升高，对菌丝生长的抑制率明显提高；QSE-21发酵液浓度为8％时，抑制率为83.7％。

2、QSE-21发酵液对灰霉菌产孢的影响

将QSE-21发酵液按0.5％和1％的体积比加到PDA培养基，制备含有不同浓度QSE-21发酵液的PDA平板，以不添加QSE-21发酵液的PDA平板作为对照(CK)，CK及2个不同QSE-21发酵液浓度的平板各5个。在平板中心接种灰霉菌孢子液(3μl，10⁶cfu)，25℃培养箱中培养6d。用水将每个平板上的孢子洗到离心管中，用2层擦镜纸过滤除去菌丝，准确计量体积，通过血球计数板法计量孢子液浓度，计算每个平板的孢子量，以每组处理中的5个平板孢子量的平均值作图。

产孢量结果如图5所示，0.5％和1％的QSE-21发酵液对灰霉菌菌丝生长抑制作用较小，菌丝能够生长到平板边缘，但明显抑制灰霉菌的产孢，且抑制效果与QSE-21发酵液成正比，在含有0.5％QSE-21发酵液的PDA平板上，灰霉菌产孢量约为CK组的2.79％，而在含有1％QSE-21发酵液的PDA平板上，灰霉菌产孢量仅约为CK组的1.16％，既在不影响菌丝生长的低浓度下，QSE-21发酵液抑制灰霉菌孢子的产生。

3、QSE-21发酵液对灰霉菌孢子萌发的抑制作用

用1/3浓度的YEPD培养基(配方为：酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加水至1L，121℃高压灭菌20min)收集灰霉菌孢子，调整至浓度为10⁴cfu。向孢子悬浮液中加入终浓度为6％的QSE-21发酵液作为处理组，以加入等体积的LB培养基作为CK组，吸取20μl孢子液滴加到载玻片上，置于暗盒中保湿，于25℃培养箱中培养。待CK组中孢子萌发超过90％，统计处理组和CK组中孢子萌发数量。每个处理统计5个载玻片，每个载玻片统计约100个孢子，以孢子萌发数量的平均值作图。

孢子萌发结果如图6所示，孢子液培养约7h时，CK组中的孢子悬浮液萌发率平均值为92.4％，而含有6％的QSE-21发酵液的孢子萌发率仅为6.9％，说明QSE-21发酵液对灰霉菌孢子的萌发具有较强的抑制作用。

4、QSE-21发酵液对灰霉菌菌核萌发的抑制作用

制备含有6％的QSE-21发酵液的PDA平板，以不含QSE-21发酵液的PDA平板为对照，在平板上倒置(在产菌核平板上靠近培养基的一侧朝上)接种表面去除了残留气生菌丝的灰霉菌菌核。将PDA平板置于25℃培养箱中培养2d，观察PDA平板上菌核的萌发情况。

菌核萌发结果如图7所示，培养2d后，接种在不含QSE-21发酵液的PDA平板上的菌核全部萌发，在菌核接触培养基的周围产生白色菌丝体，并形成菌落；接种在含有6％的QSE-21发酵液的PDA平板上的菌核只在表面长出菌丝，在靠近培养基的位置没有菌丝产生。结果表明，QSE-21发酵液对灰霉菌菌核萌发产生菌丝体具有较强的抑制作用。

综上，在QSE-21发酵液的浓度为2-8％，对菌丝生长的抑制率明显提高，且浓度为8％时，菌丝抑制率最高；在QSE-21发酵液的浓度为0.5-1％，显著抑制灰霉菌孢子的产生，且在浓度1％时，孢子抑制率最高；在QSE-21发酵液的浓度为6％时，对灰霉菌孢子的萌发以及菌核的萌发具有较强的抑制作用，说明当QSE-21发酵液的浓度在0.5-8％时，对灰霉菌具有显著的抑制作用。

实施例3：QSE-21发酵液诱导番茄叶片对灰霉菌的抗性

1、QSE-21发酵液诱导番茄叶片茉莉酸途径相关基因的表达

用实施例2中制备好的QSE-21发酵液均匀喷洒2周龄的番茄幼苗，处理后置于温室中培养，分别在处理后3h，6h，9h，12h和24h取番茄叶片，喷洒后立即取番茄叶片作为0h。每个时间点分别取3棵幼苗，每棵幼苗分别取6片叶片，共18片叶片混合后迅速用液氮速冻，置于-80℃冰箱保存。待所有材料取样完成后，每份叶片在液氮中研磨至粉末，取适量粉末用植物RNA提取试剂盒提取番茄叶片RNA，用反转录试剂盒进行反转录获得cDNA，通过荧光定量PCR(qRT-PCR)检测番茄茉莉酸合成途径关键基因脂肪氧合酶C(LoxC)、丙二烯氧合酶1(AOS1)和丙二烯氧化物环化酶(AOC)，以及茉莉酸途径下游响应基因蛋白酶抑制子I(SlPI-I)、蛋白酶抑制子II(SlPI-II)和乙烯响应因子2(SlERF2)。qRT-PCR所用的引物如表2所示。

表2 qRT-PCR所用引物

qRT-PCR反应体系如下：

qRT-PCR反应程序如下：

以番茄Actin(SlActin)基因表达量作为内参，以0h作为对照，对qRT-PCR的结果进行分析，获得基因相对表达量结果如图8所示，QSE-21发酵液处理番茄叶片诱导6个基因显著上调表达，其中茉莉酸合成途径关键基因SlLoxC、SlAOS1和SlAOC在3h(3hpi)时相对表达量迅速达到最高，在6-24h保持较高的相对表达水平；茉莉酸途径下游响应基因SlPI-I和SlPI-II在6h(6hpi)相对表达量达到最高，在6-24h保持较高的相对表达水平，而SlERF2相对表达水平在诱导3h(3hpi)迅速升高，达到最大，在3-24h逐渐下降至诱导前的水平。结果表明，QSE-21发酵液处理诱导番茄叶片茉莉酸合成途径关键基因及下游响应基因的快速反应。

2、QSE-21发酵液提高番茄叶片对灰霉菌的系统抗性

取4周龄长势一致的番茄幼苗叶片置于湿润的滤纸上，用锡箔纸包住上半部分，下半部分用QSE-21发酵液均匀喷洒作为处理组，去掉锡箔纸，在叶片上半部分中间位置(避开叶脉)滴5μl灰霉菌孢子液，孢子液浓度为10⁶cfu；以喷洒水作为对照(CK)，对照组和处理组各处理10片叶片。保湿72h，观察灰霉菌孢子侵染情况；用十字交叉法测量侵染斑的直径，并计算侵染斑面积，进行统计分析。

结果如图9所示，喷洒QSE-21发酵液的处理组中灰霉菌孢子侵染面积显著小于喷洒水的对照组，表明QSE-21菌株发酵液处理提高了番茄叶片的系统抗性，抑制灰霉菌的侵染，根据公式2计算抑制率为46.6％，该实验进行三次生物学重复，得到的结果基本一致。

其中，S_CK表示对照组中灰霉菌侵染斑面积平均值，S_QSE-21表示处理组中灰霉菌侵染斑面积平均值。

实施例4：QSE-21发酵液在防治番茄灰霉病中的应用

选取长势一致的4周龄番茄幼苗，用QSE-21发酵液均匀喷洒整个植株作为处理组，以用水处理作为对照组(CK)，对照组和处理组各取15片叶片，置于湿润的滤纸上；用直径为4mm的打孔器在培养3d的灰霉菌平板边缘取菌饼，将菌饼接种到处理过的番茄叶片上(灰霉菌菌丝与QSE-21菌株发酵液直接接触)。保湿60h，观察灰霉菌侵染情况；用十字交叉法测量菌饼中心到侵染斑边缘的直径，计算椭圆形面积，同时扣除菌饼(直径为4mm)所占面积，以剩余面积(环形)作为侵染斑面积。对处理组和对照组的侵染斑面积进行统计分析。

结果如图10所示，对照组中的15片叶片全部被侵染，而喷洒QSE-21发酵液的处理组中有40％(6/15)的叶片没有被侵染，且被侵染叶片的侵染斑面积显著小于对照组。根据公式2计算QSE-21发酵液对灰霉菌侵染的抑制率为84.4％。

综合上述所有结果，QSE-21发酵液不仅对灰霉菌具有显著的抑制作用，还可以提高番茄叶片对灰霉菌的抗性，进而提高了番茄对灰霉菌的抵御能力，因此QSE-21发酵液对番茄灰霉病有较好的抑制效果，可将其开发成生物制剂用于番茄灰霉病的有效防治。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一株提高番茄灰霉病抗性的贝莱斯芽孢杆菌QSE-21及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1426

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)

<400> 1

ggactggcgg tgctatacat gcaagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt 60

agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg 120

aaaccggggc taataccgga tggttgtttg aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggct 180

tcggctacca cttacagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca 240

ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac 300

ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 360

ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag 420

aacaagtgcc gttcaaatag ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 480

actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc 540

gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga 600

gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc 660

ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa 720

ctgacgctga ggagcgaaag agtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780

ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc 840

attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg 900

gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta atttgaagca acgcgaagaa ccttaccagg 960

tcttgacatc ctctgacaat cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg 1020

tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 1080

caacccttga ttttagttgc cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca 1140

aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca 1200

cgtgctacaa tggacagaac aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa 1260

tctgttttca gttcggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta 1320

atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1380

accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc tttttg 1426

<210> 2

<211> 1147

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)

<400> 2

aaagtatccg gcggtcttca cggtgtaggg gcgtccgtcg taaacgcctt gtcgactact 60

cttgacgtta cggttcatcg tgacggaaaa atccactatc aggcgtacga gcgcggtgtg 120

cctgtggccg atcttgaagt gatcggtgat actgataaga ccggaacgat tacgcacttc 180

gttccggatc cggaaatctt caaagaaaca actgtatacg actatgatct gctttcaaac 240

cgtgtccggg aattggcctt cctgacaaaa ggcgtaaaca tcacgattga agacaaacgt 300

gaaggacaag aacggaaaaa cgagtaccac tacgaaggcg gaatcaaaag ctatgttgag 360

tacttaaacc gttccaaaga agtcgttcat gaagagccga tttatatcga aggcgagaaa 420

gacggcataa cggttgaagt tgcattgcaa tacaacgaca gctatacaag caatatttat 480

tctttcacaa ataatatcaa cacatacgaa ggcgggacgc acgaggccgg atttaaaacc 540

ggtctgaccc gtgtcataaa cgactatgca agaagaaaag ggattttcaa agaaaatgat 600

ccgaatttaa gcggggatga tgtgagagaa gggctgactg ccattatttc aattaagcac 660

cctgatccgc aattcgaagg gcagacgaaa accaagctcg gcaactctga agcgagaacg 720

atcactgata cgctgttttt ttctgcgctg gaaacattcc ttcttgaaaa tccggactca 780

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gcgcgggaat tgacccgccg caaaagtgcg cttgagattt ccaatctgcc gggcaaactg 900

gcggactgtt cttctaaaga tccaagcatt tccgagctgt atatcgtaga gggtgactct 960

gcgggcggat cagcgaaaca gggacgggac cgccatttcc aagccattct gccgctgcgc 1020

ggtaagattc tgaacgttga gaaagccaga cttgataaga ttctctcaaa caatgaggtc 1080

agatcaatga tcacggccct cggaacagga atcggagcaa gattttaatc ttgaaaaagc 1140

gcgtatc 1147

<210> 3

<211> 564

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)

<400> 3

ggagccttag atatggctct taagcaaata gaaaaacaat tcggcaaagg ttccatcatg 60

aagctcggag aaaaaacgga tacaagaatt tcaacggtgc caagcggttc ccttgcactt 120

gataccgctc tcggaatagg cggatacccg cgcggacgga ttattgaagt atacggacct 180

gaaagctcag gtaaaacgac tgtagcgctt cacgcaatcg ctgaggttca ggaaaaaggc 240

ggacaggcag catttattga tgctgagcat gctcttgatc ctgtttacgc gcaaaagctc 300

ggtgtcaata tcgaagagct tctgctttct cagccggata cgggagagca ggcgctagag 360

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<210> 4

<211> 1166

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)

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Claims (8)

1.一株提高番茄灰霉病抗性的贝莱斯芽孢杆菌QSE-21，其特征在于，其分类名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M 2020295；所述贝莱斯芽孢杆菌QSE-21菌落为白色圆形、不透明、表面褶皱，边缘不整齐、产生褶皱的薄皮，质地干燥；QSE-21菌体为杆状，单个、成对或呈链状排列；

所述贝莱斯芽孢杆菌QSE-21提取自温室番茄植株；所述贝莱斯芽孢杆菌QSE-21的16SrDNA的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌QSE-21在用于制备防治番茄灰霉病的生物制剂中的应用，其特征在于，所述生物制剂的使用方法为：均匀喷洒在整个番茄植株上。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌QSE-21能够显著抑制灰霉菌的菌丝生长、孢子的产生和萌发以及菌核萌发。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌QSE-21能够诱导番茄叶片茉莉酸途径相关基因的表达。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌QSE-21能够显著提高番茄灰霉病抗性。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述生物制剂中包含贝莱斯芽孢杆菌QSE-21发酵液。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌QSE-21发酵液的制备方法为：将贝莱斯芽孢杆菌QSE-21接种到LB液体培养基中，在25℃，180 rpm条件下震荡培养72h，培养液经10000 rpm离心，上清液再经0.45μm无菌过滤器过滤，获得不含菌体的贝莱斯芽孢杆菌QSE-21发酵液。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌QSE-21发酵液在生物制剂中的添加体积比为0.5-8%。

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