CN106929447B - 地衣芽孢杆菌bl06及其应用 - Google Patents

地衣芽孢杆菌bl06及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了地衣芽孢杆菌BL06及其应用。地衣芽孢杆菌BL06，于2016年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.13462。所述的地衣芽孢杆菌BL06在制备防治芸薹菜软腐病的生防菌剂中的应用；也可以在促进植物生长中应用。

Description

地衣芽孢杆菌BL06及其应用
技术领域
本发明属于农业微生物领域，涉及地衣芽孢杆菌BL06及其应用。
背景技术
地衣芽孢杆菌为芽孢杆菌属内菌株，是目前得到广泛应用和研究，并具有巨大潜在开发价值的的菌株之一，菌体能通过产生抗菌活性物质，具有独特的生物夺氧作用机制，抑制病原菌的生长繁殖，同时能够产生多种促生相关物质，促进植物生长。
农业生产中，植物病原真菌性病害是威胁作物生产，影响作物产量和质量的病原物。其中，黄瓜霜霉病是由古巴假霜霉菌(Pseudoperonospora cubensis)引起的,是全世界范围内黄瓜产区最主要叶部病害之一。全世界大约有70多个国家先后发生过这种病害，对黄瓜生产威胁极大。目前，黄瓜霜霉病的防治措施主要依靠培育抗性品种，主要方法有杂交法、转基因、紫外诱变和药剂驯化，其次是选用化学药剂防治。病害一旦发生，必须间隔三四天施药一次控制病害，农药残留问题异常突出，同时易产生抗药性。
相似的植物病原真菌病害还有辣椒疫病、小麦赤霉病。均是严重危害农业生产的重要病害。
软腐病主要由欧氏杆菌属(Erwinia)细菌和根霉属(Rhizopus)真菌引起的植物病害。可使植物的组织或器官发生腐烂。病菌均为弱寄生菌，主要为害植物的多汁肥厚的器官，如块根、块茎、果实、茎基等。发病不限于田间,运输途中和贮藏期间也有发生,且为害更重。为害的作物种类甚多。中国主要的软腐病有由软腐欧氏杆菌(Erwinia aroideae)引起的十字花科作物、番茄、马铃薯、瓜类等的软腐病,由黑根霉(Rhizopus stolonifer)引起的甘薯软腐病等。
随着社会对绿色食品要求的呼应，限制或少用、不用化学药剂的声音也越来越多，即使是一些防效相对稳定的霜霉威等药剂也不断叫停。同时，消费者逐渐意识到化学农药残留问题对人体健康的影响，各界转而开始使用生物农药，如克菌康、武夷菌素、绿盾丰、双抗等，活体的生防菌剂主要有芽孢杆菌和假单胞类，但大多处于实验室研究开发阶段。
生物防治的手段近些年不断浮出视野，主要是利用一些芽孢杆菌属菌株的发酵液及其次生代谢产物以及一些天然产物植物的代谢物，防效大多在50％到70％之间。相比化学药剂,因其安全、口感品质上都稍胜一筹，故其生物防治的研究也逐步在上台阶。已有大量研究报道了将颉颃菌引入植物可提高植物的抗病、抗虫、抗逆性。由于颉颃菌在抑制植物病害方面的广谱性、高效性以及安全性，目前成为农药市场发展的趋势，被称为是最有潜力的发展方向。因此，开发新的、更为高效和安全的微生物制剂控制病害的发生是提高社会生产总量的需要，同时更是农业安全及可持续发展的需要。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中，缺乏对芸薹菜软腐病引起的病害有较高防效的芽孢杆菌生防制剂的现状，提供一种防治芸薹菜软腐病的单一生防菌菌株及其菌剂。
本发明的另一目的是提供该菌株的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
地衣芽孢杆菌BL06，于2014年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.13462。
由所述的地衣芽孢杆菌BL06制备的生防菌剂。
生防菌株BL06用于制备生防菌剂的方法为：将地衣芽孢杆菌BL06的种子菌液以1:500体积比接种至LB发酵培养液中发酵培养，28℃、200rpm培养48h，然后6000rpm离心10min，用灭菌水进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×109～1×1010CFU/mL。
当然，利用所述的防治霜霉菌等真菌病害的地衣芽孢杆菌BL06菌株制备生防菌剂并不限于以上方法。凡是能够大量培养BL06，且保持其抗霜霉病菌病害活性的方法均可用于制备本发明请求保护的生防菌剂。
所述的保藏号为CGMCC NO.13462的地衣芽孢杆菌BL06种子菌液制备方法为：将保藏号为CGMCC NO.13462的芽孢杆菌HS06菌株接种到LB培养液中28℃培养200rpm振荡培养至600nm处的OD值为0.8时结束培养。
本发明所述的地衣芽孢杆菌BL06在制备防治芸薹菜软腐病的生防菌剂中的应用。
本发明所述的地衣芽孢杆菌BL06制备的生防菌剂在防治芸薹菜软腐病中的应用。
本发明所述的地衣芽孢杆菌BL06在促进植物生长中的应用。
有益效果：
本发明是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于蔬菜的无公害生产，农民可以不用或减少其他化学农药的用量，这不仅可减少化学农药的残留问题的产生，同时有利于提高蔬菜的品质。
大田试验表明：该地衣芽孢杆菌BL06(CGMCC NO.13462)对芸薹菜软腐病的温室生防效果可达79.03％，并能够有效促进黄瓜生长。
生物样品保藏信息
一种地衣芽孢杆菌BL06，分类命名为Bacillus licheniformis.，于2016年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.13462
具体实施方式
实施例1
筛选方法：地衣芽孢杆菌BL06(CGMCC NO.13462)由江苏省淮安市丁集镇黄瓜日光大棚中黄瓜根围分离到。将黄瓜根组织切成1cm的小片，用1％的次氯酸钠浸泡5min，70％酒精浸泡1-2min，无菌水清洗3次(取最后一次清洗的溶液100μl涂于R2A固体培养基上培养，若48h后无菌生长则认为表面消毒干净，无菌)。取3g消毒好的样品置于菌研钵中，加入27ml无菌的0.85％NaCl，浸软组织，研磨，用无菌的0.85％NaCl梯度稀释。取10-1、10-2、10-3三个梯度的稀释液各100μl涂于R2A上，28℃培养48h。挑取最大的单菌落接种到新鲜R2A固体培养基，经反复转接得到纯化菌株。将纯化后的菌株用40％甘油保存于-70℃超低温冰箱中。
鉴定方法：通过形态特征，生理生化实验和16S rDNA序列分析对该菌株进行鉴定。
形态学特征：革兰氏阳性杆菌，细胞形态和排列呈杆状、单生，产近中生椭圆形芽孢，包囊稍膨大，在肉汁培养基上菌落扁平、边缘不整齐，表面粗糙褶皱。
16S rRNA基因扩增和序列分析:
地衣芽孢杆菌L06在R2A培养基中28℃培养至对数期，以12000r/min离心5min收集菌体，采用上海赛百盛基因技术有限公司的基因组DNA快速提取试剂盒，提取细菌的基因组DNA，以提取的DNA产物为模板，用细菌16S rRNA扩增通用引物U8-27(5’-AGAGTTTGATC(AC)TGGCTCAG-3’)、L1494-1514(5’-CTACGG(AG)TACCTTGTTACGAC-3’)从基因组DNA中扩增出16SrDNA基因片段。PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行测序。通过BLAST软件对测定16SrRNA基因序列进行同源性比较，结果简表，因此，将该菌株鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。
表1 Lgn-3测序比对结果
Figure GDA0002490638200000041
实施例2 BL06生防菌剂的制备
将地衣芽孢杆菌属BL06(CGMCC NO.13462)菌株接种到LB培养液中28℃ 200rpm振荡培养16h后，每隔2h在超净工作台中取样测其在600nm处的OD值，当OD值为0.8时结束培养，此菌液作为种子菌液。把种子菌液以1:500体积比接种至LB发酵培养液中发酵培养，28℃、200rpm培养48h，然后6000rpm离心10min，取沉淀即得所述的生防菌剂BL06。所得生防菌剂中活菌总浓度为1×109～1×1010CFU/mL。
实施例3温室实验测定BL06对黄瓜促生作用
生防菌处理组每株苗用30ml浓度为108CFU/ml的菌液处理，对照组用清水处理，每个处理12棵苗，每处理重复3次。接种25天后测量黄瓜株高、叶面积及鲜重、干重等指标。生物量增加(％)＝(处理组植株鲜重-对照植株鲜重)/对照植株鲜重×100％。
温室促生数据显示(表2)，BL06处理的黄瓜植株在株高、叶面积、鲜重等指标上均高于对照，植株生物增量为15.62％。BL06处理的瓜苗干重为4.89g/株，显著小于对照组，这说明菌剂处理的植株含水量更高，这可能是植株长势较好的原因。
表2:BL06对黄瓜苗的促生效果
Figure GDA0002490638200000042
注：数值为平均值±标准差，不同字母表示处理间在P＝0.05的显著水平下，差异性显著(Duncan test)。
实施例4温室实验测定BL06对芸薹菜软腐病的防治效果
生防菌处理方法：芸薹植株移栽时用5×107CFU/ml BL06菌液灌根加喷雾处理，共处理三次。每个处理3株苗。生防菌第一次处理5d后，接种软腐病菌。
病原菌接种方法：用1×107CFU/ml病原菌液喷施叶片，用保鲜膜封闭保湿，2d后取掉保鲜膜。
病原菌接种10d左右，芸薹开始发病时统计病情，之后每天统计一次，待空白对照病害严重度达到100％时停止统计。
表3.生防菌BL06对芸薹菜软腐病防效
Figure GDA0002490638200000051

Claims (3)

1.地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis.)BL06，于2016年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.13462。
2.由权利要求1所述的地衣芽孢杆菌BL06制备的生防菌剂；其特征在于通过以下方法制备得到：将地衣芽孢杆菌BL06的种子菌液以1:500体积比接种至LB发酵培养液中发酵培养，28℃、200rpm培养48h，然后6000rpm离心10min，用灭菌水进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×109～1×1010CFU/mL。
3.权利要求2所述的生防菌剂在防治芸薹菜软腐病和促进黄瓜生长中的应用。
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