CN105219673A - 防治黄瓜绿斑驳花叶病毒病的生防菌株hw2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业微生物领域，涉及防治黄瓜绿斑驳花叶病毒病的生防菌株HW2及其应用。生防菌株HW2，经鉴定该菌株属于嗜麦芽寡养单胞菌属(Stenotrophomonas？maltophilia)，2015年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC？NO.11024。同时温室试验结果显示，生防菌剂HW2能够显著降低黄瓜绿斑驳花叶病毒病的病害严重度，防治黄瓜绿斑驳花叶病毒病效果显著，防效在53.85％～57.02％之间，该菌剂对黄瓜有很好的促生效果，生物量增加可达42.76％，并显著增加黄瓜叶片叶绿素含量。因此，该菌株及由其制备的菌剂可在防治黄瓜绿斑驳花叶病毒病及促生方面应用。

Description

防治黄瓜绿斑驳花叶病毒病的生防菌株HW2及其应用

技术领域

本发明属于农业微生物领域，涉及防治黄瓜绿斑驳花叶病毒病的生防菌株HW2及其应用。

背景技术

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus，CGMMV)是芜菁花叶病毒科(Tymoviridae)烟草花叶病毒属(Tobamovirus)成员之一，是世界上许多国家和地区葫芦科植物上的重要检疫性病毒，严重威胁着西瓜、甜瓜、黄瓜等作物生产。1935年，英国Ainsworth首次报道了CGMMV在黄瓜上的危害，此后被传到欧洲、亚洲、南美洲的20多个国家。2005年我国辽宁盖州地区首次发现该病害，因其为害严重，2006年12月21日，农业部发布788号公告，将CGMMV确定为全国农业植物检疫性有害生物。

黄瓜绿斑驳花叶病毒的自然寄主主要为葫芦科植物，如黄瓜、西瓜、甜瓜、西葫芦、丝瓜等,也可侵染苋色藜、曼佗罗、烟草、栝楼等植物。作物一旦被黄瓜绿斑驳花叶病毒危害，损失非常严重，一般会造成产量损失15％～30％，严重的会达到60％以上，甚至绝收。培育抗病品种尽管是最快速有效的方法，但是由于其遗传机理及背景的复杂性，很难培育出抗性稳定的品种，同时由于抗病品种价格较贵，一般农民没有购买能力，因此限制了抗病品种的推广应用。另一方面，黄瓜绿斑驳花叶病毒病主要是以种子传播和接触传染为传播途径，病毒可通过寄主微小伤口进入组织内部，也可通过嫁接操作使健康植株感染病毒，病毒可在土壤中越冬，且活性可保持1年以上，成为下一年侵染源，从而难以防控。因此，利用植株自身抗性是综合防控黄瓜绿斑驳花叶病毒病的关键途径，在这方面，利用颉颃菌诱导植株产生对CGMMV的抗性是很有前景的发展方向。

颉颃菌是一类具有防病促生作用的有益微生物，它们可以从植物多个生境中分离得到。已有大量研究报道了将颉颃菌引入植物可提高植物的抗病、抗虫、抗逆性。由于颉颃菌在抑制植物病害方面的广谱性、高效性以及安全性，目前成为农药市场发展的趋势，被称为是最有潜力的发展方向。因此，开发新的、更为高效和安全的微生物制剂控制黄瓜绿斑驳花叶病毒病的发生是提高社会生产总量的需要，同时更是农业安全及可持续发展的需要。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中没有对黄瓜绿斑驳花叶病毒病有较高防效的生防制剂的现状，提供一种防治黄瓜绿斑驳花叶病毒病的单一生防菌菌株及其菌剂。

本发明的另一目的是提供该菌株的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种防治黄瓜绿斑驳花叶病毒病生防菌株HW2，经鉴定该菌株属于嗜麦芽寡养单胞菌属(Stenotrophomonasmaltophilia)，2015年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.11024。

生防菌株HW2用于制备生防菌剂的方法为：将嗜麦芽寡养单胞菌的种子菌液以1:500体积比接种至LB发酵培养液中发酵培养，28～30℃、200rpm培养40～48h，然后5000～6000rpm离心10～15min，用灭菌水进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×10⁹～1×10¹⁰CFU/mL。

当然，利用所述的防治黄瓜绿斑驳花叶病毒病生防菌株HW2制备生防菌剂并不限于以上方法。凡是能够大量培养HW2，且保持其抗黄瓜绿斑驳花叶病毒活性的方法均可用于制备本发明请求保护的生防菌剂。

所述的保藏号为CGMCCNO.11024的嗜麦芽寡养单胞菌HW2种子菌液制备方法为：将保藏号为CGMCCNO.11024的嗜麦芽寡养单胞菌HW2菌株接种到LB培养液中28℃培养180rpm振荡培养至600nm处的OD值为0.8时结束培养。

所述的保藏号为CGMCCNO.11024的生防菌株HW2在制备防治黄瓜绿斑驳花叶病毒病中的应用。

所述的生防菌剂稀释100倍后在黄瓜移栽时进行灌根和喷雾处理，15天为一个间隔周期共处理2次，发病时开始统计病情。嗜麦芽寡养单胞菌HW2对黄瓜绿斑驳花叶病毒病的防效为53.85～57.02％。

有益效果：

本发明是专门针对黄瓜绿斑驳花叶病毒病开发的生防制剂。由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于蔬菜的无公害生产，农民可以不用或减少其他化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且减少化学药剂的残留，有利于蔬菜的出口。

温室实验表明：该嗜麦芽寡养单胞菌HW2(CGMCCNO.11024)能显著降低黄瓜绿斑驳花叶病毒病的发生。利用该菌制备的生防菌剂稀释100倍在移栽时进行灌根和喷雾处理，在温室条件下对黄瓜绿斑驳花叶病毒病的生防效果可以达57.02％。且该嗜麦芽寡养单胞菌HW2还对黄瓜有很好的促生效果，生物量增加可达42.76％，并显著增加黄瓜叶片叶绿素含量。

生物样品保藏信息

HW2，分类命名为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，于2015年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCCNO.11024。

具体实施方式

实施例1

分离方法：嗜麦芽寡养单胞菌属HW2(CGMCCNO.11024)由江苏省淮安市丁集镇西瓜大棚内的健康西瓜叶内分离到。将西瓜叶组织切成1cm的小片，用1％的次氯酸钠浸泡5min，70％酒精浸泡1-2min，无菌水清洗3次(取最后一次清洗的溶液100μl涂于R₂A固体培养基上培养，若48h后无菌生长则认为表面消毒干净，无菌)。取3g消毒好的样品置于菌研钵中，加入27ml无菌的0.85％NaCl，浸软组织，研磨，用无菌的0.85％NaCl梯度稀释。取10^-1、10^-2、10^-3三个梯度的稀释液各100μl涂于R₂A上，28℃培养48h。挑取最大的单菌落接种到新鲜R₂A固体培养基，经反复转接得到纯化菌株。将纯化后的菌株用40％甘油保存于-70℃超低温冰箱中。

筛选方法：

为了更好的筛选所分离的菌株，本文对分离菌株的水解酶及嗜铁素的生产潜力进行了评估。蛋白酶活性是根据Yang等的方法进行测定，几丁质酶活性是在以胶体状几丁质为唯一碳源的培养基上测定，β-1,3-葡聚糖酶和纤维素酶活性分别在葡聚糖培养基上(β-1,3-葡聚糖0.1g，TSB0.4g，琼脂1.6g，4g/L的刚果红1mL，定容至100mL)和纤维素酶培养基上进行测定，参照Shin等人的方法，测定嗜铁素是否产生。接菌30℃培养3天观察并且测量透明圈内径和外径。

1.1蛋白酶活性测定

病毒由蛋白和核酸构成,因此蛋白酶可能会分解蛋白质,破坏病毒结果.

牙签挑取处于生长旺盛期的菌株点于蛋白培养基(A：脱脂奶粉8g，溶于300mL水中，121℃灭菌10min；B：琼脂8g，定容至300mL，121℃灭菌20min，A与B分别灭菌后混合)接菌后30℃培养3天观察透明圈有无，分别记录透明圈的内径和外径。

1.2几丁质酶活性测定

几丁质酶与较多真菌和细菌病害的防治具有一定关系,因此可能也与病毒病的防治有关。

将分离细菌在以胶体状几丁质为唯一碳源的培养基(Chi-Ayers)：(NH4H2PO41.0g，KCl0.2g，MgSO4.7H2O0.2g，胶体状几丁质1％(w/v)定容至1000mL，pH＝7.0，琼脂20g)上培养，接菌后30℃培养3天，测透明圈的内径和外径。

胶体状几丁质的制备：20g甲壳素溶于350mL浓盐酸，4℃放置24h，玻璃棉过滤，滤液加入2L冰无水乙醇(－20℃过夜)，10000g离心20min，沉淀用自来水冲洗，直至pH为中性，冷冻干燥，－20℃密封保存。使用时，胶体状几丁质必须用手动匀浆器至少研磨5次(RobertsandSelitrennikoff,1988)。

1.3β-1,3-葡聚糖酶活性的检测

β-1,3-葡聚糖酶可能会降解真菌的细胞壁,与一些真菌病害防治有关。

在葡聚糖平板上(β-1,3-葡聚糖0.1g，TSB0.4g，琼脂1.6g，4g/L的刚果红1mL，定容至100mL)接菌后30℃培养48h，观察并测量其透明圈的内径和外径。

1.4纤维素酶活性的检测

纤维素酶可能会降解真菌的细胞壁,与一些真菌病害防治有关。

纤维素酶活性测定参照GhoseT.K(1987)方法。把准备好的菌株接到纤维素酶活性测定平板(蛋白胨10g，酵母粉10g，羧甲基纤维素钠10g，氯化钠5g，磷酸二氢钾1g，琼脂18g，定容至1000mL，pH＝7.0)，30℃培养48h后，用1g/L的刚果红染1h后，倒掉染液后，用1M的NaCl浸泡1h。检测透明圈的有无并且测量其内径和外径。

1.5产嗜铁素活性的检测

产嗜铁素与细菌的生长有关,同时与植物的诱导抗病性有关。

测定嗜铁素是否产生，参照Shin等人(Shinetal.,2001)的方法。A：1，60.5mgCAS(铬天青S)溶于50mL去离子水；2，10mL三价铁溶液(1mMFeCl3.6H2O，10mM盐酸为溶剂)；3，72.9mgHDTMA溶于40mL去离子水。上述三个溶液混合定容至100mL，pH调至中性，121℃灭菌20min。B：30.24gPipes加入900mLWakeragar培养基，12g50％(W/V)的NaOH溶液将培养基pH调至6.8，121℃灭菌20min。A，B液混合倒平板，接菌30℃培养3天观察并且测量透明圈内径和外径。

结果表明：筛选到一株菌HW2具有以上水解酶活性及产嗜铁素活性，平板试验表明，该菌具有良好的生防潜力。

鉴定方法：通过形态特征，生理生化实验和16SrDNA序列分析对菌株HW2进行鉴定。

形态学特征：革兰氏阴性杆菌，菌落表面透明。

16SrRNA基因扩增和序列分析:

将HW2在R₂A培养基中28℃培养至对数期，以12000r/min离心5min收集菌体，采用上海赛百盛基因技术有限公司的基因组DNA快速提取试剂盒，提取细菌的基因组DNA，以提取的DNA产物为模板，用细菌16SrRNA基因扩增通用引物U8-27(5’-AGAGTTTGATC(AC)TGGCTCAG-3’)、L1494-1514(5’-CTACGG(AG)TACCTTGTTACGAC-3’)从基因组DNA中扩增出16SrRNA基因片段。PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行测序。通过BLAST软件对测定16SrRNA基因序列进行同源性比较，将该菌株鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌属(Stenotrophomonasmaltophilia)。

表1HW2测序比对结果

实施例2HW2生防菌剂的制备

将嗜麦芽寡养单胞菌属HW2(CGMCCNO.11024)菌株接种到LB培养液中28℃200rpm振荡培养16h后，每隔2h在超净工作台中取样测其在600nm处的OD值，当OD值为0.8时结束培养，此菌液作为种子菌液。把种子菌液以1:500体积比接种至LB发酵培养液中发酵培养，28℃、200rpm培养48h，然后6000rpm离心10min，用灭菌水稀释沉淀，即得所述的生防菌剂HW2。所得生防菌剂中活菌总浓度为1×10⁹～1×10¹⁰CFU/mL。

实施例3温室试验测定HW2对黄瓜绿斑驳花叶病毒病的防效

黄瓜2-3叶期时进行移栽，移栽同时进行灌根和喷雾处理。实施例2制备HW2(CGMCCNO.11024)菌剂灌根浓度为1×10⁸CFU/mL，每棵苗用量为30ml。喷雾浓度为1×10⁷CFU/mL，喷雾标准是每片叶子上有雾状液滴分布，以不掉下为准，均匀喷雾。生防菌剂处理7天后接种黄瓜绿斑驳花叶病毒(所用病原菌为病毒CGMMV，由浙江农科院馈赠，为侵染性克隆农杆菌，菌株名实验称为EHA105，转的质粒为pCB-CGMMV。将EHA105在含有利福平和卡那霉素(终浓度均为50mg/mL)的LB培养液中制备成菌液，用浸润法对黄瓜进行渗透注射接种)。第1次处理15天后，进行第2次相同处理。对照处理只接种病毒不进行生防菌处理。每个处理组24株番茄，3次重复。将番茄置于温度为28℃，光照为16h/8h温室条件下培养，待发病时调查病级数，计算病害严重度和防效。

按照辽宁省地方标准，2009年提出的病情分级标准，计算病害严重度和防效。

黄瓜绿斑驳花叶病毒病病情分级标准为：

0级：无任何症状；

1级：心叶明脉，轻微花叶，发病面积占整个植株面积的5％以下；

3级：心叶及少数叶片花叶，发病面积占整个植株面积的6％～15％；

5级：多数叶片花叶，少数叶片皱缩、畸形，植株轻微矮化，发病面积占整个植株面积的16％～30％；

7级：多数叶片严重花叶，多数叶片皱缩、畸形，植株矮化，或叶柄有褐色坏死斑点，发病面积占整个植株面积的31％～50％；

9级：严重发病，叶片严重畸形，植株严重矮化，茎部有褐色条斑，发病面积占整个植株面积的51％以上。

病害严重度％＝[∑(发病植株数×病级数)/(总植株数×最高病级数)]×100；

生防效果％＝[(对照病害严重度－处理病害严重度)/对照病害严重度]×100。

在生防菌剂HW2第1次处理40天后的调查结果显示，生防菌剂HW2对黄瓜绿斑驳花叶病毒病的生物防治效果(以下简称防效)达到57.02％(表2)。

表2生防菌剂HW2对黄瓜绿斑驳花叶病毒病的生防效果

注：此结果为HW2处理40天(对照组发病30天)后的防效统计结果。

实施例4生防菌剂HW2对黄瓜的促生作用

黄瓜品种为“津优1号”。试验共设2个处理组，分别为实施例2制备的HW2生防菌剂处理和清水对照处理。灌根浓度为1×10⁸CFU/mL，每棵苗用量为30ml。喷雾浓度为1×10⁷CFU/mL，喷雾标准是每片叶子上有雾状液滴分布，以不掉下为准，均匀喷雾。

数据显示，黄瓜移栽30天后生防菌剂HW2对黄瓜的生物量增加达42.76％。

表3生防菌剂HW2对黄瓜的促生作用

注：此结果为HW2处理30天后的统计结果。

我们对黄瓜叶片叶绿素含量也进行了测定。结果表明，菌株HW2处理后能显著增加叶片叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量，其总叶绿素含量为2.42mg/g(表4)。

表4生防菌剂HW2对黄瓜叶片叶绿素含量的影响

Claims (7)

1.一种防治黄瓜绿斑驳花叶病毒病的生防菌株HW2，经鉴定该菌属于嗜麦芽寡养单胞菌属(Stenotrophomonasmaltophilia)，2015年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.11024。

2.用权利要求1所述的防治黄瓜绿斑驳花叶病毒病生防菌株HW2制备的生防菌剂。

3.权利要求2所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于：将权利要求1所述的防治黄瓜绿斑驳花叶病毒病生防菌株HW2种子菌液接种至LB发酵培养基中28～30℃200rpm振荡培养40～48h，然后5000～6000rpm离心10～15min，用灭菌水进行稀释制成菌剂，成品菌剂中活菌总浓度为1×10⁹-1×10¹⁰CFU/mL。

4.权利要求1所述生防菌株HW2在制备防治黄瓜绿斑驳花叶病毒病制剂中的应用。

5.权利要求1所述生防菌株HW2在植物促生方面的应用。

6.权利要求2所述生防菌剂在防治黄瓜绿斑驳花叶病毒病方面的应用。

7.权利要求2所述生防菌剂在植物促生方面的应用。