CN102010835A

CN102010835A - 一种黄麻链霉菌nf0919菌株、用途及其活性发酵液的制备方法

Info

Publication number: CN102010835A
Application number: CN 201010236886
Authority: CN
Inventors: 杨敬辉; 陈宏州; 庄义庆
Original assignee: Zhenjiang Institute of Agricultural Sciences Jiangsu Hilly Area
Current assignee: Zhenjiang Institute of Agricultural Sciences Jiangsu Hilly Area
Priority date: 2010-07-27
Filing date: 2010-07-27
Publication date: 2011-04-13
Anticipated expiration: 2030-07-27
Also published as: CN102010835B

Abstract

本发明公开了一种黄麻链霉菌菌株NF0919(Streptomyces corchorusii)，该菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC No.3968。该菌株可用于防治小麦纹枯病、水稻稻曲病和水稻纹枯病和其它多种植物病害。

Description

一种黄麻链霉菌NF0919菌株、用途及其活性发酵液的制备方法

发明领域

本发明涉及一种微生物及用途，更具体地说涉及一种黄麻链霉菌NF0919菌株、用途及其活性发酵液的制备方法，属于生物农药技术领域，

背景技术

由植物病原真菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的水稻纹枯病(Rice sheath blight)、禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起的小麦纹枯病(Wheat sheath blight)和水稻绿核菌(Ustilaginoidea oryzae)引起的水稻稻曲病(Rice false smut)是当前为害水稻的主要病害。上述三类病害常年可造成10％～30％的产量损失，高发年份减产80％，甚至绝收。目前，该类病害的防治主要依赖化学药剂，但随着环保以及病菌抗药性问题的日益突出，化学防治受到严峻的挑战。当前随着高产、矮秆、多蘖水稻和小麦良种以及抛秧和直播稻等水稻轻型栽培技术的推广，使水稻和小麦纹枯病和水稻稻曲病的为害逐年加重。近年来，随着人们对食品安全的要求越来越高，生物防治在农业生产中也越来越被重视。利用颉颃微生物防治该类病害呈现良好的发展前景，目前已发现了大量对该类病害有颉颃作用的微生物。研制与开发防治水稻、小麦纹枯病和稻曲病的微生物及其代谢产物，主要是从细菌、真菌和植物中获得。目前报道用于防治该类病害的细菌属(种)主要有(1)吸水链霉菌井冈变种(Streptomyceshygroscopicus var.Jingganggensis Yen)；(2)链霉菌702(Streptomyces sp.702)；(3)金色链霉菌(Streptomyces aureochromogenes)；(4)链霉菌(Streptomyces kitasazwaensis)；(5)吸水链霉菌北京变种(Streptomyces hygrospinosus var.beijingensis)；(6)蜡质芽孢杆菌(Bacillus cerens)；(7)芽孢杆菌B-916(Bacillus subtilis B-916)；(8)金色假单胞菌(Pseudomonas aureofaciens)；(9)荧光假单胞细菌(Pseudomonas fluorescens)；(10)多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxaVLB16)；(11)链霉菌(Streptomyces sp.PM5)；(12)铜绿假单胞ZJ1999(Pseudomonasaeruginosa ZJ1999)；(13)黄单胞菌属(Xanthomonas sp.)；(14)海洋细菌PY-sw-1。

另外目前用于该类病害的生防真菌主要有以下种类：(1)绿色木霉TvMN7菌株(Trichoderma viride TvMN7)；(2)长枝木霉T8(Trichoderma longibrachiatum T8)；(3)哈茨木霉TC3(Trichoderma harzianum TC3)；(4)哈茨木霉NF9(Trichoderma harzianum NF9)；(5)青霉属(Penicillium sp)；(6)禾长蠕孢菌HGE菌株(Helminthosporium gramineum Rabenhf.sp.echinochloae HGE)。用于该类病害的生物制剂主要有：(1)井冈霉素(有效霉素)；(2)三木脂素；(3)芽孢杆菌泡腾剂；(4)抗菌肽(Purothionin)；(5)多抗(氧)霉素；(6)抗霉素A；(7)抗霉素120(农抗120)。大多数菌株或制剂只能防冶一种病害，而利用颉颃放线细菌同时防治水稻稻曲病和水稻、小麦纹枯病和其它多种病害的在现有技术中没有提及和公开。

发明内容

本发明解决现有技术存在的不足，提供一株新分离的链霉菌菌株：黄麻链霉菌NF0919菌株(Streptomyces corchorusii)，该菌株可用于防治小麦纹枯病、水稻稻曲病和水稻纹枯病和其它多种植物病害。

同时本发明还提供用该黄麻链霉菌菌株NF0919制备的活性发酵液的方法，工艺简单。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的黄麻链霉菌菌株NF0919(拉丁文学名为Streptomyces corchorusii)，已于2010年7月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC No.3968。本发明的菌种具有如下特征：

(1)NF0919菌株的形态及生理生化特征(见表1)

表1、NF0919菌株形态及理化特征

本发明的黄麻链霉菌菌株NF0919的16S rRNA基因序列为：

TCGACAGCTCCCTCCCACAAGGGGTTGGGCCACCGGCTTCGGGTGTTACCAACTTTCGTGACGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCAACTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGACCGGCTTTTTGAGATTCGCTCCACCTCACGGTATCGCAGCTCATTGTACCGGCCATTGTAGCACGTGTGCAGCCCAAGACATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCTCCTGTGAGTCCCCATCACCCCGAAGGGCATGCTGGCAACACAGGACAAGGGTGGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTACACCGACCACAAGGGGGACCCTGTCTCCAGGGTTTTCCGGTGTATGTCAAGCCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAGCCACATGCTCCGCTGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGAACTTAATGCGTTAGCTGCGGCACCGACGACGTGGAATGTCGCCAACACCTAGTTCCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTAATGGCCCAGAGATCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTTCACCGCTACACCAGGAATTCCGATCTCCCCTACCACACTCTAGCTAGCCCGTATCGAATGCAGACCCGGGGTTAAGCCCCGGGCTTTCACACCCGACGTGACAAGCCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCGCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGCGCTTCTTCTGCAGGTACCGTCACTTTCGCTTCTTCCCTGCTGAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTTCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGGGCTCATCCTTCACCGCCGGAGCTTTCAACCCTCACAGATGCCTGCGAGAGTGGTATCCGGTATTAGACCCCGTTTCCAGGGCTTGTCCCAGAGTGAAGGGCAGATTGCCCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTAATCCCCACCGAAGTGGTTCATCGTTCGACTGCA。

本发明的用该黄麻链霉菌菌株NF0919制备活性发酵液的方法，包括以下步骤：

(A)菌株的活化与一级种子培养液的培养

将保存的NF0919菌株的斜面在高氏一号培养基上活化，30℃培养10d，挑取1cm²大小的菌块接种于50mL一级种子培养液中(250mL三角瓶装培养液50mL)，置于170rpm摇床上30℃振荡培养44～48h，其中所述的50mL一级种子培养液的成分为：可溶性淀粉3％，葡萄糖2％，酵母粉1％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，K₂HPO₄ 0.2％，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K₂HPO₄含量的单位比例为W/V；

(B)二级种子培养液的培养

将步骤(A)所得一级种子培养液按5％(V/V)的接种量接入50mL二级种子培养液中(250mL三角瓶装培养液50mL)，170rpm、30℃摇床上培养48-52h，其中所述的5％的单位比例为V/V；所述的50mL二级种子培养液的成分(W/V)：马铃薯淀粉8.5％，棉籽蛋白2.2％，CaCO₃0.1％，K₂HPO₄0.05％，MgSO₄0.05％，淀粉酶0.01％，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO₃、K₂HPO₄、MgSO₄和淀粉酶含量的单位比例为W/V；

(C)发酵培养液的培养

将步骤(B)所得二级种子培养液按5％(V/V)的接种量接种于装有160L发酵培养液的容积为200L的发酵罐中，其中所述的5％的单位比例为V/V，设置发酵参数为：溶氧100％，消泡剂1.6L，搅拌速度为360rpm，发酵温度为36℃，发酵时间为72h，pH 6.8～7.2，所述的发酵培养液的成分为(W/V)：马铃薯淀粉8.5％，棉籽蛋白2.6％，K₂HPO₄ 0.05％，NaCl 0.2％，MgSO₄ 0.05％，CaCO₃ 0.1％，pH7.2-7.4，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、K₂HPO₄、NaCl、MgSO₄和CaCO₃含量的单位比例为W/V；所述的消泡剂优选为XP-100F系列发酵用有机硅消泡剂。(D)NF0919活性发酵液的制备

把步骤(C)所得发酵液在10000rpm离心5min得上清液，上清液中添加1％(W/V)润湿剂和1％(W/V)防腐剂即得菌株NF0919的活性发酵液，其中润湿剂和防腐剂含量的单位比例均为W/V；所述的润湿剂优选为木质素磺酸钠；所述的防腐剂优选为苯钾酸钠。

本发明的有益效果是：

(1)本发明提供一株新的生防链霉菌菌株——黄麻链霉菌NF0919，由该菌株发酵而得的活性发酵液可同时防治水稻、小麦纹枯病和水稻稻曲病和其它多种植物病害，防治效果显著优于当前所用生防菌剂。大田示范防治结果表明，该菌剂对水稻稻曲病、水稻纹枯病和小麦纹枯病等植物病害均有很好的防治效果。

(2)菌剂防治效果稳定，对环境友好，大规模生产的发酵工艺简单、生产成本低廉。

具体实施方式

实施例

本发明的黄麻链霉菌菌株NF0919(拉丁文学名为Strptomyces corchorusii)，已于2010年7月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC No.3968。本发明的菌种的形态及生理生化特征见表1。

本实施例的黄麻链霉菌菌株NF0919的16S rRNA基因序列为：

本实施例的用该黄麻链霉菌菌株NF0919制备活性发酵液的方法，包括以下步骤：

(A)菌株的活化与一级种子培养液的培养

(B)二级种子培养液的培养

(C)发酵培养液的培养

将步骤(B)所得二级种子培养液按5％(V/V)的接种量接种于装有160L发酵培养液的容积为200L的发酵罐中，其中所述的5％的单位比例为V/V，设置发酵参数为：溶氧100％，消泡剂1.6L，搅拌速度为360rpm，发酵温度为36℃，发酵时间为72h，pH 6.8～7.2，所述的发酵培养液的成分为(W/V)：马铃薯淀粉8.5％，棉籽蛋白2.6％，K₂HPO₄ 0.05％，NaCl 0.2％，MgSO₄ 0.05％，CaCO₃ 0.1％，pH7.2-7.4，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、K₂HPO₄、NaCl、MgSO₄和CaCO₃含量的单位比例为W/V；所述的消泡剂为XP-100F系列发酵用有机硅消泡剂。

(D)NF0919活性发酵液的制备

把步骤(C)所得发酵液在10000rpm离心5min得上清液，上清液中添加1％(W/V)润湿剂和1％(W/V)防腐剂即得菌株NF0919的活性发酵液，其中润湿剂和防腐剂含量的单位比例均为W/V；所述的润湿剂为木质素磺酸钠；所述的防腐剂为苯钾酸钠。

本实施例的实施效果

(1)NF0919活性发酵液对水稻纹枯病菌、小麦纹枯病菌和水稻稻曲病菌的室内毒力

NF0919活性发酵液对水稻纹枯病菌、小麦纹枯病菌和水稻稻曲病菌的室内毒力测定方法如下：

取活性发酵液，分别制成含活性发酵液100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125mL/L的PDA平板，并设无菌水为空白对照，对照药剂用5％井冈霉素水剂按上述相同稀释倍数测定。用直径为4mm的打孔器分别在长有水稻纹枯病菌、小麦纹枯病菌和水稻稻曲病菌的平板的边缘的同心圆上打取菌饼，将菌饼接种到含活性发酵液制成的平板培养基中央，每个菌株的每个浓度设4个重复。将平板置于25℃保温培养箱中，培养72h。用十字交叉法测定菌落净生长直径(菌落净生长直径＝菌落直径-菌饼直径)，计算抑制率。抑制率＝(空白对照菌落净生长直径-含活性发酵液的菌落净生长直径)/空白对照菌落净生长直径×100％。用DPS 13.0软件计算毒力回归方程。

NF0919活性发酵液对水稻纹枯病菌、小麦纹枯病菌和水稻稻曲病菌的室内毒力测定结果：

毒力测定结果表明，NF0919菌株活性发酵液对水稻纹枯病菌、小麦纹枯病菌和水稻稻曲病菌菌丝的生长均有强烈抑制作用(表2、3、4)，对三个病原菌的EC₅₀值分别为3.6389mL/L、4.2423mL/L和21.14mL/L。相比之下，相同稀释倍数条件下5％井冈霉素水剂对水稻纹枯病菌、小麦纹枯病菌和水稻稻曲病菌的EC₅₀值分别为85.0434mL/L、163.0561mL/L和82.1647mL/L。NF0919发酵液活性极显著高于5％井冈霉素。

表2 NF0919活性发酵液梯度稀释液对水稻纹枯病菌、小麦纹枯病菌和水稻稻曲病菌的平均抑制率

表3 5％井冈霉素梯度稀释液对水稻纹枯病菌、小麦纹枯病菌和水稻稻曲病菌的平均抑制率

表4 NF0919活性发酵液对水稻纹枯病菌、小麦纹枯病菌和水稻稻曲病菌的毒力测定结果

(2)NF0919活性发酵液对水稻纹枯病的大间防效试验

试验地条件：本试验安排在江苏省句容市镇江农业科学研究所试验田。水稻品种为998-3(高感水稻纹枯病)，生育期160天，2009年6月4播种，6月27日移栽，移栽方式为小苗机插，田间管理照常规。

试验处理方法：于水稻分蘖末期(8月9日)，分别用NF0919活性发酵液和5％井冈霉素水剂稀释500、1000和2000倍(V/V)喷雾防治，亩用水量50kg，小区面积为30m²，空白对照用清水喷雾。试验设4重复。30天后进行病害调查，每小区五点取样，共取样25穴。病害严重度分级标准：0级：不发病；1级：基部叶片、叶鞘发病；2级：倒第三叶以下各叶叶鞘或叶片发病；3级：倒第二叶以下各叶叶鞘或叶片发病；4级：剑叶叶鞘或叶片发病。计数各定点小区病害调查穴的基本苗数(方法为：水稻分蘖结束，即农事操作的烤田结束后计数)。病情指数＝{∑(各级植株数×级值)/(调查总株数×4)}×100；防治效果％＝(对照病情指数增长值)-(各处理防治后病情指数值-各处理基数病情指数值)/对照病情指数增长值。

结果：田间试验结果(表5)表明，NF0919活性稀释液500、1000、2000倍的防治效果分别为96.00％、82.64％和53.34％，均高于5％井冈霉素水剂相同稀释倍数的防效。

表5 NF0919菌株对水稻纹枯病的田间防治试验结果

注：不同大写字母表示P＜0.01。

(3)NF0919活性发酵液对水稻稻曲病的大间防效试验

试验地条件：本试验安排在江苏省句容市镇江农业科学研究所试验田。水稻品种为镇稻10号，生育期165天，2009年6月4播种，6月27日移栽，移栽方式为小苗机插，田间管理照常规。

试验处理方法：于水稻破口前1周(8月30日)，分别用NF0919活性发酵液和5％井冈霉素水剂稀释500、1000和2000倍(V/V)喷雾防治，亩用水量50kg，小区面积为30m²，空白对照用清水喷雾。试验设4重复。水稻黄熟后进行病害调查，每小区25点取样，共取样25穴。病害严重度分级标准为：0级：未发病；1级：1粒曲果；2级：3粒曲果；3级：3～5粒曲果；4级：6～9粒曲果；5级：10粒以上曲果。病情指数＝{∑(各级植株数×级值)/(调查总株数×5)}×100；防治效果％＝(对照病情指数增长值)-(各处理防治后病情指数值-各处理基数病情指数值)/对照病情指数增长值。

结果：田间试验结果(表6)表明，NF0919活性稀释液500、1000、2000倍的防治效果分别为95.53％、81.87％和56.65％，均高于5％井冈霉素水剂相同稀释倍数的防效。

表6 NF0919菌株对水稻稻曲病的田间防治试验结果

注：不同大写字母表示P＜0.01。

(4)NF0919活性发酵液对小麦纹枯病的大间防效试验

试验地条件：本试验安排在江苏省句容市镇江农业科学研究所试验田。小麦品种为镇麦168(感纹枯病)，2009年11月15日播种，田间管理照常规。

试验处理方法：于小麦分蘖末期(3月20日)，分别用NF0919活性发酵液和5％井冈霉素水剂稀释500、1000和2000倍(V/V)喷雾防治，亩用水量50kg，小区面积为30m²，空白对照用清水喷雾。试验设4重复。30天后进行病害调查，五点取样，每小区连根拔取25穴，拔去外围叶鞘调查严重度。病害严重度分级标准：0级：不发病；1级：病斑直径小于茎干直径的1/4；2级：病斑直径在茎干直径的1/4-1/2；3级：病斑直径在茎干直径的1/2-3/4；4级：病斑直径大于茎干直径的3/4；5级：枯白穗。病情指数＝{∑(各级植株数×级值)/(调查总株数×5)}×100；防治效果％＝(对照病情指数增长值)-(各处理防治后病情指数值-各处理基数病情指数值)/对照病情指数增长值。

结果：田间试验结果(表7)表明，NF0919活性稀释液500、1000、2000倍的防治效果分别为96.22％、82.10％和50.21％，均高于5％井冈霉素水剂相同稀释倍数的防效。

表7 NF0919菌株对小麦纹枯病的田间防治试验结果

注：不同大写字母表示P＜0.01。

SEQUENCE LISTING

<110>江苏丘陵地区镇江农业科学研究所

<120>一种黄麻链霉菌NF0919菌株、用途及其活性发酵液的制备方法

<130>no

<140>201010236886.1

<141>2010-07-27

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1396

<212>DNA

<213>Streptomyces corchorusii

<400>1

tcgacagctc cctcccacaa ggggttgggc caccggcttc gggtgttacc aactttcgtg 60

acgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcagcaat gctgatctgc 120

gattactagc aactccgact tcatggggtc gagttgcaga ccccaatccg aactgagacc 180

ggctttttga gattcgctcc acctcacggt atcgcagctc attgtaccgg ccattgtagc 240

acgtgtgcag cccaagacat aaggggcatg atgacttgac gtcgtcccca ccttcctccg 300

agttgacccc ggcggtctcc tgtgagtccc catcaccccg aagggcatgc tggcaacaca 360

ggacaagggt ggcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac 420

agccatgcac cacctgtaca ccgaccacaa gggggaccct gtctccaggg ttttccggtg 480

tatgtcaagc cttggtaagg ttcttcgcgt tgcgtcgaat taagccacat gctccgctgc 540

ttgtgcgggc ccccgtcaat tcctttgagt tttagccttg cggccgtact ccccaggcgg 600

ggaacttaat gcgttagctg cggcaccgac gacgtggaat gtcgccaaca cctagttccc 660

accgtttacg gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt cgctccccac gctttcgctc 720

ctcagcgtca gtaatggccc agagatccgc cttcgccacc ggtgttcctc ctgatatctg 780

cgcatttcac cgctacacca ggaattccga tctcccctac cacactctag ctagcccgta 840

tcgaatgcag acccggggtt aagccccggg ctttcacacc cgacgtgaca agccgcctac 900

gagctcttta cgcccaataa ttccggacaa cgcttgcgcc ctacgtatta ccgcggctgc 960

tggcacgtag ttagccggcg cttcttctgc aggtaccgtc actttcgctt cttccctgct 1020

gaaagaggtt tacaacccga aggccgtcat ccctcacgcg gcgtcgctgc atcaggcttt 1080

cgcccattgt gcaatattcc ccactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc gtgtctcagt 1140

cccagtgtgg ccggtcgccc tctcaggccg gctacccgtc gtcgccttgg tgagccgtta 1200

cctcaccaac aagctgatag gccgcgggct catccttcac cgccggagct ttcaaccctc 1260

acagatgcct gcgagagtgg tatccggtat tagaccccgt ttccagggct tgtcccagag 1320

tgaagggcag attgcccacg tgttactcac ccgttcgcca ctaatcccca ccgaagtggt 1380

tcatcgttcg actgca 1396

Claims

1.一种黄麻链霉菌菌株NF0919(Streptomyces corchorusii)，该菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC No.3968。

2.根据权利要求1所述的黄麻链霉菌菌株NF0919，其特征在于该菌株的16S rRNA基因序列为：

3.权利要求1所述的黄麻链霉菌菌株NF0919在防治水稻稻曲病和防治水稻、小麦纹枯病方面的应用。

4.一种用权利要求1所述的黄麻链霉菌菌株NF0919制备的活性发酵液。

5.一种制备权利要求4所述的活性发酵液的方法，其特征在于包括以下步骤：

(A)菌株的活化与一级种子培养液的培养

将保存的NF0919菌株的斜面在高氏一号培养基上活化，30℃培养10d，挑取1cm²大小的菌块接种于50mL一级种子培养液中，置于170rpm摇床上30℃振荡培养44～48h，其中所述的50mL一级种子培养液的成分为：可溶性淀粉3％，葡萄糖2％，酵母粉1％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，K₂HPO₄ 0.2％，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K₂HPO₄含量的单位比例为W/V；

(B)二级种子培养液的培养

将步骤(A)所得一级种子培养液按5％的接种量接入50mL二级种子培养液中，170rpm、30℃摇床上培养48-52h，其中所述的5％的单位比例为V/V；所述的50mL二级种子培养液的成分：马铃薯淀粉8.5％，棉籽蛋白2.2％，CaCO₃ 0.1％，K₂HPO₄ 0.05％，MgSO₄ 0.05％，淀粉酶0.01％，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO₃、K₂HPO₄、MgSO₄和淀粉酶含量的单位比例为W/V；

(C)发酵培养液的培养

将步骤(B)所得二级种子培养液按5％的接种量接种于装有160L发酵培养液的容积为200L的发酵罐中，其中所述的5％的单位比例为V/V，设置发酵参数为：溶氧100％，消泡剂1.6L，搅拌速度为360rpm，发酵温度为36℃，发酵时间为72h，pH 6.8～7.2，所述的发酵培养液的成分为：马铃薯淀粉8.5％，棉籽蛋白2.6％，K₂HPO₄ 0.05％，NaCl 0.2％，MgSO₄0.05％，CaCO₃ 0.1％，pH7.2-7.4，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、K₂HPO₄、NaCl、MgSO₄和CaCO₃含量的单位比例为W/V；

(D)NF0919活性发酵液的制备

把步骤(C)所得发酵液在10000rpm离心5min得上清液，上清液中添加1％润湿剂和1％防腐剂即得菌株NF0919的活性发酵液，其中润湿剂和防腐剂含量的单位比例均为W/V。

6.根据权利要求5所述的制备活性发酵液的方法，其特征在于步骤(C)中所述的消泡剂为XP-100F系列发酵用有机硅消泡剂。

7.根据权利要求5所述的制备活性发酵液的方法，其特征在于步骤(D)中所述的润湿剂为木质素磺酸钠；所述的防腐剂为苯钾酸钠。