CN102899356A - 黄麻链霉菌nf0919菌株代谢产物在葡萄病害防治上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明为黄麻链霉菌NF0919菌株（其在CGMCC的保藏编号为CGMCCNo.3968，菌种专利号为ZL201010236886.1）发酵液中活性代谢产物的提取方法。代谢产物能有效防治由植物病原真菌围小丛壳菌（Glomerellacingulata）侵染引发的葡萄炭疽病、囊孢壳菌（Physalosporabaccae）侵染引发的葡萄房枯病、链格孢菌（Alternariaviticola）引发的葡萄穗轴褐腐（枯）病、Coniothyriumdlodiella侵染引发的葡萄白腐病、单轴霉属（Plasmoparaviticola）侵染引发的葡萄霜霉病、灰葡萄孢菌（Botrytiscinerea）侵染引发的葡萄灰霉病和痂囊腔菌（Elsinaeampelina)侵染引发的葡萄黑痘病等多种植物病害。

Description

黄麻链霉菌NF0919菌株代谢产物在葡萄病害防治上的应用

发明领域

本发明涉及一种微生物及用途，更具体地说涉及一种黄麻链霉菌（Streptomyces corchorusii）NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取方法，及提取物在葡萄病害防治上的应用，属于生物农药技术领域。 

背景技术

由植物病原真菌围小丛壳菌（Glomerella cingulata）侵染引发的葡萄炭疽病、囊孢壳菌（Physalospora baccae）侵染引发的葡萄房枯病、链格孢菌（Alternaria viticola）引发的葡萄穗轴褐腐（枯）病、Coniothyrium dlodiella侵染引发的葡萄白腐病、单轴霉属（Plasmopara viticola）侵染引发的葡萄霜霉病、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）侵染引发的葡萄灰霉病和痂囊腔菌（Elsinae ampelina) 侵染引发的葡萄黑痘病是我国葡萄上发生的主要病害。 

葡萄病害当前主要通过化学防治来防控，常用的化学药剂有甲基硫菌灵(thiophanate-methyl)、波尔多液（bordeaux mixture）、五氯酚钠（sodium pentachlorophenol）、乙酸铜（cupric acetate）、嘧菌酯（azoxystrobin）、醚菌酯(kresoxim-methyl)、嘧霉胺(pyrimethanil)、苯醚甲环唑(difenoconazole)、烯肟菌酯(enestroburin)、氟吗啉（flumorph）、啶酰菌胺（boscalid）、甲霜灵（metalaxyl）、霜霉威（propamocarb）、多菌灵(carbendazim)、咪鲜胺（prochloraz）、吡唑醚菌酯（pyraclostrobin）和烯酰吗啉（dimethomorph）等。长期以来，由于多频次、多剂量施用化学药剂，造成葡萄病原菌对常用化学药剂都产生了不同程度的抗（耐）药性，生产上屡屡出现防治失败的事例。 

目前成功用于防治葡萄病害的生物农药专用制剂还没有。文献已报道生物防治控制葡萄病害的生防菌属（种）主要有（1）木霉菌属真菌（Trichoderma spp.）中的绿色木霉（Trichoderma viride）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）和长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）；（2）芽孢杆菌属细菌（Bacillus spp.）中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)、多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）；（3）单格孢菌( Ulocladium atrum)；（4）链霉菌属细菌（Streptomycesspp.）中的灰绿链霉菌( Streptomyces griseovirides)、吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）、金色链霉菌（Streptomyces aureochromogenes）和链霉菌（Streptomyces kitasazwaensis）；（5）假单胞菌属细菌（Pseudomonas spp.）中的洋葱假单胞菌( Pseudomonas cepacia)、荧光假单胞细菌（Pseudomonas fluorescens）和恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）；（6）酵母菌中的季也蒙毕赤氏酵母（Pichia guilliermondii）和罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii）等。 

大多数菌株或制剂只能防治一种病害，而利用同一颉颃放线细菌同时兼治葡萄多种病害在现有技术中没有提及和公开。 

发明内容

提供黄麻链霉菌（Streptomyces corchorusii）NF0919菌株发酵液中产物的提取方法，及提取物在防治葡萄炭疽病、葡萄房枯病、葡萄穗轴褐腐病、葡萄灰霉病、葡萄黑痘病和葡萄白腐病上的应用。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

本发明中提供用的黄麻链霉菌NF0919菌株的菌株特征，见专利ZL 201010236886.1。黄麻链霉菌（拉丁文学名为Streptomyces corchorusii）NF0919菌株，已于2010年7月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No. 3968。本发明的黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取方法，包括以下步骤：

（A）菌株的活化与一级种子培养液的培养

将保存的NF0919菌株的斜面在高氏一号培养基上活化，30℃培养10 d，挑取1 cm²大小的菌块接种于50 mL一级种子培养液中（250 mL三角瓶装培养液50 mL），置于170 rpm摇床上30℃振荡培养44～48 h，其中所述的50 mL一级种子培养液的成分为：可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，K₂HPO₄  0.2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl 和K₂HPO₄  含量的单位比例为W/V；

（B）二级种子培养液的培养

将步骤（A）所得一级种子培养液按5%（V/V）的接种量接入50 mL二级种子培养液中（250 mL三角瓶装培养液50 mL），170 rpm、30 ℃摇床上培养48 - 52 h，其中所述的5%的单位比例为V/V；所述的50 mL二级种子培养液的成分（W/V）：马铃薯淀粉8.5%，棉籽蛋白2.2%，CaCO₃ 0.1%，K₂HPO₄ 0.05%，MgSO₄ 0.05%，淀粉酶0.01%，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO₃ 、K₂HPO₄、MgSO₄ 和淀粉酶含量的单位比例为W/V；

（C）发酵培养液的培养

将步骤（B）所得二级种子培养液按5%（V/V）的接种量接种于装有160 L发酵培养液的容积为200 L的发酵罐中，其中所述的5%的单位比例为V/V，设置发酵参数为：溶氧100%，消泡剂1.6 L，搅拌速度为360 rpm, 发酵温度为36 ℃，发酵时间为72 h，pH 6.8～7.2，所述 的发酵培养液的成分为（W/V）：马铃薯淀粉8.5%，棉籽蛋白2.6%，K₂HPO₄ 0.05%，NaCl 0.2%，MgSO₄ 0.05%，CaCO₃ 0.1%，pH7.2-7.4，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、K₂HPO₄ 、NaCl 、MgSO₄ 和CaCO₃ 含量的单位比例为W/V；所述的消泡剂为XP-100F系列发酵用有机硅消泡剂；

（D）NF0919菌株发酵液中代谢产物分离方法

把步骤（C）所得发酵液在10000 rpm离心5 min得上清液，用浓盐酸调节pH至2.0，出现沉淀，再次离心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35℃真空干燥得提取物。 

本发明的有益效果是： 

本发明提供黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取方法，并证明其提取物可同时防治葡萄的果实、叶柄和叶片上的多种病害。大田防治结果表明，该菌株代谢产物对葡萄炭疽病、葡萄房枯病、葡萄穗轴褐腐、葡萄灰霉病、葡萄黑痘病和白腐病等葡萄病害均有很好的防治效果。

具体实施方式

实施例

本发明中提供用的黄麻链霉菌NF0919菌株的菌株特征，见专利ZL201010236886.1。本发明黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中产物的提取方法，包括以下步骤： 

（A）菌株的活化与一级种子培养液的培养

将保存的NF0919菌株的斜面在高氏一号培养基上活化，30℃培养10 d，挑取1 cm²大小的菌块接种于50 mL一级种子培养液中（250 mL三角瓶装培养液50 mL），置于170 rpm摇床上30℃振荡培养44～48 h，其中所述的50 mL一级种子培养液的成分为：可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，K₂HPO₄  0.2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl 和K₂HPO₄  含量的单位比例为W/V。

（B）二级种子培养液的培养 

将步骤（A）所得一级种子培养液按5%（V/V）的接种量接入50 mL二级种子培养液中（250 mL三角瓶装培养液50 mL），170 rpm、30 ℃摇床上培养48 - 52 h，其中所述的5%的单位比例为V/V；所述的50 mL二级种子培养液的成分（W/V）：马铃薯淀粉8.5%，棉籽蛋白2.2%，CaCO₃ 0.1%，K₂HPO₄ 0.05%，MgSO₄ 0.05%，淀粉酶0.01%，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO₃ 、K₂HPO₄、MgSO₄ 和淀粉酶含量的单位比例为W/V。

（C）发酵培养液的培养 

将步骤（B）所得二级种子培养液按5%（V/V）的接种量接种于装有160 L发酵培养液的容积为200 L的发酵罐中，其中所述的5%的单位比例为V/V，设置发酵参数为：溶氧100%，消泡剂1.6 L，搅拌速度为360 rpm, 发酵温度为36 ℃，发酵时间为72 h，pH 6.8～7.2，所述的发酵培养液的成分为（W/V）：马铃薯淀粉8.5%，棉籽蛋白2.6%，K₂HPO₄ 0.05%，NaCl 0.2%，MgSO₄ 0.05%，CaCO₃ 0.1%，pH7.2-7.4，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、K₂HPO₄ 、NaCl 、MgSO₄ 和CaCO₃ 含量的单位比例为W/V；所述的消泡剂为XP-100F系列发酵用有机硅消泡剂。

（D）NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取方法 

把步骤（C）所得发酵液在10000 rpm离心5 min得上清液，用浓盐酸调节pH至2.0，出现沉淀，再次离心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35℃真空干燥得提取物。

本实施例的实施效果：

（1）NF0919菌株发酵液的提取物，对葡萄炭疽病菌、葡萄房枯病菌、葡萄穗轴褐腐病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄黑痘病菌和葡萄白腐病菌的室内毒力测定

NF0919菌株发酵液的提取物对葡萄炭疽病菌、葡萄房枯病菌、葡萄穗轴褐腐病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄黑痘病菌和葡萄白腐病菌的室内毒力测定方法如下：

取适量提取物，用无菌水梯度稀释，制成含提取物浓度分别10、5、2.5、1.25、0.625、0 mg/L的PDA平板，并设无菌水为空白对照，对照药剂用化学药剂为98%多菌灵（carbendazim）按上述相同稀释浓度制成含药PDA平板。用直径为4 mm的打孔器分别在长有葡萄炭疽病菌、葡萄房枯病菌、葡萄穗轴褐腐病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄黑痘病菌和葡萄白腐病菌的PDA平板的边缘打取菌饼，将菌饼接种到上述含药（提取物和多菌灵）平板中央，每个病原菌的每个浓度设4个重复。将平板置于25℃保温培养箱中，培养72 h。用十字交叉法测定菌落净生长直径(菌落净生长直径=菌落直径 － 菌饼直径) ，计算抑制率。抑制率=（空白对照菌落净生长直径 － 含药的菌落净生长直径）/空白对照菌落净生长直径×100%。用DPS 13.0软件计算毒力回归方程。

NF0919发酵液的提取物对葡萄炭疽病菌、葡萄房枯病菌、葡萄穗轴褐腐病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄黑痘病菌和葡萄白腐病菌的室内毒力测定结果： 

毒力测定结果表明，NF0919菌株发酵液的提取物对葡萄炭疽病菌、葡萄房枯病菌、葡萄穗轴褐腐病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄黑痘病菌和葡萄白腐病菌菌丝的生长均有强烈抑制作用(表1)，对6个病原菌的EC₅₀值（表3）分别为0.5514 mg/L、0.7529 mg/L、1.4329 mg/L、1.1984 mg/L、1.9479 mg/L和0.2876 mg/L。相比之下，相同稀释倍数条件下98%多菌灵对葡萄炭疽病菌、葡萄房枯病菌、葡萄穗轴褐腐病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄黑痘病菌和葡萄白腐病菌的菌丝生长抑制率（表2）较低，其EC₅₀值（表3）分别为1.6830 mg/L、3.1266 mg/L、5.2827 mg/L、1.5762 mg/L、7.1469 mg/L和0.6975 mg/L。NF0919发酵液活性的提取物对葡萄病原菌的室内毒力极显著高于化学药剂多菌灵。

表1. NF0919菌株发酵液的提取物对葡萄病原菌的平均抑制率 

浓度（mg/L）	10	5	2.5	1.25	0.625	0
							对葡萄炭疽病菌的平均抑制率（%）	100	91.78	81.14	68.45	54.24	0
对葡萄房枯病菌的平均抑制率（%）	98.12	84.67	73.15	60.75	46.27	0
							对葡萄穗轴褐腐病菌的平均抑制率（%）	88.47	74.58	61.71	49.78	30.45	0
对葡萄灰霉病菌的平均抑制率（%）	91.20	85.21	56.69	48.12	40.32	0
							对葡萄黑痘病菌的平均抑制率（%）	88.47	69.17	53.51	39.45	24.24	0
葡萄白腐病菌的平均抑制率（%）	100	100	92.14	81.56	69.94	0

表2. 98%多菌灵对葡萄病原菌的平均抑制率

浓度（mg/L）	10	5	2.5	1.25	0.625	0
							对葡萄炭疽病菌的平均抑制率（%）	86.21	74.52	59.47	41.25	28.46	0
对葡萄房枯病菌的平均抑制率（%）	71.24	60.76	47.25	31.45	19.42	0
							对葡萄穗轴褐腐病菌的平均抑制率（%）	60.74	49.88	37.56	24.25	16.78	0
对葡萄灰霉病菌的平均抑制率（%）	84.35	71.24	60.15	49.38	28.46	0
							对葡萄黑痘病菌的平均抑制率（%）	57.60	41.54	29.16	18.83	10.14	0
对葡萄白腐病菌的平均抑制率（%）	100	89.95	76.48	60.72	50.42	0

表3. NF0919菌株发酵液的提取物对葡萄病原菌的毒力测定结果

 （2）NF0919菌株发酵液的提取物对葡萄病害的田间防效试验

试验处理方法：在江苏省万山红遍农业科技示范园（江苏省句容市后白镇）, 试验园葡萄连片种植, 葡萄品种为巨丰, 试验园面积约14.4亩。采用水平棚架式栽植, 树龄6年生。马肝土, 肥力中等, 有机质含量1%左右, 果园管理照常规。试验时间为2011年 6～9 月 。NF0919菌株发酵液提取物3000倍液，对照药剂为50%多菌灵可湿性粉剂(江苏省绿盾植保农药实验有限公司生产) 800倍液，空白对照为不防治, 小区面积800 m², 随机区组排列，4次重复，用水量为每棵葡萄树3 kg。试验于6月20日第1次喷药, 以后每隔10天（遇到下雨天时调整喷药日期）共防治5次，最后1次防治日期为8月13日。采用背负式静电喷雾器均匀喷雾。于最后1次施药后14天( 8月27日) 调查防效。调查时在每个小区中间随机选4株葡萄，在上、中、下、左、右5个方位分别取1个果穗，共20个果穗, 记载每个果穗轴、果粒和果柄中各种病害的发病率, 计算出病指和防治效果。

试验结果：第5次喷药后14天, NF0919菌株发酵液提取物3000倍液对葡萄炭疽病，葡萄房枯病，葡萄穗轴褐腐，葡萄灰霉病，葡萄黑痘病和白腐病的防治效果分别为90.81%、91.30%、88.34%、95.97%、92.72%和94.97%（表4），而对照药剂50%多菌灵可湿性粉剂800倍液对葡萄炭疽病，葡萄房枯病，葡萄穗轴褐腐，葡萄灰霉病，葡萄黑痘病和白腐病的防治效果分别为74.90%、65.80%、62.95%、79.85%、81.37%和68.55%（表4）。 

以上结果表明，NF0919菌株发酵液中代谢产物提取物的田间防治效果显著高于对照药剂，NF0919菌株发酵液提取物对葡萄多种病害的兼治作用显著。试验中所有处理均未发生药害现象，表明NF0919菌株发酵液中代谢产物施用安全。 

表4  NF0919菌株发酵液的提取物对葡萄病害的田间防治试验结果 

  注：不同大写字母表示 P < 0.01。

Claims (3)

1.黄麻链霉菌（Streptomyces corchorusii）NF0919菌株（该菌种特性见专利ZL 201010236886.1）发酵液中代谢产物的提取方法。

2.根据权利要求1所述的黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取物，在防治葡萄炭疽病、葡萄房枯病、葡萄穗轴褐腐病、葡萄灰霉病、葡萄黑痘病和葡萄白腐病上的应用。

3.权利要求1所述的黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取方法，其特征在于包括以下步骤：

（A）菌株的活化与一级种子培养液的培养

将保存的NF0919菌株的斜面在高氏一号培养基上活化，30℃培养10 d，挑取1 cm²大小的菌块接种于50 mL一级种子培养液中，置于170 rpm摇床上30℃振荡培养44～48 h，其中所述的50 mL一级种子培养液的成分为：可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，K₂HPO₄  0.2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl 和K₂HPO₄  含量的单位比例为W/V；

（B）二级种子培养液的培养

将步骤（A）所得一级种子培养液按5%的接种量接入50 mL二级种子培养液中，170 rpm、30 ℃摇床上培养48 - 52 h，其中所述的5%的单位比例为V/V；所述的50 mL二级种子培养液的成分：马铃薯淀粉8.5%，棉籽蛋白2.2%，CaCO₃ 0.1%，K₂HPO₄ 0.05%，MgSO₄ 0.05%，淀粉酶0.01%，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO₃ 、K₂HPO₄、MgSO₄ 和淀粉酶含量的单位比例为W/V；

（C）发酵培养液的培养

将步骤（B）所得二级种子培养液按5%的接种量接种于装有160 L发酵培养液的容积为200 L的发酵罐中，其中所述的5%的单位比例为V/V，设置发酵参数为：溶氧100%，消泡剂（XP-100F系列发酵用有机硅消泡剂）1.6 L，搅拌速度为360 rpm, 发酵温度为36 ℃，发酵时间为72 h，pH 6.8～7.2，所述的发酵培养液的成分为：马铃薯淀粉8.5%，棉籽蛋白2.6%，K₂HPO₄ 0.05%，NaCl 0.2%，MgSO₄ 0.05%，CaCO₃ 0.1%，pH7.2-7.4，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、K₂HPO₄ 、NaCl 、MgSO₄ 和CaCO₃ 含量的单位比例为W/V；

（D）NF0919菌株发酵液中代谢产物提取方法

把步骤（C）所得发酵液在10000 rpm离心5 min得上清液，用浓盐酸调节pH至2.0，出现沉淀，再次离心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35℃真空干燥得提取物。