CN102876603B

CN102876603B - 一种解淀粉芽孢杆菌Mg116菌株及用途

Info

Publication number: CN102876603B
Application number: CN2012103546282A
Authority: CN
Inventors: 庄义庆; 杨敬辉; 吴琴燕; 陈宏州
Original assignee: Zhenjiang Institute of Agricultural Sciences Jiangsu Hilly Area
Current assignee: JIANGXI NEW DRAGON BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2012-09-23
Filing date: 2012-09-23
Publication date: 2013-11-13
Anticipated expiration: 2032-09-23
Also published as: CN102876603A

Abstract

本发明为一种解淀粉芽孢杆菌Mg116菌株（其在CGMCC的保藏编号为CGMCCNo.3967）及发酵液制备成悬浮剂的方法。该制剂能有效防治由植物病原真菌围小丛壳菌（Glomerella cingulata）侵染引发的葡萄炭疽病、西瓜炭疽病和草莓炭疽病等多种植物病害。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌Mg116菌株及用途

发明领域

本发明涉及一种微生物及用途，更具体地说涉及一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Mg116菌株、用途及其制剂的制备方法，属于生物农药技术领域。

背景技术

由植物病原真菌围小丛壳菌（Glomerella cingulata）侵染引发的炭疽病是草莓、葡萄和西瓜等经济作物上的主要病害，对炭疽病防治效果的高低，将直接影响到作物产量和种植户的收益。炭疽病的防治当前主要通过化学防治来防控。主要用以下化学药剂防治：嘧菌酯（azoxystrobin）、醚菌酯(kresoxim-methyl)、苯醚甲环唑(difenoconazole)、烯肟菌酯(enestroburin)、啶酰菌胺（boscalid）、多菌灵(carbendazim)、吡唑醚菌酯（pyraclostrobin）和咪鲜胺（prochloraz）等。长期以来，由于多频次、多剂量施用化学药剂，造成炭疽病菌对常用化学药剂都产生了不同程度的抗（耐）药性，生产上屡屡出现防治失败的事例。

目前成功用于防治炭疽病菌的生物农药专用制剂还没有。文献已报道生物防治控制病害的生防菌属（种）主要有（1）木霉菌属真菌（Trichoderma spp.）中的绿色木霉（Trichoderma viride）和哈茨木霉（Trichoderma harzianum）；（2）芽孢杆菌属细菌（Bacillus spp.）中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）和巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）；（3）假单胞菌属细菌（Pseudomonas spp.）中的荧光假单胞细菌（Pseudomonas fluorescens）等。

虽然炭疽病菌的寄主范围很广，但重要的寄主作物是园艺作物，如草莓、葡萄和西瓜等。该类作物大都是应时鲜果类，且大多为即采即食，所以对药剂的选择有很大的局限性。因此对炭疽病的生物防治在生产上具有一定迫切需求。本发明提供的可有效防治炭疽病的颉颃细菌，在现有技术中没有提及和公开。

发明内容

本发明解决现有技术存在的不足，提供一株新分离的芽孢杆菌：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Mg116菌株，该菌株可用于防治由围小丛壳菌（Glomerella cingulata）侵染引发的炭疽病。同时本发明还提供用该解淀粉芽孢杆菌Mg116菌株加工成悬浮剂的制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的解淀粉芽孢杆菌（拉丁文学名为Bacillus amyloliquefaciens）Mg116菌株，已于2010年7月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为：CGMCC No. 3967。本发明的菌种具有如下特征：

（1）Mg116菌株的细胞形态及生理生化特征（见表1）

表1、Mg116菌株细胞形态及理化特征

（2）本发明的解淀粉芽孢杆菌Mg116菌株的16S rRNA基因序列为：

CTCCATAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTCTGAACCATGCGGTTCAGACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGA。

用本发明的防治炭疽病的菌株Mg116制备的生防菌剂，其制备方法包括以下步骤：

（A）菌液的获得

用无菌芽签挑取事先在PDA固体培养基上划线培养好的Mg116菌株单菌落斑，接种于装有5 mL PDA液体培养液的容积为20 mL的三角瓶中，于30 ℃、200 rpm条件下振荡培养16 h，过夜，将上步所得培养液5 mL全部接种于装有400 mL PDA培养液的容积为1000 mL的三角瓶中，200 rpm、30℃条件下振荡培养16 h；把所得的400mL培养液接种于装有20 L培养液的容积为30L的发酵罐（镇江东方GUS-30），20L发酵培养液中固容物含量为：豆粕100 g、马铃薯淀粉200 g、蔗糖25 g、酵母粉25 g、CaCO₃20 g、MnSO₄ 1.0 g，设置发酵条件为：溶氧100%，搅拌速度为350 rpm，发酵温度30 ℃，发酵时间36h，pH 7.0-7.2；

（B）菌剂加工工艺

将发酵好的发酵液按如下方法加工成悬浮剂：

（1）将发酵液离心（8000 rpm）后用20%丙三醇溶液（V/V）（溶液用无菌水配制）重新悬浮，测定悬浮液的活芽孢含量，根据测定结果用20%丙三醇溶液（V/V）调节悬浮液的活芽孢数，终含量调节成芽孢含量为1.0×10¹⁰ cfu/mL（即每毫升含100亿个活芽孢）；（2）在上述调节好的悬浮液中按5 g/L（W/V）的用量加入黄原胶，并搅拌均匀，得成品悬浮剂的浓度为100亿活芽孢/mL。

本发明的有益效果是：

（1）本发明提供一株新的生防芽孢杆菌——解淀粉芽孢杆菌MG116菌株，由该菌株发酵而制得的悬浮剂，可用于防治由围小丛壳菌（Glomerella cingulata）侵染引发的作物炭疽病。大田示范防治结果表明，该菌剂对草莓炭疽病、葡萄炭疽病和西瓜炭疽病病等植物病害均有很好的防治效果；

（2）菌剂贮藏性质稳定，防治效果好，大规模生产的发酵工艺简单、生产成本低廉。

具体实施方式

实施例

本发明的解淀粉芽孢杆菌（拉丁文学名为Bacillus amyloliquefaciens）菌株Mg116，已于2010年7月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC No. 3967。本发明的菌株的细胞形态及生理生化特征见表1。

本实施例的解淀粉芽孢杆菌Mg116菌株的16S rRNA基因序列为：

用本发明的防治炭疽病的Mg116菌株制备的生防菌剂，其制备方法包括以下步骤：

（A）菌液的获得

用无菌芽签挑取事先在PDA固体培养基上划线培养好的Mg116菌株单菌落斑，接种于装有5 mL PDA液体培养液的容积为20 mL的三角瓶中，于30 ℃、200 rpm条件下振荡培养16 h，过夜，将上步所得培养液5 mL全部接种于装有400 mL PDA培养液的容积为1000 mL的三角瓶中，200 rpm、30℃条件下振荡培养16 h；把所得的400mL培养液接种于装有20 L培养液的容积为30L的发酵罐（镇江东方GUS-30），20L发酵培养液中固容物含量为：豆粕100 g、马铃薯淀粉200 g、蔗糖25 g、酵母粉25 g、CaCO₃ 20 g、MnSO₄ 1.0 g，设置发酵条件为：溶氧100%，搅拌速度为350 rpm，发酵温度30 ℃，发酵时间36 h，pH 7.0-7.2；

（B）菌剂加工工艺

将发酵好的发酵液按如下方法加工成悬浮剂：

实施效果

（1）Mg116菌株发酵液加工而得的悬浮剂对围小丛壳菌（Glomerellacingulata）的室内毒力

Mg116菌株发酵液加工而得的悬浮剂对围小丛壳菌的室内毒力测定方法如下：

用Mg116菌株悬浮剂（100亿活芽孢/mL）配制成含10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴ cfu/mL的PDA平板，并设无菌水为空白对照；对照药剂用枯草芽孢杆菌（100亿活芽孢/mL）可湿性粉剂按上述相同浓度测定。用直径为4 mm的打孔器，在事先长好的围小丛壳菌平板的边缘的同心圆上打取菌饼，将菌饼接种到含上述含菌平板的中央，每个菌株的每个浓度设4个重复。将平板置于25℃保温培养箱中，培养96 h。用十字交叉法测定菌落净生长直径(菌落净生长直径=菌落直径 - 菌饼直径)，计算抑制率。抑制率=（空白对照菌落净生长直径 - 含药菌落净生长直径）/空白对照菌落净生长直径×100%。用DPS 13.0软件计算毒力回归方程。

Mg116悬浮剂对围小丛壳菌的室内毒力测定结果：

毒力测定结果表明，Mg116悬浮剂对围小丛壳菌菌丝的生长均有强烈抑制作用(表2、3、4)，其EC₅₀值为7.6048×10³cfu/mL。相比之下，相同稀释倍数条件下枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对围小丛壳菌的EC₅₀值分别为1.8651×10⁶ cfu/mL。Mg116悬浮剂的抑菌毒力极显著高于枯草芽孢杆菌可湿性粉剂。

表2. Mg116悬浮剂对围小丛壳菌的平均抑制率

稀释梯度（cfu/mL）	10⁸	10⁷	10⁶	10⁵	10⁴
						平均抑制率（%）	100	89.55	75.47	66.12	53.85

表3. 枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对围小丛壳菌的平均抑制率

稀释梯度（cfu/mL）	10⁸	10⁷	10⁶	10⁵	10⁴
						平均抑制率（%）	70.75	56.45	42.71	30.54	19.55

表4. Mg116悬浮剂对围小丛壳菌的毒力测定结果

（2）Mg116悬浮剂对草莓炭疽病的田间防治试验

试验处理方法：本试验安排在江苏省句容市后白镇农厂的草莓育苗田进行，草莓品种为红颊（高感炭疽病）。2011年6月10日第一次喷雾防治，间隔10天喷一次，共连续防治8次，9月1日调查防治效果。试验药剂处理：（1）解淀粉芽孢杆菌Mg116悬浮剂（100亿活芽孢/mL）1000倍液；（2）对照药剂用枯草芽孢杆菌可湿性粉剂（100亿活芽孢/mL）1000倍液；（3）空白对照用清水喷雾。亩用水量50 kg，小区面积为10 m²。试验设4重复。

结果：田间试验结果（表5）表明，Mg116悬浮剂1000倍液的防治效果为95.60%，相比之下枯草芽孢杆菌可湿性粉剂1000倍液的防治效果只为81.33%，两药剂间达到统计水平差异。

表5 Mg116悬浮剂对草莓炭疽病的田间防治试验结果

注：不同大写字母表示 P < 0.01。

（3）Mg116悬浮剂对葡萄炭疽病的田间防治试验

试验处理方法：在江苏省万山红遍农业科技示范园（江苏省句容市后白镇）, 试验园葡萄连片种植, 葡萄品种为巨丰。采用水平棚架式栽植, 行株距2 m×4 m, 树龄6年生。马肝土, 肥力中等, 有机质含量1%左右, 果园管理照常规。试验期间( 2011年6～9 月) 。试验药剂处理为：（1）Mg116悬浮剂1000倍液；（2）对照药剂为枯草芽孢杆菌可湿性粉剂1000倍液；（3）空白对照为不防治。小区面积800 m², 随机区组排列，4次重复。试验于6月20日第1次喷药, 以后每隔10天（遇到下雨天时调整喷药日期）共防治5次，最后1次防治日期为8月13日。采用背负式静电喷雾器均匀喷雾，每667m²用药液量100 kg。于最后1次施药后14天( 8月27日) 调查防效。调查时在每个小区中间随机选4株葡萄，在上、中、下、左、右5个方位分别取1个果穗，共20个果穗, 记载每个果穗轴、果粒和果柄中各种病害的发病率, 计算出病指和防治效果。

结果：田间试验结果（表6）表明，Mg116悬浮剂1000倍液的防治效果为90.72%，相比之下枯草芽孢杆菌可湿性粉剂1000倍液的防治效果只为48.44%，两药剂间达到统计水平差异。

表6 Mg116悬浮剂对葡萄炭疽病的田间防治试验结果

注：不同大写字母表示 P < 0.01。

（4）Mg116悬浮剂对西瓜炭疽病的田间防治试验

试验处理方法：本试验安排在江苏省句容市后白镇农厂的大棚西瓜田进行，西瓜品种为洞庭3号。2011年5月20日第一次喷雾防治，间隔10天喷一次，共连续防治4次，6月30日调查防治效果。试验药处理：（1）解淀粉芽孢杆菌Mg116悬浮剂（100亿活芽孢/mL）1000倍液；（2）对照药剂用枯草芽孢杆菌可湿性粉剂（100亿活芽孢/mL）1000倍液；（3）空白对照用清水喷雾。亩用水量50 kg，小区面积为50 m²。试验设4重复。

结果：田间试验结果（表7）表明，Mg116悬浮剂1000倍液的防治效果为93.5%，相比之下枯草芽孢杆菌可湿性粉剂1000倍液的防治效果只为44.46%，两药剂间达到统计水平差异；

表7 Mg116悬浮剂对葡萄炭疽病的田间防治试验结果

注：不同大写字母表示P < 0.01。

Claims

1.一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Mg116菌株，该菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC No. 3967。

2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌Mg116菌株，其特征在于该菌株的16S rRNA基因序列为：

3.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌Mg116菌株在防治草莓炭疽病、葡萄炭疽病和西瓜炭疽病方面的应用。

4. 一种用权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌Mg116菌株发酵获得的发酵液制备而成的悬浮剂。

5. 一种制备权利要求4所述的悬浮剂的方法，其特征在于包括以下步骤：

（A）菌液的获得

用无菌牙签挑取事先在PDA固体培养基上划线培养好的Mg116菌株单菌落斑，接种于装有5 mL PDA液体培养液的容积为20 mL的三角瓶中，于30 ℃、200 rpm条件下振荡培养16 h，将上步所得培养液5 mL全部接种于装有400 mL PDA培养液的容积为1000 mL的三角瓶中，在200 rpm、30℃条件下振荡培养16 h；再把所得的400 mL培养液接种于装有20 L培养液的容积为30L的发酵罐中，20 L发酵培养液中固容物含量为：豆粕100 g、马铃薯淀粉200 g、蔗糖25 g、酵母粉25 g、碳酸钙20 g、MnSO₄ 1.0 g，设置发酵条件为：溶氧100%，搅拌速度为350 rpm，发酵温度30 ℃，发酵时间36 h，pH 7.0-7.2；

（B）菌剂加工工艺

将发酵好的发酵液按如下方法加工成悬浮剂：

（1）将发酵液在8000 rpm条件下离心10 min后去除上清，余物用无菌水配制的内含20%丙三醇的溶液重新悬浮，测定悬浮液的活芽孢含量，根据测定结果用20%丙三醇溶液调节悬浮液的活芽孢数，终含量调节成芽孢含量为1.0×10¹⁰ cfu/mL，上述丙三醇的单位比例为V/V；（2）在上述调节好的悬浮液中按5 g/L的用量加入黄原胶，并搅拌均匀，得成品悬浮剂的浓度为1.0×10¹⁰ cfu/mL，其中黄原胶含量的单位比例为W/V。