CN103289934A - 一种产植酸酶解淀粉芽孢杆菌益生菌、制剂及制备方法 - Google Patents
一种产植酸酶解淀粉芽孢杆菌益生菌、制剂及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种产植酸酶解淀粉芽孢杆菌益生菌、制剂及其制备方法，解淀粉芽孢杆菌T6，16S rRNA基因序列基因GenBank登录号JX081245，该方法利用浅盘发酵培养法和液体深层发酵培养法进行菌株培养，步骤为：甘油保存菌种、菌种活化、摇瓶菌种、菌株培养、加入载体干燥、检验和包装出厂。本发明采用能够耐热、耐干燥和耐酸碱，贮藏期长并能够产生植酸酶的解淀粉芽孢杆菌菌株制备新的益生菌制剂，制剂质量稳定，提供一种可保持畜禽肠道微生态平衡、使动物生长发育处理理想状态，达到动物的最大生产力，提高动物对饲料的消化率，提高动物对疾病的抵抗能力，促进动物健康，降低日粮中的钙磷添加量和减少畜禽粪便钙磷的排除量，保护生态环境，达到节能减排的目的。
Description
技术领域
本发明属于益生菌制剂制备领域，尤其涉及一种产植酸酶解淀粉芽孢杆菌益生菌、制剂及其制备方法。
背景技术
益生菌制剂是指摄入动物体内可以促进动物胃肠道微生态平衡或增强非特异性免疫功能来预防疾病，间接起到促进动物生长作用和提高饲料转化率的活性微生物培养物。
研究表明，乳酸菌、芽孢杆菌为主的益生菌制剂可以替代饲料中添加的抗生素添加剂。饲喂含益生菌制剂的饲料可以大大减少抗生素的使用量，避免抗生素在动物体内的残留问题，提高肉、蛋、奶等畜禽产品的质量，对我国养殖业和肉类出口有重大意义。
从动物生产和饲料工业角度来评价，芽孢杆菌类有益微生物比其他微生物具更多优点，具有抗逆性好、稳定性强、生长速度快、产多种酶类、能有效抑制病原菌生长等特点，是理想的动物微生态制剂生产菌种。芽孢杆菌在制剂中以内生孢子形式存在，孢子进入动物肠道后，在肠道上部能迅速复活。但是目前具有较好抗菌活性、产酶量丰富、酶活高以及抗逆性强等益生特性的芽孢杆菌菌株较少。
植酸酶是一类能催化植酸及植酸盐水解产生无机磷或磷酸盐的酶的总称，在饲料中加入适量的植酸酶，可提高磷酸盐的利用率，减少饲料中额外磷的添加量，同时缓解植酸的抗营养作用并提高各项营养成分的利用率，并且具有节磷减排的生态效应。畜禽对于主要豆粕日粮饲料中的磷消化率很低，食入的磷有75%都随粪便排出体外。植物性饲料有三分之二的磷是以植酸磷形式存在，植酸作为一种广谱性的抗营养因子，不能够被禽类直接利用的，同时还影响矿物元素、蛋白质、氨基酸的利用率。
因此，提高植酸磷的利用率，一方面能够满足畜禽对饲料磷的需要，另一方面又可减少大量未被利用的磷排放出去对环境水体造成了富营养污染，减轻环境负担。目前植酸酶是迄今为止最为有效的提高饲料中植酸利用率的措施之一。
产植酸酶芽孢杆菌是一类需氧、产生抗逆性内生孢子的革兰氏阳性杆状细菌或球状细菌，隶属于芽孢杆菌科芽孢杆菌属，它们对高温、高热、紫外光、电磁辐射和某些化学药品均有很强的抗逆性，而且生长快捷。产植酸酶芽孢杆菌能够分泌植酸酶，同时菌体本身作为益生菌，产生具有拮抗肠道致病菌的多类物质,同时通过生物夺氧消耗肠道内的氧气造成厌氧环境,从而有利于维持肠道生态平衡，是理想的动物益生菌制剂生产菌种之一。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种产植酸酶解淀粉芽孢杆菌益生菌、制剂及其制备方法，旨在解决乳酸菌益生菌制剂对干燥、高温、酸碱、贮藏等不良环境因子的抗性差，能活着进入肠道的乳酸菌种类和数量不多，同时其他芽孢杆菌制剂不产植酸酶的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种产植酸酶解淀粉芽孢杆菌益生菌，该产植酸酶解淀粉芽孢杆菌益生菌为解淀粉芽孢杆菌T6，16S rRNA基因序列基因GenBank登录号JX081245。
本发明实施例的目的还在于提供一种产植酸酶解淀粉芽孢杆菌益生菌制剂。
本发明实施例的目的还在于提供一种产植酸酶解淀粉芽孢杆菌益生菌制剂的制备方法，该方法利用浅盘发酵培养法和液体深层发酵培养法进行菌株培养，步骤为：甘油保存菌种、菌种活化、摇瓶菌种、菌株培养、加入载体干燥、检验和包装出厂。
进一步，浅盘发酵培养法的具体步骤为：
（1）对菌种进行在营养肉汤中活化和摇瓶培养，制成种子液；
（2）对种子液在营养琼脂培养基内扩大培养制成菌苔，形成芽孢体，获取菌苔；
（3）加入膨润土后干燥、碾磨制成原菌粉，在原菌粉加入膨润土新型稀释，制成产植酸酶芽孢杆菌益生菌制剂。
进一步，液体深层发酵培养法的具体步骤为：
步骤一、对菌种进行在营养肉汤中活化，制备摇瓶种子液；
步骤二、接种到种子发酵罐扩大培养，然后接种到发酵罐中发酵培养基发酵，形成芽孢体；
步骤三、用离心、沉淀等方法收集芽孢体，添加膨润土作为载体，进行气流干燥制成原菌粉；
步骤四、在原菌粉加入膨润土稀释，制成产植酸酶芽孢杆菌益生菌制剂。
进一步，浅层培养方法，（1）菌种的活化培养和摇瓶菌种培养条件为：温度32℃～37℃，pH7.0～7.5，摇床转速120r/min～180r/min，培养时间18h～20h；（2）浅盘培养条件：营养琼脂培养基pH7.0～7.5，培养温度32℃～37℃，培养时间32h～48h。
进一步，液体深层发酵培养法，（1）活化培养和摇瓶菌种培养条件：温度32℃～37℃，pH7.0～7.5，摇床转速120r/min～180r/min，培养时间18h～20h；（2）种子罐种子扩大培养条件：培养基pH7.0～7.5，温度32℃～37℃，空气流量0.6～0.8VVM，转速250r/min～350r/min，培养时间18h～20h；（3）液体深层发酵培养条件：培养基pH7.0～7.5，温度32℃～37℃，空气流量0.3～0.45VVM，转速150r/min～300r/min，培养时间36h～42h。
进一步，发酵培养基的组成：黄豆粉0.5%～4%，葡萄糖0.1%～2%，玉米粉0.1%～0.5%，硫酸铵0.01%～0.1%，七水硫酸镁0.01%～0.04%，七水硫酸锰0.01%～0.04%，氯化钙0.005%～0.02%，调PH值7.0～8.5。
本发明提供的产植酸酶解淀粉芽孢杆菌益生菌制剂可以产生植酸酶，可保持动物肠道内微生态平衡，促进动物生长，降低料重比，提高饲料转化率，提高对钙磷的吸收率和减少钙磷排放量，提高肉鸡屠宰性能，提高免疫抗病能力，减少发病率和死亡率。
本发明采用能够耐热、耐干燥和耐酸碱，贮藏期长并能够产生植酸酶的解淀粉芽孢杆菌菌株制备新的益生菌制剂，制剂质量稳定，提供一种可保持畜禽肠道微生态平衡、使动物生长发育处理理想状态，达到动物的最大生产力，提高动物对饲料的消化率，提高动物对疾病的抵抗能力，促进动物健康，降低日粮中的钙磷添加量和减少畜禽粪便钙磷的排除量，保护生态环境，达到节能减排的目的。
附图说明
图1是本发明实施例提供的产植酸酶解淀粉芽孢杆菌益生菌制剂的制备方法流程图；
图2是本发明实施例提供的菌株T6在含植酸钙琼脂平板的生长情况示意图；
图3是本发明实施例提供的菌株T6在发酵培养基中生长曲线示意图；
图4是本发明实施例提供的42日龄肉鸡肠道菌群的影响示意图；
图5是本发明实施例提供的肉鸡粪磷含量示意图；
图6是本发明实施例提供的肉鸡粪钙含量示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
图1示出了本发明提供的产植酸酶解淀粉芽孢杆菌益生菌制剂的制备方法的流程。为了便于说明，仅仅示出了与本发明相关的部分。
本发明实施例是这样实现的，一种产植酸酶解淀粉芽孢杆菌益生菌，该产植酸酶解淀粉芽孢杆菌益生菌为解淀粉芽孢杆菌T6，16S rRNA基因序列基因GenBank登录号JX081245。
本发明实施例的目的还在于提供一种产植酸酶解淀粉芽孢杆菌益生菌制剂。
如图1所示，本发明实施例的目的还在于提供一种产植酸酶解淀粉芽孢杆菌益生菌制剂的制备方法，该方法利用浅盘发酵培养法和液体深层发酵培养法进行菌株培养，步骤为：甘油保存菌种、菌种活化、摇瓶菌种、菌株培养、加入载体干燥、检验和包装出厂。
作为本发明实施例的一优化方案，浅盘发酵培养法的具体步骤为：
（1）对菌种进行在营养肉汤中活化和摇瓶培养，制成种子液；
（2）对种子液在营养琼脂培养基内扩大培养制成菌苔，形成芽孢体，获取菌苔；
（3）加入膨润土后干燥、碾磨制成原菌粉，在原菌粉加入膨润土新型稀释，制成产植酸酶芽孢杆菌益生菌制剂。
作为本发明实施例的一优化方案，液体深层发酵培养法的具体步骤为：
步骤一、对菌种进行在营养肉汤中活化，制备摇瓶种子液；
步骤二、接种到种子发酵罐扩大培养，然后接种到发酵罐中发酵培养基发酵，形成芽孢体；
步骤三、用离心、沉淀等方法收集芽孢体，添加膨润土作为载体，进行气流干燥制成原菌粉；
步骤四、在原菌粉加入膨润土稀释，制成产植酸酶芽孢杆菌益生菌制剂。
作为本发明实施例的一优化方案，浅层培养方法，（1）菌种的活化培养和摇瓶菌种培养条件为：温度32℃～37℃，pH7.0～7.5，摇床转速120r/min～180r/min，培养时间18h～20h；（2）浅盘培养条件：营养琼脂培养基pH7.0～7.5，培养温度32℃～37℃，培养时间32h～48h。
作为本发明实施例的一优化方案，液体深层发酵培养法，（1）活化培养和摇瓶菌种培养条件：温度32℃～37℃，pH7.0～7.5，摇床转速120r/min～180r/min，培养时间18h～20h；（2）种子罐种子扩大培养条件：培养基pH7.0～7.5，温度32℃～37℃，空气流量0.6～0.8VVM，转速250r/min～350r/min，培养时间18h～20h；（3）液体深层发酵培养条件：培养基pH7.0～7.5，温度32℃～37℃，空气流量0.3～0.45VVM，转速150r/min～300r/min，培养时间36h～42h。
作为本发明实施例的一优化方案，发酵培养基的组成：黄豆粉0.5%～4%，葡萄糖0.1%～2%，玉米粉0.1%～0.5%，硫酸铵0.01%～0.1%，七水硫酸镁0.01%～0.04%，七水硫酸锰0.01%～0.04%，氯化钙0.005%～0.02%，调PH值7.0～8.5。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
本发明实施例采用产植酸酶的解淀粉芽孢杆菌T6菌株为出发菌株，利用浅盘发酵培养法和液体深层发酵法进行菌株培养。
浅盘培养法：先对菌种进行在营养肉汤中活化和摇瓶菌种，制成种子液，对种子液在营养琼脂培养基内扩大培养制成菌苔，形成芽孢体，获取菌苔加入膨润土后干燥、碾磨制成原菌粉，在原菌粉加入膨润土新型稀释，制成产植酸酶芽孢杆菌益生菌制剂。（1）活化培养和摇瓶菌种培养条件：温度32℃～37℃，pH7.0～7.5，摇床转速120r/min～180r/min，培养时间18h～20h；（2）浅盘培养条件：营养琼脂培养基pH7.0～7.5，培养温度32℃～37℃，培养时间32h～48h。
液体深层发酵培养法：先对菌种进行在营养肉汤中活化，制备摇瓶种子液，然后接种到种子发酵罐扩大培养，再接种到发酵罐中发酵，形成芽孢体，形成芽孢后用离心、沉淀等方法收集芽孢体，添加膨润土作为载体，进行气流干燥制成原菌粉，在原菌粉加入膨润土稀释，制成产植酸酶芽孢杆菌益生菌制剂。（1）活化培养和摇瓶菌种培养条件：温度32℃～37℃，pH7.0～7.5，摇床转速120r/min～180r/min，培养时间18h～20h；（2）种子罐种子扩大培养条件：培养基pH7.0～7.5，温度32℃～37℃，空气流量0.6～0.8VVM，转速250r/min～350r/min，培养时间18h～20h；（3）液体深层发酵培养条件：培养基pH7.0～7.5，温度32℃～37℃，空气流量0.3～0.45VVM，转速150r/min～300r/min，培养时间36h～42h。
本发明所采用的产植酸酶的解淀粉芽孢杆菌T6菌株制备的新型益生菌制剂不仅具有能够耐热、耐干燥、耐酸碱、耐贮藏，与常见的益生芽孢杆菌制剂相比，有生长速度快、能产生植酸酶等优点，这保证了该制剂的菌株可以顺利通过胃肠道进入动物胃肠道并迅速发挥作用，抑制肠道内腐败菌的生长，在饲料中添加使用可以促进动物生长、提高饲料转化率，减少钙磷在粪便中的排除量，可达到替代抗生素饲料添加剂类产品的目的，从而解决畜禽产品中药物残留的问题，促进动物健康生长。
经实验表明，解淀粉芽孢杆菌T6菌株在生长繁殖过程中可产生植酸酶，在含植酸钙的琼脂培养基上培养24h具有明显的透明圈（见图2）。通过在发酵培养基中培养72h，离心，收集上清液测定植酸酶活性，其酶活达1263.2U/ml。培养至16h时，细菌浓度达到最大值（见图3），此时，开始形成芽孢，到32h时，芽孢体成熟率达95%以上。
肉鸡养殖实验结果表明，该制剂显著提高肉鸡增重和日增重，降低肉鸡的料重比，提高饲料转化率，促进肠道菌群的平衡，降低粪磷、粪钙的排出量。在肉鸡饲料中添加0.1%该制剂（106CFU/g饲料）增重高于空白对照组7.86%（P<0.01），高于植酸酶对照组5.00%（P<0.05）；平均日增重比空白对照组高出5.6%（P<0.01），高于植酸酶对照组5.5%（P<0.05）；料重比分别比空白对照组、植酸酶对照组降低了2.94%和2.46%（P<0.05）（见表1）；回肠中的双歧杆菌、乳酸菌、数量均高于对照组，且肠杆菌、肠球菌和总需氧菌的总数均下降，肠道的微生物定植能力指标B/E值明显升高（见图4）；粪磷排除量分别在14日龄、28日龄42日龄时对比空白对照组，减少了41.9%、35.3%、35.2%（见图5）；粪钙排出量减少了30%、23.3%、7.1%（见图6）。
表1产植酸酶芽孢杆菌T6对肉鸡生长性能的影响
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种产植酸酶解淀粉芽孢杆菌益生菌，其特征在于，该产植酸酶解淀粉芽孢杆菌益生菌为解淀粉芽孢杆菌T6，16S rRNA基因序列基因GenBank登录号JX081245。
2.一种产植酸酶解淀粉芽孢杆菌益生菌制剂。
3.一种产植酸酶解淀粉芽孢杆菌益生菌制剂的制备方法，其特征在于，该方法利用浅盘发酵培养法和液体深层发酵培养法进行菌株培养，步骤为：甘油保存菌种、菌种活化、摇瓶菌种、菌株培养、加入载体干燥、检验和包装出厂。
4.如权利要求3所述的产植酸酶解淀粉芽孢杆菌益生菌制剂的制备方法，其特征在于，浅盘发酵培养法的具体步骤为：
（1）对菌种进行在营养肉汤中活化和摇瓶培养，制成种子液；
（2）对种子液在营养琼脂培养基内扩大培养制成菌苔，形成芽孢体，获取菌苔；
（3）加入膨润土后干燥、碾磨制成原菌粉，在原菌粉加入膨润土新型稀释，制成产植酸酶芽孢杆菌益生菌制剂。
5.如权利要求3所述的产植酸酶解淀粉芽孢杆菌益生菌制剂的制备方法，其特征在于，液体深层发酵培养法的具体步骤为：
步骤一、对菌种进行在营养肉汤中活化，制备摇瓶种子液；
步骤二、接种到种子发酵罐扩大培养，然后接种到发酵罐中发酵培养基发酵，形成芽孢体；
步骤三、用离心方法收集芽孢体，添加膨润土作为载体，进行气流干燥制成原菌粉；
步骤四、在原菌粉加入膨润土稀释，制成产植酸酶芽孢杆菌益生菌制剂。
6.如权利要求4所述的产植酸酶解淀粉芽孢杆菌益生菌制剂的制备方法，其特征在于，（1）菌种的活化培养和摇瓶菌种培养条件为：温度32℃～37℃，pH7.0～7.5，摇床转速120r/min～180r/min，培养时间18h～20h；（2）浅盘培养条件：营养琼脂培养基pH7.0～7.5，培养温度32℃～37℃，培养时间32h～48h。
7.如权利要求5所述的产植酸酶解淀粉芽孢杆菌益生菌制剂的制备方法，其特征在于，液体深层发酵培养法，（1）活化培养和摇瓶菌种培养条件：温度32℃～37℃，pH7.0～7.5，摇床转速120r/min～180r/min，培养时间18h～20h；（2）种子罐种子扩大培养条件：培养基pH7.0～7.5，温度32℃～37℃，空气流量0.6～0.8VVM，转速250r/min～350r/min，培养时间18h～20h；（3）液体深层发酵培养条件：培养基pH7.0～7.5，温度32℃～37℃，空气流量0.3～0.45VVM，转速150r/min～300r/min，培养时间36h～42h。
8.如权利要求3所述的产植酸酶解淀粉芽孢杆菌益生菌制剂的制备方法，其特征在于，发酵培养基的组成：黄豆粉0.5%～4%，葡萄糖0.1%～2%，玉米粉0.1%～0.5%，硫酸铵0.01%～0.1%，七水硫酸镁0.01%～0.04%，七水硫酸锰0.01%～0.04%，氯化钙0.005%～0.02%，调PH值7.0～8.5。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20130911 |