CN104694446B - 一种多粘类芽孢杆菌jx‑13及其应用 - Google Patents

一种多粘类芽孢杆菌jx‑13及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多粘类芽孢杆菌JX‑13，其分类命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.9796，保藏日期为2014年10月17日。本发明还公开了上述多粘类芽孢杆菌JX‑13的应用。本发明的多粘类芽孢杆菌JX‑13，由该菌株发酵而制得的可湿性粉剂，能有效防治草莓枯萎病、炭疽病、灰霉病和葡萄灰霉病、炭疽病等病害。菌剂贮藏性质稳定，防治效果好，大规模生产的发酵工艺简单、生产成本低廉。

Description

一种多粘类芽孢杆菌JX-13及其应用
技术领域
本发明涉及一种微生物及用途，更具体地说涉及一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JX-13、用途及其制剂的制备方法，属于生物农药技术领域。
背景技术
目前作物病害的防治仍主要依赖化学农药，由此引起的病原菌抗药性增加、环境污染及果实的农药残留问题愈加突出，寻求安全有效的生物防治措施控制病害日益受到重视。草莓枯萎病等土传病害是国内外草莓生产中难以防治的根部毁灭性病害，主要由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)等土传病原真菌复合侵染导致，发病植株生长发育受阻，产量和品质严重下降，已成为制约草莓产业发展的主要障碍。传统利用溴甲烷等化学药剂可有效控制草莓根腐病的发生，但对土壤环境污染大，易产生病菌耐药性及农药残留等问题，已被世界大多数国家禁止使用。轮作和土壤消毒等农艺措施虽有一定防治效果，但其生产成本较大，难以适应中国集约化农业种植模式的要求。因此，筛选对草莓土传病害有较强抗性的生防菌并用于草莓生产，将会有效解决连作土传病害，对草莓产业的可持续发展具有重要意义。近年来国内外关于草莓土传微生物防治已有研究报道。已分离获得生防细菌、放线菌及真菌。其中生防真菌主要为木霉属(Trichoderma)和丛枝菌根真菌(AMF)，但在国内尚无在草莓上取得实际应用的报道。
草莓和葡萄的炭疽病、灰霉病，发生普遍，分布广泛，是目前制约我国草莓和葡萄产区的重要病害。在条件适宜发病时，可造成草莓、葡萄减产，严重时减产40％以上。采用田间管理和化学防治的方法防治虽然能取得一定的防治效果，但易产生抗药性、而且有环境污染和果实农药残留。因此，寻找高效安全的替代防治方法显得尤为迫切。生物防治方法因其与环境友好、维持生态平衡、有利于人类健康等优点而成为可持续农业发展中的方向技术之一，已为越来越多生产者和种植者所接受。在国外，用生物学方法防治上述病害已有所进展。Freeman et a1.(2004)用4种木霉菌Trichoderma harzianum、hamatum、atroviride和longibrachiatum的提取物防治草莓、葡萄的炭疽病和灰霉病取得良好效果。以色列Makhteshim Agan Chemical Works公司已将哈茨木霉harzianum 开发为真菌生防制剂，并在以色列、欧洲和北美的20多个国家成功注册。在我国，对草莓、葡萄等作物生物防治的研究相对滞后，仅有枯草芽孢杆菌等少数登记应用。
因草莓、葡萄是鲜食为主的应时鲜果，所以对药剂的选择有一定的局限性。因此对草莓、葡萄病害的生物防治在生产上具有一定迫切需求。本发明提供的颉颃细多粘类芽孢杆菌JX-13菌株及制剂，在草莓、葡萄上防治病害上的应用在现有技术中没有提及和公开。
发明内容
发明目的：为了解决现有技术存在的不足，本发明所要解决的第一个技术问题是提供了一株分离自石楠根部的内生芽孢杆菌：多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JX-13菌株，该菌株可用于防治草莓枯萎病、炭疽病、灰霉病和葡萄灰霉病、炭疽病。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供了多粘类芽孢杆菌JX-13的应用。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供了用该多粘类芽孢杆菌JX-13菌株加工成可湿性粉剂及其制备方法。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供了一种多粘类芽孢杆菌JX-13，其分类命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，保藏编号为：CGMCC No.9796，保藏日期为2014年10月17日。
其中，上述的多粘类芽孢杆菌JX-13在防治草莓枯萎病、草莓灰霉病、草莓炭疽病、葡萄灰霉病和葡萄炭疽病方面的应用。
其中，上述的多粘类芽孢杆菌JX-13的发酵液制备而成的可湿性粉剂。
其中，上述的可湿性粉剂的制备方法，包括以下步骤：
(A)菌液的获得：用无菌芽签挑取事先在PDA固体培养基上划线培养好的JX-13菌株单菌落斑，接种于装有5mL PDA液体培养液的容积为20mL的三角瓶中，于30℃、200rpm条件下振荡培养16h，过夜得到培养液，将上步所得培养液5mL全部接种于装有400mL PDA培养液的容积为1000mL的三角瓶中，200rpm、30℃条件下振荡培养16h；把所得的400mL培养液接种于装有20L发酵培养液的容积为30L的发酵罐中发酵得到发酵液；
(B)菌剂加工工艺：将发酵好的发酵液按如下方法加工成可湿性粉剂：将发酵液离心后用玉米淀粉吸干，测定活芽孢含量，根据测定结果用白炭黑和高岭土调节活芽孢数得到粉剂，终含量调节成芽孢含量为1.0×1010cfu/克；将上述调节好粉剂进入气流粉碎机并搅拌均匀，得成品为100亿活芽孢/克的可湿性粉剂。
其中，上述20L发酵培养液中固容物含量为：豆粕100g、马铃薯淀粉200g、蔗糖25g、酵母粉25g、CaCO320g、MnSO41.0g，设置发酵条件为：溶氧100％，搅拌速度为350rpm，发酵温度30℃，发酵时间36h，pH 7.0-7.2。
其中，上述的可湿性粉剂在防治草莓枯萎病、草莓灰霉病、草莓炭疽病、葡萄灰霉病和葡萄炭疽病方面的应用。
本发明还包括上述的可湿性粉剂在防治草莓枯萎病方面的应用。
本发明还包括上述的可湿性粉剂在防治草莓灰霉病方面的应用。
本发明还包括上述的可湿性粉剂在防治葡萄灰霉病方面的应用。
本发明还包括上述的可湿性粉剂在防治葡萄炭疽病方面的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点如下：
(1)本发明提供一株新的生防芽孢杆菌——枯草芽孢杆菌JX-13菌株，由该菌株发酵而制得的可湿性粉剂，能有效防治草莓枯萎病、炭疽病、灰霉病和葡萄灰霉病、炭疽病等土传病害。
(2)菌剂贮藏性质稳定，防治效果好，大规模生产的发酵工艺简单、生产成本低廉。
具体实施方式
下面列举实施例对本发明进一步说明，但不因此限制本发明的内容。
实施例1
获得多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JX-13菌株的方法如下：
PDA培养基配方为：马铃薯(去皮)200g/L，葡萄糖20g/L，水1L，琼脂20g/L，pH自然。将马铃薯去皮，切成小块，于锅中加水约1L煮沸半个小时，用双层纱布过滤，取其滤液加葡萄糖，并加水补足1L。
获得菌株的方法包括以下步骤：
1)菌株的分离、纯化与保存。
在位于江苏省句容市陈武镇的江苏农林职业技术学院农博园内的大叶石楠根部土壤中采集样品，在超净工作台上用无菌水将样品稀释后在PDA平皿上涂布并放置于30℃培养箱中培养，根据细菌的菌落特征及时挑取不同形态单菌落至PDA平皿上，纯化2次，记录菌株号，将已纯化的菌株转到PDA斜面上培养好后放入4℃冰箱中备用。然后将上述分离保存的细菌菌株转接中PDA平皿上活化，采用平皿对峙培养法筛选草莓枯萎病、炭疽病、灰霉病和葡萄灰霉病、炭疽病菌的拮抗菌株，根据抑菌圈的大小评定菌株的拮抗活性。
2)鉴定菌株种属并保藏。
将拮抗活性最强的菌株传代纯化培养后，对菌株进行分子鉴定，鉴定结果显示菌株为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，对其命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JX-13菌株，并制作多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)JX-13菌株的冷冻干燥管进行原始菌株的冻藏。
本发明的多粘类芽孢杆菌JX-13，其分类命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.9796，保藏日期为2014年10月17日。
本发明的菌种具有如下特征：
(1)JX13菌株的细胞形态及生理生化特征(见表1)
表1、细胞形态和理化试验结果
(2)本发明JX13菌株的16S rRNA基因测序后的序列如SEQ ID NO:1所示；本发明的多粘类芽孢杆菌JX-13菌株的gyrB基因测序后的序列如SEQ ID NO:2所示。
实施例2
本发明菌株JX-13制备的可湿性粉剂，其制备方法包括以下步骤：
(A)菌液的获得
用无菌芽签挑取事先在PDA固体培养基上划线培养好的JX-13菌株单菌落斑，接种于装有5mL PDA液体培养液的容积为20mL的三角瓶中，于30℃、200rpm条件下振荡培养16h，过夜，将上步所得培养液5mL全部接种于装有400mL PDA培养液的容积为1000mL的三角瓶中，200rpm、30℃条件下振荡培养16h；把所得的400mL培养液接种于装有20L培养液的容积为30L的发酵罐(镇江东方GUS-30)，20L发酵培养液中固容物含量为：豆粕100g、马铃薯淀粉200g、蔗糖25g、酵母粉25g、CaCO320g、MnSO41.0g，设置发酵条件为：溶氧100％，搅拌速度为350rpm，发酵温度30℃，发酵时间36h，pH 7.0-7.2；
(B)菌剂加工工艺
将发酵好的发酵液按如下方法加工成可湿性粉剂：
(1)将发酵液离心(8000rpm)后用玉米淀粉吸干，测定活芽孢含量，根据测定结果用白炭黑和高岭土(各一半量)调节活芽孢数，终含量调节成多粘类芽孢杆菌芽孢含量为1.0×1010cfu/克(即每克含100亿个活芽孢)；(2)在上述调节好粉剂进入气流粉碎机并搅拌均匀，得成品为100亿活芽孢/克的可湿性粉剂。
实验例：
JX-13可湿性粉剂对草莓病害的田间防治试验
田间防治效果试验在江苏省句容市白兔镇大棚草莓园和葡萄园进行，草莓品种为红颊，葡萄品种为巨峰。试验处理方案如下：
(A)草莓枯萎病的防治
药剂处理方法：多粘类芽孢杆菌JX-13可湿性粉剂(100亿活芽孢/克)1000倍液，对照药剂50％甲基硫菌灵可湿性粉剂1000倍液，在草莓移栽时每棵苗灌根200ml药液，空白对照灌清水，200棵苗每小区，随机区组排列，3次重复，于灌根60天后调查病情指数。
(B)草莓炭疽病、葡萄炭疽病的防治
试验药剂处理：多粘类芽孢杆菌JX-13可湿性粉剂(100亿活芽孢/克)1000倍液，对照药剂50％甲基硫菌灵可湿性粉剂1000倍液，空白对照用清水喷雾。用水量50kg/667m2，小区面积为20m2。试验设3次重复，防治间隔期10天。连续细喷雾防治3次。分别于最后一次防治后10天调查病情指数。
(C)草莓灰霉病、葡萄灰霉病的防治
试验药剂处理：多粘类芽孢杆菌JX-13可湿性粉剂(100亿活芽孢/克)1000倍液，对照药剂50％甲基硫菌灵可湿性粉剂1000倍液，空白对照用清水喷雾。用水量50kg/667m2，小区面积分别为20m2。试验设3次重复，防治间隔期10天。连续细喷雾防治3次。分别于最后一次防治后10天调查病情指数。
结果与分析：多粘类芽孢杆菌JX-13可湿性粉剂(100亿活芽孢/克)1000倍液，对草莓枯萎病、草莓灰霉病、草莓炭疽病，葡萄炭疽病和葡萄灰霉病的防治效果分别为85.02％、78.15％、81.91％、85.43％和84.55％(表2)，而对照药剂50％甲基硫菌灵可湿性粉剂1000倍液，对草莓灰霉病、草莓炭疽病、葡萄炭疽病、葡萄灰霉病和草莓枯萎病的防治效果分别为57.30％、65.86％、68.81％、72.05％和58.78％(表2)。
以上结果表明，多粘类芽孢杆菌JX-13可湿性粉剂(100亿活芽孢/克)1000倍液的田间防治效果显著高于对照药剂，多粘类芽孢杆菌JX-13可湿性粉剂(100亿活芽孢/克)1000倍液对草莓灰霉病、草莓炭疽病，葡萄灰霉病、葡萄炭疽病和草莓枯萎病等病害的兼治作用显著。试验中所有处理均未发生药害现象，表明多粘类芽孢杆菌JX-13可湿性粉剂(100亿活芽孢/克)1000倍液施用安全。
表2 多粘类芽孢杆菌JX-13可湿性粉剂对草莓、葡萄病害田间防治试验结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.多粘类芽孢杆菌JX-13的发酵液制备而成的可湿性粉剂，其特征在于，该多粘类芽孢杆菌JX-13分类命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.9796，保藏日期为2014年10月17日，该可湿性粉剂中的芽孢含量为1.0×1010 cfu/克。
2.权利要求1所述的可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（A）菌液的获得：用无菌芽签挑取事先在PDA固体培养基上划线培养好的JX-13菌株单菌落斑，接种于装有5 mL PDA液体培养液的容积为20 mL的三角瓶中，于30℃、200 rpm条件下振荡培养16 h，过夜得到培养液，将上步所得培养液5 mL全部接种于装有400 mL PDA培养液的容积为1000 mL的三角瓶中，200 rpm、30℃条件下振荡培养16 h；把所得的400 mL培养液接种于装有20 L发酵培养液的容积为30 L的发酵罐中发酵得到发酵液；
（B）菌剂加工工艺：将发酵好的发酵液按如下方法加工成可湿性粉剂：将发酵液离心后用玉米淀粉吸干，测定活芽孢含量，根据测定结果用白炭黑和高岭土调节活芽孢数得到粉剂，终含量调节成芽孢含量为1.0×1010 cfu/克；将上述调节好粉剂进入气流粉碎机并搅拌均匀，得成品为100亿活芽孢/克的可湿性粉剂。
3.根据权利要求2所述的可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，所述20L发酵培养液中固容物含量为：豆粕100 g、马铃薯淀粉200 g、蔗糖25 g、酵母粉25 g、CaCO3 20 g、MnSO41.0 g，设置发酵条件为：溶氧100%，搅拌速度为350 rpm，发酵温度30 ℃，发酵时间36 h，pH7.0-7.2。
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多粘类芽孢杆菌抗菌物质和防病机制之研究进展;赵爽 等;《中国农学通报》;20080731;第24卷(第7期);第347-350页 *

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