CN105200116B - 一种快速测定复合微生物菌剂中多粘类芽孢杆菌含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速测定复合微生物菌剂中多粘类芽孢杆菌含量的方法，所述复合微生物菌剂的活性成分为枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌，本发明通过向培养基中加入一定浓度的氨苄西林钠，抑制枯草芽孢杆菌的生长，但不抑制多粘类芽孢杆菌的生长，从而避免了快速长出的枯草芽孢杆菌对多粘类芽孢杆菌统计数据的影响。该方法可以快速、简便、准确地测定复合微生物菌剂中多粘类芽孢杆菌的含量。

Description

一种快速测定复合微生物菌剂中多粘类芽孢杆菌含量的方法

技术领域

本发明涉及一种复合微生物菌剂的检测方法，具体涉及一种快速测定复合微生物菌剂中多粘类芽孢杆菌含量的方法，属于微生物检测技术领域。

背景技术

微生物肥料俗称细菌剂料，简称菌剂，是指一类含有活微生物的特定肥料，应用于农业生产中，能够获得特定的肥料效应。施用后通过菌剂中微生物的生命活动，借助其代谢过程或代谢产物，以改善植物生长条件，尤其是营养环境。为了提高肥效，常在菌剂中混合几种活微生物。

多粘类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌及胶冻芽孢杆菌等微生物不仅具有农药的杀菌作用，而且还能改善土壤环境，促进植物生长，具有肥料的作用。为了最大限度的利用复合微生物菌剂的功效，目前常将枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌及胶冻芽孢杆菌混合制成复合菌剂。胶冻样芽胞杆菌,又称硅酸盐细菌,尽管其对营养条件要求不高，对环境条件适应性强，但通常情况下，添加在复合菌剂中的胶冻样芽孢杆菌的量只有枯草芽孢杆菌或多粘类芽孢杆菌量几十分之一甚至百分之一，因此，将复合菌剂稀释到相应倍数测定枯草芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌含量时，即便胶冻样芽孢杆菌能在该培养条件下生长，但其生长的菌量对枯草芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌统计结果也不会造成显著性影响，故此测定时，常不考虑胶冻样芽孢杆菌的量；同时胶冻样芽孢杆菌的测定相对较容易，由于其在选择性(无氮或无有效磷钾养分)固体培养基上有其独特菌落和细胞形态特征，因而不需生化特性检测或基因序列分析也很容易与其他细菌区分。但枯草芽孢杆菌与多粘类芽孢杆菌所使用的培养基相同，在常规的培养条件下，枯草芽孢杆菌生长速度较快，而多粘类芽孢杆菌生长速度相对较慢，培养基中快速长出的枯草芽孢杆菌覆盖了多粘类芽孢杆菌，从而使得无法准确统计多粘类芽孢杆菌的含量，而且枯草芽孢杆菌的适应性较多粘类芽孢杆菌更强，通过控制培养温度等简单方法难以准确统计多粘类芽孢杆菌的含量。随著近年来此类菌剂的生产和应用越来越广泛，我们急需建立一种简易、快速、能准确测定多粘类芽孢杆菌含量的方法。

氨苄西林钠(Ampicillin Sodium，CAS号：69-52-3)。化学结构式：

化学式：C₁₆H₁₈N₃NaO₄S。氨苄西林钠属于青霉素类抗生素，可以用于肌内注射或者静脉注射，主要用以治疗敏感细菌所致的上、下呼吸道感染、胃肠道感染、尿路感染、皮肤、软组织感染、脑膜炎、败血症、心内膜炎等。目前还没有氨苄西林钠抑制枯草芽孢杆菌或多粘类芽孢杆菌的文献报导。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速测定复合微生物菌剂中多粘类芽孢杆菌含量的方法，以简化操作，获得更为准确的检测结果。为达到上述发明目的，本发明采用了以下技术方案：

一种快速测定复合微生物菌剂中多粘类芽孢杆菌含量的方法，所述复合微生物菌剂的活性成分为枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌，该方法包括以下步骤：

1)在微生物培养基中加入氨苄西林钠，使其浓度达到0.05～0.3μg/mL，混匀后制成平板；

2)将待测复合微生物菌剂在含重量百分比为0.05～0.5％Tween-80的生理盐水中溶解后，置于磁力搅拌器上，在室温下搅拌20～40min，转速为100～200rpm，然后再将该溶液置于超声水浴锅中，超声20～40min，制得待测样品溶液；

3)将待测样品溶液均匀涂布在步骤(1)制得的平板上，涂布完成后，将其放入32℃恒温培养箱中，24～48h后统计各平板菌落数并计算含量。

优选地，所述氨苄西林钠的浓度为0.1μg/mL。

所述微生物培养基为PDA培养基。

优选地，步骤2)中，将待测复合微生物菌剂在含重量百分比为0.1％Tween-80的生理盐水中溶解后，置于磁力搅拌器上，在室温下搅拌30min，转速为150rpm，然后再将该溶液置于超声水浴锅中，超声30min，制得待测样品溶液。

本发明的有益效果是：

本发明通过向培养基中加入一定浓度的氨苄西林钠，抑制枯草芽孢杆菌的生长，但不抑制多粘类芽孢杆菌的生长，从而避免了快速长出的枯草芽孢杆菌对多粘类芽孢杆菌统计数据的影响。该方法通过计数菌落的数量并换算成活芽孢含量，可以快速、简便、准确地测定复合微生物菌剂中多粘类芽孢杆菌的含量。

附图说明

图1是本发明实施例中测定方法流程图。

图2是不同浓度氨苄西林钠对枯草芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌的抑菌圈试验(K1为枯草芽孢杆菌、K3为多粘类芽孢杆菌)。

图3是多粘类芽孢杆菌在含不同浓度氨苄西林钠平板上生长情况照片。

图4是枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌的混合菌在含不同浓度氨苄西林钠平板上生长情况照片。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例：采用图1所示方法流程，分别对枯草芽孢杆菌颗粒菌剂、多粘类芽孢杆菌液体菌剂、枯草芽孢杆菌+多粘类芽孢杆菌+胶冻样芽孢杆菌复合颗粒菌剂、枯草芽孢杆菌+多粘类芽孢杆菌+胶冻样芽孢杆菌复合液体菌剂的含量进行测定，依次作为实施例1～4。

测定步骤如下：

1)取PDA培养基，装入500mL的三角瓶内，高压蒸汽灭菌后，待冷却至55～65℃后加入氨苄西林钠，使其浓度分别达到0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL，混匀后制成PDA平板。

2)在无菌操作条件下，将样品搅拌均匀，准确称取10.0g样品，加入90mL含0.1％(重量百分比)Tween-80的的灭菌生理盐水中，充分溶解后，置于磁力搅拌器上搅拌30min，然后再将该溶液置于超声水浴锅中，超声30min，得到稀释10倍的样品溶液，标记为0号，然后依次进行10倍梯度稀释，每个稀释度设3个重复样品。

3)将上述各梯度稀释液分别吸取100μL，用L形玻棒均匀涂布在步骤(1)所得平板上，32℃恒温培养箱中24h，选择适宜的稀释度，菌落数在30～300的平板为有效计数平板。

4)计算加入不同浓度氨苄西林钠后的活芽孢含量为式中N是活芽孢数，单位为cfu/g；c是同一稀释倍数的多个有效计数平板上的平均菌落数；m是称取的菌剂样品质量，单位为g；t是统计平板对应的稀释倍数。

结果比较：

将0μg/mL含量的氨苄西林钠PDA平板作为各实施例的对照组，对各实施例中含不同浓度氨苄西林钠的PDA平板的测定结果进行比较，结果如表1所示。

从表1可以看出，实施例1采用本发明的方法，在含较低浓度氨苄西林钠的PDA平板上未能检测出活芽孢，说明氨苄西林钠对枯草芽孢杆菌有很好的抑制作用。这一结论我们从图2所示的抑菌圈试验中也能看出：即在含0.1μg/mL氨苄西林钠的平板上，K1所表示的枯草芽孢杆菌都有抑菌圈出现，而K3所表示的多粘类芽孢杆菌则在较低氨苄西林钠浓度下没有抑菌圈出现或是抑菌圈不明显，只有在较高浓度下，才出现了明显的抑菌圈；实施例2采用本发明的方法均能检测出活芽孢，但随着氨苄西林钠含量的增大，活芽孢数有所减少，说明选择适当含量的氨苄西林钠对本发明的检测结果至关重要。这一结论在图3中也能看出：即在图示的3个氨苄西林钠浓度梯度下，都有多粘类芽孢杆菌的生长，且0.1μg/mL-0.2μg/mL浓度下，其生长菌量与空白对照平板上生长的菌量几乎没有差异，当浓度升到0.5μg/mL时，多粘类芽孢杆菌生长的量出现了明显减少；实施例3和实施例4测定结果显示：在含低浓度氨苄西林钠的PDA平板上，检测出的活芽孢数与添加在复合菌剂中的多粘类芽孢杆菌含量相当，而在不含氨苄西林钠的对照组PDA平板上，检测出的活芽孢数与添加在复合菌剂中的枯草芽孢杆菌含量相当，这说明适当含量的氨苄西林钠同样对复合微生物菌剂中的枯草芽孢杆菌有抑制作用，而对多粘类芽孢杆菌没有影响。同样，这一结论在图4中也能看出：即复合菌剂在不加氨苄西林钠的平板上生长的菌的菌落形态及菌量都与枯草芽孢杆菌一样，而在含不同浓度氨苄西林钠的平板上生长的菌的菌落形态与不加氨苄西林钠的平板上生长的菌的菌落形态则完全不同，再结合生长的菌量，不难看出该菌应为多粘类芽孢杆菌。

综合表1及图2-4的结果，采用本发明的方法测定复合微生物菌剂中多粘类芽孢杆菌含量不仅操作简单，而且快速、准确，是一个较理想的检测方法。

Claims (4)

1.一种快速测定复合微生物菌剂中多粘类芽孢杆菌含量的方法，所述复合微生物菌剂的活性成分为枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌，其特征在于包括以下步骤：

1)在微生物培养基中加入氨苄西林钠，使其浓度达到0.1～0.3μg/mL，混匀后制成平板；

2)将待测复合微生物菌剂在含重量百分比为0.05～0.5％Tween-80的生理盐水中溶解后，置于磁力搅拌器上，在室温下搅拌20～40min，转速为100～200rpm，然后再将该溶液置于超声水浴锅中，超声20～40min，制得待测样品溶液；

3)将待测样品溶液均匀涂布在步骤(1)制得的平板上，涂布完成后，将其放入32℃恒温培养箱中，24～48h后统计各平板菌落数并计算含量。

2.如权利要求1所述快速测定复合微生物菌剂中多粘类芽孢杆菌含量的方法，其特征在于：步骤1)中，在微生物培养基中加入氨苄西林钠，使其浓度达到0.1μg/mL，混匀后制成平板。

3.如权利要求1所述快速测定复合微生物菌剂中多粘类芽孢杆菌含量的方法，其特征在于：所述微生物培养基为PDA培养基。

4.如权利要求1所述快速测定复合微生物菌剂中多粘类芽孢杆菌含量的方法，其特征在于：步骤2)中，将待测复合微生物菌剂在含重量百分比为0.1％Tween-80的生理盐水中溶解后，置于磁力搅拌器上，在室温下搅拌30min，转速为150rpm，然后再将该溶液置于超声水浴锅中，超声30min，制得待测样品溶液。