CN105524974A - 一种高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物学检验技术领域，具体而言，涉及一种高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，包括：1)、称量微生物制剂样品并加入溶剂中，振荡，得第1稀释液；2)、吸取所述第1稀释液加入溶剂中，振荡，得到第2稀释液；3)、重复步骤2)n次，每次均从上一次得到的稀释液中吸取并进行稀释，分别得到第3、4、5……n+2稀释液；4)、取2～4个连续稀释度的菌液均匀涂于培养基表面培养并统计菌落个数，结合稀释倍数及涂板时吸取的稀释液体积逆推得到高浓度微生物制剂产品含菌量。该方法减小了梯度稀释时造成的误差，测量更准确，可用于测量10亿/g～1500亿/g或10亿/mL～1500亿/mL的微生物制剂。
Description
技术领域
本发明涉及微生物学检验技术领域，具体而言，涉及一种高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法。
背景技术
微生物制剂在农业中的应用主要为种植和养殖过程中，在种植上的主要作用表现为促进植物生长、提高植物防病抗病能力、提高肥料利用率、提高植物抗旱、修复土壤、降解农药等；在养殖上的主要作用表现为补充、调整或维持动物肠道内微生态平衡，促进机体肠道吸收和提高宿主免疫水平；它还可以对由于集约化养殖造成的水体环境污染进行调整和修护，保持养殖环境的生态平衡。
由于制备方法的限制，传统的微生物制剂的浓度通常较低，如生物有机肥微生物制剂的产品的浓度标准一般在0.2亿/g或0.2亿/mL左右。随着微生物制剂制备工艺的不断完善，产品中的微生物浓度也不断攀升，制剂中微生物密度极大，从而使得稀释液中的微生物不完全分散，如果用现有检测方法进行含菌量检测，培养基上的多个微生物可能会生长成为一个菌落，由此导致菌落数的统计结果大大低于实际值，从而使微生物含量的检测结果低于实际水平。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明目的在于提供一种高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，所述的检测方法可解决现有技术在检测高浓度微生物制剂的含菌量时不准确的问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，包括：
1)、称量微生物制剂样品并加入溶剂中混匀，得第1稀释液；
2)、吸取所述第1稀释液加入溶剂中，振荡，得到第2稀释液；
3)、重复步骤2)n次，每次均从上一次得到的稀释液中吸取并进行稀释，分别得到第3、4、5……n+2稀释液；
4)、取2～4个连续稀释度的菌液均匀涂于培养基表面培养并统计菌落个数，结合稀释倍数及涂板时吸取的稀释液体积逆推得到高浓度微生物制剂产品含菌量。
本申请提供的高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，通过将样品梯度稀释并充分振荡分散以减小每一次稀释时带来的系统误差和偶然误差，从而更精确地进行检测。
由于本方法用于微生物制剂产品的含菌量检测，而微生物制剂在进行工业生产时的大致含菌量范围是可以根据生产流程进行推断的。因而本申请提供的方法多用于含菌量的精确检测或对成品的质检。故而根据样品菌的大致含量选取2～4个连续稀释度足以将最佳稀释度选定在内。
优选的，如上所述的高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，在步骤4)中，在取2～4个连续稀释度的菌液均匀涂于培养基表面培养并统计菌落个数时具体包括：
取2～4个连续稀释度的菌液及等量的所述溶剂均匀涂于培养基表面，每个稀释度做2～4个重复，36～38℃培养1～3天，培养完成后统计菌落个数。
取溶剂培养的目的是为了提供空白对照，防止因溶剂被微生物制品污染而造成计数不准。
优选的，如上所述的高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，所述检测方法的适用微生物制剂的浓度范围为：
10亿/g～1500亿/g或10亿/mL～1500亿/mL。
优选的，如上所述的高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，在步骤1)中，称取微生物制剂样品的量为1g或1mL；在步骤1)～3)中，所述稀释液的稀释倍数均为上一稀释液或微生物制剂样品原样的8～15倍。
限定稀释起点的目的是，虽然使用更少的样品如0.01g或1μL会方便操作，但在测量的是如此高浓度的微生物制剂的前提下，称量的量越少，误差越大；
在8～15倍的稀释倍数下，样品可以被溶剂充分稀释，且误差也不会很大；若稀释倍数过大，虽然可以减小误差，但稀释所用溶剂的量过大，难以操作。
因而综合上述两点原因，本申请优选限定稀释起点为1g或1mL，且进行梯度稀释。
在操作时，为了方便计算，在步骤1)中，称取微生物制剂样品的量为1g或1mL(称量精确到千分位)，溶剂的量为9mL；
在步骤2)中，吸取第1稀释液的量为1mL，溶剂的量为9mL。
此外，在本领域中，在固体微生物制剂产品计数稀释时，近似的认为1g加入9mL溶剂即为稀释10倍。
优选的，如上所述的高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，所述溶剂为无菌水。
溶剂也可根据微生物种类进行其他选择，如以常见的缓冲液(PBS、TBS)进行稀释等。
优选的，如上所述的高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，所述混匀为使用摇床混匀；所述振荡为使用小型旋涡振荡器进行振荡。
进一步优选的：
在步骤1)中，摇床的转速为150～300转/min，所述混匀的时间为20～40分钟；
在步骤2)中，振荡的频率为40～80Hz，所述振荡的时间为20～40秒。
在步骤1)中，由于初始加入了样品中含菌量非常巨大，为了充分地分散以减小后续份数造成的误差，因而摇床的转速比较快，且混匀时间较长。
优选的，如上所述的高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，在步骤3)中，n＝4～8。
n＝4～8即最高稀释倍数为1：1×106～1：1×1010。
优选的，如上所述的高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，所述微生物制剂产品中的微生物为光合细菌、放线菌、硝化细菌、反硝化细菌、硫化细菌、酵母菌、蛭弧菌、乳酸菌或芽孢杆菌中的一种。
本申请适用于单一菌种制成的微生物制剂；
若想将本申请应用于复合微生物制剂，则需要针对该复合微生物制剂中的微生物类型选配不同类型的培养基。
优选的，如上所述的高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，所述微生物制剂产品为经喷雾干燥制成枯草芽孢杆菌制剂。
经喷雾干燥制成芽孢杆菌制剂为申请人(北京世纪阿姆斯生物技术有限公司)所生产的产品，其菌含量很高，芽孢杆菌浓度可达1000亿/g以上。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)、经过特定时间的振荡后，高浓度微生物制剂产品可被高度均一地分散在溶剂里，大大减小了梯度稀释时造成的误差，测量更准确。
2)、以8～15倍为间隔进行梯度稀释，误差比直接稀释到更高倍数要小的多，更适合10亿/g～1500亿/g或10亿/mL～1500亿/mL的微生物制剂样品的检测，对评定高浓度微生物制剂质量、指导生产具有重要意义。
3)、本申请提供的检测方法操作简单，易于掌握。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，包括：
S11、称量微生物制剂样品并加入溶剂中混匀，得第1稀释液；
S12、吸取所述第1稀释液加入溶剂中，振荡，得到第2稀释液；
S13、重复步骤S12八次，每次均从上一次得到的稀释液中吸取并进行稀释，分别得到第3、4、5……10稀释液；
S14、取4个连续稀释度的菌液均匀涂于培养基表面培养并统计菌落个数，结合稀释倍数及涂板时吸取的稀释液体积逆推得到高浓度微生物制剂产品含菌量。
实施例2
一种高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，以1500亿/mL的芽孢杆菌制剂检测为例，包括：
S21、称量1.000mL芽孢杆菌制剂样品并加入9mL溶剂中，与摇床上300转/min孵育40分钟，得第1稀释液；
S22、吸取所述第1稀释液1mL加入9mL溶剂中，使用小型旋涡振荡器，80Hz振荡40秒，得到第2稀释液；
S23、重复步骤S22八次，每次均从上一次得到的稀释液中吸取并进行稀释，分别得到第3～10稀释液；
S24、取第7、8、9、10稀释液的菌液及等量的所述溶剂均匀涂于培养基表面培养并统计菌落个数，结合稀释倍数及涂板时吸取的稀释液体积逆推得到高浓度芽孢杆菌制剂产品含菌量。
实施例3
一种高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，以1180亿/g的经喷雾干燥制成的枯草芽孢杆菌制剂检测为例，包括：
S31、用电子天平称量1.000g芽孢杆菌制剂样品，加入带10颗左右玻璃珠的18×180mm的无菌试管中，加无菌水9ml，然后用200转/min的摇床摇30分钟，形成1：10稀释液；
S32、在无菌室超净工作台内，用移液枪吸取上述稀释液1ml徐徐加入含有9ml无菌水的18×180mm的无菌试管中(注意枪头不要触及管内无菌水)，用小型旋涡振荡器60Hz振荡30秒，混匀成1：1×102的稀释菌悬液；
S33、重复上步，依次稀释，分别得到……1：1×107、1：1×108、1：1×109等浓度的菌悬液；
注意每个稀释度必须更换无菌的移液枪枪头；
S34、用200μl移液枪吸取1×107、1：1×108、1：1×109稀释度菌悬液0.1ml(根据样品菌含量吸取合适的稀释梯度)，加至直径为9cm的培养皿的琼脂培养基表面，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂于琼脂表面。每一稀释度重复3次，同时加无菌水的空白对照(同一个稀释度用同一个玻璃刮铲，换梯度需更换刮铲)；
S35、将培养皿放入37℃培养箱中培养1～3天，待菌落长出后统计菌落个数；
实施例4
一种高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，以300亿/g的酵母菌制剂检测为例，包括：
S41、称量1.000g酵母菌制剂样品并加入9mL无菌水中，在摇床上150转/min摇25分钟，得第1稀释液；
S42、吸取所述第1稀释液1mL加入9mL无菌水中，用小型旋涡振荡器40Hz振荡25秒，得到第2稀释液；
S43、重复步骤S42六次，每次均从上一次得到的稀释液中吸取并进行稀释，分别得到第3～8稀释液；
S44、取第5、6、7、8稀释液的菌液及等量的无菌水均匀涂于培养基表面，每个稀释度做2个重复，36～38℃培养1天，培养完成后统计菌落个数，结合稀释倍数及涂板时吸取的稀释液体积逆推得到高浓度酵母菌制剂产品含菌量。
实施例5
一种高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，以600亿/g的乳酸菌制剂检测为例，包括：
S51、称量1.000g乳酸菌制剂样品并加入9mL无菌水中，用摇床250转/min摇35分钟，得第1稀释液；
S52、吸取所述第1稀释液1mL加入9mL无菌水中，用小型旋涡振荡器50Hz振荡35秒，得到第2稀释液；
S53、重复步骤S52七次，每次均从上一次得到的稀释液中吸取并进行稀释，分别得到第3～9稀释液；
S54、取第7、8、9稀释液的菌液及等量的无菌水均匀涂于培养基表面，每个稀释度做1个重复，36～38℃培养3天，培养完成后统计菌落个数，结合稀释倍数及涂板时吸取的稀释液体积逆推得到高浓度乳酸菌制剂产品含菌量。
实施例6
一种高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，以1300亿/g的反硝化细菌制剂检测为例，包括：
S61、称量1.000mL反硝化细菌制剂样品并加入9mL无菌水中，用摇床300转/min摇40分钟，得第1稀释液；
S62、吸取所述第1稀释液1mL加入9mL无菌水中，用小型旋涡振荡器80Hz振荡40秒，得到第2稀释液；
S63、重复步骤S62八次，每次均从上一次得到的稀释液中吸取并进行稀释，分别得到第3～10稀释液；
S64、取第7、8、9、10稀释液的菌液及等量的无菌水均匀涂于培养基表面，每个稀释度做3个重复，36～38℃培养1天，培养完成后统计菌落个数，结合稀释倍数及涂板时吸取的稀释液体积逆推得到反硝化细菌制剂产品含菌量。
实验例
对比例1：在实验例3的基础上，将S31中称量的微生物量设为0.001g，加入到9.999mL无菌水中，得到稀释倍数为1×104的第一稀释液，接下来的操作同S32～S35；
对比例2：在实验例3的基础上，将S31中摇动时间改为10分钟，S32中振荡时间改为8秒，其余操作均与实验例3一致。
表1检测方法结果的比较
从上表可知，相对于国标检测方法，本申请给出的检测方法准确度更高，标准差更小，更适用于高浓度微生物的检测。而对于对比例1和对比例2来说，分别存在称量时误差较大即分散不均匀的问题，导致测量的准确度和标准差幅度均非常巨大，测量不准确。借助于本发明的上述技术方案，通过限定具体的稀释倍数及震动时间，可提高微生物制剂含菌量检测的准确度。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (10)
1.一种高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，其特征在于，包括：
1)、称量微生物制剂样品并加入溶剂中混匀，得第1稀释液；
2)、吸取所述第1稀释液加入溶剂中，振荡，得到第2稀释液；
3)、重复步骤2)n次，每次均从上一次得到的稀释液中吸取并进行稀释，分别得到第3、4、5……n+2稀释液；
4)、取2～4个连续稀释度的菌液均匀涂于培养基表面培养并统计菌落个数，结合稀释倍数及涂板时吸取的稀释液体积逆推得到高浓度微生物制剂产品含菌量。
2.如权利要求1所述的高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，其特征在于，在步骤4)中，在取2～4个连续稀释度的菌液均匀涂于培养基表面培养并统计菌落个数时具体包括：
取2～4个连续稀释度的菌液及等量的所述溶剂均匀涂于培养基表面，每个稀释度做2～4个重复，36～38℃培养1～3天，培养完成后统计菌落个数。
3.如权利要求2所述的高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，其特征在于，所述检测方法的适用微生物制剂的浓度范围为：
10亿/g～1500亿/g或10亿/mL～1500亿/mL。
4.如权利要求3所述的高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，其特征在于：
在步骤1)中，称取微生物制剂样品的量为1g或1mL；在步骤1)～3)中，所述稀释液的稀释倍数均为上一稀释液或微生物制剂样品原样的8～15倍。
5.如权利要求4所述的高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，其特征在于，所述溶剂为无菌水。
6.如权利要求4所述的高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，其特征在于：
所述混匀为使用摇床混匀；所述振荡为使用小型旋涡振荡器进行振荡。
7.如权利要求6所述的高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，其特征在于：
在步骤1)中，摇床的转速为150～300转/min，所述混匀的时间为20～40分钟；
在步骤2)中，振荡的频率为40～80Hz，所述振荡的时间为20～40秒。
8.如权利要求4所述的高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，其特征在于，在步骤3)中，n＝4～8。
9.如权利要求1～8任一项所述的高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，其特征在于，所述微生物制剂产品中的微生物为光合细菌、放线菌、硝化细菌、反硝化细菌、硫化细菌、酵母菌、蛭弧菌、乳酸菌或芽孢杆菌中的一种。
10.如权利要求1～8任一项所述的高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，其特征在于，所述微生物制剂产品为经喷雾干燥制成的枯草芽孢杆菌制剂。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160427 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |