CN102021222A - 土壤微生物数量精确测定的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种土壤可培养微生物数量精确测定的方法，其步骤是：(1)土壤前处理：去除土壤样品中的植物残体和动物以及小石子，再将土壤样品混合均匀；(2)测定土壤含水量：先将铝盒放在烘箱中烘干，取出铝盒置于下部放有部分干燥硅胶的干燥器中冷却至室温，称量烘干土壤+铝盒的重量；(3)土壤悬浮液制备：称取烘干重的新鲜土壤样品，置于经灭菌的杯中，得到土壤悬浮液；(4)土壤悬浮液稀释：用经灭菌的电动移液器稀释法土壤悬浮液依次稀释；(5)培养基配制；(6)接种与培养；(7)计数与计算。该方法操作简便、快速，测定结果精密度和准确度高、重复性好，适合于大批量土壤样品的各种可培养微生物数量的精确测定。

Description

土壤微生物数量精确测定的方法

技术领域

本发明属于微生物数量精确测定技术领域，更具体涉及一种土壤可培养微生物数量精确测定的方法，适合于高等学校、科研单位、医疗卫生和环境保护部门等测定土壤可培养微生物的数量。

背景技术

土壤微生物在土壤有机质和氮磷等主要养分的循环和转化中起着重要的作用。土壤微生物种类繁多，数量庞大。从分类学上看，土壤微生物可分为细菌、真菌、放线菌、病毒和原生动物等。尽管土壤微生物基因分析表明，土壤可培养微生物的占土壤中总微生物的比率较小，但在功能上土壤可培养微生物可能发挥着主要作用，特别是土壤中可培养细菌和真菌。

最初测定土壤可培养微生物数量的方法是采用稀释平板培养计数法，该方法的优点在于可测定土壤中可培养的各种类型微生物的数量，包括细菌、真菌和放线菌。特别是可用于测定可培养的具有特殊功能的微生物种群，如氨化细菌、硝化细菌、反硝化细菌、解磷菌和固氮菌等。因此，稀释平板培养计数法一直是测定土壤微生物数量最常用的方法。但是，过去的方法普遍存在的主要问题是精密度低，准确度和重复性差，不适合用于进行精确的土壤微生物数量研究。其原因在于：其一，该方法需要经过多步稀释，采用传统吸管进行土壤悬浮液进行稀释，很难对少量（1.0毫升）的土壤悬浮液进行准确取样，当某次稀释取样不发生误差时，将对后续稀释度将带来很大的影响。其次，过去的方法在进行稀释时没有考虑到土壤中的水分，也是准确度差和误差大的原因之一。其三，在测定土壤可培养细菌时，由于真菌的生长干扰细菌的计数，而测定土壤真菌时，由于细菌的生长而影响真菌的计数。Lombard于2006年将稀释培养法测定微生物数量的过程比作“黑箱”，影响其测定结果不确定性的因素很多，包括：器皿和设备选择、测定所用样品的取样和初始稀释制备悬浮液、悬浮液系列稀释及接种液涂抹、随机误差的排除、操作者和时间、培养基和试剂、菌落确定和计数等。因此，建立精确的稀释平板培养法对于研究土壤可培养微生物数量具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种土壤微生物数量精确测定的方法，该方法操作简便、快速，技术要求相对较低，测定结果精密度和准确度高、重复性好，适合于大批量土壤样品的各种可培养微生物数量的精确测定。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

首先对土壤样品进行前处理，再测定土壤含水量，然后称取土壤加无菌水制备土壤悬浮液，再用经灭菌的电动移液器将土壤悬浮液进行稀释，然后分别经灭菌的电动移液器取适宜稀释度的土壤悬浮液于平板培养基中，涂抹后进行培养，然后计数培养后平板培养基上的菌落数，再计算出土壤可培养微生物数量。

一种土壤微生物数量精确测定的方法，其步骤是：

（1）土壤前处理：去除土壤样品中可见的植物残体（根、茎、叶等）和动物以及小石子，再将土壤样品彻底混合均匀。

（2）测定土壤含水量：先将铝盒放在烘箱中于103℃下烘干8–10小时，取出铝盒置于下部放有部分干燥硅胶（硅胶CAS112926-00-8）的干燥器中冷却至室温（20–25℃），称量铝盒重量，取10–20克新鲜土壤样品放入上述烘干后的铝盒中，称量新鲜土壤+铝盒的重量，将其放入烘箱中在103℃下烘干20–24小时，取出置于上述干燥器中冷却至室温（20–25℃），然后称量烘干土壤+铝盒的重量。采样下列公式计算土壤含水量：

土壤含水量（%）= [（新鲜土壤+铝盒）（g）– 铝盒（g）] / [（烘干土壤+铝盒）（g）– 铝盒（g）] ′ 100%。

（3）土壤悬浮液制备：称取相当于10克烘干重的上述新鲜土壤样品，置于经灭菌（121℃，30分钟）的250–325毫升乐扣杯中，再加入经灭菌的直径为0.5厘米的玻璃珠5–7粒，然后加入无菌水，使加入的无菌水与土壤中水之和为90毫升。将装有土壤悬浮液的乐扣杯置于振荡器中震荡，使土壤彻底分散。即得到10^-1土壤悬浮液。

（4）土壤悬浮液稀释：用经灭菌的电动移液器按10倍稀释法将上述土壤悬浮液依次稀释成10^-2–10^-6土壤悬浮液。

（5）培养基配制：分别配置土壤可培养细菌培养基和土壤可培养真菌培养基，将培养基在121℃下灭菌30分钟，冷却至40-50℃后，在细菌培养基中加入真菌抑制剂放线菌酮（Sigma公司产），真菌培养基中加入细菌抑制剂四环素和链霉素硫酸盐（Amresco公司产）。然后将培养基倒入培养皿中制备平板培养基。

（6）接种与培养：用经灭菌的电动移液器分别取上述10^-3–10^-6土壤悬浮液0.1毫升，置于土壤可培养细菌培养基或土壤可培养真菌培养基中，每个稀释度重复3–4次，用经酒精灯火焰灭菌的刮铲将培养基表面悬浮液涂抹均匀，置于25–30℃下培养2–4天。

（7）计数与计算：选择培养皿中生长的菌落数为20–100个菌落的稀释度进行计数。采用下列公式计算土壤可培养细菌或真菌：

土壤可培养细菌或土壤可培养真菌（cfu/克）=（菌落平均数 ′ 稀释倍数 ′ 10）/ 土样烘干质量。其中，“10”为换算系数，即将0.1毫升悬土壤浮液换算为1.0毫升。

用于实现本发明土壤可培养细菌和真菌数量精确测定的培养基配方：

（1）土壤可培养细菌培养基：牛肉膏10克、蛋白胨3克、氯化钠5克、琼脂20克、水1升，灭菌（121℃，30分钟）后加入放线菌酮200–300毫克/升。

（2）土壤可培养真菌培养基：硝酸钠660毫克、磷酸二氢钾330毫克、硫酸镁165毫克、硫酸亚铁6.6毫克、酵母膏165毫克、蔗糖10克、琼脂20克、水1升，灭菌（121℃，30分钟）后加入链霉素硫酸盐200–300毫克/升和四环素10–15毫克/升。

本发明具有以下优点：

1.      使用本发明土壤可培养微生物数量精确测定的方法，测定的土壤可培养细菌和真菌等数量的结果不仅精密度和准确度高，而且重复性好，测定结果变异系数（CV）范围为0.2%–5.4%。

2.      本发明的土壤可培养微生物数量精确测定的方法，排除了土壤水分导致测定结果偏低的影响，提高了测定准确性。

3.      本发明的土壤可培养微生物数量精确测定的方法，排除了操作过程人为因素的影响，操作简便、快速。土壤悬浮液稀释和稀释液取样误差降低到1.0%–2.0%，操作速度提高2–3倍。技术要求相对较低，适合大批量样品的分析测定。

4.      本发明的土壤可培养微生物数量精确测定的方法，排除了土壤细菌和真菌测定时相互影响，不需对细菌和真菌菌落进行显微镜判别，提高了测定速度和结果准确性。

5.      实用性广，适合于旱地土壤、淹水稻田土壤、污泥以及食品中等各种可培养微生物数量精确测定中应用。

附图说明

图1为一种土壤可培养微生物数量精确测定的方法的流程图。

图2为一种添加稻草和选择性抑菌剂对旱地土壤可培养细菌数量的影响示意图。

图3为一种添加稻草和选择性抑菌剂对旱地土壤可培养真菌数量的影响示意图。

图4为一种添加稻草和选择性抑菌剂对稻田土壤可培养细菌数量的影响示意图。

图5为一种添加稻草和选择性抑菌剂对稻田土壤可培养真菌数量的影响示意图。

具体实施方式

一种土壤可培养微生物数量精确测定的方法，包括下列步骤：

（1）土壤前处理1：对于测定土壤可培养微生物数量的样品，应在晴天从田间采样，采用时用直接为2厘米的土钻采9–11钻表层（0.1–20厘米）土壤。采集的土壤应先去除样品中可见的植物残体（根、茎、叶等）和动物以及小石子，再将土壤样品彻底混合均匀。旱地土壤也可过孔径2毫米的筛后再混合，淹水稻田土壤可放入1–2升的烧杯中混合。

（2）测定土壤含水量2：先将铝盒放在烘箱中于103℃下烘干8或9或10小时，取出铝盒置于下部放有部分干燥硅胶的干燥器中冷却至室温（20–25℃，以下相同），称量铝盒重量，取10–20克新鲜土壤样品放入上述烘干后的铝盒中，称量新鲜土壤+铝盒的重量，将其放入烘箱中在103℃下烘干20或21或22或23或24小时，取出置于上述干燥器中冷却至室温（20–25℃），然后称量烘干土壤+铝盒的重量。每个土壤重复3–4次。采样下列公式计算土壤含水量：

土壤含水量（%）= [（新鲜土壤+铝盒）（g）– 铝盒（g）] / [（烘干土壤+铝盒）（g）– 铝盒（g）] ′ 100%。

例如：测定某旱地土壤的含水量，铝盒重量为12.88克，新鲜土壤+铝盒重量为23.03克，烘干土壤+铝盒重量为21.12克。那么，该土壤的含水量=（23.03–12.88）/（21.12–12.88）′ 100% = 18.82%，即每100克新鲜土壤中含有18.82克水分。

通常旱地土壤含水量为12%–22%，淹水稻田土壤含水量为40%–55%。若不测定土壤含水量，在制备土壤悬浮液时不考虑土壤中的水分，将使土壤悬浮液的稀释度升高，导致测定的土壤微生物数量结果偏低，影响测定结果的准确性。本发明在土壤悬浮液制备时，通过测定的土壤含水量，准确计算出相当于10克烘干重的新鲜土壤中的水分量，使加入的无菌水量与土壤中水分量之和为90.0毫升，从而得到准确的10^-1土壤悬浮液。

（3）土壤悬浮液制备3：称取相当于10克烘干重的上述新鲜土壤样品，在无菌工作台上，将土壤置于经灭菌（121℃，30分钟）的250–325毫升乐扣杯中，再加入经灭菌的直径为0.5厘米的玻璃珠5–7粒，然后用经灭菌（121℃，30分钟）的瓶口分液器（Socorex Calibrex 521，10–100毫升，瑞士产）加入无菌水，使加入的无菌水与土壤中水之和为90.0毫升。将装有土壤悬浮液的乐扣杯盖紧后置于振荡器中，在100转/分钟下震荡30分钟，使土壤彻底分散。即得到10^-1土壤悬浮液。例如：采用上述含水量为18.82%的土壤制备悬浮液时，应称取12.32克新鲜土壤，再加入87.68毫升无菌水，即得到准确的10^-1土壤悬浮液。

（4）土壤悬浮液稀释4：用瓶口分液器（Socorex Calibrex 521，2–20毫升，瑞士产）在长为10–12厘米、口径为2厘米的试管中加水9.00毫升，塞棉塞于试管口，再在121℃下灭菌30分钟。在无菌工作台上，用经灭菌（121℃，30分钟）的电动移液器（BIOHIT eLINE，50–1200微升，芬兰产）从混合均匀的上述10^-1土壤悬浮液中取1.00毫升，加入上述含有9.00毫升无菌水的试管中，混合均匀，即得到10^-2土壤悬浮液。再按上述相同方法从混合均匀的10^-2土壤悬浮液中取1.00毫升，加入上述含有9.00毫升无菌水的试管中，混合均匀，即得到10^-3土壤悬浮液；依次类推，即可得到10^-4、10^-5和10^-6土壤悬浮液。采用该方法进行土壤悬浮液稀释，不仅使可使稀释过程中的取样误差降低到1.0%–2.0%，提高土壤悬浮液稀释液的准确性，而且操作速度提高2–3倍。

（5）培养基配制5：土壤可培养细菌培养基配制：称取牛肉膏10克、蛋白胨3克、氯化钠5克、琼脂20克于2升烧杯中，加水1升，边加热边搅拌煮沸，使试剂溶化，然后将培养基分装至500毫升三角瓶中，每瓶装培养基200–250毫升，在瓶口加塞棉塞，将装有培养基的三角瓶置于高压灭菌锅中，在121℃温度灭菌30分钟。取出灭菌后的培养基冷却至40–50℃时，再将培养基置于无菌工作台上，加入放线菌酮200–300毫克/升。土壤可培养真菌培养基配制：称取硝酸钠660毫克、磷酸二氢钾330毫克、硫酸镁165毫克、硫酸亚铁6.6毫克、酵母膏165毫克、蔗糖10克、琼脂20克于2升烧杯中，加入水升，按上述相同方法进行培养基分装、灭菌，灭菌后的培养基冷却至40–50℃时，再将培养基置于无菌工作台上，加入加入链霉素硫酸盐200–300毫克/升和四环素10–15毫克/升。然后在无菌工作台上，将上述细菌和真菌培养基分别倒入经灭菌（121℃，30–60分钟）的直径为9厘米的培养皿中，每个培养皿倒入培养基15–20毫升。即可分别得到细菌和真菌平板培养基。

（6）接种与培养6：用经灭菌（121℃，30分钟）的电动移液器（BIOHIT eLINE，5–300微升，芬兰产）分别取上述10^-4–10^-6或者10^-3–10^-5土壤悬浮液0.1毫升，分别接种到土壤可培养细菌培养基或者土壤可培养真菌培养基中，每个稀释度重复3–4次，用经酒精灯火焰灭菌的刮铲将培养基表面悬浮液涂抹均匀，置于25–30℃下培养2–4天。采用该方法进行土壤悬浮液接种，可使取样误差降低到1.0%–2.0%，提高测定准确性，降低测定误差；操作速度提高3–5倍，适合于大批量样品测定。

（7）计数与计算7：选择培养皿中生长的菌落数为20–100个菌落的稀释度进行计数。采用下列公式计算土壤可培养细菌或真菌数量：

土壤可培养细菌或土壤可培养真菌（cfu/克）=（菌落平均数 ′ 稀释倍数 ′ 10）/ 土样烘干质量。其中，“10”为换算系数，即将0.1毫升悬土壤浮液换算为1.0毫升。

例如：某土壤细菌数量测定时，称取相当于10克烘干重的新鲜土壤制备土壤悬浮液，并按上述方法进行系列稀释，然后选择10^-5土壤悬浮液取0.1毫升接种到平板培养基中，培养后，在培养皿中行成的细菌菌落数为82个。那么，该土壤的细菌数量 =（82 ′ 10⁵ ′ 10）/ 10 = 8.2 ′ 10⁶ cfu/克。

以下是有关添加稻草和选择性抑菌剂对红壤稻田和旱地土壤可培养微生物影响效果比较试验：

（1）土壤采集和处理

取红壤旱地和稻田表层（0–20厘米）土壤，除去其中可见动植物残体，过筛（孔径<2毫米），混匀，用去离子水调节土壤含水量至饱和持水量的40%，置密封的塑料桶内，在25℃黑暗条件下预培养7–10天，桶内放适量水以保持相对湿度为100%，并在桶内放1小杯1摩尔/升NaOH溶液以吸收土壤呼吸产生的CO₂，经预培养后的新鲜土壤用于培养试验。

（2）稻草制备及选择性抑菌剂

收集晒干的稻草置45℃下烘干，粉碎后过60目筛，密封保存备用。

真菌抑制剂放线菌酮（纯度>94%，Sigma公司产），细菌抑制剂四环素（干基效力> 900 微克/毫克）和链霉素硫酸盐（干基效力650 ~ 850单位/毫克），均由Amresco公司产。

（3）试验处理

稻田和旱地土壤均设4个处理：对照（CK；不添加稻草和抑制剂）、添加稻草（T1）、稻草+放线菌酮（T2）和稻草+四环素+链霉素硫酸盐（T3），每个处理4次重复。取经预培养的相当于500克烘干土重的新鲜土样16份，稻草添加量按碳5000毫克/公斤，直接与土样彻底混匀；选择性抑制剂加入量为放线菌酮200毫克/公斤、链霉素硫酸盐200毫克/公斤、四环素10毫克/公斤，分别配成溶液加入土样中。各处理用1%（重量比）硫酸铵溶液补充至氮50毫克/公斤，用蒸馏水调节旱地土壤含水量至饱和持水量的45%、稻田土壤含水量至饱和持水量的105%，分别装入1升塑料杯中，再置于50升塑料桶（底部加少量水以保持100%湿度、并放置1小杯1摩尔/升NaOH溶液吸收CO₂），密封后置于25 ± 1℃、黑暗条件下培养45天，每3天通风换气1次以保证土壤微生物生长所需充足的氧气。分别于培养的第0、6、12、18、24、30 和45天取样，采用本发明的方法测定土壤可培养细菌和真菌数量。

（4）测定结果阐述

测定结果表明，对于旱地土壤，整个培养期间（45天）测定的各处理土壤细菌数量的变异系数（CV）为0.2%–4.5%，各处理土壤真菌数量的变异系数（CV）为0.3%–5.0%（图2、图3）。这阐明该本发明方法测定土壤细菌和真菌数量的精确度高和重复性好。对照处理（CK）由于没有添加外源底物和抑菌剂，理论上每次测定的结果应该是相同的，实际测定结果表明在整个培养期间（45天）7次测定的旱地土壤细菌数量和真菌数量的变异系数（CV）分别为1.7%和5.0%（图2、图3）。阐明本发明方法测定的旱地土壤细菌和真菌数量的准确性好，且系统误差小。

对于稻田土壤，整个培养期间（45天）测定的各处理土壤细菌数量的变异系数（CV）为0.3%–4.8%，各处理土壤真菌数量的变异系数（CV）为0.5%–5.4%（图4、图5）。这阐明该本发明方法测定土壤细菌和真菌数量的精确度高和重复性好。对照处理（CK）由于没有添加外源底物和抑菌剂，理论上当土壤含水量保持不变时，每次测定的结果应该是相同的；实际测定结果表明，当土壤含水量由饱和持水量的45%改变为105%时，土壤细菌和真菌数量略有下降，采用培养第6–45天期间6次测定的稻田土壤细菌数量和真菌数量的变异系数分别为0.5%和5.4%（图4、图5）。阐明本发明方法也可用于测定的稻田土壤细菌和真菌数量，且准确性好，系统误差小。

由于本发明方法测定的结果误差小、精确度高，可用于研究添加稻草和选择性抑菌剂各处土壤细菌和真菌数量的变化。试验结果表明，旱地土壤中添加稻草处理土壤细菌和真菌数量比对照（CK）均显著提高，但真菌的增加比例远大于细菌，说明细菌和真菌均参与土壤中稻草的分解和转化，而真菌起主要作用。稻田土壤中，添加稻草处理土壤细菌数量比对照（CK）显著提高，而土壤真菌数量明显下降，说明在淹水稻田土壤中稻草分解和转化的主要微生物为细菌，土壤细菌的大量繁殖可抑制土壤真菌。

Claims (3)

1.一种土壤微生物数量精确测定的方法，其步骤是：

（1）土壤前处理：去除土壤样品中的植物残体和动物以及小石子，再将土壤样品混合均匀；

（2）测定土壤含水量：先将铝盒放在烘箱中于103℃下烘干8–10小时，取出铝盒置于下部放有部分干燥硅胶的干燥器中冷却至室温，称量铝盒重量，取10–20克新鲜土壤样品放入上述烘干后的铝盒中，称量新鲜土壤+铝盒的重量，将其放入烘箱中在103℃下烘干20–24小时，取出置于上述干燥器中冷却至室温，然后称量烘干土壤+铝盒的重量，采样下列公式计算土壤含水量：

土壤含水量%= 新鲜土壤+铝盒g– 铝盒g/ 烘干土壤+铝盒g– 铝盒g′ 100%；

（3）土壤悬浮液制备：称取10克烘干重的上述新鲜土壤样品，置于经灭菌的250–325毫升乐扣杯中，再加入经灭菌的直径为0.5厘米的玻璃珠5–7粒，然后加入无菌水，使加入的无菌水与土壤中水之和为90毫升，将装有土壤悬浮液的乐扣杯置于振荡器中震荡，使土壤分散，即得到10^-1土壤悬浮液；

（4）土壤悬浮液稀释：用经灭菌的电动移液器按10倍稀释法将上述土壤悬浮液依次稀释成10^-2–10^-6土壤悬浮液；

（5）培养基配制：分别配置土壤可培养细菌培养基和土壤可培养真菌培养基，将培养基在121℃下灭菌30分钟，冷却至40-50℃后，在细菌培养基中加入真菌抑制剂，真菌培养基中加入细菌抑制剂，然后将培养基倒入培养皿中制备平板培养基；

（6）接种与培养：用经灭菌的电动移液器分别取上述10^-3–10^-6土壤悬浮液0.1毫升，置于土壤可培养细菌培养基或土壤可培养真菌培养基中，每个稀释度重复3–4次，用经酒精灯火焰灭菌的刮铲将培养基表面悬浮液涂抹均匀，置于25–30℃下培养2–4天；

（7）计数与计算：选择培养皿中生长的菌落数为20–100个菌落的稀释度进行计数，采用下列公式计算土壤可培养细菌或真菌：

土壤可培养细菌或土壤可培养真菌（cfu/克）=（菌落平均数 ′ 稀释倍数 ′ 10）/ 土样烘干质量；其中，“10”为换算系数，即将0.1毫升悬土壤浮液换算为1.0毫升。

2.根据权利要求1所述的一种土壤可培养微生物数量精确测定的方法，所述的土壤可培养细菌培养基：牛肉膏10克、蛋白胨3克、氯化钠5克、琼脂20克、水1升，灭菌121℃，30分钟后加入放线菌酮200–300毫克/升。

3.根据权利要求1所述的一种土壤可培养微生物数量精确测定的方法，所述的土壤可培养真菌培养基：硝酸钠660毫克、磷酸二氢钾330毫克、硫酸镁165毫克、硫酸亚铁6.6毫克、酵母膏165毫克、蔗糖10克、琼脂20克、水1升，灭菌121℃，30分钟后加入链霉素硫酸盐200–300毫克/升和四环素10–15毫克/升。

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