CN117417975A - 一种设置土壤微生物多样性梯度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，具体公开了一种设置土壤微生物多样性梯度的方法，包括如下步骤：采集新鲜土壤样品记为原生境土壤样品；分别利用原生境土壤样品制备得到无菌土壤和土壤接种原液；无菌水稀释土壤接种原液，获得不同稀释倍数的原生境土壤稀释液；将不同稀释倍数的原生境土壤稀释液分别接种至无菌土壤中，均质后获得不同梯度的预培养土壤；将不同梯度的预培养土壤于20‑26℃黑暗培养6‑9周。本发明提供的方法能够消除土壤稀释对土壤中微生物群落丰度的影响，明确土壤稀释对土壤微生物多样性的影响，操作简便、快捷。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种设置土壤微生物多样性梯度的方法。
背景技术
土壤是生物多样性最丰富的场所，一克土壤可能含有多达100亿种微生物，数万种不同的物种。土壤微生物多样性可以分为遗传多样性、功能多样性、结构多样性和物种多样性。有研究表明土壤微生物多样性降低会影响生态系统功能，降低生态系统的抵抗力。全球气候变化和人为活动降低土壤微生物群落的丰度和多样性。要研究土壤微生物多样性对生态系统功能的影响，必须以存在不同土壤微生物多样性差异的土壤为研究对象，且这些研究对象中的土壤微生物多样性之间有一定的规律才能达到研究目的。
因此，如何人为设置土壤之间仅存在土壤微生物多样性差异是亟待解决的问题。
发明内容
为人为设置土壤的土壤微生物多样性差异，本发明提供了一种设置土壤微生物多样性梯度的方法，本发明的方法能够消除土壤稀释对原生境土壤中微生物群落丰度的影响，通过测定培养后原生境土壤微生物丰度及多样性，为后续研究土壤多样性降低对生态系统抵抗力提供技术支持。
本发明提供了一种设置土壤微生物多样性梯度的方法，包括如下步骤：
采集新鲜土壤样品记为原生境土壤样品；
分别利用原生境土壤样品制备得到无菌土壤和土壤接种原液；
无菌水稀释土壤接种原液，获得不同稀释倍数的原生境土壤稀释液；
将不同稀释倍数的原生境土壤稀释液分别接种至无菌土壤中，均质后获得不同梯度的的预培养土壤；
将不同梯度的预培养土壤于20-26℃黑暗培养6-9周。
进一步地，所述无菌土壤制备过程为：取原生境土壤样品灭菌得无菌土壤。
进一步地，所述灭菌方式为高压灭菌。
进一步地，所述土壤接种原液制备过程为：取原生境土壤样品与无菌水混合制备土壤接种原液。
进一步地，所述原生境土壤样品与无菌水用量比为100g:200-500mL。
进一步地，所述原生境土壤样品与无菌水用量比为100g:300mL。
进一步地，所述的不同稀释倍数的原生境土壤稀释液指：稀释倍数分别为100、101、102、104、106的原生境土壤稀释液。
进一步地，所述预培养土壤制备过程中所述原生境土壤稀释液与无菌土壤混合的用量比为1mL：8-10g。
进一步地，黑暗培养温度为20-24℃，培养时间为6-8周。
进一步地，培养期间保持土壤60-65％的田间持水量。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、通过本发明的方法发现，恒温黑暗培养后获得不同稀释梯度的细菌和真菌丰度无显著差异；恒温黑暗培养后获得的土壤细菌和真菌多样性随稀释倍数的增加均显著下降。因此，本发明的方法能够消除土壤稀释对原生境土壤中微生物群落丰度的影响，明确土壤稀释对土壤微生物多样性的影响。
2、本发明提供了一种设置土壤微生物多样性的方法，能够消除土壤稀释对原生境土壤中微生物群落丰度的影响。本发明的提供的方法耗时短，只需8周，操作简便、快捷。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一个或多个实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的设置土壤微生物多样性梯度的方法的操作流程图。
图2为本发明实施例1恒温黑暗培养后不同稀释梯度的细菌和真菌的丰度差异；
图中，A为不同稀释梯度的细菌的丰度差异；
B为不同稀释梯度的真菌的丰度差异；
D0、D1、D2、D4、D6分别表示恒温黑暗培养后稀释梯度为100、101、102、104和106的土壤。
图3为本发明实施例1恒温黑暗培养后不同性梯度的土壤的细菌和真菌多样性变化；
图中，A-D依次表示微生物ASVs、Chao指数、Ace指数和Shannon指数；
左图表示微生物为细菌，右图表示微生物为真菌；
D0、D1、D2、D4、D6分别表示恒温黑暗培养后稀释梯度为100、101、102、104和106的土壤。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明提供了一种设置土壤微生物多样性梯度的方法，包括以下步骤：
采集新鲜土壤样品记为原生境土壤样品，分两份备用；
取一份原生境土壤样品，灭菌得无菌土壤；
另一份原生境土壤样品与无菌水混合制备土壤接种原液，无菌水稀释土壤接种原液，获得不同稀释倍数的原生境土壤稀释液；
将不同稀释倍数的原生境土壤稀释液分别接种至无菌土壤中，均质后获得不同微生物梯度的预培养土壤；
将预培养土壤于恒温培养箱中黑暗培养；
观测不同微生物梯度培养后土壤微生物丰度和多样性。
在本发明中，将原生境土壤灭菌，得到无菌土壤。所述土壤优选为没有使用过化肥和农药的表层草原土壤，所述采集的方式优选为通过灭菌土钻采集。采集草原土壤后，将土样装于自封袋中，置于4℃冰箱储存。将采集的土壤样品过1.5-2.5mm的筛子，更优选为过2mm的筛子，过筛后，去除植物残体和石块，土壤充分混合后，得到原生境土壤样品。所述无菌土壤通过高压灭菌得到无菌土壤，高压灭菌锅优选设置温度为121℃，设置时间为20min，高压灭菌会改变土壤的物理和化学性质，其副作用会对我们的结果产生轻微影响，但实验过程中所有土壤均采用相同方式进行灭菌，因此忽略高压灭菌对土壤产生的副作用。
在本发明中，将原生境土壤样品与无菌水混合得到土壤接种原液，所述土壤接种原液由新鲜的原生境土壤样品与无菌水按照100g:200-500mL混合制备，更优选为原生境土壤样品与无菌水按照100g:300mL混合制备。所述将土壤接种原液与无菌水混合稀释，梯度稀释倍数为100、101、102、104、106倍，得到不同稀释倍数的原生境土壤稀释液。
本发明中，不同稀释倍数的原生境土壤稀释液与无菌土壤混合的用量比为1mL：8-10g，更优选为原生境土壤梯度稀释液与无菌土壤混合的用量比为1mL：10g。
本发明中，将预培养梯度土壤置于培养箱中，恒温黑暗无菌培养，培养温度为20-24℃，培养时间为6-8周，培养期间保持土壤60-65％的田间持水量，更优选为培养温度20℃，培养8周，培养期间保持土壤60％的田间持水量。
实施例1：一种设置土壤微生物多样性梯度的方法。
一种设置土壤微生物多样性梯度的方法，包括如下步骤：
(1)选择没有使用过化肥和农药的草原土壤，使用灭菌土钻采集表层土壤，采集深度为0～10cm，共随机选择20个点，将土壤样品装入自封袋中，记为原生境土壤样品，并置于4℃冰箱保存；
(2)将采集的原生境土壤样品过2mm筛网，去除植物残体和石块等杂质，并分成两份，一份用于灭菌得到无菌土壤，另一份用于制备土壤接种原液；
a.称取15份质量为500g的原生境土壤样品分别装入灭菌袋中，高压灭菌锅设置121℃，灭菌20min，得到无菌土壤；
b.称取100g原生境土壤样品与300mL无菌水充分混合，静置1min后，取上层土壤悬浊液得到土壤接种原液；
(3)使用无菌水稀释土壤接种原液，稀释梯度为100、101、102、103和106倍，得到不同稀释倍数的原生境土壤稀释液；
(4)不同稀释倍数的原生境土壤稀释液按照1mL：10g的比例分别接种到无菌土壤中，上下翻转30次达到均质，得到不同梯度的预培养梯度土壤；
(5)所有不同梯度的预培养梯度土壤容器采用无菌棉花和橡皮筋封闭，培养箱中20℃恒温黑暗培养8周，培养期间保持土壤60％的田间持水量，每周摇晃容器使微生物均质，不同梯度的预培养梯度土壤培养后分别记为D0、D1、D2、D4和D6(依次对应100、101、102、103和106稀释倍数)。
培养结束后，通过实时荧光定量PCR测定D0、D1、D2、D4和D6土壤细菌和真菌的丰度，Illumina MiSeq高通量测序测定土壤细菌和真菌群落多样性。
实施例2：一种设置土壤微生物多样性梯度的方法。
(1)选择没有使用过化肥和农药的草原土壤，使用灭菌土钻采集表层土壤，采集深度为0～10cm，共随机选择20个点，将土壤样品装入自封袋中，记为原生境土壤样品，并置于4℃冰箱保存；
(2)将采集的原生境土壤样品过2mm筛网，去除植物残体和石块等杂质，并分成两份，一份用于灭菌得到无菌土壤，另一份用于制备土壤接种原液；
a.称取15份质量为500g的原生境土壤样品分别装入灭菌袋中，高压灭菌锅设置121℃，灭菌20min，得到无菌土壤；
b.称取100g原生境土壤样品与200mL无菌水充分混合，静置1min后，取上层土壤悬浊液得到土壤接种原液；
(3)使用无菌水稀释土壤接种原液，稀释梯度为100、101、102、103和106倍，得到不同稀释倍数的原生境土壤稀释液；
(4)不同稀释倍数的原生境土壤稀释液按照1mL：10g的比例分别接种到无菌土壤中，上下翻转30次达到均质，得到不同梯度的预培养梯度土壤；
(5)所有不同梯度的预培养梯度土壤容器采用无菌棉花和橡皮筋封闭，培养箱中20℃恒温黑暗培养6周，培养期间保持土壤65％的田间持水量，每周摇晃容器使微生物均质，不同梯度的预培养梯度土壤培养后分别记为D0、D1、D2、D4和D6(依次对应100、101、102、103和106稀释倍数)；
培养结束后，通过实时荧光定量PCR测定D0、D1、D2、D4和D6土壤细菌和真菌的丰度，Illumina MiSeq高通量测序测定土壤细菌和真菌群落多样性。
实施例3：一种设置土壤微生物多样性梯度的方法。
(1)选择没有使用过化肥和农药的草原土壤，使用灭菌土钻采集表层土壤，采集深度为0～10cm，共随机选择20个点，将土壤样品装入自封袋中，记为原生境土壤样品，并置于4℃冰箱保存；
(2)将采集的原生境土壤样品过2mm筛网，去除植物残体和石块等杂质，并分成两份，一份用于灭菌得到无菌土壤，另一份用于制备土壤接种原液；
a.称取15份质量为500g的原生境土壤样品分别装入灭菌袋中，高压灭菌锅设置121℃，灭菌20min，得到无菌土壤；
b.称取100g原生境土壤样品与400mL无菌水充分混合，静置1min后，取上层土壤悬浊液得到土壤接种原液；
(3)使用无菌水稀释土壤接种原液，稀释梯度为100、101、102、103和106倍，得到不同稀释倍数的原生境土壤稀释液；
(4)不同稀释倍数的原生境土壤稀释液按照1mL：10g的比例分别接种到无菌土壤中，上下翻转30次达到均质，得到不同梯度的预培养梯度土壤；
(5)所有不同梯度的预培养梯度土壤容器采用无菌棉花和橡皮筋封闭，培养箱中24℃恒温黑暗培养8周，培养期间保持土壤60％的田间持水量，每周摇晃容器使微生物均质，不同梯度的预培养梯度土壤培养后分别记为D0、D1、D2、D4和D6(依次对应100、101、102、103和106稀释倍数)；
培养结束后，通过实时荧光定量PCR测定D0、D1、D2、D4和D6土壤细菌和真菌的丰度，Illumina MiSeq高通量测序测定土壤细菌和真菌群落多样性。
实施例4
一种设置土壤微生物多样性梯度的方法。
(1)选择没有使用过化肥和农药的草原土壤，使用灭菌土钻采集表层土壤，采集深度为0～10cm，共随机选择20个点，将土壤样品装入自封袋中，记为原生境土壤样品，并置于4℃冰箱保存；
(2)将采集的原生境土壤样品过2mm筛网，去除植物残体和石块等杂质，并分成两份，一份用于灭菌得到无菌土壤，另一份用于制备土壤接种原液；
a.称取15份质量为500g的原生境土壤样品分别装入灭菌袋中，高压灭菌锅设置121℃，灭菌20min，得到无菌土壤；
b.称取100g原生境土壤样品与500mL无菌水充分混合，静置1min后，取上层土壤悬浊液得到土壤接种原液；
(3)使用无菌水稀释土壤接种原液，稀释梯度为100、101、102、103和106倍，得到不同稀释倍数的原生境土壤稀释液；
(4)不同稀释倍数的原生境土壤稀释液按照1mL：10g的比例分别接种到无菌土壤中，上下翻转30次达到均质，得到不同梯度的预培养梯度土壤；
(5)所有不同梯度的预培养梯度土壤容器采用无菌棉花和橡皮筋封闭，培养箱中24℃恒温黑暗培养8周，培养期间保持土壤65％的田间持水量，每周摇晃容器使微生物均质，不同梯度的预培养梯度土壤培养后分别记为D0、D1、D2、D4和D6(依次对应100、101、102、103和106稀释倍数)；
培养结束后，通过实时荧光定量PCR测定D0、D1、D2、D4和D6土壤细菌和真菌的丰度，Illumina MiSeq高通量测序测定土壤细菌和真菌群落多样性。
以上实施例1-4获得的分析结果基本一致，以下以实施例1为例进行详细的阐述。
将实施例1中培养结束后，通过荧光定量PCR测定D0、D1、D2、D4和D6土壤细菌和真菌的丰度，采用高通量测序方法测定细菌和真菌的多样性。
具体如下：
荧光定量PCR使用引物338F/806R和ITS4/ITS5通过SYBR Green I检测(PowerqPCR PreMix)分别检测细菌16S rRNA基因和真菌ITS区域。扩增细菌的16S rRNA基因通过引物515F/806R进行扩增；真菌ITS1区域通过引物对ITS1F/ITS2-2043R进行扩增。扩增产物送至上海美吉生物医药有限公司，采用Illumina MiSeq测序平台进行高通量测序。
使用DADA2软件包对获得的原始序列进行处理，即对llumina测序过程中的错误序列进行建模和校正，具体操作如下：(i)使用cutadapt软件修剪原始数据中的正反向序列，去除重复序列，过滤测序质量较差的序列：(ii)使用learnErrors函数了解测序过程中引入的错误；(iii)通过mergePairs软件合并正反序列中的重叠区域。去除嵌合体后，得到更高分辨率的扩增子序列变体(amplicon sequence variants,ASVs)。基于Naive Bayesian分类器，细菌ASVs序列与SILVA 138数据库对比，真菌ASVs序列与UNITE 8数据库对比，获得每个ASV的代表序列的分类信息。细菌和真菌群落分析基于获得的ASVs数据进行。
结果如图2所示，实施例1经过恒温黑暗培养后获得D0、D1、D2、D4和D6土壤的细菌丰度无显著差异。经过恒温黑暗培养后获得D0、D1、D2、D4和D6土壤的真菌丰度也无显著差异。
如图3所示，实施例1经过恒温黑暗培养后获得D0、D1、D2、D4和D6土壤的细菌多样性随稀释倍数的增加显著下降。恒温黑暗培养后获得D0、D1、D2、D4和D6土壤的真菌多样性随稀释倍数的增加显著下降。说明本发明提供的设置微生物多样性梯度方法能够消除土壤稀释对原生境土壤中微生物群落丰度的影响，明确土壤稀释对土壤微生物多样性的影响。
综上所述，恒温黑暗培养后获得不同稀释梯度的细菌和真菌丰度无显著差异。恒温黑暗培养后获得的土壤细菌和真菌多样性随稀释倍数的增加均显著下降。因此，本发明的方法能够消除土壤稀释对原生境土壤中微生物群落丰度的影响，明确土壤稀释对土壤微生物多样性的影响。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种设置土壤微生物多样性梯度的方法，其特征在于，包括如下步骤：
采集新鲜土壤样品记为原生境土壤样品；
分别利用原生境土壤样品制备得到无菌土壤和土壤接种原液；
无菌水稀释土壤接种原液，获得不同稀释倍数的原生境土壤稀释液；
将不同稀释倍数的原生境土壤稀释液分别接种至无菌土壤中，均质后获得不同梯度的预培养土壤；
将不同梯度的预培养土壤于20-26℃黑暗培养6-9周。
2.根据权利要求1所述的设置土壤微生物多样性梯度的方法，其特征在于，所述无菌土壤制备过程为：取原生境土壤样品灭菌得无菌土壤。
3.根据权利要求2所述的设置土壤微生物多样性梯度的方法，其特征在于，所述灭菌方式为高压灭菌。
4.根据权利要求1所述的设置土壤微生物多样性梯度的方法，其特征在于，所述土壤接种原液制备过程为：取原生境土壤样品与无菌水混合制备土壤接种原液。
5.根据权利要求4所述的设置土壤微生物多样性梯度的方法，其特征在于，所述原生境土壤样品与无菌水用量比为100g:200-500mL。
6.根据权利要求5所述的设置土壤微生物多样性梯度的方法，其特征在于，所述原生境土壤样品与无菌水用量比为100g:300mL。
7.根据权利要求1所述的设置土壤微生物多样性梯度的方法，其特征在于，所述的不同稀释倍数的原生境土壤稀释液指：稀释倍数分别为100、101、102、104、106的原生境土壤稀释液。
8.根据权利要求1所述的设置土壤微生物多样性梯度的方法，其特征在于，所述预培养土壤制备过程中所述原生境土壤稀释液与无菌土壤混合的用量比为1mL：8-10g。
9.根据权利要求1所述的设置土壤微生物多样性梯度的方法，其特征在于，黑暗培养温度为20-24℃，培养时间为6-8周。
10.根据权利要求1所述的设置土壤微生物多样性梯度的方法，其特征在于，培养期间保持土壤60-65％的田间持水量。
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-
2023
- 2023-10-23 CN CN202311375183.0A patent/CN117417975A/zh active Pending
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