CN104630103A

CN104630103A - 一种微生物菌剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN104630103A
Application number: CN201510047518.5A
Authority: CN
Inventors: 张永军
Original assignee: Shenzhen Runtian Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Runtian Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2015-01-29
Filing date: 2015-01-29
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2035-01-29
Also published as: CN104630103B

Abstract

本发明公开了一种微生物菌剂及其制备方法和应用，所述微生物菌剂含有解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZD0531，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2014345。本发明的微生物菌剂，以解淀粉芽孢杆菌为活性成分，能够显著提高作物产量，该微生物菌剂的制备方法简单，易于大规模推广应用。

Description

一种微生物菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及农用微生物技术领域，尤其涉及一种微生物菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

改革开放以来，我国农业有了长足的发展。化学肥料的应用给我国的粮食生产带来了空前的丰收，由改革开放初期的亩产500-600斤增加到现在的亩产1000斤以上，使拥有十三亿多人口的中国解决了温饱问题，人民生活有了保障。化肥在农业增产中起了主要作用，我国有十八亿亩耕地，每年消耗逾1.5亿吨化肥。化肥的大量施用，对环境造成严重污染，耕地大面积盐渍化，土壤板结严重，使得产量下降。为了增产，农民加倍施用化肥，形成了恶性循环。很多地区的瓜果、蔬菜、药材大面积严重污染，很多出口导向型产品如山东蔬菜、云南田七、江西脐橙、广东火龙果和荔枝等我国优势农产品，因产品品质、农药残留超标等问题，而无法出口创汇，直接造成数十亿元的经济损失。为了解决这种问题，国家有关部门通过各项有关政策，引导企业、院校加大研发力度。

自2008年以来，国家对与微生物肥料相关的生物产业进行了有史以来力度最大、涉及面最广的国家政策和产业化专项扶持，为我国微生物肥料的发展提供了极其良好的机遇。我国的微生物肥料近12年发展迅速，并已成为我国农业生物产业的重要组成部分。目前，国家农业部科技推广部门大力宣传，引导农民使用生物肥料。具专业机构估计，未来几年，生物肥料的应用会达到化肥总量的3％-5％，但目前的发展离农业生产的需求还有很大距离。截至2013年我国微生物肥料年产量约上千万吨，与欧美发达国家相比，可以说是微乎其微，而且在开发利用方面与一些发达国家还有相当大的距离。

农业微生物学是微生物科学的一个重要分支学科，农业微生物研究主要包括：农用微生物资源、土壤微生物、植物营养、微生物固氮、微生物农药、微生物肥料等几个方面。我国在农业微生物研究方面突出表现在农用微生物资源上，通过从自然界中筛选分离具有良好的农业应用价值的微生物菌种，并对农用微生物的功能和作用机理进行深入研究是非常重要的。虽然在这方面，我国已有60年的发展历史，但因种种原因，未能持续化、规模化使用微生物肥料，致使我国在技术发展上远远落后于发达国家。

近年来，在国家政策的引导下，一大批优秀的专家、学者努力研究，通过技术交流等方法，引进了国外先进技术，并结合多年来的经验推出了以根瘤菌、放线菌、固氮菌、解磷菌、钾细菌等为代表的生物肥料产品，带动我国生物肥料产业蓬勃发展。随着研究的深入和应用的需要，在不断扩大新品种的开发和改进上，微生物肥料已形成由豆科作物肥料向非豆科作物肥料转化，由单一菌种向复合菌种转化，由单一功能向多功能转化，由无芽孢菌种向有芽孢菌种转化。

基于目前的情况，继续寻找具有优异的农业应用价值的微生物菌种并对其进行深入研究对于微生物肥料的发展具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种微生物菌剂，其以解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)为活性成分，能够显著提高作物产量，该微生物菌剂的制备方法简单，易于大规模推广应用。

本发明的目的还在于提供上述微生物菌剂的培养方法和应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：一种微生物菌剂，含有解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZD0531，其保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学)，保藏号为CCTCC NO：M2014345。

本发明的微生物菌剂中的解淀粉芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，菌落呈白色或灰白色、不透明、有皱褶，菌体为直杆状，含有芽孢。其16SrDNA序列如SEQID NO：3所示。该微生物菌剂能够提高作物的产量。

本发明的解淀粉芽孢杆菌ZD0531的培养方法，包括将该解淀粉芽孢杆菌ZD0531接种于用于培养解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的培养基进行培养。

其中，上述培养基中含有2-4g/L的牛肉膏、8-12g/L的蛋白胨和4-6g/L的氯化钠。牛肉膏的含量例如2.2g/L、2.5g/L、2.8g/L、3.2g/L、3.5g/L、3.8g/L、3.9g/L等，蛋白胨的含量例如8.5g/L、9.0g/L、9.5g/L、10.0g/L、10.5g/L、11.0g/L、11.5g/L、11.8g/L等，氯化钠的含量例如4.2g/L、4.5g/L、4.8g/L、5.2g/L、5.5g/L、5.8g/L、5.9g/L等。优选地，上述培养基中含有3g/L的牛肉膏、10g/L的蛋白胨和5g/L的氯化钠。上述培养温度为25-34℃，例如25℃、25.5℃、26℃、26.5℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、32.5℃、33℃、33.5℃、33.8℃等；培养时间为12-48小时，例如15小时、18小时、20小时、21小时、25小时、28小时、32小时、36小时、40小时、42小时、45小时、46小时、47小时等。

本发明的微生物菌剂可以是液态菌剂。作为液态菌剂，解淀粉芽孢杆菌ZD0531以活菌的形式存在于液态菌剂中。本发明的微生物菌剂中解淀粉芽孢杆菌ZD0531的含量在2.0×10⁸cfu/mL以上，能够满足作为农用微生物菌剂的条件。

本发明的微生物菌剂还可以是固态菌剂，其中含有固态基质，该固态基质选自轻质碳酸钙、高岭土、白炭黑、硅藻土中的一种或两种以上的混合物。

本发明还提供上述微生物菌剂在提高作物的产量中的应用。

本发明还提供上述微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将活化后的解淀粉芽孢杆菌ZD0531在种子培养基中培养，得到种子培养液；

(2)将所述种子培养液接种到发酵培养基中，均匀搅拌，进行给氧发酵，得到半成品；

(3)将所述半成品投入装有发酵培养基的注水发酵罐中，进行给氧发酵，得到所述微生物菌剂。

作为本发明的优选方案，上述种子培养基中含有2-4g/L的牛肉膏、8-12g/L的蛋白胨和4-6g/L的氯化钠；步骤(1)培养温度为25-34℃；培养时间为12-48小时。

作为本发明的优选方案，上述发酵培养基包含芝麻粕和大米油糠，步骤(2)中种子培养液的接种量占总量的8-12％，例如8.2％、8.5％、9.5％、9.8％、10.5％、10.8％、11.2％、11.7％、11.9％等；芝麻粕占总量的50-70％，例如52％、53.8％、55.7％、58.2％、59％、62.5％、65.4％、67.8％、68.1％、69.5％等；大米油糠占总量的20-40％，例如21％、22.5％、24.5％、25.8％、26.7％、27.8％、29.5％、31.2％、32.8％、34.5％、35.8％、36.7％、38.2％、39.5％等；步骤(2)发酵温度为28-36℃，例如28.2℃、29.5℃、30.2℃、31.3℃、32.1℃、33.6℃、34.5℃、35.2℃、35.8℃等；发酵时间为18-24天，例如18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天等；发酵pH维持在6.5-6.9，例如6.52、6.55、6.60、6.61、6.68、6.72、6.75、6.80、6.85、6.88等。

作为本发明的优选方案，上述步骤(3)中半成品的投入量占总量的4-6％，例如4.2％、4.3％、4.5％、4.7％、5.1％、5.4％、5.7％、5.8％、5.9％等；发酵温度为25-32℃，例如25.5℃、26℃、26.8℃、27℃、28℃、29℃、30℃、30.5℃、30.8℃、31.2℃、31.5℃、31.8℃等；发酵时间为12-18天，例如12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天等；发酵pH维持在6.5-6.9，例如6.52、6.55、6.60、6.61、6.68、6.72、6.75、6.80、6.85、6.88等。

本发明的微生物菌剂含有解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZD0531，用于作物生产中能够显著提升作物的产量，因此本发明的解淀粉芽孢杆菌ZD0531是一种非常有价值的农用微生物。

生物样品保藏信息：

菌株名称：Bacillus amyloliquefaciens ZD0531

保藏日期：2014年7月21日

保藏单位：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)

保藏编号：CCTCC NO：M2014345

附图说明

图1为本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZD0531的划线培养结果的照片；

图2为本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZD0531的革兰氏染色结果的光学显微镜照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZD0531的筛选和分离

本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZD0531是从土壤中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：于6、7月份从吉林省长白山森林中采集树根周围的肥沃湿土，采用牛肉膏-蛋白胨固体培养基进行筛选。具体筛选方法如下：称取1-2g土样溶解在200mL无菌水中，置于30℃摇床中250rpm震荡摇晃30min；静置待上层澄清后，取100μL上清液，进行10^-1、10^-2、10^-3、10^-4稀释，然后将稀释液涂布于牛肉膏-蛋白胨固体培养基平板上，每个梯度浓度涂布三个平板，在30℃培养2d后，依据解淀粉芽孢杆菌的主要生物学特征挑取几十个菌落进行个别单独培养。

将35株个别单独培养的菌落分别于牛肉膏-蛋白胨液体培养基中32℃培养36小时后，得到浓度大约2.0×10⁸cfu/mL的培养液，使用分别来自35株菌体的培养液分别进行实验室喷施实验。具体方法是：选取实验室养殖的开花坐果期的辣椒360盆(植株生长状况基本相同)，分为36组，每组10盆；将上述培养液分别稀释50倍，作为淋施液，分别淋施到35组辣椒上，剩余一组作为对照淋施相同稀释倍数的培养基(不含任何菌体)，每7天淋施一次，直到果实采摘。

果实采摘后，分别称取每组辣椒的总产量，发现有3组淋施液处理的辣椒的产量相比对照组增产20.7％、28.5％和40.2％，而其它组淋施液处理的辣椒相比对照组没有发现明显增产。

取相比对照组增产40.2％的辣椒组施用的菌体，将其命名为ZD0531，并对其进行进一步鉴定。

上述实验所用的牛肉膏-蛋白胨培养基中含有3g/L的牛肉膏、10g/L的蛋白胨和5g/L的氯化钠。

实施例2：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZD0531的鉴定

1、形态鉴定

取ZD0531菌株在牛肉膏-蛋白胨固体培养基上划线培养，32℃培养36小时。观察其形态特征：菌落呈白色或灰白色、不透明、有皱褶，菌体为直杆状，含有芽孢(如图1所示)，初步判断是芽孢杆菌。

2、染色

取菌体涂片，进行革兰氏染色后用光学显微镜观察菌体，发现该菌株为革兰氏阳性(如图2所示)。

3、生理生化特征

参照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》和《常见细菌系统鉴定手册》对ZD0531进行生理生化特征鉴定，结果见表1。

表1

实验项目	实验结果
		革兰氏染色	+
细胞形状	直杆状
		形成芽孢	+
芽孢圆形	-
		伴孢晶体	-

氧化酶	+
		分解酪素	+
水解淀粉	+
		水解明胶	+
氧化酶	+
		利用葡萄糖	+
利用乳糖	+
		利用L-阿拉伯糖	+
利用木糖	+
		利用甘露醇	+
利用柠檬酸盐	+
		pH6.7生长	+
50℃生长	-

注：表中，“+”表示实验结果为阳性；“-”表示实验结果为阴性。

根据上述生理生化特征，将其与《常见细菌系统鉴定手册》进行比较，初步将菌株ZD0531鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

4、分子生物学鉴定

申请人委托广东省微生物分析检测中心对该菌株进行进一步鉴定，分析其16SrDNA。

实验方法：

1)DNA提取

(1)挑取活化的菌株ZD0531，接种于牛肉膏-蛋白胨液体培养基(3g/L的牛肉膏、10g/L的蛋白胨和5g/L的氯化钠)中，26-28℃恒温摇床培养2天；

(2)将培养物全部转至10mL的离心管中，6000rpm室温离心5min收集菌体，弃上清，离心管倒置于干净的吸水纸上晾干残余的液体，加入2.7mL DNA抽提缓冲液，充分悬浮菌体后，加入20μL 10mg/mL的蛋白酶K，混匀，置于恒温水浴摇床水平振荡，225rpm，37℃，30min；

(3)加入0.3mL 20％SDS，轻轻颠倒几次混匀，置于恒温水浴箱静置，65℃温浴2h，期间每隔15-20min上下颠倒几次混匀直至裂解完全后，于室温离心10min，600rpm；

(4)将上清转至新的离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇(24：1)抽提10min，6000rpm，室温离心10min；

(5)重复步骤(4)两到三次；

(6)将上清转至新的离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温静置1h后于14000rpm室温离心20min，收集粗DNA；

(7)沉淀的粗DNA用70％冰乙醇轻轻涮洗，弃涮洗液后置于干净工作台上晾干，加入100-200μL无菌超纯水或TE缓冲液溶解DNA后，转至灭菌的1.5mL离心管中，-20℃保存备用。

2)DNA纯度和浓度鉴定

采用核酸/蛋白分析仪于Nucleic Acid程序下测定

(1)用双蒸水在260nm、280nm两个波长下校零；

(2)取1μL DNA样品，加入水至100μL，混匀；

(3)在260nm、280nm两个波长下分别读出样品吸光值为OD260＝0.5839，OD280＝0.3421，OD260/OD280＝1.71；

(4)核酸浓度计算：[c]＝OD260×50×稀释倍数＝0.5839×50×100＝2920ng/μL。

3)PCR扩增反应

使用检测16SrDNA的引物进行PCR扩增，引物序列如下：

27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO：1)；

1429R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO：2)。

PCR反应体系如下表2所示：

表2

成分	用量(μL)
		反应缓冲液(10×buffer)	5
dNTP混合物(10mmoL)	1
		Taq DNA聚合酶(5U/μL)	0.5
氯化镁(MgCl₂)(25mmoL)	5
		上游引物27F(10pmol/μL)	1
下游引物1429R(10pmol/μL)	1
		模板DNA	1
无菌水	35.5

设置空白对照：空白对照中含有除模板DNA以外的所有成分。

PCR反应程序如下：94℃5min；94℃1min，56℃1min，72℃2min，30个循环；72℃7min。

取扩增产物5μL与1μL上样缓冲液混合，点样在0.8％的琼脂糖凝胶上，电泳检测。

4)切取目标扩增条带进行胶回收，然后送上海英俊生物技术有限公司进行测序，得到测序序列如下：

catgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttaggagccagcc(SEQ ID NO：3)。

将得到的测序序列与Genbank数据库进行同源性比对，发现其与公开的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)KYJC116SrRNA基因(登录号：gb/HM585055.1)具有100％的同源性，因此最终将本发明的菌株ZD0531鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZD0531。

该菌株已于2014年7月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学)，保藏号为CCTCC NO：M2014345，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，菌株名称为ZD0531。

实施例3：含解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZD0531的微生物菌剂的制备

本实施例使用本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZD0531在不同的工艺条件下，成功制备了可用的微生物菌剂，具体方法如下：

第一种工艺：

将保藏的菌种活化后接种到种子培养基中，32℃下利用恒温摇床培养36小时，得到种子培养液，种子培养基配方为含有3g/L的牛肉膏、10g/L的蛋白胨和5g/L的氯化钠。

将体积10％的种子培养液与90％的发酵培养基(芝麻粕60％和大米油糠30％，经123℃高温灭菌处理)混匀搅拌，投入发酵罐给氧发酵，发酵温度34℃，pH维持在6.7，发酵时间21天，得到半成品原料。

将体积5％的半成品原料与95％的发酵培养基混合投入注水发酵罐中，给氧发酵，发酵温度常温(25-32℃)，pH维持在6.7，发酵时间15天，得到液体微生物菌剂。

经检测，活的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZD0531的浓度在2.0×10⁸cfu/mL以上，符合农用微生物菌剂的要求。

第二种工艺：

将保藏的菌种活化后接种到种子培养基中，25℃下利用恒温摇床培养48小时，得到种子培养液，种子培养基配方为含有4g/L的牛肉膏、8g/L的蛋白胨和6g/L的氯化钠。

将体积12％的种子培养液与88％的发酵培养基(芝麻粕68％和大米油糠20％，经123℃高温灭菌处理)混匀搅拌，投入发酵罐给氧发酵，发酵温度36℃，pH维持在6.5，发酵时间18天，得到半成品原料。

将体积4％的半成品原料与96％的发酵培养基混合投入注水发酵罐中，给氧发酵，发酵温度常温(25-32℃)，pH维持在6.5，发酵时间18天，得到液体微生物菌剂。

第三种工艺：

将保藏的菌种活化后接种到种子培养基中，34℃下利用恒温摇床培养12小时，得到种子培养液，种子培养基配方为含有2g/L的牛肉膏、12g/L的蛋白胨和4g/L的氯化钠。

将体积8％的种子培养液与92％的发酵培养基(芝麻粕52％和大米油糠40％，经123℃高温灭菌处理)混匀搅拌，投入发酵罐给氧发酵，发酵温度28℃，pH维持在6.9，发酵时间24天，得到半成品原料。

将体积6％的半成品原料与94％的发酵培养基混合投入注水发酵罐中，给氧发酵，发酵温度常温(25-32℃)，pH维持在6.9，发酵时间12天，得到液体微生物菌剂。

上述三种工艺制得的液态微生物菌剂，分别与轻质碳酸钙、高岭土、白炭黑或硅藻土按照液固之比为1：2混合，搅拌均匀后，自然风干，得到固态微生物菌剂。

实施例4：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZD0531微生物菌剂对作物的增产试验

申请人委托广东省耕地肥料总站进行了辣椒淋施“微生物菌剂”的小区试验。共进行了两个小区试验，试验过程和结果报告如下。

第一组小区试验

1.材料和方法

1.1试验地点：试验在广东省韶关市新丰县丰城街道办大洞罗葵花菜地进行，试验地为沙壤土，肥力中等，前茬作物为菜心。试验地土壤分析结果见表3。

表3试验地土壤分析结果

1.2供试作物：农户自留品种辣椒。

1.3供试肥料：本发明实施例3中第一种工艺制备的微生物菌剂，含有效活菌数2.0×10⁸cfu/mL以上。

1.4试验设计

试验设4个处理组，每个处理3次重复，随机排列，小区面积20m²。各处理组设计如下：

处理一：习惯施肥+施用本发明的微生物菌剂；

处理二：习惯施肥+施用本发明灭活的微生物菌剂；

处理三：习惯施肥；

处理四：不施用任何肥料。

当地农民习惯施肥为：亩施腐熟农家肥1000kg及进口三元素复合肥(15-15-15)35kg，结合整地作基肥深施；移植后7天和15天各施一次进口三元素复合肥(15-15-15)8kg/亩，开花结果期开沟施进口三元素复合肥(15-15-15)15kg/亩，以后每采果一次，用0.5％尿素进行根外追肥一次。处理四全期不施用任何肥料。

1.5试验过程

辣椒于8月6日播种，9月6日移植，亩植3000株，11月10日至12月16日收获完，试验结束。

处理一在习惯施肥的前提下，于辣椒定植时(9月6日)将“微生物菌剂”按1：25倍液兑水稀释施于作为根部作为基肥，施用量为10L/亩，10天后追肥一次，按1：50倍液兑水稀释后灌根，施用量为2.5L/亩，以后每隔7天施用一次，每次均按1：50倍液兑水稀释后淋施，施用量为2.5L/亩，全期共施用8次；处理二在习惯施肥的前提下，同期施用与处理一等量的灭活的“微生物菌剂”；处理三按照当地习惯施用基肥和追肥；处理四全期根据田间土壤的水分状况，淋适量清水，全期不施用任何肥料。

2.结果分析

2.1淋施“微生物菌剂”对辣椒主要农艺性状的影响

由表4可见，收获时淋施“微生物菌剂”的处理一辣椒株高分别比处理二、处理三、处理四的增加0.7％、0.7％、17.4％；雌花数分别比处理二、处理三、处理四的增加5.6％、6.4％、36.7％；挂果数分别比处理二、处理三、处理四的增加10.4％、12.3％、175.0％；座果率分别比处理二、处理三、处理四的增加2.0％、2.3％、22.1％；单果平均重量分别比处理二、处理三、处理四的增加8.7％、9.6％、25.9％。结果说明，淋施“微生物菌剂”可增加辣椒雌花数和挂果数，提高辣椒单果平均重量。

表4淋施“微生物菌剂”对辣椒主要农艺性状的影响

注：挂果数以第二次生理落果的果数计算。

2.2淋施“微生物菌剂”对辣椒产量的影响

从表5可见，淋施“微生物菌剂”的处理一辣椒小区平均产量为50.2kg，折合亩产1673.3kg，比处理二亩产增产83.3kg，增幅为5.2％；比处理三亩产增产106.6kg，增幅为6.8％；比处理四亩产增产551.1kg，增幅为49.1％。结果说明，辣椒淋施“微生物菌剂”有较好的增产作用。

表5淋施“微生物菌剂”对辣椒产量的影响

表6方差分析表

注：*表示差异达到显著水平，**表示差异达到极显著水平。

由表6可见，F值≥F0.01(F0.05)，各处理间辣椒小区平均产量差异达到极显著水平，进一步用PLSD法进行多重比较，结果见表7。

表7多重比较结果

注：PLSD0.05＝2.93，PLSD0.01＝4.43，不同小写字母表示经PLSD检验为差异显著，不同大写字母表示经PLSD检验为差异极显著。

由表7可见，处理一辣椒产量最高，处理二的次之，处理三的第三，处理四的最低。处理一与处理二、处理三之间辣椒小区平均产量差异均达到显著水平，处理一与处理四之间小区平均产量差异达到极显著水平。

3.结论

3.1淋施“微生物菌剂”可增加辣椒雌花数和挂果数，提高辣椒单果平均重量。

3.2辣椒淋施“微生物菌剂”比淋施灭活的“微生物菌剂”的处理二亩增产5.2％，增产显著；比习惯施肥的处理三亩产增产6.8％，增产显著；比不施用任何肥料的处理四亩产增产49.1％，增产极显著。

第二组小区试验

1.材料和方法

1.1试验地点：试验在广东省惠州市惠城区小金口街道办九龙村菜地进行，试验地为沙壤土，肥力中等，前茬作物为通心菜。试验地土壤分析结果见表8。

表8试验地土壤分析结果

1.2供试作物：农户自留品种辣椒。

1.3供试肥料：本发明实施例3中第二种工艺制备的微生物菌剂，含有效活菌数2.0×10⁸cfu/mL以上。

1.4试验设计

处理一：习惯施肥+施用本发明的微生物菌剂；

处理二：习惯施肥+施用本发明灭活的微生物菌剂；

处理三：习惯施肥；

处理四：不施用任何肥料。

当地农民习惯施肥为：基肥亩施腐熟农家肥1000kg及进口复合肥(15-15-15)40kg；追肥：定植后7天和20天分别兑水淋施进口复合肥(15-15-15)8kg/亩和10kg/亩，开花座果期追施进口复合肥(15-15-15)15kg/亩，以后每采果一次，兑水淋施进口复合肥(15-15-15)5kg/亩。

1.5试验过程

辣椒于9月15日播种，10月28日移植，移植前田块起畦，畦宽1.2米，畦高0.25米，亩植3000株。1月12日至3月28日收获完，试验结束。

处理一在习惯施肥的前提下，于辣椒定植时(10月28日)将“微生物菌剂”按1：25倍液兑水稀释施于作为根部作为基肥，施用量为10L/亩，10天后追肥一次，按1：50倍液兑水稀释后灌根，施用量为2.5L/亩，以后每隔7天施用一次，每次均按1：50倍液兑水稀释后淋施，施用量为2.5L/亩，全期共施用8次；处理二在习惯施肥的前提下，同期施用与处理一等量的灭活的“微生物菌剂”；处理三按照当地习惯施用基肥和追肥；处理四全期根据田间土壤的水分状况，淋适量清水，全期不施用任何肥料。

2.结果分析

2.1淋施“微生物菌剂”对辣椒主要农艺性状的影响

由表9可见，收获时淋施“微生物菌剂”的处理一辣椒株高分别比处理二、处理三、处理四的增加2.6％、5.1％、17.8％；雌花数分别比处理二、处理三、处理四的增加6.0％、6.8％、40.2％；挂果数分别比处理二、处理三、处理四的增加11.1％、13.0％、205.9％；座果率分别比处理二、处理三、处理四的增加2.0％、2.4％、24.0％；单果平均重量分别比处理二、处理三、处理四的增加9.1％、8.6％、25.4％。结果说明，淋施“微生物菌剂”可增加辣椒雌花数和挂果数，提高辣椒单果平均重量。

表9淋施“微生物菌剂”对辣椒主要农艺性状的影响

注：挂果数以第二次生理落果的果数计算。

2.2淋施“微生物菌剂”对辣椒产量的影响

从表10可见，淋施“微生物菌剂”的处理一辣椒小区平均产量为52.6kg，折合亩产1753.4kg，比处理二亩产增产103.3kg，增幅为6.3％；比处理三亩产增产154.5kg，增幅为9.7％；比处理四亩产增产585.6kg，增幅为50.1％。结果说明，辣椒淋施“微生物菌剂”有较好的增产作用。

表10淋施“微生物菌剂”对辣椒产量的影响

表11方差分析表

注：*表示差异达到显著水平，**表示差异达到极显著水平。

由表11可见，F值≥F0.01(F0.05)，各处理间辣椒小区平均产量差异达到极显著水平，进一步用PLSD法进行多重比较，结果见表12。

表12多重比较结果

注：PLSD0.05＝2.14，PLSD0.01＝3.24，不同小写字母表示经PLSD检验为差异显著，不同大写字母表示经PLSD检验为差异极显著。

由表12可见，处理一辣椒产量最高，处理二的次之，处理三的第三，处理四的最低。处理一与处理二之间辣椒小区平均产量差异达到显著水平，处理一与处理三、处理四之间小区平均产量差异均达到极显著水平。

3.结论

3.2辣椒淋施“微生物菌剂”比淋施灭活的“微生物菌剂”的处理二亩增产6.3％，增产显著；比习惯施肥的处理三亩产增产9.7％，增产极显著；比不施用任何肥料的处理四亩产增产50.1％，增产极显著。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims

1. 一种微生物菌剂，含有解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZD0531，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2014345。

2. 根据权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂能够提高作物的产量。

3. 根据权利要求1或2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为液态菌剂。

4. 根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中解淀粉芽孢杆菌ZD0531的含量为2.0×10⁸cfu/mL以上。

5. 根据权利要求1或2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为固态菌剂，其中含有固态基质，所述固态基质选自轻质碳酸钙、高岭土、白炭黑、硅藻土中的一种或两种以上的混合物。

6. 权利要求1-5任一项所述的微生物菌剂在提高作物的产量中的应用。

7. 一种权利要求1-5任一项所述的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）将活化后的解淀粉芽孢杆菌ZD0531在种子培养基中培养，得到种子培养液；

（2）将所述种子培养液接种到发酵培养基中，均匀搅拌，进行给氧发酵，得到半成品；

（3）将所述半成品投入装有发酵培养基的注水发酵罐中，进行给氧发酵，得到所述微生物菌剂。

8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养基中含有2-4g/L的牛肉膏、8-12g/L的蛋白胨和4-6g/L的氯化钠；所述步骤（1）培养温度为25-34℃；培养时间为12-48小时。

9. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基包含芝麻粕和大米油糠，所述步骤（2）中种子培养液的接种量占总量的8-12%，所述芝麻粕占总量的50-70%，所述大米油糠占总量的20-40%；所述步骤（2）发酵温度为28-36℃，发酵时间为18-24天，发酵pH维持在6.5-6.9。

10. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中半成品的投入量占总量的4-6%，发酵温度为25-32℃，发酵时间为12-18天，发酵pH维持在6.5-6.9。