CN113430256A - 一种利用高通量测序技术分析土壤中可培养细菌含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用高通量测序技术分析土壤中可培养细菌含量的方法,包括以下步骤:(1)采集土壤样品,分离得到可培养细菌,对土壤中可培养细菌进行16S rRNA基因测序,将DNA序列与细菌属水平下的已知物种DNA序列进行比对,鉴定出土壤中属水平下的可培养细菌的物种名称;(2)提取同一土壤样品中的基因组DNA进行16S rRNA基因扩增子的高通量测序,分析土壤细菌属水平下的物种组成;(3)筛选出属水平下可培养细菌与高通量测序所得的相对应的细菌物种,并进行同源性分析;(4)获得(3)中同源性大于97%的土壤中可培养细菌物种在高通量测序结果中的含量。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域,具体涉及一种利用高通量测序技术分析土壤中可培养细菌含量的方法。
背景技术
土壤细菌系统极为庞大,种类繁多,对土壤中的有机物、氮、磷和钾等循环和转化具有重要作用,同时也含有土传病害。以往对土壤微生物的研究表明,实验室条件可纯培养的土壤细菌种类较少,而且获得的可培养细菌在整个土壤细菌系统中所占比例较小。但是一些可培养细菌在土壤生态系统中可能发挥着主要功能或可能存在潜在的危害。通过了解土壤可培养细菌的含量和组成比例,为探究可培养细菌在土壤系统中的生态功能作用和危害提供依据。
现在关于研究土壤可培养微生物数量和含量的方法较少。申请号为201010560939.5的专利文件,通过结合土壤含水量、土壤悬浮液的稀释度和培养皿中生长的菌落数计算土壤可培养细菌和真菌的数量。但是该方法只能通过菌落数计算得到可培养微生物在土壤中的数量,而无法分析可培养微生物在土壤中的含量和组成比例;其次该方法在测定土壤含水量和菌落计数过程极为繁琐,而且在这两个实验步骤中容易产生较大的实验误差,尤其对于菌落计数过程。
本发明的技术方案中,首先利用分子生物学技术对土壤中可培养细菌的物种进行鉴定,其次使用16S rRNA基因高通量测序技术分析土壤细菌的物种组成。筛选出属水平下高通量测序所得的细菌与可培养细菌对应的物种,并分析其与可培养细菌物种的同源性,进一步确定二者为相同物种。最后分析土壤中属水平下可培养细菌物种的含量。本方法的优势在于操作步骤简便快捷,能够准确的分析出可培养细菌在土壤细菌系统中的含量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用高通量测序技术分析土壤中可培养细菌含量的方法。该方法能够快速检测出土壤中可培养细菌的含量,准确地分析出土壤细菌系统中所含可培养细菌的组成比例。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种利用高通量测序技术分析土壤中可培养细菌含量的方法,包括以下步骤:
(1)采集土壤样品,经过培养分离获得土壤中的可培养细菌,通过16S rRNA基因测序和序列比对,鉴定出土壤中属水平下的可培养细菌的物种种类;
(2)提取与(1)中同一土壤样品的基因组DNA,利用16S rRNA基因高通量测序技术分析土壤中总细菌属水平下的物种组成;
(3)筛选出属水平下高通量测序所得细菌与可培养细菌对应的物种,分析二者的同源性,相似度大于97%的即为相同细菌物种;
(4)在高通量测序分析平台上分析属水平下土壤中可培养细菌物种的含量。
上述步骤(1)中所述的经过培养分离获得土壤中可培养细菌的步骤为:
将10 g去除杂质的土壤样品置于三角瓶中,加入90 mL无菌水的,充分震荡混匀,制成土壤悬液原液;采用10倍系列稀释法用无菌水依次将土壤悬液原液稀释至原液的100、1000和10000倍;吸取各稀释梯度的土壤悬液100 μL,用涂布棒均匀涂布到LB培养基平板上,于37 ℃恒温培养箱中倒置培养18~24小时;待平板上长出单菌落后继续将单菌落转接到LB培养基平板上进行培养,将单菌落重复转接3次后获得纯化的可培养细菌菌株。
上述步骤(1)中所述鉴定土壤中属水平下的可培养细菌物种的步骤为:
将纯化后的单菌落接种到30 mL的 LB液体培养基中,在温度为37 ℃ 和转速为180 rpm的摇床中培养18~24小时,获得细菌培养液后提取基因组DNA,用16S rRNA基因引物(27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R:5'-GGT TA CCTTGTTACGACTT-3')对DNA进行PCR扩增,扩增产物送至测序公司进行测序,测序获得的菌株基因序列用DNAMAN 8.0软件拼接,将每条拼接后的有效序列与NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中属水平下的已知细菌物种序列进行Blast比对,鉴定土壤中属水平下的可培养细菌物种。
上述步骤(1)中所述鉴定获得的土壤中属水平下的可培养细菌物种包括:慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)。
上述步骤(2)中所述的16S rRNA基因高通量测序步骤为:
从0.5 g土壤样品中提取总基因组DNA,用带有Barcode序列的16S rRNA基因引物(338F:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'和806R:5'-GGACTACHVGGTWTCTAA-3')对DNA进行PCR扩增,扩增产物送至测序公司,在Illumina Miseq平台上测序后,以97%的阈值对序列进行聚类分析,分析土壤细菌属水平下的物种组成。
上述步骤(3)中所述的同源性分析步骤为:
筛选出属水平下高通量测序所得的细菌与可培养细菌相对应的物种,用MEGA 7.0软件比对其DNA序列与获得的可培养细菌物种DNA序列的相似度,并用MEGA 7.0软件的邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建系统发育树。高通量测序获得的细菌DNA序列以97%的阈值对序列进行聚类,认可DNA序列相似度大于97%的为相同物种;最后在高通量测序分析平台上分析属水平下土壤中可培养细菌物种的相对含量。
上述方法在土壤中可培养细菌含量分析中的应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果:
本发明首先通过培养、分离、纯化和分子生物鉴定方法获得土壤中属水平下的可培养细菌物种,并结合高通量测序技术分析出的土壤细菌属水平下物种组成,筛选出属水平下高通量测序所得的细菌与可培养细菌对应的物种,并利用分子生物学方法分析其与获得的可培养细菌物种的同源性,进一步确定二者为相同物种,最后利用高通量测序技术分析土壤中可培养细菌物种的相对含量。本方法能够快速、准确地分析出土壤中可培养细菌物种的相对含量,为确定土壤可培养细菌物种在土壤生态系统中细菌的组成比例提供一种新的思路和方法。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
图2为土壤细菌属水平下的物种组成图。
图3为属水平下高通量测序细菌物种与可培养细菌物种的系统发育树图。
图4为属水平下土壤中可培养细菌的物种组成图。
具体实施方式
以下结合实施实例对本发明做进一步说明,需要指出的是,本实施实例仅用于解释本发明,而非对本发明的限制。
实施例1
以福建省武夷山国家公园土壤为研究对象,通过分子生物学鉴定方法结合高通量测序技术分析土壤中可培养细菌物种的含量,为检测土壤可培养细菌物种在土壤细菌系统的组成比例提供一种新的思路和方法。
试验选取了4个不同的土壤采样点,每个采样点三个重复。4个土壤采样点分别为:九曲溪样地(JQX),上云窝样地(SYW),流香涧茶园(LXJ),慧苑坑(HYK)。详细的采样点位置如表1所示。
表1 武夷山国家公园土壤采样点信息
土壤可培养细菌筛选分离和纯化试验
称取10 g新鲜土壤样品置于三角瓶中,加入90 mL的无菌水,充分震荡混匀,制成土壤悬液原液;采用10倍系列稀释法用无菌水依次将土壤悬液原液稀释至原液的100、1000和10000倍;吸取各稀释梯度的土壤悬液100 μL,用涂布棒均匀涂布到LB培养基平板上,于37 ℃恒温培养箱中倒置培养18~24小时。待平板上长出单菌落后继续将单菌落转接到LB培养基平板上进行培养,将单菌落重复转接3次后获得了纯化后的单菌株。
土壤可培养细菌物种鉴定
将纯化后的单菌落接种到装有30 mL的LB液体培养基中,在温度为37 ℃ 和转速为180 rpm的摇床中培养18~24小时,获得细菌培养液后提取基因组DNA。用16S rRNA基因引物(27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R:5'-GGTTACC TTGTTACGACTT-3')对DNA进行PCR扩增,取足够量扩增产物送至测序公司进行测序,测序获得的菌株基因序列用DNAMAN8.0软件拼接,将每条拼接后的有效序列与NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中属水平下的已知细菌物种序列进行Blast比对,鉴定出土壤中属水平下的可培养细菌物种。
经过比对鉴定,获得的土壤可培养细菌在属水平下包含了4种已知物种,分别为:(1)慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium),其16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,长度为1417 bp;(2)芽孢杆菌属(Bacillus),其16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,长度为1421 bp;(3)类芽孢杆菌属(Paenibacillus),其16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,长度为1412 bp;(4)不动杆菌属(Acinetobacter),其16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,长度为1432 bp。
16S rRNA基因高通量测序试验
从0.5 g新鲜的土壤样品中提取总基因组DNA,用带有Barcode序列的16S rRNA基因引物(338F:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'和806R:5'-GGACTACHVGGTWTCTAA-3')对DNA进行PCR扩增,取足够量扩增产物送至上海美吉生物医药科技有限公司,在Illumina Miseq平台上测序以97%的阈值对序列进行聚类分析,分析土壤细菌属水平下的物种组成。
土壤细菌属水平下的物种组成如图2所示,4个土壤采样点中相对含量大于1%的细菌物种共有50种,其中与可培养细菌对应的物种分别为:(1)慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium),其16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,长度为427 bp;(2)芽孢杆菌属(Bacillus),其16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示,长度为429 bp;(3)类芽孢杆菌属(Paenibacillus),其16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示,长度为428 bp;(4)不动杆菌属(Acinetobacter),其16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示,长度为430 bp。
细菌物种同源性分析
用MEGA 7.0软件对高通量测序中获得的对应于可培养细菌的物种的DNA序列与可培养细菌单菌落进行DNA序列进行比对,去除多余的DNA序列后,分析二者的相似度,并用MEGA 7.0软件的邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建系统发育树。由于高通量测序获得的细菌DNA序列以97%的阈值对序列进行聚类,可认为DNA序列相似度大于97%的为相同物种。
高通量测序中对应的可培养细菌的物种与可培养细菌物种的相似度和系统发育树分别如表2和图3所示,其中慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)的相似度为 98.58%,芽孢杆菌属(Bacillus)的相似度为98.82%,类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的相似度为97.86%,不动杆菌属(Acinetobacter)的相似度为97.37%。
表2 属水平下高通量测序细菌物种与可培养细菌物种的相似度
土壤中可培养细菌物种含量分析
通过MEGA7.0软件比对分析确定高通量测序中对应可培养细菌的物种与可培养细菌为相同物种后,在高通量测序分析平台上分析土壤中可培养细菌物种的含量。结果如图4所示,慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)含量在SYW采样点(3.76%)最高,在LXJ采样点(0.64%)最低;芽孢杆菌属(Bacillus)的含量在HYK采样点(2.95%)最高,在SYW采样点(0.02%)最低;类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的含量介于0.05%(SYW采样点)到2.02%(LXJ采样点)之间;不动杆菌属(Acinetobacter)的含量在JQX采样点(1.22%)最高,在SYW采样点最低(0.004%)。通过分析,获得了以上4个点位土壤中属水平下的可培养细菌含量,能够直观地反映出以上4个点位可培养菌在土壤生态系统中的细菌组成比例,为探究可培养细菌在土壤中的生态功能或危害提供依据。
以上分析结果表明,本发明所描述的方法对于分析土壤中可培养细菌物种的含量是可行的,此方法和思路也可应用于分析不同生态环境中的可培养微生物的含量。因此,本发明为检测土壤中可培养细菌物种的含量提供了一种准确、快捷的研究分析方法,为探究可培养细菌在土壤系统中的生态功能作用和危害提供依据。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 泉州师范学院
<120> 一种利用高通量测序技术分析土壤中可培养细菌含量的方法
<130> 12
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1417
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.1
<400> 1
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gtgcagaaga ggagagcgga attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga 660
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agggggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagcgc gcgcaggcgg tcttttaagt 240
ctggtgttta agtgcggggc tcaaccccgt gacgcactgg aaactgggag acttgagtgc 300
agaagaggag agcggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt ggaacaacac 360
cagtggcgaa ggcggctctc tggactgtaa ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc 420
aaacagg 427
<210> 6
<211> 429
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.6
<400> 6
tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct gacggagcaa cgccgcgcga gtgatgaagg 60
ttttcggatc gtaaagctct gttgttaggg aagaacaagt gcgagagtaa ctgctcacat 120
cttgacggta cctaaccaga aagccacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 180
tatgtggcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaacgg ctcgcaggcg cattcttaag 240
tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg gagggtcatt ggaaactgag aaacttgagt 300
gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac 360
accagtggcg aaggcgactc tctgatctgt aactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga 420
gcgcatagg 429
<210> 7
<211> 428
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.7
<400> 7
tagggaatct tccgcaatgg acgcaagtct gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg 60
ttttcggatc gtaaagctct gttgccctag acgaacagca aggcgagtaa ctgcgctttg 120
tgtcacggta taggagaaga aagccccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 180
tagggggcaa tcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagcg cgcgcaggcg gtcacataag 240
ttgggtgttt acgcccgggg ctcaaccccg gttcgcatcc aaaactggtt gacttgagtg 300
taggagaggc aggtggaagt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca 360
ccagtggcga aggcgacttt caggcctata actgacgctg aggcgcgaaa gcgtggggag 420
caaacagg 428
<210> 8
<211> 430
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.8
<400> 8
tggggaatat tggacaatgg gcgcaagcct gatccagcca tgccgcgtgt gtgaagaagg 60
ccttatggtt gtaaagcact ttaagcgagg aggaggctac tttagttaat acctagagat 120
agtggacgtt actcgcagaa taagcaccgg ctaactctgt gccagcagcc gcggtaatac 180
agagggtgca agcgttaatc ggatttactg ggcgtaaagc gcgcgtaggc ggctaattaa 240
gtcaaatgtg aaatccccga gcttaacttg ggaattgcat tcgatactgg ttagctagag 300
tgtgggagag gatggtagaa ttccaggtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tctggaggaa 360
taccgatggc gaaggcagcc atctggccta acactgacgc tgaggtgcga aagcatgggg 420
agcaaacagg 430
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 27F
<400> 9
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 1492R
<400> 10
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 338F
<400> 11
actcctacgg gaggcagcag 20
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 806R
<400> 12
ggactachvg gtwtctaa 18
Claims (7)
1.一种利用高通量测序技术分析土壤中可培养细菌含量的方法,其特征在于:包括以下步骤:
采集土壤样品,经过培养分离获得土壤中的可培养细菌,通过16S rRNA基因测序和序列比对,鉴定出土壤中属水平下的可培养细菌的物种种类;
(2)提取与(1)中同一土壤样品的基因组DNA,利用16S rRNA基因高通量测序技术分析土壤中总细菌属水平下的物种组成;
(3)筛选出属水平下高通量测序所得细菌与可培养细菌对应的物种,分析二者的同源性,相似度大于97%的即为相同细菌物种;
(4)在高通量测序分析平台上分析属水平下土壤中可培养细菌物种的含量。
2.根据权利要求1所述的一种利用高通量测序技术分析土壤中可培养细菌含量的方法,其特征在于:步骤(1)中所述的经过培养分离获得土壤中可培养细菌的步骤为:将10 g的新鲜土壤置于三角瓶中,加入90 mL的无菌水,充分震荡混匀后,制成土壤悬液原液;采用10倍系列稀释法,用无菌水依次将土壤悬液原液稀释至原液的100、1000和10000倍;吸取各稀释梯度的土壤悬液100 μL,用涂布棒均匀涂布到LB培养基平板上,于恒温培养箱中在37℃下,倒置培养18~24小时;待平板上长出单菌落后继续将单菌落转接到LB培养基平板上进行培养,将单菌落重复转接3次后获得了纯化的可培养细菌单菌株。
3.根据权利要求1所述的一种利用高通量测序技术分析土壤中可培养细菌含量的方法,其特征在于:上述步骤(1)中所述的鉴定土壤中属水平下的可培养细菌物种的步骤为:将纯化后的单菌落接种到30 mL的LB液体培养基中,在培养温度为37 ℃和转速为180 rpm的摇床中培养18~24 小时,获得细菌培养液后提取其基因组DNA;用16S rRNA基因引物27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'对DNA进行PCR扩增,取扩增产物送至测序公司进行测序,测序获得的菌株基因序列用DNAMAN 8.0软件拼接,将每条拼接的有效序列与NCBI数据库中属水平下的已知细菌物种序列进行Blast比对,鉴定土壤中属水平下的可培养细菌物种。
4.根据权利要求1所述的一种利用高通量测序技术分析土壤中可培养细菌含量的方法,其特征在于:步骤(1)中所述的鉴定获得的土壤中属水平下的可培养细菌物种包括:慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)。
5.根据权利要求1所述的一种利用高通量测序技术分析土壤中可培养细菌含量的方法,其特征在于:步骤(2)中所述的16S rRNA基因高通量测序步骤为:从0.5 g土壤样品中提取总基因组DNA,用带有Barcode序列的16S rRNA基因引物338F:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'和806R:5'-GGACTACHVGGTWTCTAA-3'对DNA进行PCR扩增,扩增产物送至测序公司,在Illumina Miseq平台上测序后,以97%的阈值对序列进行聚类分析,分析土壤中细菌属水平下的物种组成。
6.根据权利要求1所述的一种利用高通量测序技术分析土壤中可培养细菌含量的方法,其特征在于:步骤(3)中所述的同源性分析步骤为:筛选出属水平下高通量测序所得细菌与可培养细菌对应的物种,用MEGA 7.0软件比对其DNA序列与获得的可培养细菌物种DNA序列的相似度,并用MEGA 7.0软件的邻接法构建系统发育树,高通量测序获得的细菌DNA序列以97%的阈值对序列进行聚类,认可DNA序列相似度大于97%的为相同物种。
7.权利要求1所述方法在土壤中可培养细菌含量分析中的应用。
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