CN113337441A

CN113337441A - 一种耐高温硫氧化菌株lyh-2及其应用

Info

Publication number: CN113337441A
Application number: CN202110707657.1A
Authority: CN
Inventors: 李伟光; 陈莉; 赵艺; 彭建邦; 周雨洁
Original assignee: Harbin Institute of Technology Shenzhen
Current assignee: Harbin Institute of Technology Shenzhen
Priority date: 2021-06-24
Filing date: 2021-06-24
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2041-06-24
Also published as: CN113337441B

Abstract

一种耐高温硫氧化菌株LYH‑2及其应用，它属于环境生物技术领域，涉及一种市政污泥堆肥中耐高温除臭菌，具体涉及一种耐高温硫氧化菌株LYH‑2及其应用。一种耐高温硫氧化菌株LYH‑2，它为耐热柯恩氏菌(Cohnella thermotolerans)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年5月13日，保藏号为CGMCC No.22518。一种耐高温硫氧化菌株LYH‑2用于降低市政污泥堆肥高温期所产生的臭气，对硫化氢臭气的控制效率高达55.81％，达到固硫除臭的目的。本发明可获得一种耐高温硫氧化菌株LYH‑2及其应用。

Description

一种耐高温硫氧化菌株LYH-2及其应用

技术领域

本发明属于环境生物技术领域，涉及一种市政污泥堆肥中耐高温除臭菌，具体涉及一种耐高温硫氧化菌株LYH-2及其应用。

背景技术

随着环保力度不断加强，我国的污水处理事业得到飞速发展，污水产量与日俱增，而污泥作为污水处理过程中必然会产生的副产物，其产量也不断增加。截至2018年底，我国城市污泥产量(含水率以80％计)超过5000万吨/年，到2020年底，污泥产量升至6000～9000万吨/年。污泥产量大，资源化潜力巨大，但市政污泥中大量的重金属和细菌病毒等有害物质也成为阻碍污泥事业发展的绊脚石。

污泥好氧堆肥发酵技术作为实现污泥减量化、无害化的重要手段，其原理是利用堆体中好氧微生物的作用将污泥中的有机物转化成稳定的腐殖质的过程。污泥堆肥工艺操作简单，建设和运行成本低，并且堆肥后的成品中含有丰富的氮、磷、硫等营养物质，可作为作物肥料和土壤填充剂使用。但目前仍然存在占地面积大、恶臭气体大量释放、重金属难以稳定处理等问题，其中臭气问题尤其是含硫臭气的产生正成为严重阻碍堆肥技术发展的重要难题。H₂S占所有含硫臭气的39％～43％，其臭阈值仅为0.0007mg/m³，对总恶臭浓度的贡献率高。硫化氢、甲硫醇、甲硫醚等含硫臭气的产生不仅会损害操作人员的身心健康，也对周围的空气、水源等环境造成严重污染。

通过向堆体中添加硫氧化微生物(Sulfur-Oxidizing Bacteria，SOB)可较好地解决含硫臭气的产生问题，该过程通常是利用无色硫细菌或光合硫细菌体内的多种氧化酶的作用，将S^2-/HS^-等低价的硫氧化成S⁰和SO₄ ^2-等氧化态硫的过程。但目前已研究的无色硫氧化菌多为中常温菌株，如副球菌属、硫杆菌属和假单胞菌属等，常温菌无法适应堆体内的高温环境，在堆肥高温期极易失活，其硫氧化功能的发挥受到限制。因此，具有硫氧化功能的耐高温菌株的筛选和应用就显得尤为重要了，将其作为接种剂添加到污泥堆肥中，不仅会弥补高温期硫氧化作用的缺失，达到在高温条件下控制硫化氢臭气的目的，同时也能推进堆肥反应的进程，加快堆体腐熟。

发明内容

本发明的目的是要解决现有无色硫氧化菌无法适应市政污泥堆肥内的高温环境，在堆肥高温期极易失活，其硫氧化功能的发挥受到限制的问题，而提供一种耐高温硫氧化菌株LYH-2及其应用。

一种耐高温硫氧化菌株LYH-2，它为耐热柯恩氏菌(Cohnella thermotolerans)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，保藏日期为2021年5月13日，保藏号为CGMCC No.22518。

进一步的，一种耐高温硫氧化菌株LYH-2用于降低市政污泥堆肥高温期所产生的臭气。

进一步的，所述的市政污泥堆肥高温期的温度为50℃～65℃。

本发明一种耐高温硫氧化菌株LYH-2的性质如下：

一种耐高温硫氧化菌株LYH-2(耐热柯恩氏菌LYH-2)在LB培养基上培养24h后，显现的菌落特征为：菌落呈白色，透明，表面湿润，不易挑取，边缘整齐；革兰氏染色结果显示为红色阴性。由生理生化特征实验可得，明胶液化、接触酶、硝酸盐还原、反硝化、 V-P、丙二酸利用、硫化氢产生的实验结果显示为阴性；M.R、亚硝酸盐还原、淀粉水解、吲哚、氧化酶的结果显示为阳性。利用16S rRNA的方法进行测序，序列比对可知，与菌株LYH-2同源性最相近的是耐热柯恩氏菌(Cohnella thermotolerans)，相似度高达99.66％，将序列上传到GenBank数据库，得到其登录号为MW659162。

本发明的有益效果：

一、本发明提供的一种耐高温硫氧化菌株LYH-2是从污泥堆肥样品中筛选出来的耐高温除臭菌株，能在30～65℃下生长并稳定发挥硫氧化作用。与不接菌的对照组相比，在堆肥初期接种的除臭菌剂，可较快地适应堆肥的高温环境，延长堆肥高温期的时间，减少堆体中含硫臭气的释放量，达到固硫除臭的目的。耐高温硫氧化菌株LYH-2的应用可以为市政污泥的资源化和环境污染控制提供一条合理有效的途径；

二、本发明提供的耐高温硫氧化菌株LYH-2对硫化氢臭气的控制效率高达55.81％。

本发明可获得一种耐高温硫氧化菌株LYH-2。

附图说明

图1为实施例1中一种耐高温硫氧化菌株LYH-2的系统发育树构建图；

图2为不同温度下耐高温硫氧化菌株LYH-2的硫氧化能力测试曲线

图3为实施例2中堆肥过程中温度的变化曲线；

图4为实施例2中堆肥过程中含水率的变化曲线；

图5为实施例2中堆肥过程中氧气含量的变化曲线；

图6为实施例2中堆肥过程中硫化氢臭气累积排放量的变化曲线。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式是一种耐高温硫氧化菌株LYH-2，它为耐热柯恩氏菌(Cohnella thermotolerans)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年5月13日，保藏号为 CGMCCNo.22518。

本实施方式的有益效果：

一、本实施方式提供的一种耐高温硫氧化菌株LYH-2是从污泥堆肥样品中筛选出来的耐高温除臭菌株，能在30～65℃下生长并稳定发挥硫氧化作用。与不接菌的对照组相比，在堆肥初期接种的除臭菌剂，可较快地适应堆肥的高温环境，延长堆肥高温期的时间，减少堆体中含硫臭气的释放量，达到固硫除臭的目的。耐高温硫氧化菌株LYH-2的应用可以为市政污泥的资源化和环境污染控制提供一条合理有效的途径；

二、本实施方式提供的耐高温硫氧化菌株LYH-2的对硫化氢臭气的控制效率高达55.81％。

本实施方式可获得一种耐高温硫氧化菌株LYH-2。

具体实施方式二：本实施方式是一种耐高温硫氧化菌株LYH-2用于降低市政污泥堆肥高温期所产生的臭气。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：所述的市政污泥堆肥高温期的温度为50℃～65℃。其它步骤与具体实施方式二相同。

采用以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例1：一种耐高温硫氧化菌株LYH-2；

1.所用培养基：

富集培养基：磷酸二氢钾2.0g，氯化铵0.5g，葡萄糖0.5g，氯化镁0.2g，硫化钠(NaS·9H₂O)0.2g，去离子水1000ml，pH调至7.0～7.2；

选择性培养基：葡萄糖0.5g，磷酸二氢钾1.2g，磷酸氢二钾1.2g，氯化铵0.4g，氯化镁0.2g，硫化钠(Na₂S·9H₂O)0.08g，去离子水1000mL，pH为7.0；

LB培养基：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，琼脂10.0～20.0g，去离子水1000mL， pH值7.0～7.2。

2.耐高温硫氧化菌株的筛选：

样品来源于黑龙江省哈尔滨市文昌污水处理厂的堆肥物料；

准确称量10g堆肥样品放入70℃烘箱中烘2.5h，将烘干后的物料放于装有90mL无菌水的锥形瓶中震荡1h。取3％的悬浊液接种于200mL的富集培养基中，在50℃下培养72h，在同一温度下再次取3％的富集液接入新鲜培养基中进行多次富集；最后取1mL 富集后的混菌液，用9mL的无菌水以不同浓度梯度进行稀释，分别取不同浓度梯度的稀释液用玻璃棒均匀涂布于固体选择性培养基上，放于45℃恒温培养，每组做3个重复。挑选单菌落进行反复划线以获得纯菌株，最终获得51株纯菌株，将菌株接种于斜面4℃保存用于后续实验。

将初筛获得的纯菌株接种至200mL的含有80mg/L硫化钠的液体选择性培养基中，将摇瓶置于55℃，150r/min的摇床中震荡50h后，每隔12h测定一次不同菌株的硫化物的去除效果和硫酸盐的生成能力。其中有1株菌在50h内对硫化物的去除效果高达80％以上，菌株在高温条件下的硫氧化能力较强，将其编号为LYH-2用于后续研究。

3.耐高温硫氧化菌株的鉴定：

将菌株LYH-2接种于LB固体培养基上，将平板放置于45℃的培养箱中培养24h 后，对菌株的表观形态进行观察发现：菌落呈白色，透明，表面湿润，不易挑取，边缘整齐。利用革兰氏染色法制片，通过电子显微镜观察到菌株染色为红色，因此鉴定菌株LYH-2 为革兰氏阴性菌。同时依据《常见细菌系统鉴定手册》，对该耐高温硫氧化菌进行接触酶、 M.R、V-P和淀粉水解等生理生化实验测试，结果如表1所示。

表1耐高温硫氧化菌株生理生化特性

试验	LYH-2	试验	LYH-2
				接触酶	-	硫化氢产生	-
M.R	+	吲哚	+
				V-P	-	亚硝酸盐还原	+
硝酸盐还原	-	反硝化	-
				淀粉水解	+	明胶液化	-
丙二酸利用	-	氧化酶	+

+：阳性；-：阴性

利用16S rRNA的方法进行分子生物学鉴定，利用试剂盒提取硫氧化细菌LYH-2的DNA为模板，引物序列设计为27F(5′-AGT TTG ATC MTG GCT CAG-3′)和1492R (5′-GGT TACCTT GTT ACG ACTT-3′)。PCR反应程序如下：94℃下预变性4min；94 ℃下变性45秒，55℃下退火45秒，72℃下延伸1min，做30个循环，72℃下延伸修复10min。将PCR反应产物在1.7％的琼脂糖凝胶中进行电泳，目的片段进行胶回收后，进行片段测序。测序结果在NCBI数据库中进行序列比对，比对结果显示，与菌株LYH-2 同源性最高的为耐热柯恩氏菌(Cohnellathermotolerans)，二者的相似度高达99.66％，将序列上传到NCBI数据库中，得到其登录号为MW659162。在MEGA X软件中构建系统发育树，得到的系统发育分析结果如图1所示。同时结合菌落形态观察和生理生化分析，确定菌株LYH-2属于柯恩氏菌属。

图1为实施例1中一种耐高温硫氧化菌株LYH-2的系统发育树构建图。

实施例2：实施例1中一种耐高温硫氧化菌株LYH-2用于降解硫化物：

1.不同温度下耐高温硫氧化菌株LYH-2硫氧化能力的测试：

将发酵24h的种子液，以3％(体积分数)的接种量接种于200mL的液体选择性培养基中，摇床转速为150r/min。每5℃设置为一个温度梯度，分别测定耐高温硫氧化菌在 30～65℃不同初始温度之间的硫化物的去除效果和硫酸盐生成能力的变化。菌液在摇床中震荡50h后，利用0.22μm的滤膜对菌液进行过滤。为了测定硫化物浓度，首先进行酸化吹脱预处理，将过滤后的液体置于硫化物酸化吹气仪中吹脱，水浴温度控制在60～70℃， (1+1)的磷酸添加量为20mL，以75～100mL/min流速的氮气处理20min，300mL/min的流速吹脱10min，400mL/min的流速吹脱5min。利用《水和废水监测分析方法(第四版)》中的亚甲基蓝分光光度法，对预处理后的样品进行硫化物浓度的测定。过滤后液体中的硫酸盐产生量由改良的硫酸钡比浊法进行测定，具体方法见《空气和废气监测分析方法(第四版)》，测定结果如图2所示。

图2为不同温度下耐高温硫氧化菌株LYH-2的硫氧化能力测试曲线；

从图2可知，当温度在30～55℃时，菌株LYH-2对于培养基中硫化物的去除能力随着温度升高而不断增加，并且当温度为55℃时，去除率达到最高值86.64％；而当温度高于55℃时，硫化物去除能力则随温度升高而不断下降。此外，硫酸盐生成率在50℃时达到最高值(29.70％)，55℃时的生成率(29.30％)和50℃时相差较小。由上述结果可知，菌株LYH-2的温度耐受范围较广，在30℃～65℃之间均能生长且发挥硫氧化作用，并推测其发挥硫氧化作用的最适温度范围在50～60℃之间。

2.耐高温硫氧化菌株LYH-2在污泥堆肥中的应用：

将耐高温硫氧化菌株LYH-2发酵24h的种子液，以3％(体积分数)的接种量，接种于高温灭菌后的选择性培养基中，在温度为50℃，转速为150r/min的条件下培养24h，收集培养液得到除臭菌剂。将添加除臭菌剂的设为实验组(T)，同时空白组(CK)添加灭菌后的选择性培养基。

以市政污泥为堆肥主料，调理剂选用市售的小麦稻壳，C/N比调节至15～20，初始含水率在60％左右，除臭菌剂接种量：除臭菌剂的体积与市政污泥的质量比为50mL:1kg；堆肥反应器为圆柱形水浴式反应器，总堆肥质量为42kg，水浴温度随堆肥温度变化而相应调整，初始通气流量设定为0.5L/min，待温度升至60℃，将通气量调至0.2L/min。温度采用电子温度计测量，硫化氢臭气和氧气浓度采用便携式臭气检测仪进行检测，温度和气体值每日读数一次；含水率是通过在105℃下将样品烘至恒重，利用烘干前后的重量差计算得到。堆肥总时间为22天。

污泥堆肥过程中的温度变化如图3所示；

图3为实施例2中堆肥过程中温度的变化曲线；

从图3可知，添加除臭菌剂的实验组在堆肥第2天即达到55.9℃，进入堆肥高温期，并在第3天达到最高温度60.6℃，而此时空白组的最高堆肥温度仅为54.8℃，实验组比空白组的最高温度高5.8℃，说明耐高温菌剂的添加有利于堆肥温度的提升。同时与未接种除臭菌剂的空白组相比，接菌组的高温期持续7天，而空白组的高温期仅为5天，接菌组的高温期比空白组长2天，可有效延长堆肥高温期。堆肥过程中的含水率变化如图4所示；

图4为实施例2中堆肥过程中含水率的变化曲线；

从图4可知，空白组和实验组的堆体内含水率变化呈现相同的趋势，均随着堆肥反应的进行而不断降低，并且接菌组的含水率始终低于空白组的值。在整个堆肥过程中，接菌组的含水率共下降15.7％，空白组的含水率共减少11.78％，说明菌剂的添加能有效减少堆体含水率，促进堆肥反应的完成。

污泥堆肥过程中的氧气浓度变化和硫化氢浓度变化如图5和6分别所示；

图5为实施例2中堆肥过程中氧气含量的变化曲线；

图6为实施例2中堆肥过程中硫化氢臭气累积排放量的变化曲线；

从图5和图6可知，在堆肥第一周内，空白组和添加除臭菌剂的实验组所产生的硫化氢臭气浓度相差不大；而堆体内氧气含量迅速下降，到了第6天，实验组氧气含量达到最低(3.99％)。随着堆肥反应的不断进行，堆体内的厌氧区域逐渐扩大，氧气含量逐渐接近0，空白组产生的硫化氢累积浓度急剧增加；而在添加除臭菌剂的堆体内，大量的硫氧化菌利用堆体内的S^2-/HS^-等低价硫进行硫氧化反应，避免其作为臭气释放，从而大大减少了硫化氢臭气的产生。到堆肥第18天，微生物发酵反应所需的氧气逐渐减少，堆体内的氧气含量迅速回升。在整个堆肥期间，空白组的硫化氢累积排放量为162.38ppm，而添加除臭菌剂的堆体内的硫化氢累积量仅为71.75ppm，除臭菌剂的对硫化氢臭气的控制效率高达55.81％，说明除臭菌剂的添加可有效减少硫化氢臭气的产生和释放。

<110> 哈尔滨工业大学

<120>一种耐高温硫氧化菌株LYH-2及其应用

<160> 3

<210> 1

<211> 1489

<212> DNA

<213>耐热科恩氏菌（Cohnella thermotolerans）。

ggctcaggac gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa gtcgagcgga ctttcaaggg 60

agcttgctcc cgcgaaggtt agcggcggac gggtgagtaa cacgtaggca acctgcccgc 120

aagaccggga taacattcgg aaacgaatgc taagaccgga tacgcaagag ggaggcatct 180

tcctgttggg aaacacggag caatctgtgg cttgcggatg ggcctgcggc gcattagcta 240

gttggtgggg taacggctca ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgaacgg 300

ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc 360

acaatgggcg caagcctgat ggagcaacgc cgcgtgagtg aggaaggcct tcgggtcgta 420

aagctctgtt gccagggaag aataagggtg aggtcactac tcacccgatg acggtacctg 480

agaagaaagc cccggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gggcgagcgt 540

tgtccggaat tattgggcgt aaagcgcgcg caggcggttt cttaagtctg gtgtttaagt 600

gcggggctca accccgtgac gcactggaaa ctgggagact tgagtgcagg agaggagagc 660

ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc 720

ggctctctgg actgtaactg acgctgaggc gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga 780

taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaggtg ttgggggggt ccacccctcg 840

gtgccgaagt taacacatta agcactccgc ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc 900

aaaggaattg acggggaccc gcacaagcag tggagtatgt ggtttaattc gaagcaacgc 960

gaagaacctt accaggtctt gacatccctc tgaatacgct agagatagcg taggccttcg 1020

ggacagagga gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1080

agtcccgcaa cgagcgcaac ccttaagctt agttgccagc gcgtaaaggt gggcactcta 1140

aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gcggggatga cgtcaaatca tcatgcccct 1200

tatgacctgg gctacacacg tactacaatg gccggtacaa cgggcagcga aggggcgacc 1260

cggagccaat cctatcaaag ccggtctcag ttcggattgc aggctgcaac tcgcctgcat 1320

gaagtcggaa ttgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggtct 1380

tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttacaacacc cgaagccggt ggggtaaccg 1440

caaggagcca gccgtcgaag gtggggtaga tgattggggt gaagtcgta 1489

<210>2

<211>18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>27F。

AGTTTGATCMTGGCTCAG 18

<210>3

<211>19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>1492R。

GGTTACCTTGTTACGACTT 19

Claims

1.一种耐高温硫氧化菌株LYH-2，其特征在于它为耐热柯恩氏菌(Cohnellathermotolerans)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年5月13日，保藏号为CGMCC No.22518。

2.如权利要求1所述的一种耐高温硫氧化菌株LYH-2的应用，其特征在于一种耐高温硫氧化菌株LYH-2用于降低市政污泥堆肥高温期所产生的臭气。

3.根据权利要求3所述的一种耐高温硫氧化菌株LYH-2的应用，其特征在于所述的市政污泥堆肥高温期的温度为50℃～65℃。