CN116083290A - 一种适用于铅锌-抗生素-抗性基因污染土壤修复的复合微生物菌剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种适用于铅锌‑抗生素‑抗性基因污染土壤修复的复合微生物菌剂的制备方法，属于污染土壤的微生物修复剂开发领域。在农业生产的过程中，由于抗生素的误用和滥用，形成铅锌‑抗生素‑抗性基因污染土壤，危害土壤生态系统绿色可持续发展。本发明的复合微生物菌剂包括抗铅锌细菌ZS2、PS45和PS5：该发明通过液体发酵收集活菌，加入硅藻土制备得到复合微生物菌剂。依靠硅藻土对重金属与抗性基因的吸附作用，与抗铅锌微生物协同作用，降低土壤中铅锌、抗生素以及游离抗性基因的含量，实现污染土壤的修复，具有广阔的应用前景和推广价值。
Description
技术领域
本发明属于污染土壤的微生物修复剂开发领域，具体涉及一种适用于铅锌-抗生素-抗性基因污染土壤修复的复合微生物菌剂的制备方法。
背景技术
土壤是自然环境的重要组成部分，是植物生长的基础，也是农业生产的基础。在农业生产的过程中，由于抗生素的误用和滥用，使得大量的抗生素以原药或代谢物的形式随人或动物体的排泄而进入环境，进而增加了土壤或水环境中微生物的抗性压力，加速了大量抗性微生物的产生，抗性基因一旦产生后不会迅速消失，土壤中铅、锌等重金属与抗性基因的分布存在一定的相关性，影响着抗性基因丰度，形成铅锌-抗生素-抗性基因污染土壤，污染物进入土壤环境后会对土壤生态系统造成深刻影响，进而危害农作物绿色可持续发展。处理土壤中抗生素污染的途径很多，传统物理化学方法对治理严重污染土壤具有时间短、见效快的效果，例如微波处理、高温分解、光催化和土壤异位堆肥，但这些技术耗能高、费用高、易引起二次污染，并且对于处理大面积的农田和低水平的抗生素污染土壤并不适用。微生物修复是利用特定微生物体对土壤中重金属离子的螯合作用，以及对土壤中游离抗性基因的固定作用，促进土壤生态平衡的绿色生物防控措施。具有高效经济、环境友好等特点。该技术已广泛应用于各种污染土壤修复领域，具有较高的应用价值。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种适用于铅锌-抗生素-抗性基因污染土壤修复的复合微生物菌剂及其制备方法，利用微生物修复的方式实现铅锌-抗生素-抗性基因污染土壤的有效修复。
本发明一种适用于铅锌-抗生素-抗性基因污染土壤修复的复合微生物菌剂，其中所述菌种黄色微球菌Micrococcus flavus PS5于2014年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9929；苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis于2014年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9934；不解糖假苍白杆菌Pseudochrobactrum asaccharolyticumZS2于2014年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9930。
技术方案：
为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：
(1)制备一种适用于铅锌-抗生素-抗性基因污染土壤修复的复合微生物菌剂包括以下步骤：
步骤一：种子发酵液制备：
调节液体种于发酵培养基A的pH至6.5-6.8，并进行常规灭菌处理，按照无菌操作方法分别挑取生长于斜面培养基的活化菌株，包括抗锌细菌ZS2解糖假苍白杆菌CGMCCNo.9930、抗铅锌细菌PS45苏云金芽孢杆菌CGMCC No.9934、抗铅细菌PS5黄色微球菌CGMCCNo.9929，接入液体种子发酵培养基A进行摇瓶发酵，恒定温度32±1℃，摇床转速200-220rpm，待菌株发酵达到对数期时停止发酵。
步骤二：复合发酵：
调节液体复合菌发酵培养基B的pH至6.5-6.8，并进行常规灭菌处理，按液体质量6-9％无菌操作接入步骤一获得的复合菌种子发酵液。复合菌中解糖假苍白杆菌ZS2、苏云金芽孢杆菌PS45、黄色微球菌PS5均处于对数期，其比例为1：(1.5-2)：1，恒定温度35±1℃，搅拌速度200-250rpm，通风量0.25-0.28M3/min，罐压0.07-0.08MPa，持续发酵68-72hr，显微镜检测发酵液中细菌数目达到9.0×1011个/mL时终止发酵；
步骤三：活菌细胞收集：
分别收集步骤二复合液体复合菌发酵培养基B的发酵液，用酵母分离离心机离心分离除去发酵液中的水，获得浅黄色粘稠状菌体细胞；
步骤四：复合微生物制剂制取；
在步骤三获得的浅黄色粘稠状菌体细胞中，按照菌体与甘油的体积比1：(0.5-0.8)的比例加入甘油，并搅拌混合均匀。再按照体积比1：(1.2-1.5)的比例加入细度为300目的硅藻土，搅拌混合均匀，获得浅黄色固体制剂即目的复合微生物制剂产品。
步骤一中，液体发酵培养基A的配方如下：
甘油15-20g/L，NaNO32.0-2.5g/L，(NH4)2SO42.0-2.5g/L，MgSO4·7H2O0.5-0.8g/L，K2HPO41.5-2.0g/L，KH2PO41.5-2.0g/L，NaCl1.0-1.5g/L，CaCl2·2H2O0.01-0.03g/L，FeSO4·7H2O0.01-0.03g/L，酵母提取物1-1.5g/L，漆黄素0.2-0.4g/L，余量水定容至1L。
步骤二中，液体发酵培养基B的配方如下：
葡萄糖5-8g/L，玉米浆8-10g/L，NaNO32.0-2.5g/L，(NH4)2SO43-5g/L，K2HPO41.0-1.5g/L，MnSO4·2H2O0.3-0.5mg/L，Na2HPO40.3-0.5g，CaCl2·2H2O0.01-0.03g/L，酵母粉0.01-0.03g/L，漆黄素0.5-1.0g/L，余量水定容至1L。
(2)复合微生物菌剂修复铅锌-抗生素-抗性基因污染土壤的应用
一种适用于铅锌-抗生素-抗性基因污染土壤修复的复合微生物菌剂的制备方法及应用，其特征在于，采用权利要求1-7中所述的复合微生物菌剂进行，包括如下步骤：
步骤一：调节复合污染土壤，使田间持水量为最大田间持水量的60％-70％；
步骤二：在复合污染土壤中加入腐殖酸，平衡3-5天，调节土壤pH在6.8-7.2。
步骤三：复合微生物菌剂与复合污染土壤的质量比为1：(25-30)，以上述比例在污染土壤中加入复合微生物菌剂，修复周期从施用复合微生物菌剂起20～30天。
上述复合污染土壤中污染物包括重金属铅锌等、和/或抗生素、和/或抗生素抗性基因。
(3)土壤理化性质、重金属、抗生素与抗性基因检测
土壤理化性质测定参照土壤农化标准方法测定。测定指标及相关标准如下：样本中水分NY/T52-1987、pHNY/T1377-2007、全氮NY/T53-1987、全磷NY/T88-1988、全钾含量NY/T87-1988。
土壤样品重金属测定：收集到的土壤样品进行前处理，风干、研磨、过100目尼龙筛，参考相关标准测定土壤样本中铜、锌、铅、铬、镉重金属的含量。分析过程中添加国家标准物质进行质量控制。分析步骤参考标准：GB/T17137-1997土壤质量总铬的测定火焰原子吸收分光光度法；GB/T17138-1997土壤质量铜、锌的测定火焰原于吸收分光光度法；GB/T17141-1997土壤质量铅、镉的测定石墨炉原子吸收分光光度法；
土壤样品抗生素的测定：采用固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱的方法测定土壤样品中抗生素的含量，其中抗生素的种类包括四环素类(土霉素、四环素、金霉素)、磺胺类(磺胺二甲嘧啶)和大环内酯类(红霉素)
土壤样品抗性基因的检测：共检测20种抗性基因，其中包括11种四环素类抗性基因(tet A、tetB/P、tet C、tetE、tetG、tetM、tetO、tetQ、tetW、tet T和tetX)5种磺胺类抗性基因，包括sul1、sul2、sulA、dfrA1和dfrA7，4种大环内酯类抗性基因，包括erm Q、erm X、erm B、erm F。采用MoBio Powersoil DNA Isolation Kit提取土壤样品中的总DNA，采用荧光实时定量PCR的方法检测上述抗性基因。扩增体系配置完成后在ABI ViiA 7Real TimePCR系统上进行基于SYBR Green的qRT-PCR。PCR循环条件包括95℃下5min，然后在95℃下变性15s，在55℃下退火30s，在72℃下延伸30s。以16s rDNA V3区为内源性对照，所有反应分三次进行。根据目标基因和内参基因的扩增结果，用比较周期阈值(2-ΔΔCT)法计算目标基因的相对基因表达量。
3.本发明具有以下优点：
本发明是一种高效、绿色环保、价格低廉，易于实施的土壤生物修复技术，该发明核心技术是一种适用于铅锌-抗生素-抗性基因污染土壤修复的复合微生物菌剂的制备，本发明使用的黄色微球菌PS5、苏云金芽孢杆菌PS45和不解糖假苍白杆菌ZS2生长速率接近，18-24hr达到对数增长期，采用复合发酵的方式能够简化生产流程，有效提高发酵生产效率，降低生产成本。通过液体发酵收集活菌，加入硅藻土制备得到复合微生物菌剂。依靠硅藻土对重金属与抗性基因的吸附作用，与抗铅锌微生物协同作用，通过螯合固定降低土壤中铅锌、抗生素以及游离抗性基因的含量。本发明操作简单，环境友好。针对设施农田、果树栽培、中药种植等污染土壤环境，利用微生物修复的方式对铅锌-抗生素-抗性基因污染土壤具有良好的修复效果，能够快速有效恢复土壤生态稳定性，为发展绿色农产品打下基础，具有广阔的应用前景和推广价值。
附图说明：
图1土壤中抗生素检出量(μg·kg-1)
图2修复后土壤样本中不同抗生素类抗性基因检出量
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明。
实施例1
步骤一：种子发酵液制备：
调节液体种于发酵培养基A的pH至6.8，并进行常规灭菌处理，按照无菌操作方法分别挑取生长于斜面培养基的活化菌株，包括抗锌细菌ZS2解糖假苍白杆菌CGMCCNo.9930、抗铅锌细菌PS45苏云金芽孢杆菌CGMCC No.9934、抗铅细菌PS5黄色微球菌CGMCCNo.9929，接入液体种子发酵培养基A进行摇瓶发酵，恒定温度33℃，摇床转速200rpm，待菌株发酵达到对数期时停止发酵。
步骤二：复合发酵：
调节液体复合菌发酵培养基B的pH至6.8，并进行常规灭菌处理，按液体质量9％无菌操作接入步骤一获得的复合菌种子发酵液。复合菌中解糖假苍白杆菌ZS2、苏云金芽孢杆菌PS45、黄色微球菌PS5均处于对数期，其比例为1∶2∶1，恒定温度36℃，搅拌速度250rpm，通风量0.28M3/min，罐压0.08MPa，持续发酵72hr，显微镜检测发酵液中细菌数目达到9.0×1011个/mL时终止发酵；
步骤三：活菌细胞收集：
分别收集步骤二复合液体复合菌发酵培养基B的发酵液，用酵母分离离心机离心分离除去发酵液中的水，获得浅黄色粘稠状菌体细胞；
步骤四：复合微生物制剂制取；
在步骤三获得的浅黄色粘稠状菌体细胞中，按照菌体与甘油的体积比1：0.8的比例加入甘油，并搅拌混合均匀。再按照体积比1∶1.5的比例加入细度为300目的硅藻土，搅拌混合均匀，获得浅黄色固体制剂即目的复合微生物制剂产品。
步骤一中，液体发酵培养基A的配方如下：
甘油20g/L，NaNO32.5g/L，(NH4)2SO42.5g/L，MgSO4·7H2O0.8g/L，K2HPO42.0g/L，KH2PO42.0g/L，NaCl1.5g/L，CaCl2·2H2O0.03g/L，FeSO4·7H2O0.03g/L，酵母提取物1.5g/L，漆黄素0.4g/L，余量水定容至1L。
步骤二中，液体发酵培养基B的配方如下：
葡萄糖8g/L，玉米浆10g/L，NaNO32.5g/L，(NH4)2SO45g/L，K2HPO41.5g/L，MnSO4·2H2O0.5mg/L，Na2HPO40.5g，CaCl2·2H2O0.03g/L，酵母粉0.03g/L，漆黄素1.0g/L，余量水定容至1L。
实例2
本实施例通过修复设施蔬菜农田耕作层土壤检测本发明复合微生物菌剂修复铅锌-抗生素-抗性基因污染土壤的效果。
污染土壤样本采集参照GB/T36197-2018土壤质量土壤采样技术指南。供试土壤采自陕西省宝鸡市太白县某农田耕作层5-25cm。
经检测，土壤基本理化性质见表1，土壤重金属检出量见表2，抗生素检出量见图1，抗性基因检出量见图2。
实验设置对照组与实验组，每组三个平行样本。其中对照组不添加复合微生物菌剂。
步骤一：调节复合污染土壤，使田间持水量为最大田间持水量的60％；
步骤二：在复合污染土壤中加入腐殖酸，平衡5天，调节土壤pH在7.0。
步骤三：复合微生物菌剂与复合污染土壤的质量比为1∶25，以上述比例在污染土壤中加入复合微生物菌剂，修复周期从施用复合微生物菌剂起20天后。
实例3
本实施例通过修复设施蔬菜农田耕作层土壤检测本发明复合微生物菌剂修复铅锌-抗生素-抗性基因污染土壤的效果。
污染土壤样本采集参照GB/T36197-2018土壤质量土壤采样技术指南。供试土壤采自陕西省安康市某中药种植基地场地土壤层5-25cm。经检测，土壤基本理化性质见表1，土壤重金属污染物检出量见表2，抗生素检出量见图1，抗性基因检出量见图2。
实验设置对照组与实验组，每组三个平行样本。其中对照组不添加复合微生物菌剂。
步骤一：调节复合污染土壤，使田间持水量为最大田间持水量的65％；
步骤二：在复合污染土壤中加入腐殖酸，平衡5天，调节土壤pH在6.8。
步骤三：复合微生物菌剂与复合污染土壤的质量比为1∶20，以上述比例在污染土壤中加入复合微生物菌剂，修复周期从施用复合微生物菌剂起30天后。
结果分析：
参照土壤农化标准方法测定各土壤样本的基本理化性质，结果见表1.
表1土壤理化性质
对比表2中菌剂处理前后六例土样中的重金属检出量的结果，复合微生物菌剂修复土壤后，与对照组相比，锌、铅、铬检出量显著下降(P＜0.05)，下降了22.3％-44.1％。
表2土壤重金属污染物检出量
经复合微生物菌剂修复后，各处理组土壤中的土霉素、四环素、金霉素、磺胺二甲嘧啶、红霉素含量均低于对照土壤(图1)。与未处理组比较，处理组的抗生素检出量显著下降(P＜0.05)，下降了29％-59％。
根据荧光定量PCR结果中不同抗性基因的CT值的变化，可以评价菌剂修复对土壤样本中的抗性基因含量的影响(图2)。ΔCT＝CT(待测抗性基因)-CT(管家基因16s rDNA)，当CT(待测抗性基因)≥30则认定待测抗性基因无检出，测得CT(管家基因16s rDNA)均值为16，因此ΔCT≥14认定待测抗性基因无检出，在ΔCT≤14的范围内，CT值的增加表示待测抗性基因检出量下降。从图2结果可以看出，在宝鸡地区采集的土壤样本中，四环素类抗性基因(tetC、tetG、tetX、tet W)、磺胺类抗性基因(sul1、sul2、sulA)、大环内酯类抗性基因(erm B、erm Q、erm F、erm X)均有检出，菌剂修复后CT值显著增加(P＜0.05说明待测抗性基因检出量下降；在安康地区采集的土壤样本中，四环素类抗性基因(tet B/P、tetC、tetG、tetM)、磺胺类抗性基因(sull、sul2、sulA)、大环内酯类抗性基因(erm B、erm Q、erm F、ermX)均有检出，菌剂修复后CT值显著增加P＜0.05说明待测抗性基因检出量下降。
以上通过测定复合微生物菌剂修复前后土壤样本中重金属、抗生素、抗性基因的含量，说明依靠复合微生物菌剂中硅藻土对重金属与抗性基因的吸附作用，与抗铅锌微生物协同作用，通过螯合固定，显著降低土壤中铅锌、抗生素以及游离抗性基因的含量，针对设施农田、果树栽培、中药种植等污染土壤环境，实现污染土壤的修复，恢复污染土壤生态稳定性，具有广阔的应用潜力。以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种适用于铅锌-抗生素-抗性基因污染土壤修复的复合微生物菌剂及其制备方法，其特征在于，包括抗锌细菌解糖假苍白杆菌、抗铅锌细菌苏云金芽孢杆菌、抗铅细菌黄色微球菌、硅藻土。
2.根据权利要求1所述的一种适用于铅锌-抗生素-抗性基因污染土壤修复的复合微生物菌剂，其特征在于：黄色微球菌Micrococcus flavus PS5于2014年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9929；苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis于2014年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9934；不解糖假苍白杆菌Pseudochrobactrumasaccharolyticum ZS2于2014年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9930。
3.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂其中抗锌细菌ZS2解糖假苍白杆菌CGMCCNo.9930、抗铅锌细菌PS45苏云金芽孢杆菌CGMCC No.9934、抗铅细菌PS5黄色微球菌CGMCCNo.9929经液体发酵制得，包括以下步骤：
步骤一：种子发酵液制备：
调节液体种子发酵培养基A的pH至6.5-6.8，并进行常规灭菌处理，按照无菌操作方法分别挑取生长于斜面培养基的活化菌株，包括抗锌细菌ZS2解糖假苍白杆菌CGMCCNo.9930、抗铅锌细菌PS45苏云金芽孢杆菌CGMCC No.9934、抗铅细菌PS5黄色微球菌CGMCCNo.9929，接入液体种子发酵培养基A进行摇瓶发酵，恒定温度32±1℃，摇床转速200-220rpm，待菌株发酵达到对数期时停止发酵；
步骤二：复合发酵：
调节液体复合菌发酵培养基B的pH至6.5-6.8，并进行常规灭菌处理，按液体质量6-9％无菌操作接入步骤一获得的复合菌种子发酵液。复合菌中解糖假苍白杆菌ZS2、苏云金芽孢杆菌PS45、黄色微球菌PS5均处于对数期，其比例为1:(1.5-2):1，恒定温度35±1℃，搅拌速度200-250rpm，通风量0.25-0.28M3/min，罐压0.07-0.08MPa，持续发酵68-72hr，显微镜检测发酵液中细菌数目达到9.0×1011个/mL时终止发酵；
步骤三：活菌细胞收集：
分别收集步骤二复合液体复合菌发酵培养基B的发酵液，用酵母分离离心机离心分离除去发酵液中的水，获得浅黄色粘稠状菌体细胞；
步骤四：复合微生物制剂制备：
在步骤三获得的浅黄色粘稠状菌体细胞中，按照菌体与甘油的体积比1：(0.5-0.8)的比例加入甘油，并搅拌混合均匀。再按照体积比1：(1.2-1.5)的比例加入细度为300目的硅藻土，搅拌混合均匀，获得浅黄色固体制剂即目的复合微生物制剂产品。
4.一种适用于铅锌-抗生素-抗性基因污染土壤修复的复合微生物菌剂，其特征在于：步骤一中，液体发酵培养基A的配方如下：
甘油15-20g/L，NaNO3 2.0-2.5g/L，(NH4)2SO4 2.0-2.5g/L，MgSO4·7H2O0.5-0.8g/L，K2HPO4 1.5-2.0g/L，KH2PO4 1.5-2.0g/L，NaCl 1.0-1.5g/L，CaCl2·2H2O 0.01-0.03g/L，FeSO4·7H2O 0.01-0.03g/L，酵母提取物1-1.5g/L，漆黄素0.2-0.4g/L，余量水定容至1L。
5.一种适用于铅锌-抗生素-抗性基因污染土壤修复的复合微生物菌剂，其特征在于：步骤二中，液体发酵培养基B的配方如下：
葡萄糖5-8g/L，玉米浆8-10g/L，NaNO3 2.0-2.5g/L，(NH4)2SO4 3-5g/L，K2HPO4 1.0-1.5g/L，MnSO4·2H2O 0.3-0.5mg/L，Na2HPO4 0.3-0.5g，CaCl2·2H2O0.01-0.03g/L，酵母粉0.01-0.03g/L，漆黄素0.5-1.0g/L，余量水定容至1L。
6.如权利要求1所述的铅锌污染土壤复合微生物修复剂的制备方法制得的铅锌污染土壤复合微生物修复剂。
7.一种适用于铅锌-抗生素-抗性基因污染土壤修复的复合微生物菌剂的制备方法及其应用，其特征在于，复合微生物菌剂与复合污染土壤的质量比为1：(25-30)。
8.根据权利要求7所述的一种硅藻土和抗重金属微生物联合修复污染土壤的方法，其特征在于，所述方法的修复周期是从施用复合微生物菌剂起20～30天。
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