CN114907996B - 卡利比克迈耶氏酵母bjm3及其在林可霉素降解方面的应用、菌剂 - Google Patents

卡利比克迈耶氏酵母bjm3及其在林可霉素降解方面的应用、菌剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及卡利比克迈耶氏酵母BJM3及其在林可霉素降解方面的应用、菌剂。本发明提供的卡利比克迈耶氏酵母BJM3，其分类命名为卡利比克迈耶氏酵母(Meyerozyma caribbica)BJM3，保藏编号为CGMCC NO.24066。该菌株是从华北制药股份有限公司污水处理厂的好氧池里分离得到，该菌株对林可霉素具有较高的降解速率和降解率，并且在降解过程中，不会产生抗性基因，对环境安全无害。对林可霉素菌渣降解试验结果表明，该菌株能够有效降解林可霉素菌渣中的林可霉素，120小时对林可霉素菌渣中林可霉素的降解率达到82.45％，降解速率快且降解率高，为林可霉素菌渣处理提供了新的资源化途径。

Description

卡利比克迈耶氏酵母BJM3及其在林可霉素降解方面的应用、 菌剂
技术领域
本发明涉及卡利比克迈耶氏酵母BJM3及其在林可霉素降解方面的应用、菌剂，属于环境保护领域。
背景技术
菌渣是抗生素生产过程中产生的有机固体废弃物，是生产抗生素的发酵液过滤后产生的固体残渣。抗生素菌渣的主要成分是微生物菌体、残留培养基、残留的抗生素及其代谢产物等。
抗生素菌渣含有丰富的有机营养物，资源化利用价值很大，但其中含有高含量的抗生素残留，如果处置不当，会对生态环境以及人体健康产生潜在的危害。如何实现既能利用其营养成分，又能有效去除抗生素残留，消除其对环境的污染风险，是当前的研究热点。
抗生素菌渣如果不及时妥善处理，其中的抗生素会在土壤和植物中蓄积造成环境污染，并沿食物链传递到人，引起人群过敏、食物中毒，甚至产生致癌、致畸、致突变等作用，严重干扰人类各项生理功能。如通过动物食品摄入人体的抗生素会对人体肠道内正常菌群产生不良影响，破坏肠道内生态区系平衡，使致病菌大量繁殖。动物食品中的耐药菌会传递给人类，威胁人类健康。
另外，菌渣有机质含量较高，可引起二次发酵而产生恶臭，严重污染环境。目前抗生素菌渣的处理处置技术包括焚烧、肥料化(堆肥)、饲料化(被禁止)、填埋和能源化(厌氧发酵生产沼气)等。抗生素菌渣的含水量很高，热值较低，其干燥需要消耗大量的能量，据估算焚烧成本高达2000元/吨。抗生素菌渣含有较多的硫和氮等元素，增加焚烧过程中锅炉的脱硫负担，焚烧产生的氮氧化合物会造成大气污染。
把菌渣用作发酵氮源是另一个资源化的思路。本项目组已经就该抗生素菌渣的生物降解取得以下研究成果。申请公布号CN109022318A的中国发明专利申请公开了枯草芽孢杆菌L1 及其在降解林可霉素菌渣中残留林可霉素的应用，将枯草芽孢杆菌L1接种于残留林可霉素的初始浓度为16.77mg/L的菌渣中，37℃处理6天之后，林可霉素降解率达到95.39％。Li等 (Yonghong Li,Luping Fu,Xuan Li,et al.Novel strains with superiordegrading efficiency for lincomycin manufacturing biowaste.Ecotoxicology andEnvironmental Safety,2021,209:111802)报道，将枯草芽孢杆菌(菌株LMB-A)和粘液红酵母(菌株LMB-D)分别接种于残留林可霉素的初始浓度为1117.55mg/L的菌渣中，144h之后，林可霉素降解率分别达到92.69％和74.05％。
虽然枯草芽孢杆菌对林可霉素菌渣中林可霉素的降解率能够达到90％以上，降解效果较好，但枯草芽孢杆菌属于细菌，有产生抗生素抗性基因的可能和潜力，抗生素抗性基因能在自然界传播进而对环境带来危害。粘液红酵母虽然为真菌，但是其对林可霉素菌渣中林可霉素降解速度慢、降解率较低。
发明内容
本发明的目的在于提供一株卡利比克迈耶氏酵母(Meyerozyma caribbica)BJM3，该菌株能够高效降解林可霉素，可应用于林可霉素菌渣中林可霉素的降解，并且具有较高的降解速率和降解率。
本发明的目的还在于，提供一株卡利比克迈耶氏酵母(Meyerozyma caribbica)BJM3在降解林可霉素方面的应用。
本发明的目的还在于，提供一种由卡利比克迈耶氏酵母(Meyerozyma caribbica)BJM3 制备的菌剂。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一株卡利比克迈耶氏酵母(Meyerozyma caribbica)，其分类命名为卡利比克迈耶氏酵母(Meyerozyma caribbica)BJM3，保藏编号为CGMCC NO.24066。
本发明提供的卡利比克迈耶氏酵母(Meyerozyma caribbica)BJM3，该菌株是从华北制药股份有限公司污水处理厂的好氧池里分离得到。该菌株为真菌，对林可霉素具有较高的降解速率和降解率，并且在林可霉素降解过程中，不会产生抗性基因，对环境安全无害；还能有效降解自来水或土壤中的林可霉素。
本发明还提供了上述卡利比克迈耶氏酵母(Meyerozyma caribbica)BJM3在降解林可霉素方面的应用。
本发明取得的有益效果：该卡利比克迈耶氏酵母BJM3用于降解林可霉素菌渣中的林可霉素时，在120小时之内对林可霉素菌渣中林可霉素的降解率达到82.45％；现有技术中的粘液红酵母(菌株LMB-D)于144小时对林可霉素的降解率达到最高值74.05％；本发明的卡利比克迈耶氏酵母(Meyerozyma caribbica)BJM3对林可霉素菌渣中的林可霉素的降解效果明显优于菌株LMB-D。以上结果表明，本发明的卡利比克迈耶氏酵母BJM3菌株对林可霉素菌渣中的林可霉素的降解速度快且降解率高；并且在降解林可霉素过程中不会产生抗性基因，对环境安全无害，为抗生素菌渣的处理提供新的资源化途径。
为了证明林可霉素降解产物的安全性本发明还分析了该卡利比克迈耶氏酵母(Meyerozyma caribbica)BJM3菌株降解林可霉素的代谢产物，发现这些代谢产物对环境的毒性小于林可霉素本身。
本发明中的卡利比克迈耶氏酵母BJM3对林可霉素具有较高的降解率，可用于降解来源于水、土壤、林可霉素菌渣中的林可霉素；优选的，所述降解林可霉素为林可霉素菌渣中的林可霉素。
进一步地，为了使林可霉素菌渣中的林可霉素得到更好的降解，所述卡利比克迈耶氏酵母(Meyerozyma caribbica)BJM3在降解林可霉素方面的应用包括以下步骤：将卡利比克迈耶氏酵母BJM3菌液接种于林可霉素菌渣中，于25～32℃下培养，实现林可霉素菌渣中林可霉素的降解。
进一步地，为了使林可霉素菌渣中的林可霉素降解的更完全，优选的，所述培养的时间为100～150h。
进一步地，为了充分降解林可霉素菌渣中的林可霉素，所述林可霉素菌渣中林可霉素含量为1000～1200mg/kg；所述林可霉素菌渣来自河南天方药业有限公司，是由林可霉素发酵液压滤后产生的固体废弃物，其中林可霉素残留量为1000～1200mg/kg。
进一步地，为了提高林可霉素菌渣中林可霉素的降解率，所述卡利比克迈耶氏酵母 (Meyerozyma caribbica)BJM3菌液的加入量以林可霉素菌渣重量计为0.2～2mL/g，优选为 0.5mL/g，菌液中活菌数为3×109～4×109cfu/mL。
本发明还提供了一种含有卡利比克迈耶氏酵母(Meyerozyma caribbica)BJM3的菌剂，优选的，所述菌剂用于降解林可霉素菌渣中的林可霉素。
本发明提供的一种含有卡利比克迈耶氏酵母(Meyerozyma caribbica)BJM3的菌剂，该菌剂对林可霉素菌渣中的林可霉素具有较高的降解速率和降解率，能有效降解自来水或土壤中的林可霉素；其中菌剂中的卡利比克迈耶氏酵母(Meyerozyma caribbica)BJM3为真菌，在林可霉素降解过程中的不会产生抗性基因，对环境安全无害。
优选的，所述菌剂为菌液，菌液中的活菌数为3×109～4×109cfu/mL。
进一步地，为了提高菌液对林可霉素菌渣中林可霉素的降解速率，使菌液具有较高的降解活力，所述菌液在培养过程中使用的培养基主要由以下质量分数的组分组成：甘油2％，玉米浆1％，蛋白胨2％，溶剂为水；pH＝6.0。
保藏说明
本发明提供的卡利比克迈耶氏酵母，其分类命名为卡利比克迈耶氏酵母(Meyerozyma caribbica)BJM3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC NO.24066，保藏日期2021年12月09日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号。
附图说明
图1为本发明中卡利比克迈耶氏酵母菌株BJM3菌落形态照片和菌体镜检照片；
图2为本发明中卡利比克迈耶氏酵母菌株BJM3的系统发育树；
图3为本发明中卡利比克迈耶氏酵母菌株BJM3的生长曲线；
图4为本发明中菌株LMB-D和卡利比克迈耶氏酵母菌株BJM3对林可霉素的降解曲线；
图5为本发明中菌株LMB-D和卡利比克迈耶氏酵母菌株BJM3对林可霉素降解率变化曲线；
图6为本发明中林可霉素的降解途径。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明作进一步说明。
实施例卡利比克迈耶氏酵母菌株BJM3及其在林可霉素降解方面的应用，具体说明如下：
实施例1卡利比克迈耶氏酵母菌株BJM3的筛选与鉴定
1、材料
菌种筛选所用培养基(液)及其配方(g/L)如下：
普通肉汤固体琼脂培养基质量终浓度组成：蛋白胨10，牛肉膏3，氯化钠5，琼脂20，溶剂为水，pH值为7.4。
林可霉素降解性能验证培养基质量终浓度组成：蛋白胨10，牛肉膏3，氯化钠5，林可霉素3.5，溶剂为水，pH值为7.4。
YEPD(一)培养基质量终浓度组成：葡萄糖20，酵母浸粉10，蛋白胨20，溶剂为去离子水(相当于酵母浸粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，溶剂为去离子水)。
YEPD(二)培养基质量终浓度组成：甘油20，玉米浆10，蛋白胨20，溶剂为去离子水，pH为6.0(甘油2％，玉米浆1％，蛋白胨2％，溶剂为去离子水)。
矿物质基础培养基：K2HPO4 1.6，KH2PO4 0.4，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl2·2H2O0.0025， FeCl3·6H2O 0.0023，NH4NO3 0.5，溶剂为去离子水。
2、菌种筛选
将从华北制药股份有限公司污水处理厂的好氧池里取得的污水稀释不同倍数(即2.5倍、 25倍、250倍、2500倍和25000倍)，加入林可霉素至最终浓度为10g/L，然后将上述污水林可霉素混合物涂布到平板上，于37℃培养24h。
结果表明，在林可霉素为10g/L的平板上长出几个菌落，该菌落能够在含高浓度的林可霉素且以林可霉素为唯一碳源的平板上生长，可以判断其具有较强的林可霉素降解能力。
3、菌种鉴定
3.1形态学特征
根据菌落特征和显微镜观察结果，见附图1；
菌株的菌落特征：细胞为圆形和椭圆形，0.1cm粘稠状乳白色菌落、无气味，菌苔表面光滑湿润，易被挑起，边缘比较透明、整齐，没有孢子及假菌丝。
3.2分子生物学特征
3.2.1菌丝体的制备
将纯化后的菌体接种于普通肉汤培养基中，28℃培养36～48h，待菌丝体生长至直径4mm 以上(比绿豆大一些比黄豆小一些)时最佳。
3.2.2菌丝体的分离与保存
将制备好的菌丝体移入10mL离心管中，-20℃冷冻保存24h；具体操作方法如下：取5mL 移液枪头，用剪刀将枪头前端6mm处(确保能吸入菌丝体且不外漏)剪掉，用此枪头吸取菌液转入离心管中，将装有菌液的离心管放入离心机中于5000r/min离心20min，弃上清液。
3.2.3超声提取DNA
在菌丝体中加入无菌水摇匀后超声震荡10min，于5000r/min离心10min，在沉淀中加入氯化苄提取缓冲液3mL(pH＝9.0)，20％SDS溶液0.4ml，氯化苄原液2.4mL。
充分震荡摇匀后于50℃水浴1～2h，每隔10min摇匀一次，待菌丝体完全溶解后加入0.1m 乙酸钠溶液(pH＝5.2)2.4mL。冰浴15min。冰浴后于5000r/min离心15min。取上清液4mL 至新的离心管中，加入异丙醇4mL，混匀后室温沉淀20min再于5000r/min离心10min，用80％乙醇洗涤沉淀两次，在超净台中将乙醇吹干(要保持沉淀的湿润)。加入300μL1×TE重溶DNA沉淀得到DNA粗品。取200μL粗提DNA于1.5mL离心管中，加入等体积的氯仿，轻轻上下颠倒30次，然后于18℃，12000r/min离心5min，所得上清液即为真菌DNA。
3.2.4PCR扩增及电泳检测
采用18S rRNA通用模板NS1(5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’)和NS2 (5’-GGCTGCTGGCACCAGACTTGC-3’)对真菌的DNA进行扩增。
PCR扩增体系20μL：上下游引物各0.5μL，提取的DNA模板0.5μL(10～100ng/μL)，灭过菌的超纯水8.5μL，最后加入2×Ex Tap酶10μL。
PCR扩增程序的运行参数：PCR扩增程序的运行参数：
(94℃，5min)+{(94℃，30s)+(55℃，30s)+(72℃，1min)}×30+(72℃，7min)。
扩增后的PCR产物的电泳检测：扩增结束的PCR产物，使用1×TE作为电泳的缓冲液，采用1％琼脂糖凝胶进行电泳，并使电泳缓冲液没过凝胶块；再分别加入待测样品和Trans2K Plus II DNA Marker 4uL，设置电压140V，时间15min。电泳结束后，通过自动对焦凝胶成像分析仪观察胶块上的目的条带，将结果符合要求的PCR原液(不少于10μL)送至送杭州金唯智公司进行测序。
经18sRNA鉴定，该菌株(18SRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)为卡利比克迈耶氏酵母(Meyerozymacaribbica)BJM3。
通过BioEdit 7.2.6查看测序结果的序列峰图，选取波峰波谷清晰连续可读的碱基序列，在NB数据库中通过BLAST系统，将目的序列与核酸序列库GenBank中的序列进行同源比对，确定菌株所属种类，并下载多个相似序列，使用MEGA8.5软件构建系统进化树，确定菌株的进化分类。最终确定了该菌株的系统发育树，详见附图2。
实施例2卡利比克迈耶氏酵母菌株BJM3的培养
将实施例1筛选鉴定出的菌株接入普通肉汤培养基中于30℃、200r/min培养并定时取样，在显微镜下观察菌种的增殖情况并测定600nm的吸光度，观察该菌株的生长情况，并绘制生长曲线，详见附图3。
从图中可以看出，该菌株的对数期在28～36h出现，稳定期在36～48h。
实施例3卡利比克迈耶氏酵母菌株BJM3降解林可霉素初步验证试验
降解林可霉素的酶系是微生物的次级代谢产物，在稳定期开始分泌，所以采用稳定期的卡利比克迈耶氏酵母菌株BJM3微生物细胞用于林可霉素降解验证试验。
按实施例2方法将卡利比克迈耶氏酵母菌株BJM3培养至稳定期(40h)，菌液中OD600值为1.25，取该菌液5mL接入100mL林可霉素降解性能验证培养基中，于30℃、200r/min 培养48h。培养结束后于8000rpm离心10min并用0.45μm的水滤膜过滤，在清液中加入硼酸和甲醇后于60℃水浴30min，然后再于8000rpm离心10min并用0.45μm滤膜过滤，得滤液。
采用高效液相色谱法测定滤液中的林可霉素；固定相：液相色谱用十八烷基硅烷键合硅胶(5μm)柱，4.6mm×200mm；流动相：0.05M的硼砂溶液(用85％的磷酸溶液调节pH值至6.1)和甲醇混合(体积比为42:58)，流速：1mL/min；柱温：30℃，检测器：紫外检测器，检测波长：214nm。
在上述条件下，0～8.0mg/mL范围内林可霉素标准品水溶液浓度(×)与紫外吸收(峰面积，y)成线性关系，线性回归方程是y＝1.1013X-0.0203，R2＝0.9997。
将所得滤液按照上述高效液相色谱条件测定滤液中林可霉素的峰面积，然后将峰面积代入线性回归方程，计算出林可霉素的浓度；进而计算林可霉素的降解率，结果表明林可霉素的降解率达到37.5％，说明该菌株具有降解林可霉素的能力。
实施例4卡利比克迈耶氏酵母菌株BJM3培养基和培养条件优化
将卡利比克迈耶氏酵母菌株BJM3接种至麦芽汁培养基、YEPD(一)培养基和普通肉汤培养基中，30℃培养30h(对数期内)后检测OD600数值，结果表明酵母菌株BJM3在YEPD(一)培养基中生长最快。
在YEPD(一)培养基的基础上依次改变其中一个因素，培养30h取样测定600nm的吸光度，依次对碳源种类及氮源种类，培养基初始pH、培养温度、装液量及转速进行优化，结果如下：
(1)碳源的选择
该酵母菌株BJM3在YEPD(一)培养基中生长最快，固定YEPD(一)培养基的组分 (酵母浸粉1％，蛋白胨2％)，碳源的添加量均为2％，只改变碳源的类别，30℃培养30h(对数期内)后，测定OD600。
表1 碳源的影响
碳源 淀粉 甘油 蔗糖 麦芽糖 葡萄糖
OD600 5.670 8.585 7.449 7.856 5.716
上述表中结果表明，YEPD培养基采用甘油作为碳源时，酵母菌株BJM3的生长状况最好。
(2)氮源的选择
固定YEPD培养基的组分(甘油2％)，替换酵母浸粉的氮源添加量为1％，和/或替换蛋白胨的氮源添加量为2％，只改变氮源种类，30℃培养30h(对数期内)后，测定OD600。
表2 氮源的影响
综合考虑成本和培养效果，YEPD培养基采用玉米浆和蛋白胨作为氮源时，酵母菌株 BJM3的长势最好。
(3)pH的选择
在优化的培养基(甘油2％，玉米浆1％，蛋白胨2％)基础上，分别调节培养基pH至5.0～8.0，于30℃培养30h(对数期内)后，测定OD600。
表3 pH值的影响
pH 5.0 6.0 7.0 8.0
OD600 8.608 9.032 8.174 7.626
由表中结果可知，酵母菌株BJM3生长的最适pH值为6.0，生长条件偏酸性。
(4)温度的选择
在优选的培养基(甘油2％，玉米浆1％，蛋白胨2％，pH值6.0)基础上，分别设置不同温度对酵母菌株BJM3培养30h(对数期内)后，测定OD600。
表4 温度的影响
温度/℃ 25 28 30 32
OD600 9.174 10.273 4.527 5.475
由表中结果可知，酵母菌株BJM3的最佳培养温度为28℃。
(5)装液量的选择
在上述优选的培养基(甘油2％，玉米浆1％，蛋白胨2％，溶剂为去离子水，pH值6.0) 基础上，改变容器中菌液的装液量，28℃培养30h，不同装液量对该菌株生长浓度的影响(摇床水平优化)，结果如表5所示：
表5 装液量的影响
装液量(％) 35 40 45 50
OD600 7.256 9.323 10.727 8.392
由表中结果可知，在装液量为45％时，酵母菌株BJM3的生长情况最好。
(6)转速的选择
在上述优选的培养基(甘油2％，玉米浆1％，蛋白胨2％，溶剂为去离子水，pH值6.0， 28℃，装液量45％)的基础上，考察不同转速对菌株生长情况的影响，结果如表6所示：
表6 转速的影响
转速r/min 150 180 200
OD600 9.313 11.724 12.862
由表中结果可知，酵母菌株BJM3生长最适转速为200r/min。
实施例5
卡利比克迈耶氏酵母菌株BJM3和粘液红酵母(菌株LMB-D)对林可霉素菌渣中的林可霉素的降解效果实验，具体如下：菌株LMB-D为Li等(Yonghong Li,Luping Fu,Xuan Li,et al. Novel strains with superior degrading efficiency for lincomycinmanufacturing biowaste. Ecotoxicology and Environmental Safety,2021,209:111802)文献中提到的菌株。
林可霉素菌渣取自河南天方药业有限公司，是由林可霉素发酵液压滤后产生的固体废弃物，其中林可霉素的残余含量为1117.55mg/kg。
将5mL在最优条件(YEPD(二)培养基配方：甘油2％，玉米浆1％，蛋白胨2％，pH 值6.0，装液量45％，转速200r/min，28℃)下培养至稳定期的卡利比克迈耶氏酵母菌株BJM3的菌液(OD600值为1.25；活菌数为3.2×109cfu/mL)和5mL培养至稳定期的菌株LMB-D(OD600值为1.25)分别接入10g灭菌的林可霉素菌渣中；分别放入培养箱中于28℃下静置培养144h。
在培养不同时间后进行取样，溶于10倍体积的甲醇中摇匀、过滤，采用高效液相色谱方法测定，然后计算出林可霉素的浓度和林可霉素的降解率；详细结果如附图4和附图5。
由图中结果可知，最初20小时卡利比克迈耶氏酵母BJM3降解速度略低于菌株LMB-D，20小时后卡利比克迈耶氏酵母BJM3的降解速度远远超过了菌株LMB-D；到100h时，两株菌株达到几乎相同的降解率，120小时卡利比克迈耶氏酵母BJM3对林可霉素的降解率达到最高，达到了82.45％；而菌株LMB-D的林可霉素降解率于144小时达到最高值，降解率仅为74.05％；说明，本发明中的卡利比克迈耶氏酵母BJM3比菌株LMB-D总降解速度快且降解率高。
实施例6卡利比克迈耶氏酵母菌株BJM3降解林可霉素的降解产物分析
为了进一步了解林可霉素的生物降解机制，采用卡利比克迈耶氏酵母菌株BJM3对林可霉素(含有3.5g/L林可霉素的矿物质基础培养基)进行降解3天处理，降解产物经过预处理后通过HPLC-(+)ESI-MS分析降解产物。
预处理步骤如下：将样品用二氯甲烷萃取以去除无机盐和其他水溶性杂质，所得有机相通入氮气吹干，干燥所得粉固体用甲烷溶解并经0.45μm滤膜过滤以去除蛋白质，这个过程重复三次；最后用甲烷吹干后溶解于色谱纯甲醇进行HPLC-MS(SHIMADZU LC-30A)分析。
林可霉素及其降解产物通过梯度洗脱进行分离：固定相选用Kinetex RP C18色谱柱(2.6 μm，50mm×2.1mm)，柱温40℃。
MS：测量模式选择电喷雾电离，毛细管电压为5.5kV，雾化器温度为450℃。优化调谐部分条件以达到最高的灵敏度。
流动相由0.1％甲酸水溶液(A)和0.1％甲酸的甲醇溶液(B)组成。梯度洗脱程序如下：0～3 min，100％A；3～6min，90％A和10％B；6～9min，70％A和30％B；9～12min 50％A和50％B； 12～13min，80％A和20％B；13～15min 90％A和10％B，流速为0.3mL/min。记录离子的质量准确度为±5ppm。在100–1000m/z范围内进行全扫描。
HPLC-MS分析结果表明，经卡利比克迈耶氏酵母菌株BJM3处理后林可霉素的羟基化产物和降解产物(M1、M2、M3和M4)的分子离子保留时间分别在3min、6.61min、2.86min 和0.77min。依据降解产物推测林可霉素的降解途径，详见附图6；在降解产物中，分子离子(m/z)峰为393的产物M1被鉴定为N-去甲基林可霉素，是林可霉素生物合成中的前体物质，该产物可能由脱甲基酶催化林可霉素降解产生，降解步骤可能与林可霉素合成步骤相反。吡咯烷环上的甲基基团很容易去除，导致M1的响应值比M2和M3大得多。分子离子(m/z)为359的M2是通过失去与吡喃糖环相连的硫甲基而形成。分子离子(m/z)为172的M3被鉴定为2-丙基-N-甲基脯氨酸，可能是林可霉素经酰胺酶催化降解产生的中间体。经检索文献，发现这些代谢产物不具有抗生素的活性，且无明显的环境毒性。
<110> 河南金百合生物科技股份有限公司 郑州大学
<120> 卡利比克迈耶氏酵母BJM3及其在林可霉素降解方面的应用、菌剂
<160> 1
<170> Patent In Version 3.5
<210> 1
<212> DNA
<213> 卡利比克迈耶氏酵母（Meyerozyma caribbica）
<221> 18S rRNA基因
<400> 1
actgcgaatg gctcattaaa tcagttatcg tttatttgat agtaccttta ctacttggat 60
aaccgtggta attctagagc taatacatgc taaaaatccc gactgtttgg aagggatgta 120
tttattagat aaaaaatcaa tgctctttga gctctttgat gattcataat aacttttcga 180
atcgcatggc cttgtgctgg cgatggttca ttcaaatttc tgccctatca actttcgatg 240
gtaggatagt ggcctaccat ggtttcaacg ggtaacgggg aataagggtt cgattccgga 300
gagggagcct gagaaacggc taccacatcc aaggaaggca gcaggcgcgc aaattaccca 360
atcccgacac ggggaggtag tgacaataca taacgataca gggccctttc gggtcttgta 420
attggaatga gtacaatgta aataccttaa cgaggaacaa ttggagggca agtctgg 477
<210> 2
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> NS1
<400> 2
gtagtcatat gcttgtctc 19
<210> 3
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> NS2
<400> 3
ggctgctggc accagacttg c 21

Claims (10)

1.一株卡利比克迈耶氏酵母（Meyerozyma caribbica），其特征在于，其分类命名为卡利比克迈耶氏酵母（Meyerozyma caribbica）BJM3，保藏编号为CGMCC NO.24066。
2.如权利要求1所述的卡利比克迈耶氏酵母（Meyerozyma caribbica）在降解林可霉素中的应用。
3.根据权利要求2所述的卡利比克迈耶氏酵母（Meyerozyma caribbica）在降解林可霉素中的应用，其特征在于，所述降解林可霉素为降解林可霉素菌渣中的林可霉素。
4.根据权利要求2或3所述的卡利比克迈耶氏酵母（Meyerozyma caribbica）在降解林可霉素中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤，将卡利比克迈耶氏酵母BJM3菌液接种于林可霉素菌渣中，于25~32℃下培养，实现林可霉素菌渣中林可霉素的降解。
5.根据权利要求4所述的卡利比克迈耶氏酵母（Meyerozyma caribbica）在降解林可霉素中的应用，其特征在于，所述培养的时间为100~150 h。
6.根据权利要求4所述的卡利比克迈耶氏酵母（Meyerozyma caribbica）在降解林可霉素中的应用，其特征在于，所述林可霉素菌渣中林可霉素的含量为1000 ~1200 mg/kg。
7.根据权利要求4所述的卡利比克迈耶氏酵母（Meyerozyma caribbica）在降解林可霉素中的应用，其特征在于，所述卡利比克迈耶氏酵母BJM3菌液的加入量以林可霉素菌渣重量计为0.2~2mL/g，菌液中的活菌数为3×109~4×109cfu/mL。
8.一种含有如权利要求1所述的卡利比克迈耶氏酵母（Meyerozyma caribbica）的菌剂，其特征在于，所述菌剂用于降解林可霉素菌渣中的林可霉素。
9.根据权利要求8所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为菌液，菌液中的活菌数为3×109~4×109cfu/mL。
10.根据权利要求9所述的菌剂，其特征在于，所述菌液所使用的培养基由以下质量分数的组分组成：甘油2%，玉米浆1%，蛋白胨2%，溶剂为水；pH=6.0。
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