CN109628338B - 一种根瘤菌t37及其用途、含有该根瘤菌t37的生物修复菌剂及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及环境无机污染物生物处理技术领域，具体涉及一种根瘤菌T37及其用途、含有该根瘤菌T37的生物修复菌剂及其制备方法和用途。该根瘤菌T37，分类命名为Rhizobium xichuanensis T37，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2018年10月29日，菌种保藏号为CCTCC NO：M2018723。该根瘤菌T37可吸附固定土壤中的重金属离子，用于修复重金属污染的环境。

Description

一种根瘤菌T37及其用途、含有该根瘤菌T37的生物修复菌剂 及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及环境无机污染物生物处理技术领域，具体涉及一种根瘤菌T37及其用途、含有 该根瘤菌T37的生物修复菌剂及其制备方法和用途。

背景技术

土壤利用强度大，投入和产出高，受人类活动影响较大的一种资源。随着工业化和城市化 的快速发展，污染物大量排放和不当处置、部分不合格化学品农用等导致我国许多地区的土壤 重金属累积和超标等环境问题日益凸显，已经引起了社会各界的高度关注。据2014年《全国 土壤污染状况调查公报》显示我国受污染土壤总的点位超标率为16.1％，其中无机污染物/重 金属超标点位数占全部超标点位的82.8％，Cd的超标率最高，达到7.0％。无机重金属污染物， 如：Cd、Pb、Cu、等，在土壤中移动性差、滞留时间长、不能被微生物降解，严重恶化土壤环境质量，并可经水、植物等介质进入人体，最终严重影响人类健康。重金属超标土壤的农业 利用是在我国耕地资源十分紧张，粮食和食物安全形势十分严峻前提下的一种不得已的选择。 在此前提下，寻求边利用、边修复的有效途径具有重要的意义。因此，在产业快速发展、民众 关注食品安全和健康的国情下，如何通过重金属超标土壤安全利用和肥料保障等措施来减少蔬菜或农作物中的重金属含量是关键问题。

重金属污染的微生物固定修复作为一种廉价、高效、环保修复技术逐渐成为国内外研究的 热点。其中，细菌修复是指利用细菌对重金属吸附固定或转化为低毒产物，固定或钝化其生物 有效性，从而降低重金属的有效态含量，阻控农作物对重金属的吸收。在“土壤-植物-微生物” 这个充满活力的生态系统，根际土壤中存在着数量和种类丰富的细菌种群，是根际环境中最重要的生物因素。重金属污染土壤中根际和根内重金属抗性细菌与植物根系以及土壤形成特殊根 际微环境，影响植物生长、重金属吸收和转运过程。根际促生细菌通过产生植物生长激素促进 植物生长，改变根际微环境中重金属元素生物有效性，调控植物对重金属的吸收和富集效率。 近年来研究成果表明：根际促生菌通过菌体表面活性基团吸附，诱导植物系统抗性，激活植物抗氧化酶活性，分泌高亲和性铁载体增加根际铁供给量，竞争性抑制重金属元素的根系吸收， 改变植物重金属的吸收、转运及胞内分布过程，抑制重金属元素向植物地上部分转运，同时增 加农作物产量和微生物种群多样性。相比无机、有机改良剂，植物促生细菌作为重金属钝化剂 不仅能够固定土壤中的重金属，减少植物对重金属的吸收，还能够促进作物生长、改善作物品质，改善重金属污染农田土壤理化性质和结构以及环境友好，有益于农业可持续发展等优点。

发明内容

本发明的目的之一是针对现有技术中的不足，提供一种可以吸附环境中的重金属离子的根 瘤菌T37。

本发明的目的之二在于提供上述根瘤菌T37在重金属污染的环境修复中的应用；

本发明的目的之三在于提供一种含有根瘤菌T37的生物修复菌剂，该生物修复菌剂可用于 修复重金属污染的环境；

本发明的目的之四在于提供上述含有根瘤菌T37的生物修复菌剂的制备方法；

本发明的目的之五在于提供上述含有根瘤菌T37的生物修复菌剂在重金属污染的土壤修 复中的应用。

一种根瘤菌T37，分类命名为Rhizobium xichuanensis T37，保藏于中国典型培养物保 藏中心(CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市洪山区八一路，武汉大学，保藏日期为2018年10月29日，菌种保藏号为CCTCC NO：M2018723。

优选的，所述根瘤菌T37的培养条件为：培养基为TSA、NA或LB琼脂培养基，在 10-40℃、pH 5.5-9.0和0-2％NaCl(质量分数)下培养。

优选的，所述根瘤菌T37的培养条件为：在28℃、pH7.0和无NaCl下培养。

本发明所述的保藏号为CCTCC NO：M2018723的根瘤菌T37在重金属污染的环境修复 中的应用。

一种含有保藏号为CCTCC NO：M2018723的根瘤菌T37的生物修复菌剂。

优选的，所述生物修复菌剂为液体制剂，其中含有保藏号为CCTCC NO：M2018723的根瘤菌T37菌株的有效活菌数为10亿个/mL以上。

一种含有保藏号为CCTCC NO：M2018723的根瘤菌T37的生物修复菌剂的制备方法，包括下述步骤：(1)将根瘤菌T37在培养皿上活化，接种于试管斜面上备用。试管种接 种至含100mL LB培养基的250mL摇瓶中，振荡培养至对数期；(2)发酵罐中投入配制 好的培养基，投料结束后121℃高压湿热灭菌；(3)冷却至30℃后，将步骤(1)培养好 的摇瓶菌种按2％的接种量接种入发酵罐，接种后的发酵罐温度控制在30℃，培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6，搅拌速度为180转/分，整个工艺流程培养时间为48h；(4) 发酵完成后培养液出罐，分装成液体制剂。

优选的，所述发酵罐中的培养基配方为葡萄糖0.8％，(NH4)₂SO₄ 1.0％，K₂HPO₄0.2％， MgSO₄ 0.05％，NaCl 0.01％，酵母膏0.02％，pH值7.2-7.5，所述培养基的体积占发酵罐体 积的80％。

一种含有保藏号为CCTCC NO：M2018723的根瘤菌T37的生物修复菌剂在重金属污染 的环境修复中的应用。

优选的，上述含有保藏号为CCTCC NO：M2018723的根瘤菌T37的生物修复菌剂应用于修复重金属污染环境中的萝卜。

本发明的有益效果是：本发明分离得到的新菌株根瘤菌T37通过DNA-DNA杂交实验证实， 与现有已知菌株的相关性最大为48.7％，远低于国际系统细菌学委员会在1987年关于DNA相关 性为70％的界限规定；经生理生化特性鉴定，本发明的新菌株根瘤菌T37在多项生理生化指标 上与参比菌株均有差别；本发明的新菌株根瘤菌T37有效吸附环境中的重金属离子，丰富了种 质资源，可用于重金属污染环境的修复。

本发明的含有根瘤菌T37的生物修复菌剂可通过发酵获得液体制剂，制备方法简单，便于 使用。

本发明的含有根瘤菌T37的生物修复菌剂经田间实验证实，可使根际土中有效态的Cd和Pb 的含量显著降低，也可一定程度上使非根际土中的有效态的Cd和Pb的含量降低；本发明的含有 根瘤菌T37的生物修复菌剂可显著提高根际土的pH，进而可吸附更多的重金属离子，也可一定 程度上提高非根际土的pH。

本发明的含有根瘤菌T37的生物修复菌剂，可以使萝卜可食用部分中重金属的含量下降 80％以上，达到国家食品安全标准，且生产和使用成本较低，具有广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描 述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实 施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的根瘤菌T37的16S rDNA系统发育进化树；

图2菌株T37吸附重金属前后的扫描电镜和能谱观察图；

图3为萝卜田间实验图；

图4为不同处理对萝卜根际土和非根际土Cd和Pb的DTPA提取态含量的影响

注：不同字母(a-c)表示处理之间有显著差异(p<0.05)

图5：不同处理对萝卜根际土和非根际土pH值的影响

注：不同字母(a-b)表示处理之间有显著差异(p<0.05)

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实 施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：分离、纯化获取根瘤菌T37，观察其菌落特征，确定其生长特性

1、供试土壤、培养基和植物

供试土壤来自河南省淅川县某铅镉矿区周围农田土壤

LB培养基(g/L)：酵母膏5.0，NaCl 10.0，蛋白胨10.0，固体培养基加入1.5％的琼脂粉， 121℃灭菌30min。

2、菌株T37的分离、筛选与纯化

取新鲜农田土样0.5g放到含有50mL无菌去离子水的摇瓶内，摇瓶内含有5颗玻璃珠，150 rpm，震荡培养30min，然后取1mL菌悬液梯度稀释成10^-4、10^-5，涂布于含有100mg L^{- 1}Cd²⁺和500mg L^-1Pb²⁺的Luria-Bertani's(LB)固体平板上，30℃培养3d。之后从长出来的菌落中 依据菌落大小、边缘形状和颜色等指标挑取菌落，纯化保存。然后对这些细菌进行摇瓶吸附试 验，以LB液体培养基为基础，灭菌后添加重金属Cd、Pb母液，使其浓度为10mg L^-1和50mg L^-1。 将培养18h左右的供试菌株制备成菌悬液，调节optical density 600(OD₆₀₀)值为1.0左右，按 1％的比例接入上述含重金属的培养基中，30℃，150rpm振荡培养。设置动态取样时间点为0、 2、4、6、8、12、18、24h。同时设置无菌水作为对照做相同处理。采用Inductively coupled plasma-optical emission spectrometer(ICP-OES)测定上清液中Cd、Pb浓度。通过计算得出供试 菌株对培养基中Cd、Pb离子的去除率。挑取重金属去除率最高的5个菌株进行测序。经测序， 发现了一株新菌种——菌株T37，分类命名为Rhizobiumxichuanensis T37，保藏于中国典型培 养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市洪山区八一路，武汉大学，保藏日期为2018 年10月29日，菌种保藏号为CCTCC NO：M2018723。

3、菌株T37的分类鉴定

3.1菌落特征观察

取菌株T37的单菌落，划线至LB固体培养基上，30℃培养5d，观察其菌落的大小、颜色、边缘、凸起、透明度等特点。

结论：菌株T37是好氧的革兰氏阴性菌。细胞呈杆状，无芽孢，无鞭毛。菌株可以在TSA， NA和LB琼脂培养基上生长。在LB固体培养基上，30℃培养2天后，菌落直径约为0.8mm，圆形，凸起，边缘光滑。

3.2菌株的生长特性

挑取在LB固体培养基上培养24h的新鲜培养物，接种到LB液体培养基中，30℃摇床培 养18h，作为种子液。

所培养的T37种子按2％(v/v)接种量转接氯化钠浓度分别为0.0％、2.0％、3.5％、5.0％、7.0％、 9.0％和10.0％的LB培养基，30℃培养，48h后时测定其生长情况。

用无菌的1mol/L HCl和1mol/L NaOH将灭好菌的LB培养基调至pH值分别为3.0、4.0、 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、8.5、9.0、10.0和11.0，将所培养的T37种子按2％接种量接入，30℃培养，48h后时测定其生长情况。

将所培养的T37种子按2％(v/v)的接种量转接新鲜的LB液体培养基中，混匀。分别置于4℃、 10℃、15℃、20℃、28℃、37℃、45℃、50℃和60℃的水浴培养，每个温度梯度设置三个平行， 48h后时测定其生长情况。

结论：菌株T37生长发生在10-40℃，4℃和45℃不能生长，最适温度为28℃。菌株T37 可以在pH 5.5-9.0(最适pH7.0)和0-2％NaCl(最适0％)下生长。

实施例二：新菌株T37的遗传信息鉴定

1、16S rDNA基因序列的扩增、序列测定及系统发育树的构建

本发明采用高盐法进行菌株T37基因组DNA的提取：将菌株T37在LB固体平板上划线培养 活化菌株，置于30℃下培养24h，挑取单菌落至LB液体培养基中，于30℃，160rpm下培养至对数期；12000rpm离心5min收集菌体至2mL的无菌离心管中，加入1.0mL TE缓冲液洗涤T37 菌体，待菌体被洗涤至无培养基残留后再加入1.0mL TE缓冲液将菌体重新悬浮；加入溶菌酶 至终浓度为20mg/mL，在37℃下温浴2h后加入8μL蛋白酶K(20mg/mL)和50μL 10％SDS， 65℃水浴2h，使其澄清(或37℃过夜至澄清)；加入三分之一体积的饱和NaCl溶液充分震荡 混匀15s，65℃水浴10min，12000rpm离心10min，小心地将上清液转移到洁净无菌的离心管中，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25:24:1)进行抽提至界面无蛋白为止，收集上清；再将上 清液转移到另外一个洁净无菌的离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，上下颠倒混匀使其沉淀； 将沉淀的DNA用洁净的毛细管挑出后用70％乙醇洗涤干净，置于超净台风口处使乙醇完全挥 发；最后用50μL的无菌水将DNA溶解，于-20℃冰箱保存。

用于16S rDNA基因序列扩增反应的引物为一对通用引物。上游引物为 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物为5′-TACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应体 系为50μL，包括10×Buffer 5μL，dNTP(20mmol/L)4μL，引物(25pmol/μL)各1μl，Mg²⁺(25 mmol/L)4μL，菌体DNA(约50ng/μL)1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.3μL，加超纯水至50 μL。反应条件^[5]：95℃预变性5min；94℃变性30s；54℃退火30s；72℃，延伸1min；30 个循环，72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的大小(1.5kb左右)，采用PCR回收 试剂盒回收16S rDNA的基因片段，TA克隆后进行测序。测序结果通过在线分析 (www.ezbiocloud.net)，与GenBank中的16S rDNA基因序列进行相似性比较，构建系统进化树。

结论：以菌株T37的总DNA为模板，16S rDNA基因通用引物为引物进行PCR扩增，得到总长为1397bp的T37 16S rDNA基因序列。将该序列在EZtaxon数据库 (https://www.ezbiocloud.net)中进行比对，结果表明菌株T37与Rhizobium属的亲缘关系最近， 其中与Rhizobium skierniewicense Ch 11^T的16S rDNA序列相似度最高，为97.99％，与Rhizobium nepotum 39/7^T的16S rDNA序列相似度为97.77％，与Rhizobium rubi NBRC13261^T的16S rDNA序列相似度为97.48％，与Rhizobium radiobacter ATCC 19358^T的16SrDNA序列 相似度为97.27％，故将菌株T37初步鉴定为Rhizobium属，并将其命名为Rhizobium sp.T37。

通过Neighbor-Joining法构建菌株T37的系统进化树(详见说明书附图图1)表明，菌株 T37位于Rhizobium属进化树内部，后续通过多相分类手段对菌株T37进行分类地位的鉴定。

其中，T37 16S rDNA基因序列(1397bp)为：

CGCCTGGCGGCAGCTTACCATGCAGTCGAACGCCCCGCAAGGGGAGTGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATCTACCG TGCCCTGCGGAATAGCTCCGGGAAACTGGAATTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGATTTATCGGGGTATGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCA CATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAG CCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATATTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCAGAGCTCAACTCTGGAACTGCCTTTGATACTGGGTATCTTGAGTATGGA AGAGGTAAGTGGAATTGCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGCAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGTCCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAAT GTTAGCCGTCGGGCAGTTGACTGTTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAG CTCTTGACATTCGGGGTATGGGCAGTGGAGACATTGTCCTTCAGTTAGGCTGGCCCCAGAACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCA CTCTAAGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAGCGAGACAGCGATGTCGAGCTAATCTCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATT GCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCCATGGGAGTTGGTTTTAACCCGAAAGGCGCTGCGCTAACCGCAAAGGAGCCAGGCGGA CCCATCGGAGGTACAGCGCC

2、新菌株T37G+C含量的测定

基因组DNA的提取方法如上所述。

取0.1-0.2mL抽提所得DNA(约1mg/mL)溶液低压冻干，加入1μL高氯酸(优级纯)，封管，沸水浴中加热水解1h

用HPLC测定四种脱氧核糖核苷酸标准品混合液

标准品以每种每毫升0.1mg的量配成混合液。经过HPLC后，得到峰面积，计算出单位 峰面积中脱氧核糖核苷标准品的毫克分子数。

用HPLC测定样品DNA

样品色谱图中各种核糖核苷的峰面积，乘以单位峰面积中每种脱氧核糖核苷酸标准品的毫 克分子数，即得出样品DNA中4种脱氧核糖核苷酸的毫克数。

计算(G+C)mol％含量

(G+C)mol％含量的计算公式：(G+C)mol％＝(G+C)/(G+C+A+T)

结果显示：菌株T37的G+C含量为53.3％，与参比菌株在含量上有一定的差异。其中参 比菌株2(Rhizobium skierniewicense Ch 11^T)的G+C含量为57.2％，参比菌株3(Rhizobium rubi NBRC 13261^T)的G+C含量为51.3％，参比菌株4(Rhizobium radiobacterATCC 19358^T)的G+C含量为55.6％， 参比菌株4(Rhizobium nepotum 39/7^T)的G+C含量为49.3％。

2、新菌株T37与参比菌株的DNA-DNA杂交

2.1菌体DNA抽提

DNA的提取方法如上所述，DNA沉淀溶于0.1×SSC缓冲液中备用。SSC缓冲液：在800ml 水中溶解175.3g NaCl和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/l NaOH溶液调节pH值至7.0，加 水定容至1L，分装后高压灭菌。

2.2DNA纯度分析

将抽提的DNA样品分别测其260nm、280nm、230nm的吸光度，纯度要求为A₂₆₀：A₂₈₀：A₂₃₀＝1.0：1.515：0.450，DNA浓度要求在A₂₆₀＝1.5-2.0(约50μg/ml)。

2.3复变速率法测定DNA样品的同源性

DNA样品预处理：剪切DNA样品，使片段大小为2-5×10⁵dalton之间。

DNA变性：取样品A、B各1.5ml分别装到两支试管中，再取A、B各0.75ml装在同一 只试管中混匀为M。三个样品分别置于沸水浴中变性15min，用预热吸管吸取10×SSC 0.36mL分别加入上述变性样品中，使终浓度为2×SSC，继续变性5min，立即上样。

测定DNA复变速率：样品在260nm处，用可加热的比色杯达到最适复变温度(最适复变温度＝47.0+0.51×(G+C％)))时的吸光度作为0，每隔3min，记录一次A₂₆₀吸光度。一般线性区域在0-45min范围内，0-30min为测量段。

计算：复变速率(V)＝(0时吸光度-30min时吸光度)/30，得到V_a，V_b，V_m，并用以 下公式计算DNA-DNA杂交度(D％)

D％＝〔4V_m-(V_a+V_b)]/2(V_a V_b)^1/2〕，其中V_m为按照复变速率(V)＝(0时吸光度-30min 时吸光度)/30公式计算得到的混合样品M的复变速率；V_a为按照复变速率(V)＝(0时吸 光度-30min时吸光度)/30公式计算得到的样品A的复变速率；V_b为按照复变速率(V)＝(0时吸光度-30min时吸光度)/30公式计算得到的样品B的复变速率。

结论：参考16S rDNA比对的结果，对T37与遗传亲缘关系最相似的种Rhizobiumskierniewicense Ch 11^T、Rhizobium rubi NBRC 13261^T、Rhizobium radiobacter ATCC19358^T和Rhizobium nepotum 39/7^T进行DNA-DNA杂交试验。菌株T37与Rhizobiumskierniewicense Ch 11^T DNA杂交度为41.7％、与Rhizobium rubi NBRC 13261^T DNA杂交度为43.7％、与Rhizobium radiobacter ATCC 19358^T DNA杂交度为46.7％与Rhizobiumnepotum 39/7^T DNA杂交度为48.7％， 均远低于国际系统细菌学委员会-(InternationalCommittee on Systematic Bacteriology， ICSB)在1987年关于DNA相关性70％为细菌种的界限规定。结合上述数据可判定，菌株T37为 Rhizobium属的一个新菌种，依照国际细菌系统分类委员会的命名方法，将该新种命名为 Rhizobium xichuanensis sp.nov.。

实施例三：新菌株T37的生理生化特性鉴定

1、利用API 20NE，API ZYM和API 20E鉴定系统(生产厂商：bioMérieux)及常规的生理生化测定方法对菌株T37及参比菌株进行生理生化特征鉴定：

实验步骤参照说明书即可。

检测结果如下表1所示：

表1.菌株T37与参比菌株之间的不同生理生化特征

1：T37；2：Rhizobium skierniewicense Ch 11^T；3：Rhizobium rubi NBRC 13261^T；

4：Rhizobium radiobacter ATCC 19358^T；5：Rhizobium nepotum 39/7^T

+，阳性；-，阴性；w，弱阳性

结论：菌株T37与参比菌株的生理生化差异点，如表1所示。菌株T37可以水解淀粉，但不能水解酪蛋白和吐温80。氧化酶、过氧化氢酶、吲哚、明胶水解、硝酸盐还原反应呈阳性。邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷的生成、VP反应呈现弱阳性。精氨酸二水解酶、柠檬酸盐利用、硫化氢、赖氨酸脱羧酶，鸟氨酸脱羧酶，色氨酸脱氨酶和脲酶反应均为阴性。菌株T37 可以利用以下物质产酸：苦杏仁苷，熊果苷，D-海藻糖，纤维二糖，D-果糖，D-葡萄糖，D- 甘露糖，龙胆二糖，L-鼠李糖，甘油，乳糖，麦芽糖，D-蜜二糖，甲基D-葡萄糖苷，N-乙酰 氨基葡萄糖，核糖，淀粉，D-蔗糖，棉子糖，松三糖，D-木糖和甲基D-甘露糖苷。菌株T37 不能利用以下物质产酸：2-酮基-D-葡萄糖酸盐，5-酮基-D-葡萄糖酸盐，阿东糖醇，D-阿拉伯 糖醇，D-岩藻糖，松二糖，D-半乳糖，D-阿拉伯糖，糖原，D-来苏糖，D-塔格糖，半乳糖醇，赤藓糖醇，葡萄糖酸盐，菊粉，L-阿拉伯糖醇，L-阿拉伯糖，L-岩藻糖，L-山梨糖，D-木糖， 甘露醇，肌醇，水杨苷，甲基木糖苷，山梨糖醇和木糖醇。

2、新菌株T37脂肪酸的测定

试验方法主要参照MIDI操作手册，即在培养基上28℃恒温培养细菌24h后取菌，通过 提取和分离细菌细胞膜中的磷脂脂肪酸(PLFA)，甲基化后进行气相色谱鉴定分析。所需溶 液的配方及操作如下，所有有机试剂均为HPLC级，无机试剂均为优级纯。

溶液I(皂化试剂)：混合150mL水和150mL甲醇，加入45g NaOH，同时搅拌至完全溶解。

溶液II(甲基化试剂)：325mL 6mol的盐酸加入到275mL甲醇中，混合均匀。

溶液III(萃取试剂)：加200mL甲基叔丁基醚到200mL正己烷中，混合均匀。

溶液IV(碱洗液)：在900mL去离子水中加入10.8g NaOH，搅拌至完全溶解。

溶液V(饱和NaC1溶液)：在100mL去离子水中加入40g NaC1。

2.1细菌的培养：在含LB培养基的培养皿上按照四区划线法分别接种保存的菌株，28℃ 恒温培养箱中培养24h。随机选取部分培养基上培养的菌株，转接到另一含LB培养基的培养 皿中，28℃再培养24h，用于比较活化处理时间长短对鉴定结果的影响。

2.2菌株的获取：按照MIDI推荐的方法，三区取样获取的菌株脂肪酸最具代表性。因此 用普通接种环获取已培养好的三区菌株至少40mg到10mL带聚四氟乙烯塞的玻璃瓶中。

2.3皂化：在取好菌株样的玻璃瓶中加入1.0mL的溶液I(皂化试剂)，盖好盖子，旋涡 振荡5-10s，于100℃的沸水浴中加热5min，稍冷却后振荡5-10s，再将玻璃瓶放入水浴中继 续加热25min，然后冷却至室温。

2.4甲基化：每个玻璃瓶中加入溶液II(甲基化试剂)2.0mL，盖紧盖子旋涡振荡后，放 入80℃水浴加热10min，再将玻璃瓶冷却至室温。

2.5萃取：往玻璃瓶中加入1.25mL溶液III(萃取试剂)，玻璃瓶盖紧盖子温和振荡10min 后，打开盖子，取出每个样品的下层相并丢弃，保留上层有机相。

2.6基本洗涤：每个玻璃瓶中加入溶液IV(碱洗液)，盖紧盖子后在旋转式混合振荡仪 上温和旋转振荡5min。静置几分钟，若两相界面不清楚，加数滴溶液V(饱和NaC1溶液)使两层液面的接口更清楚。

2.7分析：吸取上层有机相于气相色谱样品瓶中，在安捷伦6890气相色谱仪，配备分流/ 不分流进样口，氢火焰离子化检测器(FID)及HP气相色谱化学工作站(HPCHEMSTATION ver A 5.01)；色谱柱为Ultra-2柱，长25m，内径0.2mm，液膜厚度0.33mm；气相色谱各参数由MIDI Sherlock程序(MIDI，Inc.Newark，DE)设置调用(炉温为二阶程序升温：起始 温度170℃，每分钟5℃升至260℃，随后以40℃/min升至310℃，维持1.5min；进样口温度 250℃，载气为氢气，流速0.5mL/min，分流进样模式，分流比100：1，进样量2mL；检测 器温度300℃，氢气流速30mL/min，空气流速216mL/min，补充气(氮气)流速30mL/min)。

经脂肪酸的分析可知：菌株T37的主要脂肪酸为C_18:1ω7c，summed feature 2(comprising C_12:0aldehyde,iso-C_16:1I and/or C_14:0 3-OH和summed feature 3(comprising C_16:1ω7c and/or iso-C_15:0 2-OH，符合该属主要的脂肪酸类型，且在含量上与其他参比菌株(Rhizobium skierniewicense Ch 11^T；Rhizobium rubi NBRC 13261^T；Rhizobium radiobacter ATCC 19358^T；Rhizobium nepotum 39/7^T)脂肪酸 均有差异。

3、新菌株T37呼吸醌的测定

菌体摇瓶培养，通过离心收集菌体，用蒸馏水洗涤两次，离心后-70℃冻3d，冷冻干燥3d， 4℃保存备用。以同属标准菌株或标准品为对照。

取冻干菌体约100mg，加入氯仿：甲醇＝2：1的溶液40mL，在黑暗处磁力搅拌10h左右。在黑暗处用滤纸过滤收集滤液，用减压旋转薄膜蒸发仪40℃(36℃)减压蒸馏至干燥。用1mL丙酮重新溶解干燥物，长条状点样于GF254硅胶板上(青岛海洋化工厂分厂，100×200mm)，同时在一端点V_K做对照。以苯作展层剂，展层约20min。取出风干后在254nm紫外灯 下观察。R_f＝0.8，在绿色荧光背景下呈暗褐色的带即为甲基萘醌的位置，与V_K位点齐平，若 R_f＝0.4-0.5的位置有暗褐色的带则为泛醌组分。刮下R_f＝0.8的带，用1mL丙酮溶解，然后用细菌滤器过滤除去硅胶，收集滤液(可适当浓缩至200-300μL)，即得甲基萘醌的丙酮溶液。置于4℃,黑暗处保存。

用反相高压液相色谱分析法进行甲基萘醌的测定。高压液相色谱仪为Waters，反相高压 液相柱为十八烷基硅烷(ODS 5μm,250×4.6mm id)，进样量为20μL，流动相为甲醇(分析 纯)：异丙醇(分析纯)＝2：1溶液，流速为1.00mL/min，柱温为40℃，240nm和270nm 紫外检测，使用Waters Epower软件完成测定并记录数据。根据标准条件下不同甲基萘醌组分与洗脱时间的关系，结合标准菌株的校正值，分析实验菌株的甲基萘醌。

结果显示：主要的呼吸醌为MK-7，与参比菌株(Rhizobium skierniewicense Ch11^T；Rhizobium rubi NBRC 13261^T；Rhizobium radiobacter ATCC 19358^T；Rhizobiumnepotum 39/7^T)一致。

实施例四：菌株T37吸附重金属离子性能的测定

配制LB液体培养基，分装到2L三角瓶中，每瓶1L培养基。添加Cd²⁺和Pb²⁺母液， 使培养基中的Cd²⁺浓度为10mg L^-1，Pb²⁺浓度为50mg L^-1，121℃灭菌25min。将供试菌株 T37接种于LB液体培养基中，30℃、150rmp摇床振荡培养18h至对数生长期，将菌液转移 至无菌离心管中6000rpm离心10min收集菌体，菌体用无菌去离子水清洗两遍，最终制备成 OD₆₀₀＝1.0的菌悬液。按1％的接种量接种于含有LB培养基的三角瓶中，30℃静置培养48h。 离心收集菌体沉淀，离心沉淀的细菌菌体加入2.5％新鲜戊二醛悬浮固定2h，然后用无菌去离 子水清洗3次，再进行梯度乙醇脱水，即50％，70％，85％，95％各1次，100％乙醇2次， 15～20min/次，最后一次离心的菌体低温冷冻干燥24h，然后用导电胶将菌体粉末粘附于样品台上，喷金后利用扫描电镜(Hitachi TM S-4800)对细菌吸附重金属前后的形貌进行观察，最后选取电镜图片中的亮点用能谱仪(EDAX Inc.Genesis XM)进行元素的鉴定。

结论：说明书附图图2所示为菌株T37吸附Cd、Pb前后的SEM-EDX图像。由图2可知，菌株T37在Cd、Pb的胁迫下，菌株表面没有发生明显的变化，说明菌株能够正常生长，抵抗Cd、Pb的胁迫，株菌细胞表面上有许多的白点，通过能谱图可知，这些白点是重金属Cd、Pb离子。株菌的表面都吸附了大量的Cd、Pb离子，说明株菌T37能够大量吸附周围环境中的重金属离子。

实施例五：含有根瘤菌T37的生物修复菌剂的制备及田间试验

1、菌剂的制备

取甘油管中的菌株T37 50μL转移到含有3mL LB液体试管中，30℃、150rmp摇床振荡培 养18h至对数生长期，然后再转移到至含100mL LB培养基的250mL摇瓶中，30℃、150rmp 振荡培养至对数期，准备接种发酵罐。发酵罐10升，投料量8升，培养基配方为：葡萄糖0.8％， (NH4)₂SO₄ 1.0％，K₂HPO₄ 0.2％，MgSO₄ 0.05％，NaCl 0.01％，酵母膏0.02％，pH值7.2-7.5。 投料完毕后121℃高压湿热灭菌，冷却至30℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按2％的接种量接种 入10升发酵罐，接种后的发酵罐温度控制在30℃，培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6，搅拌 速度为180转/分。整个工艺流程培养时间为48小时。发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上。 发酵完成后培养液出罐，包装瓶分装成液体剂型。

2、田间小区设计

在河南省淅川县某铅镉矿区周围的农田中选取一块5m×20m大小的区域，土壤的基本理 化性质为pH 6.92±0.03，有机质22.5±1.2g kg^-1；总Cd含量1.83±0.1mg kg^-1，总Pb含量256 ±12.3mg kg^-1。经过除草、翻地、晾干、碎土和平整土地后，用卷尺分成6个4m×4m的小区， 每个小区之间留下20cm的间隙。试验共有2个处理，分别是：1.不接菌处理组(CK)、2.接菌 T37处理组(T37)。每个处理三个重复。为了降低地块区域环境对试验结果的影响，采用抓 阄的方式决定每个实验小区所对应的处理组。

2.1萝卜种植和测定

供试萝卜：红皮白萝卜，种子购自南阳市某种子站

首先对萝卜种子进行消毒，用5％的次氯酸钠溶液浸泡5min，消毒后的萝卜种子用无菌 去离子水洗三次。然后将部分萝卜种子放到供试菌株制成的菌悬液中，进行浸种2小时，最后 将种子均匀地撒到每个小区土壤的表面，用遮阳网盖住，再喷洒适量水。待种子生长5天后， 掀开遮阳网，正常生长。同时，在生长的过程中，逐步间苗。萝卜生长10天后，第一次接菌。 在萝卜可食用部分开始发育时进行第二次接菌处理。整个萝卜生长周期共计50天，期间注意 灌溉和除草。盆栽试验完成后，收获萝卜(萝卜田间实验图如说明书附图图3所示)。

2.1考察不同处理对萝卜各组织中Cd和Pb含量的影响：

选取萝卜叶和萝卜可食用部分为样品。所有样品80℃烘干至恒重后用电子秤称重。将烘 干的植物样品用微型植物组织粉碎机磨碎，准确称取1.00g用于微波消解，用5％HNO₃定容， 采用ICP-OES测定消解液中Cd、Pb含量，计算后得出萝卜各组织中的Cd、Pb浓度。结果见 表2：

表2：不同处理对萝卜各组织中Cd和Pb含量的影响

注：同一列不同字母(a-b)表示处理之间有显著差异(p<0.05)

由表2可知，与不接菌对照组(CK组)相比，处理组T37中萝卜可食用部分中的Cd浓度下降了90％，为0.07±0.01mg/kg；萝卜可食用部分中的Pb浓度下降了87％，为0.08±0.01 mg/kg，均达到食品安全国家标准。

2.2考察不同处理对土壤中Cd和Pb含量的影响：

植物收获处理时将根系与土壤小心分离并收集根际土和非根际土壤，将根际和非根际土放 入无菌纸袋中，放冰箱保存备用。准确称取根际土或非根际土2.0g于50mL离心管中，按1:4的土水比例加入DTPA提取液，振荡提取2h，12000rpm离心10min，采用ICP-OES测定上清液中Cd含量，实验结果详见说明书附图图4

由图4所示，与不接菌对照组(CK组)相比，菌株T37能够显著降低萝卜根际土中有效 态Cd和Pb的浓度，菌株T37处理组的萝卜根际土中有效态Cd降低了37％，菌株T37处理组的萝卜根际土中有效态Pb降低了64％。

3、考察不同处理对土壤pH的影响

取萝卜根际或非根际土壤1.0g，以1:2.5的土水比例加入无菌去离子水，充分振荡2h， 12000rpm离心10min，取上清液用pH计测pH值。参照土壤农化分析，采用重铬酸钾容量法测定不同处理盆栽土壤根际土和非根际土中有机质的含量，比较其差异。

结论：与不接菌对照组(CK组)相比，菌株T37能够显著提高萝卜根际土的pH，结果如图5所示。当土壤pH值升高，有机质溶解度会变大，络合能力增强，从而可以吸附更多的重金属离子。因此菌株T37通过提高萝卜根际土的pH，进而降低了根际土中有效态Cd和Pb的浓度，从而阻控了萝卜对Cd和Pb的吸收。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则 之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南阳师范学院

<120> 一种根瘤菌T37及其用途、含有该根瘤菌T37的生物修复菌剂及其制备方法和用途

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1397

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgcctggcgg cagcttacca tgcagtcgaa cgccccgcaa ggggagtggc agacgggtga 60

gtaacgcgtg ggaatctacc gtgccctgcg gaatagctcc gggaaactgg aattaatacc 120

gcatacgccc tacgggggaa agatttatcg gggtatgatg agcccgcgtt ggattagcta 180

gttggtgggg taaaggccta ccaaggcgac gatccatagc tggtctgaga ggatgatcag 240

ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgg 300

acaatgggcg caagcctgat ccagccatgc cgcgtgagtg atgaaggcct tagggttgta 360

aagctctttc accggtgaag ataatgacgg taaccggaga agaagccccg gctaacttcg 420

tgccagcagc cgcggtaata cgaagggggc tagcgttgtt cggaattact gggcgtaaag 480

cgcacgtagg cggatattta agtcaggggt gaaatcccag agctcaactc tggaactgcc 540

tttgatactg ggtatcttga gtatggaaga ggtaagtgga attgcgagtg tagaggtgaa 600

attcgtagat attcgcagga acaccagtgg cgaaggcggc ttactggtcc attactgacg 660

ctgaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 720

acgatgaatg ttagccgtcg ggcagttgac tgttcggtgg cgcagctaac gcattaaaca 780

ttccgcctgg ggagtacggt cgcaagatta aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac 840

aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgcag aaccttacca gctcttgaca 900

ttcggggtat gggcagtgga gacattgtcc ttcagttagg ctggccccag aacaggtgct 960

gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1020

cctcgccctt agttgccagc attcagttgg gcactctaag gggactgccg gtgataagcc 1080

gagaggaagg tggggatgac gtcaagtcct catggccctt acgggctggg ctacacacgt 1140

gctacaatgg tggtgacagt gggcagcgag acagcgatgt cgagctaatc tccaaaagcc 1200

atctcagttc ggattgcact ctgcaactcg agtgcatgaa gttggaatcg ctagtaatcg 1260

cagatcagca tgctgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacaccc 1320

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atcggaggta cagcgcc 1397

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taccttgtta cgactt 16

Claims (10)

1.一种根瘤菌T37（Rhizobium xichuanensis T37），其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2018年10月29日，菌种保藏号为CCTCC NO：M2018723。

2.根据权利要求1所述的根瘤菌T37，其特征在于，所述根瘤菌T37的培养条件为：培养基为TSA、NA或LB琼脂培养基，在10-40℃、pH 5 .5-9 .0和0-2％NaCl下培养。

3.根据权利要求2所述的根瘤菌T37，其特征在于，所述根瘤菌T37的培养条件为：在28℃、pH7.0和无NaCl条件下培养。

4.权利要求1所述的根瘤菌T37在重金属污染的环境修复中的应用。

5.一种含有权利要求1所述的根瘤菌T37的生物修复菌剂。

6.根据权利要求5所述的生物修复菌剂，其特征在于，所述生物修复菌剂为液体制剂，其中含有保藏号为CCTCC NO：M2018723的根瘤菌T37菌株的有效活菌数为10亿个/mL以上。

7.根据权利要求5或6所述的生物修复菌剂的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)将根瘤菌T37在培养皿上活化，接种于试管斜面上备用，接种至含100mL LB培养基的250mL摇瓶中，振荡培养至对数期；(2)发酵罐中投入配制好的培养基，投料结束后121℃高压湿热灭菌；(3)冷却至30℃后，将步骤(1)培养好的摇瓶菌种按2％的接种量接种入发酵罐，接种后的发酵罐温度控制在30℃，培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6，搅拌速度为180转/分，整个工艺流程培养时间为48h；(4)发酵完成后培养液出罐，分装成液体制剂。

8.根据权利要求7所述的生物修复菌剂的制备方法，其特征在于，所述发酵罐中的培养基配方为葡萄糖0.8％，(NH₄)₂SO₄ 1.0％，K₂HPO₄ 0.2％，MgSO₄ 0.05％，NaCl 0.01％，酵母膏0.02％，pH值7.2-7.5。

9.权利要求5或6所述的生物修复菌剂在重金属污染的环境修复中的应用。

10.根据权利要求9所述的生物修复菌剂在重金属污染的环境修复中的应用，其特征在于，应用于修复重金属污染环境中的萝卜。

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