CN105039198A - 铅锌污染土壤复合微生物修复剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及铅锌污染土壤复合微生物修复剂及其制备方法。铅锌矿产开采的尾矿和废弃矿石中的重金属通过降雨、风化等表生地球化学作用向周边地区扩散，对生态系统的结构与功能造成了巨大影响。本发明通过专用液体发酵培养基分别培养黄色微球菌PS5和不解糖假苍白杆菌ZS2后，收集发酵液，离心分离除去发酵液中的水，把离心获得的两种粘稠状菌体充分搅拌混合均匀，获得浅黄色粘稠状菌体细胞，加入甘油和硅藻土搅拌混合均匀，获得淡黄色固体制剂即目的产品。本发明通过微生物生物代谢将铅锌离子富集钝化于细胞，并产生蛋白类生物可以结合吸附金属离子增加降解效率，具有较好的温度、pH等环境适应能力，修复后无化学残留和二次污染。
Description
技术领域
本发明属于土壤生物修复技术领域，具体涉及一种铅锌污染土壤复合微生物修复剂及其制备方法。
背景技术
铅锌矿产开采的尾矿和废弃矿石中的重金属通过降雨、风化等表生地球化学作用向周边地区扩散，对生态系统的结构与功能造成了巨大影响。由于自然沉降和雨淋沉降作用，重金属会造成土壤沙化和结晶化，严重影响土壤品质，造成大量土壤退化。当前国内外对于铅锌矿区土壤污染的修复主要有物理、化学和生物修复技术，其中物理化学修复因可能造成二次污染。而生物修复无二次污染、且费用低、效率高，以成为研究的主流发展方向。微生物来源于土壤，能够迅速生长，通过菌体细胞生长繁殖固化金属离子，改善土壤有机质，增加土壤营养，可适用于对多种有色金属复合污染土壤的修复。生物修复的手段对矿区污染土壤生态系统进行改善、恢复，对于保护矿区生态环境，解决矿产产业发展与环境保护工作的矛盾，推动我省经济绿色化可持续发展具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种铅锌污染土壤复合微生物修复剂及其制备方法，采用生物修复的方法对铅锌污染土壤进行有效修复。
本发明所采用的技术方案是：
铅锌污染土壤复合微生物修复剂的制备方法，其特征在于：
包括以下步骤：
步骤一：发酵：
调节液体发酵培养基A的pH至6.0-6.5,并进行常规灭菌处理，按液体质量6-9%无菌操作接入黄色微球菌PS5，恒定温度35±1℃，搅拌速度200-250rpm，通风量0.27-0.30M3/min，罐压0.07-0.08MPa，持续发酵72-76hr，显微镜检测计数发酵液中细胞数达2.0×109个/mL时终止发酵；
调节液体发酵培养基B的pH至6.0-6.5，并进行常规灭菌处理，按液体重量6-9%无菌操作接入不解糖假苍白杆菌ZS2，恒定温度35±1℃，搅拌速度200-250rpm，通风量0.28-0.32M3/min，罐压0.07-0.08MPa，持续发酵72-76hr，显微镜检测计数发酵液中细胞数达2.0×109个/mL时终止发酵；
步骤二：菌体细胞分离：
分别收集步骤一液体发酵培养基A、液体发酵培养基B的黄色微球菌PS5、不解糖假苍白杆菌ZS2的发酵液，用酵母分离离心机离心分离除去发酵液中的水，把离心获得的两种粘稠状菌体充分搅拌混合均匀，获得浅黄色粘稠状菌体细胞；
步骤三：制剂制取：
在步骤二获得的浅黄色粘稠状菌体细胞中，按照菌体与甘油的体积比1:（0.6-1.1）的比例加入甘油，并搅拌混合均匀，再按照菌体：硅藻土的体积比1：（1.1-1.4）的比例加入细度为300目的硅藻土，搅拌混合均匀，获得淡黄色固体制剂即目的产品。
步骤一中的黄色微球菌PS5（Micrococcusflavus）于2014年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.9929，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
步骤一中的不解糖假苍白杆菌ZS2（Pseudochrobactrumasaccharolyticum）于2014年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.9930，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
步骤一中，液体发酵培养基A的配方如下：
葡萄糖15-20g/L，玉米浆8-12g/L，(NH4)2SO42.5-3.0g/L，NaCl1.5-2.0g/L，MgSO4·7H2O0.5-0.7g/L，K2HPO4·3H2O2.5-3.0g/L，MnSO4·2H2O0.4-0.6mg/L，余量水定容至1L。
步骤一中，液体发酵培养基B的配方如下：
石蜡0.2-0.5%，玉米浆8-10g/L，葡萄糖5-8g/L，(NH4)2SO46-8g/L，K2HPO41.0-1.5g/L，MnSO4·2H2O0.3-0.5mg/L，Na2HPO40.3-0.5g，酵母粉0.01-0.03g/L，余量水定容至1L。
如所述的铅锌污染土壤复合微生物修复剂的制备方法制得的铅锌污染土壤复合微生物修复剂。
本发明具有以下优点：
本发明涉及的黄色微球菌PS5和不解糖假苍白杆菌ZS2菌种是分离于铅锌开采矿区的污染土壤环境，菌种可以在铅离子8nmol/L、锌离子12nmol/L的环境中生长，通过微生物生物代谢将铅锌离子富集钝化于细胞，并产生蛋白类生物可以结合吸附金属离子增加降解效率，以此菌种为基础制备的微生物修复剂具有较好温度、pH等环境适应能力，施用土壤80天，降解游离金属离子93%，达到了较好的修复效果，修复后无化学残留和二次污染，可广泛用于铅锌矿开采、储存、提炼等过程中的污染土壤的无害化处理，是一种绿色环保的生态污染治理技术。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
本发明涉及的铅锌污染土壤复合微生物修复剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：发酵：
调节液体发酵培养基A的pH至6.0-6.5,并进行常规灭菌处理，按液体质量6-9%无菌操作接入黄色微球菌PS5，恒定温度35±1℃，搅拌速度200-250rpm，通风量0.27-0.30M3/min，罐压0.07-0.08MPa，持续发酵72-76hr，显微镜检测计数发酵液中细胞数达2.0×109个/mL时终止发酵；
调节液体发酵培养基B的pH至6.0-6.5，并进行常规灭菌处理，按液体重量6-9%无菌操作接入不解糖假苍白杆菌ZS2，恒定温度35±1℃，搅拌速度200-250rpm，通风量0.28-0.32M3/min，罐压0.07-0.08MPa，持续发酵72-76hr，显微镜检测计数发酵液中细胞数达2.0×109个/mL时终止发酵。
液体发酵培养基A的配方如下：
葡萄糖15-20g/L，玉米浆8-12g/L，(NH4)2SO42.5-3.0g/L，NaCl1.5-2.0g/L，MgSO4·7H2O0.5-0.7g/L，K2HPO4·3H2O2.5-3.0g/L，MnSO4·2H2O0.4-0.6mg/L，余量水定容至1L。
液体发酵培养基B的配方如下：
石蜡0.2-0.5%，玉米浆8-10g/L，葡萄糖5-8g/L，(NH4)2SO46-8g/L，K2HPO41.0-1.5g/L，MnSO4·2H2O0.3-0.5mg/L，Na2HPO40.3-0.5g，酵母粉0.01-0.03g/L，余量水定容至1L。
步骤二：菌体细胞分离：
分别收集步骤一液体发酵培养基A、液体发酵培养基B的黄色微球菌PS5、不解糖假苍白杆菌ZS2的发酵液，用酵母分离离心机离心分离除去发酵液中的水，把离心获得的两种粘稠状菌体充分搅拌混合均匀，获得浅黄色粘稠状菌体细胞。
步骤三：制剂制取：
在步骤二获得的浅黄色粘稠状菌体细胞中，按照菌体与甘油的体积比1:（0.6-1.1）的比例加入甘油，并搅拌混合均匀，再按照菌体：硅藻土的体积比1：（1.1-1.4）的比例加入细度为300目的硅藻土，搅拌混合均匀，获得淡黄色固体制剂即目的产品。
步骤一中的黄色微球菌PS5于2014年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.9929。
步骤一中的不解糖假苍白杆菌ZS2于2014年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.9930。
实施例1：
步骤一：发酵：
调节液体发酵培养基A的pH至6.0,并进行常规灭菌处理，按液体质量9%无菌操作接入黄色微球菌PS5，恒定温度34℃，搅拌速度250rpm，通风量0.27M3/min，罐压0.08MPa，持续发酵72hr，显微镜检测计数发酵液中细胞数达2.0×109个/mL时终止发酵；
调节液体发酵培养基B的pH至6.5，并进行常规灭菌处理，按液体重量6%无菌操作接入不解糖假苍白杆菌ZS2，恒定温度36℃，搅拌速度200rpm，通风量0.32M3/min，罐压0.07MPa，持续发酵76hr，显微镜检测计数发酵液中细胞数达2.0×109个/mL时终止发酵。
液体发酵培养基A的配方如下：
葡萄糖15g/L，玉米浆12g/L，(NH4)2SO42.5g/L，NaCl2.0g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，K2HPO4·3H2O3.0g/L，MnSO4·2H2O0.4mg/L，余量水定容至1L。
液体发酵培养基B的配方如下：
石蜡0.5%，玉米浆8g/L，葡萄糖8g/L，(NH4)2SO46g/L，K2HPO41.5g/L，MnSO4·2H2O0.3mg/L，Na2HPO40.5g，酵母粉0.01g/L，余量水定容至1L。
步骤二：菌体细胞分离：
分别收集步骤一液体发酵培养基A、液体发酵培养基B的黄色微球菌PS5、不解糖假苍白杆菌ZS2的发酵液，用酵母分离离心机离心分离除去发酵液中的水，把离心获得的两种粘稠状菌体充分搅拌混合均匀，获得浅黄色粘稠状菌体细胞。
步骤三：制剂制取：
在步骤二获得的浅黄色粘稠状菌体细胞中，按照菌体与甘油的体积比1:1.1的比例加入甘油，并搅拌混合均匀，再按照菌体：硅藻土的体积比1：1.1的比例加入细度为300目的硅藻土，搅拌混合均匀，获得淡黄色固体制剂即目的产品。
实施例2：
步骤一：发酵：
调节液体发酵培养基A的pH至6.2,并进行常规灭菌处理，按液体质量7%无菌操作接入黄色微球菌PS5，恒定温度35℃，搅拌速度220rpm，通风量0.28M3/min，罐压0.07MPa，持续发酵74hr，显微镜检测计数发酵液中细胞数达2.0×109个/mL时终止发酵；
调节液体发酵培养基B的pH至6.2，并进行常规灭菌处理，按液体重量7%无菌操作接入不解糖假苍白杆菌ZS2，恒定温度35℃，搅拌速度220rpm，通风量0.30M3/min，罐压0.07MPa，持续发酵74hr，显微镜检测计数发酵液中细胞数达2.0×109个/mL时终止发酵。
液体发酵培养基A的配方如下：
葡萄糖17g/L，玉米浆10g/L，(NH4)2SO42.7g/L，NaCl1.7g/L，MgSO4·7H2O0.6g/L，K2HPO4·3H2O2.7g/L，MnSO4·2H2O0.5mg/L，余量水定容至1L。
液体发酵培养基B的配方如下：
石蜡0.3%，玉米浆9g/L，葡萄糖6g/L，(NH4)2SO47g/L，K2HPO41.2g/L，MnSO4·2H2O0.4mg/L，Na2HPO40.4g，酵母粉0.02g/L，余量水定容至1L。
步骤二：菌体细胞分离：
分别收集步骤一液体发酵培养基A、液体发酵培养基B的黄色微球菌PS5、不解糖假苍白杆菌ZS2的发酵液，用酵母分离离心机离心分离除去发酵液中的水，把离心获得的两种粘稠状菌体充分搅拌混合均匀，获得浅黄色粘稠状菌体细胞。
步骤三：制剂制取：
在步骤二获得的浅黄色粘稠状菌体细胞中，按照菌体与甘油的体积比1:0.8的比例加入甘油，并搅拌混合均匀，再按照菌体：硅藻土的体积比1：1.2的比例加入细度为300目的硅藻土，搅拌混合均匀，获得淡黄色固体制剂即目的产品。
实施例3：
步骤一：发酵：
调节液体发酵培养基A的pH至6.5,并进行常规灭菌处理，按液体质量6%无菌操作接入黄色微球菌PS5，恒定温度36℃，搅拌速度200rpm，通风量0.30M3/min，罐压0.07MPa，持续发酵76hr，显微镜检测计数发酵液中细胞数达2.0×109个/mL时终止发酵；
调节液体发酵培养基B的pH至6.0，并进行常规灭菌处理，按液体重量9%无菌操作接入不解糖假苍白杆菌ZS2，恒定温度34℃，搅拌速度250rpm，通风量0.28M3/min，罐压0.08MPa，持续发酵72hr，显微镜检测计数发酵液中细胞数达2.0×109个/mL时终止发酵。
液体发酵培养基A的配方如下：
葡萄糖20g/L，玉米浆8g/L，(NH4)2SO43.0g/L，NaCl1.5g/L，MgSO4·7H2O0.7g/L，K2HPO4·3H2O2.5g/L，MnSO4·2H2O0.6mg/L，余量水定容至1L。
液体发酵培养基B的配方如下：
石蜡0.2%，玉米浆10g/L，葡萄糖5g/L，(NH4)2SO48g/L，K2HPO41.0g/L，MnSO4·2H2O0.5mg/L，Na2HPO40.3g，酵母粉0.03g/L，余量水定容至1L。
步骤二：菌体细胞分离：
分别收集步骤一液体发酵培养基A、液体发酵培养基B的黄色微球菌PS5、不解糖假苍白杆菌ZS2的发酵液，用酵母分离离心机离心分离除去发酵液中的水，把离心获得的两种粘稠状菌体充分搅拌混合均匀，获得浅黄色粘稠状菌体细胞。
步骤三：制剂制取：
在步骤二获得的浅黄色粘稠状菌体细胞中，按照菌体与甘油的体积比1:0.6的比例加入甘油，并搅拌混合均匀，再按照菌体：硅藻土的体积比1：1.4的比例加入细度为300目的硅藻土，搅拌混合均匀，获得淡黄色固体制剂即目的产品。
上述黄色微球菌PS5和不解糖假苍白杆菌ZS2的菌种分离于铅锌开采矿区的污染土壤环境，菌种可以在铅离子8nmol/L、锌离子12nmol/L的环境中生长，通过微生物生物代谢将铅锌离子富集钝化于细胞，并产生蛋白类生物可以结合吸附金属离子增加降解效率，以此菌种为基础制备的微生物修复剂具有较好的温度、pH等环境适应能力，施用土壤80天，降解游离金属离子93%，达到了较好的修复效果。
本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。
Claims (6)
1.铅锌污染土壤复合微生物修复剂的制备方法，其特征在于：
包括以下步骤：
步骤一：发酵：
调节液体发酵培养基A的pH至6.0-6.5,并进行常规灭菌处理，按液体质量6-9%无菌操作接入黄色微球菌PS5，恒定温度35±1℃，搅拌速度200-250rpm，通风量0.27-0.30M3/min，罐压0.07-0.08MPa，持续发酵72-76hr，显微镜检测计数发酵液中细胞数达2.0×109个/mL时终止发酵；
调节液体发酵培养基B的pH至6.0-6.5，并进行常规灭菌处理，按液体重量6-9%无菌操作接入不解糖假苍白杆菌ZS2，恒定温度35±1℃，搅拌速度200-250rpm，通风量0.28-0.32M3/min，罐压0.07-0.08MPa，持续发酵72-76hr，显微镜检测计数发酵液中细胞数达2.0×109个/mL时终止发酵；
步骤二：菌体细胞分离：
分别收集步骤一液体发酵培养基A、液体发酵培养基B的黄色微球菌PS5、不解糖假苍白杆菌ZS2的发酵液，用酵母分离离心机离心分离除去发酵液中的水，把离心获得的两种粘稠状菌体充分搅拌混合均匀，获得浅黄色粘稠状菌体细胞；
步骤三：制剂制取：
在步骤二获得的浅黄色粘稠状菌体细胞中，按照菌体与甘油的体积比1:（0.6-1.1）的比例加入甘油，并搅拌混合均匀，再按照菌体：硅藻土的体积比1：（1.1-1.4）的比例加入细度为300目的硅藻土，搅拌混合均匀，获得淡黄色固体制剂即目的产品。
2.根据权利要求1所述的铅锌污染土壤复合微生物修复剂的制备方法，其特征在于：
步骤一中的黄色微球菌PS5于2014年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.9929。
3.根据权利要求2所述的铅锌污染土壤复合微生物修复剂的制备方法，其特征在于：
步骤一中的不解糖假苍白杆菌ZS2于2014年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.9930。
4.根据权利要求3所述的铅锌污染土壤复合微生物修复剂的制备方法，其特征在于：
步骤一中，液体发酵培养基A的配方如下：
葡萄糖15-20g/L，玉米浆8-12g/L，(NH4)2SO42.5-3.0g/L，NaCl1.5-2.0g/L，MgSO4·7H2O0.5-0.7g/L，K2HPO4·3H2O2.5-3.0g/L，MnSO4·2H2O0.4-0.6mg/L，余量水定容至1L。
5.根据权利要求4所述的铅锌污染土壤复合微生物修复剂的制备方法，其特征在于：
步骤一中，液体发酵培养基B的配方如下：
石蜡0.2-0.5%，玉米浆8-10g/L，葡萄糖5-8g/L，(NH4)2SO46-8g/L，K2HPO41.0-1.5g/L，MnSO4·2H2O0.3-0.5mg/L，Na2HPO40.3-0.5g，酵母粉0.01-0.03g/L，余量水定容至1L。
6.如权利要求5所述的铅锌污染土壤复合微生物修复剂的制备方法制得的铅锌污染土壤复合微生物修复剂。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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