CN116410870B - 一株草酸青霉、复合菌剂、联合修复剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一株草酸青霉、复合菌剂、联合修复剂及其应用。本发明提供的草酸青霉能处理铅浓度为1000～1500mg/L的溶液，对铅的去除率达到98％；所述草酸青霉通过分泌草酸促进磷石膏和土壤中难溶性磷酸盐磷素溶解，可以提高土壤难溶性磷酸盐的利用率，减少化学磷肥的施用、降低磷矿石消耗和提高磷石膏的资源利用率；同时，释放出的磷酸根离子可以与Pb⁺发生沉淀反应，生成稳定的铅‑磷酸盐化合物，达到固铅的效果，可以强化磷石膏磷素资源利用，提高铅污染修复效果，在促进含磷固体废弃物再利用、实现磷矿资源可持续发展、减少工业和农业废弃物排放及维护生态环境安全起着重要作用。

Description

一株草酸青霉、复合菌剂、联合修复剂及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一株草酸青霉、复合菌剂、联合修复剂及其应用。

背景技术

重金属是土壤、水体的重要污染物。铅是工业快速发展导致的较为普遍的重金属污染元素，具有隐蔽性较高、生物累积性和不可逆性的特点，能在环境中长期持久存在。水体铅污染能进一步造成土壤铅污染，土壤中铅污染物还能被植物吸收后经食物链向生物体内富集，从而危害农产品质量，进一步威胁动物和人体健康。因此，采取可持续的修复技术对铅污染进行长期固定修复至关重要。

磷石膏是湿法磷酸生产过程中的副产物，其主要成分是CaSO₄·2H₂O，同时含有磷、氟、残余酸等杂质。由于我国磷石膏大量堆存，使土壤和水资源中重金属含量升高，造成磷资源的浪费并且威胁生态环境安全。磷是磷石膏中含量较多的元素之一，是一种重要的含磷废弃物资源。因此，合理开发利用磷石膏中的磷资源，是缓解磷矿资源危机，实现磷石膏中磷资源高效利用和废弃物资源化再利用的重要措施。

磷石膏作为工业副石膏，且对重金属离子有一定的吸附能力，是一种低成本的吸附剂，可以作为吸附剂用于治重金属污废水，具有极大的利用价值。研究如何进一步提高磷石膏在重金属污染治理领域的效果，对提高资源利用效率、改善环境质量具有重要意义。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一株草酸青霉、复合菌剂、联合修复剂及其应用。本发明提供的草酸青霉(Penicilliumoxalicum)够强化磷石膏磷素资源利用，提高铅污染修复效果，在促进含磷固体废弃物再利用、实现磷矿资源可持续发展、减少工业和农业废弃物排放及维护生态环境安全起着重要作用。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一株草酸青霉(Penicilliumoxalicum)，所述草酸青霉保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.22475。

本发明还提供了一种复合菌剂，所述复合菌剂包括红酵母(Redyeast)和上述技术方案所述的草酸青霉；所述草酸青霉和红酵母的孢子浓度分别为1×10⁷～9×10⁷CFU/mL。

本发明还提供了一种联合修复剂，所述联合修复剂的制备原料包括：上述技术方案所述的草酸青霉、磷石膏、红酵母、秸秆和黄豆粉；

所述磷石膏、秸秆和黄豆粉的质量比为(8～10)：(8～11)：1；

所述草酸青霉的孢子数和磷石膏的质量比为1×10⁷～9×10⁷CFU：1g；

所述红酵母的孢子数和磷石膏的质量比为1×10⁷～9×10⁷CFU：1g。

优选的，所述秸秆包括玉米秸秆、小麦秸秆和水稻秸秆中的一种或多种。

本发明还提供了上述技术方案所述联合修复剂的制备方法，包括以下步骤：

将磷石膏、秸秆和黄豆粉混合，调节料水比，得到发酵原料；

混合所述草酸青霉、红酵母和发酵原料进行好氧发酵，得到所述联合修复剂。

优选的，所述磷石膏、秸秆和黄豆粉的混合物和水的质量比为(1～2)：(1.2～1.5)。

优选的，混合所述草酸青霉、红酵母和发酵原料进行好氧发酵的方法包括：将所述草酸青霉和发酵原料混合，进行第一好氧发酵，得到发酵物料；将所述发酵物料和红酵母混合，进行第二好氧发酵，得到所述联合修复剂。

本发明还提供了上述技术方案所述的草酸青霉或上述技术方案所述的复合菌剂或上述技术方案所述的联合修复剂或利用权上述技术方案所述制备方法制备得到的联合修复剂在促进难溶性磷酸盐溶解和/或修复重金属污染中的应用。

优选的，所述难溶性磷酸盐包括磷酸铁、磷酸铝、磷酸钙和氟基磷灰石中的一种或多种。

优选的，所述重金属包括铅。

有益效果：

本发明提供了一株草酸青霉，所述草酸青霉保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.22475。本发明提供的草酸青霉具有高浓度的铅耐受性和铅固定效率，能处理铅浓度为1000～1500mg/L的溶液，对铅的去除率达到98％；所述草酸青霉通过分泌草酸促进磷石膏和土壤中难溶性磷酸盐磷素溶解，可以提高土壤难溶性磷酸盐的利用率，减少化学磷肥的施用、降低磷矿石消耗和提高磷石膏的资源利用率；同时，释放出的磷酸根离子可以与Pb⁺发生沉淀反应，生成稳定的铅-磷酸盐化合物，达到固铅的效果，可以强化磷石膏磷素资源利用，提高铅污染修复效果，在促进含磷固体废弃物再利用、实现磷矿资源可持续发展、减少工业和农业废弃物排放及维护生态环境安全起着重要作用。

生物保藏说明

草酸青霉，拉丁名为Penicilliumoxalicum，于2021年06月11日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.22475。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明提供的草酸青霉的菌落图；

图2为本发明提供的草酸青霉的显微镜图像；

图3为本发明提供的草酸青霉的系统进化树分析图；

图4为草酸青霉与红酵母联合磷酸盐对磷的释放的影响图；

图5为草酸青霉与红酵母联合磷酸盐对铅污染的固定的影响图；

图6为草酸青霉与红酵母联合磷酸盐对TCLP-Pb含量的影响图；

图7为草酸青霉与红酵母联合磷酸盐对铅去除率的影响图；

图8添加磷酸盐类功能真菌联合修复剂对土壤磷释放的影响图；

图9添加磷酸盐类功能真菌联合修复剂对铅固定的影响图。

具体实施方式

本发明提供了一株草酸青霉(Penicilliumoxalicum)，所述草酸青霉保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.22475。

本发明所述草酸青霉菌落生长较快，呈灰绿色，平坦，质地绒状(见图1)；分生孢子梗呈扫帚状分枝(见图2)。

在本发明中，所述草酸青霉的ITS序列优选如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供的草酸青霉可以通过分泌草酸促进难溶性磷酸盐中磷素的溶解，降低环境中铅的生物有效性，有利于改善生态环境，提高土壤中磷的利用率，减少化肥施用，可用于含磷固体废弃物再利用，实现磷矿资源可持续发展并提高铅污染的修复和治理。

本发明还提供了一种复合菌剂，所述复合菌剂包括红酵母(Redyeast)和上述技术方案所述的草酸青霉；所述复合菌剂中草酸青霉和红酵母的孢子浓度分别为1×10⁷～9×10⁷CFU/mL。本发明对所述红酵母的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。

本发明提供的复合菌剂中草酸青霉能够固定铅离子的同时促进磷酸盐中磷素的释放，发挥菌株的最大效能，红酵母分泌的胞外多聚物还能促进草酸青霉的生长。因此，草酸青霉与红酵母联合可以促进含磷固体废弃物再利用并提高铅污染修复程度，具有作为功能微生物修复剂的潜力，为推进农业绿色发展做出贡献。

本发明优选还提供了上述技术方案所述复合菌剂的制备方法，优选包括以下步骤：

将所述草酸青霉接种到PDA培养基上，在28～30℃的环境中培养，得到草酸青霉孢子悬浮液；

将所述红酵母接种到PDB培养基中，在28～30℃的环境中培养，得到红酵母孢子悬浮液；

将所述草酸青霉孢子悬浮液和所述红酵母孢子悬浮液混合，得到混合孢子悬浮液；

将所述混合孢子悬浮液接种到PDB培养基中，振荡培养，得到所述复合菌剂。

在本发明中，所述草酸青霉孢子悬浮液和所述红酵母孢子悬浮液的体积比优选为1：1；所述混合孢子悬浮液的接种量优选为1～2％的体积浓度，更优选为1％；所述振荡培养的温度优选为28～30℃，更优选为28℃；所述振荡培养的速度优选为160～180rpm，更优选为180rpm。

本发明还提供了一种联合修复剂，所述联合修复剂的制备原料包括：上述技术方案所述的草酸青霉、磷石膏、红酵母、秸秆和黄豆粉；

所述磷石膏、秸秆和黄豆粉的质量比为(8～10)：(8～11)：1；

所述草酸青霉的孢子数和磷石膏的质量比为1×10⁷～9×10⁷CFU：1g；

所述红酵母的孢子数和磷石膏的质量比为1×10⁷～9×10⁷CFU：1g。

以质量份计，本发明所述联合修复剂的制备原料包括磷石膏8～10份，优选为8或10份，更优选为8份。

以所述磷石膏的质量份为基准，本发明所述联合修复剂的制备原料包括秸秆8～11份，优选为8或11份，更优选为11份。在本发明中，所述秸秆优选包括玉米秸秆、小麦秸秆和水稻秸秆中的一种或多种，更优选为玉米秸秆、小麦秸秆和水稻秸秆的混合物；所述混合物中玉米秸秆、小麦秸秆和水稻秸秆的质量比优选为(8～10)：(2～4)：(1～2)，更优选为8：2：1。秸秆中含有的纤维素能有效地对重金属离子进行吸附、络合，降低重金属的生物有效性；另外，秸秆还能进一步促进所述草酸青霉分泌草酸，进一步降低重金属的生物有效性。

以所述磷石膏的质量份为基准，本发明所述联合修复剂的制备原料包括黄豆粉1份。

本发明所述草酸青霉的孢子数和磷石膏的质量比为1×10⁷～9×10⁷CFU：1g，优选为1×10⁷CFU：1g；所述红酵母的孢子数和磷石膏的质量比为1×10⁷～9×10⁷CFU：1g，优选为1×10⁷CFU：1g。

本发明提供的联合修复剂中的草酸青霉通过分泌草酸促进磷石膏和土壤中难溶性磷酸盐磷素溶解，可以提高土壤难溶性磷酸盐的利用率，减少化学磷肥的施用、降低磷矿石消耗和提高磷石膏的资源利用率；同时，释放出的磷酸根离子可以与Pb⁺发生沉淀反应，生成稳定的铅-磷酸盐化合物，达到固铅的效果；再者，红酵母分泌的胞外多聚物(EPS)不仅可以与溶液中的铅阳离子反应生成EPS-Pb，有助于红酵母和磷酸盐的固定化，还能促进草酸青霉的生长，从而提高草酸的分泌量，达到固定更多铅离子的目的，在促进含磷固体废弃物再利用、实现磷矿资源可持续发展、减少工业和农业废弃物排放及维护生态环境安全起着重要作用。

本发明还提供了上述技术方案所述联合修复剂的制备方法，包括以下步骤：

将磷石膏、秸秆和黄豆粉混合，得到混合物；

将所述混合物和水混合，得到发酵原料；

混合所述草酸青霉、红酵母和发酵原料进行好氧发酵，得到所述联合修复剂。

本发明将磷石膏、秸秆和黄豆粉混合，调节料水比，得到发酵原料。

在本发明中，所述磷石膏、秸秆和黄豆粉的混合物和水的质量比，即料水比优选为(1～2)：(1.2～1.5)，更优选为1：1.2。

得到发酵原料后，优选将发酵原料进行灭菌处理，得到灭菌后的发酵原料。

得到灭菌后的发酵原料后，本发明混合所述草酸青霉、红酵母和发酵原料进行好氧发酵，得到所述联合修复剂。

在本发明中，混合所述草酸青霉、红酵母和发酵原料进行好氧发酵的方法优选包括：将所述草酸青霉和发酵原料混合，进行第一好氧发酵，得到发酵物料；将所述发酵物料和红酵母混合，进行第二好氧发酵，得到所述联合修复剂。

在本发明中，所述好氧发酵、第一好氧发酵和第二好氧发酵的时间分别优选为6～8天，更优选为7天；所述好氧发酵、第一好氧发酵和第二好氧发酵的温度分别优选为28～30℃，更优选为30℃。

本发明好氧发酵、第一好氧发酵和第二好氧发酵期间均优选为每3天翻堆一次。

本发明先将发酵原料与草酸青霉进行第一发酵，促进秸秆腐解及草酸青霉孢子繁殖，再将发酵物料和红酵母进行第二发酵，可以促进红酵母出芽生殖和提高活性。

本发明还提供了上述技术方案所述的草酸青霉或上述技术方案所述的复合菌剂或上述技术方案所述的联合修复剂或利用上述技术方案所述制备方法制备得到的联合修复剂在促进难溶性磷酸盐溶解和/或修复重金属污染中的应用。

在本发明中，所述难溶性磷酸盐优选包括磷酸铁、磷酸铝、磷酸钙和氟基磷灰石中的一种或多种；所述重金属优选包括铅。

本发明优选还提供了一种修复重金属污染的方法，优选包括以下步骤：

将上述技术方案所述的草酸青霉施入待修复的区域中；

或者，将上述技术方案所述的复合菌剂施入待修复的区域中；

或者，将上述技术方案所述的联合修复剂施入待修复的区域中。

在本发明中，所述待修复的区域优选包括重金属污染的土壤或水体。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例和附图对本发明提供的一株草酸青霉、复合菌剂、联合修复剂及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(1)菌株的分离

草酸青霉菌株分离材料来自于安徽农业大学皖北综合试验站的小麦秸秆，应用PVK固体培养基分离草酸青霉。称取土样10g放入90mL无菌水中，25℃，180rpm摇床振荡30min，取上清液以10^-2、10^-3、10^-4和10^-5逐级稀释，各取稀释后的上清液0.1mL涂布于PVK固体培养基上，每个浓度进行3次平行重复实验，28℃培养3～5天，挑取溶磷圈明显的单菌落，划线培养于PDA固体培养基。经过上述筛选，获得一株可降解难溶性磷酸盐的菌株，命名为AH-F-2-7。

PVK固体培养基：葡萄糖10g、磷酸钙5g、氯化钠0.2g、七水合硫酸镁0.25g、七水合硫酸铁0.03g、四水硫酸锰0.03g、氯化钾0.2g、硫酸铵0.5g、琼脂15g和去离子水1000mL。

PDA固体培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g和蒸馏水1000mL。

(2)菌株的鉴定

将步骤(1)筛选的AH-F-2-7菌株纯化后于28℃条件下在PDA固体培养基上培养，观察菌落形态和显微特征。菌落结构如图1所示，草酸青霉菌落呈灰绿色，平坦，质地绒状；显微图像如图2所示，该菌株分生孢子梗呈扫帚状分枝。在无菌条件下利用真菌DNA提取试剂盒抽提基因组DNA，提取产物利用PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶产物切割回收并纯化后进行测序，测序结果为：AH-F-2-7菌株的ITS序列如SEQ ID NO.1所示：5’-ACCTGCGGA AGGATCATTACCGAGTGAGGGCCCTCTGGGTCCAACCTCCCACCCGTGTTTATCGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTCACGGCCGCCGGGGGGCATCCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACACACAAACGAACTCTTGTCTGAAGATTGCAGTCTGAGTACTTGACTAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCTCTCGCCCCCCGCTTCCGGGGGGCGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCCCGCCGGCGAACACCATCAATCTTAACCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAA-3’；

PCR扩增引物为ITS1和ITS4；所述ITS1的序列如SEQ ID NO.2所示：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；所述ITS4的序列如SEQ ID NO.3所示：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

PCR扩增体系(25μl)：12.5μlPCRMasterMix、1.0μlITS1、1.0μlITS4、2μlDNA片段和8.5μldH₂O。

PCR反应程序：95℃预变性5min；以95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s为一个循环，循环35次；72℃延伸5min，4℃保温30min。

在GenBank数据库中，将AH-F-2-7菌株的ITS序列采用BLAST检索，发现其与草酸青霉同源性较高，选取同源性高于99％的菌株进行系统发育树构建，结果显示AH-F-2-7菌株与草酸青霉MN856405.1:16-585聚于同一分支，且遗传距离较近，鉴定为草酸青霉(如图3所示)。

本发明筛选获得的AH-F-2-7菌株鉴定为草酸青霉，分类命名为草酸青霉(Penicilliumoxalicum)，将菌株于2021年06月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.22475。

实施例2

一种复合菌剂，由以下方法制备得到：

1)将实施例1筛选的草酸青霉菌株接种到经121℃灭菌20min的PDA固体培养基中，接种量为1环，28℃恒温培养5天；用无菌水刮洗孢子，收集孢子液，利用血球计数板计数，得浓度为1×10⁷CFU/mL的草酸青霉孢子悬浮液；

2)向150mL三角瓶里加入100mLPDB培养基，121℃高温灭菌20min，从冰箱里取出红酵母固体培养基，在超净工作台用接种环接种1环红酵母菌株至灭菌后的PDB培养基中，封口后，于28℃，180rpm下振荡48小时；48小时之后用无菌水洗下孢子，将少量菌丝打碎制成红酵母孢子悬液，浓度为1×10⁷CFU/mL；

3)将所述草酸青霉孢子悬液和红酵母孢子悬液按体积比为1：1的比例接入PDB培养基当中，震荡培养3天，得到所述复合菌剂；所述草酸青霉孢子悬液和红酵母孢子悬液的总体积为所述PDB培养基体积的1％。

实施例3

一种联合修复剂，由以下方法制备得到：

将玉米秸秆200g、小麦秸秆50g、磷石膏200g、水稻秸秆25g、黄豆粉25g和水600g混合后，121℃灭菌20min，得到发酵物料；

将110mL实施例2步骤1)制备得到的草酸青霉孢子悬浮液接种到所述发酵物料中(即孢子数和磷石膏的比例为10⁷CFU：1g)，在30℃的环境中发酵7天，得到磷石膏有机肥；

将110mL实施例2步骤2)制备得到的红酵母孢子悬浮液接种到所述磷石膏有机肥中(即孢子数和磷石膏的比例为10⁷CFU：1g)，用玻璃棒搅拌均匀，2层纱布覆盖，在30℃的环境中发酵7天，得到所述联合修复剂。

应用例1草酸青霉和红酵母复合磷酸盐中磷素释放能力和铅固定的测定

摇瓶培养试验：本试验共分为六处理，POX+FAp、Rho+FAp、POX+Rho+FAp、POX+EPS+FAp、POX+SFU+FAp和FAp，每个处理进行4次平行重复实验；具体如下：

FAp：在250mL的锥形瓶内添加0.24gPb(NO₃)₂粉末、1g氟基磷灰石和100mLPDB培养基；所述PDB培养基经过121℃下灭菌20min处理；将锥形瓶在无菌条件下以180rpm，28℃的温度下培养；

POX+FAp：在250mL的锥形瓶内添加0.24gPb(NO₃)₂粉末、1g氟基磷灰石和100mLPDB培养基；所述PDB培养基经过121℃下灭菌20min处理；添加0.5mL草酸青霉孢子悬浮液后，将锥形瓶在无菌条件下以180rpm，28℃的温度下培养；

Rho+FAp：与POX+FAp相似，唯一区别在于，将草酸青霉孢子悬浮液替换为红酵母孢子悬浮液；

POX+Rho+FAp：在250mL的锥形瓶内添加0.24gPb(NO₃)₂粉末、1g氟基磷灰石和100mLPDB培养基；所述PDB培养基经过121℃下灭菌20min处理；添加0.5mL草酸青霉孢子悬浮液和0.5mL红酵母孢子悬浮液后，将锥形瓶在无菌条件下以180rpm，28℃的温度下培养；

POX+EPS+FAp：与POX+Rho+FAp相似，唯一区别在于，将红酵母孢子悬浮液替换为红酵母胞外多聚物(EPS)；

POX+SFU+FAp：与POX+Rho+FAp相似，唯一区别在于，将红酵母孢子悬浮液替换为红酵母上清液(SFU)；

该应用例中所用到的草酸青霉孢子悬浮液为实施例2步骤1)制备得到的草酸青霉孢子悬浮液；所述红酵母孢子悬浮液为实施例2步骤2)制备得到的红酵母孢子悬浮液；

红酵母胞外多聚物(EPS)和红酵母上清液(SFU)制备方法如下：

将马铃薯葡萄糖肉汤培养基在121℃下灭菌20min后，接种1环红酵母，并在28℃，180rpm下摇动48小时，得到活化的红酵母菌液；

将所述活化的红酵母菌液在4℃下，于12,000rpm下离心两次，每次10分钟，4℃冰箱里静置48h，收集上清液和沉淀(即EPS)；

将上清液与3倍体积的无水乙醇混合，得到所述酵母红酵母上清液(SFU)；

PDB液体培养基的配方为：马铃薯200g、葡萄糖20g和蒸馏水1000mL。

每个处理组培养6天后，将PDB培养基过滤到具有无磷滤纸的50mL离心管中，并在5000rpm下离心6分钟。采用ICP-OES测定每个处理培养液中的有效磷和铅含量。测定结果见图4～7。

图4结果表明，从释放的磷量来看，POX+Rho+FAp处理比较于其他处理的磷含量最大，为15.5mg/L。培养6天后，POX+EPS+FAp，POX+FAp，POX+SFU+FAp，Rho+FAp和FAp处理的平均磷含量分别为13.6mg/L，7.6mg/L，6.6mg/L，5.6mg/L和1.3mg/L。

图5～7的结果表明，将草酸青霉和红酵母复合磷酸盐培养后修复铅污染水的巨大潜力。磷酸盐仅能去除溶液中72.1％的铅离子，草酸青霉和磷酸盐组合可以去除95.6％的铅离子，红酵母和磷酸盐组合也可以去除98.3％的铅离子。POX+Rho和磷酸盐的组合可以去除高达99.7％的铅离子，POX+EPS和磷酸盐的组合可以去除高达99.4％的铅离子，POX+SFU和磷酸盐的组合的组合可以去除94.3％的铅离子。这些结果反映了POX+Rho在与磷酸盐作用后的铅修复中的优越性，超越了单个菌株与磷酸盐组合。并且POX和Rho对铅的耐受性都很高。

应用例2磷酸盐类功能真菌联合修复剂土壤铅污染修复试验

(1)将土样(安徽宿州，pH8.1，全氮1.21g/kg，碱解氮18.34mg/kg，速效钾184.98mg/kg，有效磷5.42mg/kg，有机质18.34g/kg)进行120℃，20min的高温灭菌，添加硝酸铅作为铅污染物，土样中初始铅含量为250mg/kg；

(2)将步骤(1)中添加有硝酸铅的土样与实施例3制备的联合修复剂混合；进行3个处理，每个处理进行3次平行重复实验，混合比例分别为：土样与联合修复剂的质量比为20：1、20：2和20：4；

混合均匀后在28℃条件下静置培养一周后进行破坏性取样，所取样品混合均匀后分别选取2g土壤进行水溶磷和有效铅含量测定。土壤水溶磷和有效铅的提取土和水的质量比均为40：2，振荡条件为180rpm，18小时。振荡结束后在4000rpm条件下离心10分钟，静置30分钟后对上清液水溶磷含量和有效铅含量进行分析，结果见图8和图9。

由图8可知，随着联合修复剂含量的增加，土样中水溶磷含量分别增加到5.95mg/kg、11.37mg/kg和24.41mg/kg，表明实施例3制备的联合修复剂可增加土壤中磷释放。

由图9可知，说明添加联合修复剂能够显著降低土壤铅浓度，随着联合修复剂含量的增加，土壤中铅分别下降至25.47mg/kg、24.87mg/kg和17.40mg/kg，说明实施例3制备的联合修复剂对铅有明显的固定作用，有效提高土壤中磷含量，消除磷石膏重金属污染。

综上所述，本发明提供的草酸青霉能促进难溶性磷酸盐中磷素的溶解，对重金属铅离子具有较强的固定能力，在提高土壤中磷的利用率，减少化肥施用，改善生态环境中起着重要作用。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.一株草酸青霉(Penicillium oxalicum)，其特征在于，所述草酸青霉保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.22475。

2.一种复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂包括红酵母(Redyeast)和权利要求1所述的草酸青霉；所述草酸青霉和红酵母的孢子浓度分别为1×10⁷～9×10⁷CFU/mL。

3.一种联合修复剂，其特征在于，所述联合修复剂的制备原料包括：权利要求1所述的草酸青霉、磷石膏、红酵母、秸秆和黄豆粉；

所述磷石膏、秸秆和黄豆粉的质量比为(8～10)：(8～11)：1；

所述草酸青霉的孢子数和磷石膏的质量比为1×10⁷～9×10⁷CFU：1g；

所述红酵母的孢子数和磷石膏的质量比为1×10⁷～9×10⁷CFU：1g。

4.根据权利要求3所述的联合修复剂，其特征在于，所述秸秆选自玉米秸秆、小麦秸秆和水稻秸秆中的一种或多种。

5.权利要求3或4所述联合修复剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将磷石膏、秸秆和黄豆粉混合，调节料水比，得到发酵原料；

混合所述草酸青霉、红酵母和发酵原料进行好氧发酵，得到所述联合修复剂。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述磷石膏、秸秆和黄豆粉的混合物和水的质量比为(1～2)：(1.2～1.5)。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，混合所述草酸青霉、红酵母和发酵原料进行好氧发酵的方法包括：将所述草酸青霉和发酵原料混合，进行第一好氧发酵，得到发酵物料；将所述发酵物料和红酵母混合，进行第二好氧发酵，得到所述联合修复剂。

8.权利要求1所述的草酸青霉或权利要求2所述的复合菌剂或权利要求3或4所述的联合修复剂或利用权利要求5～7任一项所述制备方法制备得到的联合修复剂在促进难溶性磷酸盐溶解和/或修复重金属污染中的应用；所述重金属为铅。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述难溶性磷酸盐选自磷酸铁、磷酸铝、磷酸钙和氟基磷灰石中的一种或多种。