CN111484939B - 一株壮观丝衣霉的分离及其应用 - Google Patents

一株壮观丝衣霉的分离及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株壮观丝衣霉的分离及其应用，属于微生物法处理废水领域。本发明分离得到的一株壮观丝衣霉能够适应工业生产所产生的强酸性废水条件，能够很好地生长繁殖，并且其对叶酸废水具有良好的处理效果，对污水中对环境有害的有机污染物有很好的净化作用，可以使COD值下降93.9％，可以完全去除废水中的氨氮，并且还能有效去除废水中的TDS，去除率可达98.1％；同时，对降低废水中的苯胺含量、改善废水的酸度、盐度也有很好的作用。且该菌株易于培养，容易保存，对于工业化处理强酸性污水具有非常广阔的应用前景，也有利于生态环境的保护及可持续发展。

Description

一株壮观丝衣霉的分离及其应用
技术领域
本发明涉及一株壮观丝衣霉的分离及其应用，属于微生物法处理废水领域。
背景技术
叶酸的生产原料主要为对硝基苯甲酞氯、谷氨酸钠、氰乙酸甲醋、硝酸肌、甲醇钠、三氯丙酮、焦亚硫酸钠、盐酸、硫酸等，生产叶酸每吨需要使用200吨水，反应过程中副反应众多，排出废水中大量的无机盐对环境造成了严重的破坏。叶酸废水是在叶酸生产过程中所产生的一类高酸度、高盐度、高COD、高氨氮、高色度的制药废水。多年来，利用微生物来处理强酸高盐度废水一直是研究的热点。现如今的微生物处理叶酸废水都是先将叶酸废水的pH值调节至中性，再将活性污泥投加到叶酸废水中进行降解污染物，这大大增加了废水处理的工艺步骤，还大大增加了处理叶酸废水的成本。通过驯化与筛选出来的优势微生物处理叶酸废水，可以大大缩短污水处理完成的时间，提高处理废水的效率，同时无需将pH调至中性，减少处理叶酸废水的成本。微生物处理废水运行费用低，安全无二次污染对环境友好等优点，符合可持续性发展的需求。
发明内容
本发明提供了一株壮观丝衣霉YS-1，已于2020年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19609，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。。
本发明提供了所述壮观丝衣霉YS-1的培养方法，所述方法是将壮观丝衣霉YS-1以体积比1～5％的接种量接种至培养基中，于100～200rpm、30～40℃恒温环境中培养10～24h。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将壮观丝衣霉YS-1以体积比1～3％的接种量接种至培养基中，于120～150rpm、32～36℃恒温环境中培养12～24h。
本发明提供了一种降低叶酸废水中COD或降低废水酸度的方法，所述方法是将所述菌株YS-1接种至叶酸废水中进行处理，处理12～30h。
在本发明的一种实施方式中，叶酸废水接种壮观丝衣霉YS-1后处理时间为22～26h。
在本发明的一种实施方式中，所述壮观丝衣霉YS-1接种量为废水体积的2～5％，OD600为1～2。
在本发明的一种实施方式中，所述处理条件为：温度30～40℃，100～200r/min。
本发明提供了一种完全降解叶酸废水中氨氮的方法，所述方法是将所述壮观丝衣霉YS-1接种至叶酸废水中进行处理，处理12～30h。
在本发明的一种实施方式中，叶酸废水接种壮观丝衣霉YS-1后处理时间为22～26h。
在本发明的一种实施方式中，所述壮观丝衣霉YS-1接种量为废水体积的2～5％，OD600为1～2。
在本发明的一种实施方式中，所述处理条件为：温度30～40℃，100～200r/min。
本发明提供了一种降低叶酸废水中TDS或盐度或苯胺含量的方法，所述方法是将所述菌株YS-1接种至叶酸废水中进行处理，处理12～30h。
在本发明的一种实施方式中，叶酸废水接种壮观丝衣霉YS-1后处理时间为22～26h。
在本发明的一种实施方式中，所述壮观丝衣霉YS-1接种量为废水体积的3～5％，OD600为1.5～2。
在本发明的一种实施方式中，所述处理条件为：温度30～40℃，100～200r/min。
本发明提供了一种所述壮观丝衣霉YS-1在处理强酸性废水中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述强酸性废水的pH不高于3.0。
在本发明的一种实施方式中，所述强酸性废水的pH不高于2.0。
本发明提供了一种含有所述壮观丝衣霉YS-1的污水处理剂。
在本发明的一种实施方式中，所述污水处理剂的制备方法为：将所述壮观丝衣霉进行活化培养，得到菌液，将活化培养后的菌液进行离心，收集沉淀，加入缓冲溶液清洗沉淀，在经清洗的沉淀中添加冻干保护剂，将添加有冻干保护剂的沉淀进行真空冷冻干燥，得到菌粉，所述菌粉单独可作为污水处理剂，或将所述菌粉与其他成分进行混合得到复合污水处理剂。
在本发明的一种实施方式中，所述其他成分包括土豆粉、蔗糖、纤维素或其两种以上的混合物。
在本发明的一种实施方式中，活化培养后菌液的浓度为1.0×105～1.0×107CFU/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述壮观丝衣霉在污水处理剂中的质量百分数为50％～80％。
本发明提供了一种利用含有所述壮观丝衣霉YS-1的污水处理剂在污水处理中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用为降低废水的COD值。
在本发明的一种实施方式中，所述应用为去除废水中的氨氮或TDS。
在本发明的一种实施方式中，所述应用为降低废水中的盐度和苯胺含量。
在本发明的一种实施方式中，所述应用为降低废水的酸度。
的应用。
有益效果：本发明从常州市新鸿医药化工技术有限公司的污水中分离出一株壮观丝衣霉，该菌株能够适应工业生产所产生的强酸性废水条件，能够很好地生长繁殖，并且其对污水中对环境有害的有机污染物有很好的净化作用，可以使COD值下降93.9％，可以完全去除废水中的氨氮；还能有效去除废水中的TDS，去除率可达98.1％；可有效改善废水的酸度，将pH调节至6.9；对于废水中的苯胺的降解率达88.9％。因而在工业化处理强酸性污水具有非常广阔的应用前景，也有利于生态环境的保护及可持续发展。
附图说明
图1为本发明的壮观丝衣霉YS-1菌落形态及细胞形态图。
图2为本发明的壮观丝衣霉YS-1菌株rDNA电泳图；DL2000条带分布：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道1～3分别表示同一平板上挑取的单菌落。
生物材料保藏
本发明所提供的壮观丝衣霉，分类学命名为壮观丝衣霉Byssochlamysspectabilis，已于2020年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19609，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
酸性LB液体培养液：胰蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母浸出膏5g，加入蒸馏水并加入盐酸调节至所需的酸度，总体积为1L，于121℃灭菌20min后制得。
酸性PDA固体培养基：马铃薯洗净皮，称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸20～30分钟，能被玻璃棒戳破即可)；用八层纱布过滤，加热，再加20g琼脂；继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装锥形瓶，加塞、包扎，于121℃灭菌20min后趁热加入盐酸调节至pH为1.5，冷却后贮存备用。
实施例1：菌株的筛选及鉴定
1、菌株的筛选
(1)将取回的叶酸废水进行降温和调整pH的预处理，将废水温度降至室温，将pH依次调整为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0；
(2)将pH调整为7的叶酸废水150mL装入500mL的锥形瓶中，加入终浓度为1g/L的葡萄糖，1.5g/L的K2HPO4，0.1g/L的CaCl2，0.1g/L的MgSO4，0.05g/L的FeSO4，加入25mL取回的含活性污泥的泥水混合物，将锥形瓶放入摇床中，设定温度为35℃，摇床转速为140r/min。测定COD的数值，当COD的测定值不断减小直到趋于100mg/L时，表示这一阶段驯化完成；
(3)将锥形瓶中的活性污泥取出，投加到pH为6的叶酸废水中，重复步骤(2)，直到锥形瓶中的叶酸废水的pH为3.0时，完成pH为3.0的活性污泥的驯化；
(4)从步骤(3)驯化后的活性污泥中蘸取5μL液体加入到灭过菌的LB液体培养基中。在35℃、140r/min下的摇床中培养24h后，蘸取200μL液体，于PDA固体培养基上涂布。
(5)PDA固体培养基放在35℃的培养箱中培养1～2d，观察菌落的形态。在每个菌落上挑取少量菌种于pH为1.5的LB液体培养基中，培养12～24h后接种于pH为1.5的PDA固体培养基上；
(6)将步骤(5)重复多次，直至每个PDA固体培养基中都获得单一的菌种；
(7)从长出单一菌种的培养基中挑取单菌种接种至2mL酸性LB培养基(pH1.5)，在35℃、140rpm培养12h至OD600为0.9；
(8)将步骤(7)中OD600为0.9的菌液以体积比3％的接种量接种至300mL酸性LB培养基(pH1.5)，在35℃、140rpm培养12～24h。
2、菌株的鉴定
分离出的本发明的菌株在酸性PDA培养基上菌落呈白色、中等大小、圆形、湿润、凸的、边缘透明，菌落不透明；利用光学显微镜观察菌株的形态特征，菌丝延伸分布(如图1所示)。
该菌株的菌属由上海美吉生物医药科技有限公司进行鉴定，利用3730XL双向测序方法，使用ITS通用引物扩增后，将扩增得到的条带进行电泳检测。电泳图如图2所示，序号为1的电泳条带则表示的该菌株的电泳带。
(1)所用引物：
ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，
ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC；
(2)PCR扩增反应体系：
①10×Ex Taq buffer 2μL、②5U Ex Taq 0.2μL、③2.5mM dNTP Mix 1.6μL、④27F和1492R各1μL、⑤DNA 0.5μL、ddH2O13.7μL。
(3)PCR反应条件：
①95℃5min；②95℃30s；③56℃30s；④72℃90s；⑤将②～④三个步骤循环25次；⑥72℃10min；⑦4℃保温。
实施例2：壮观丝衣霉YS-1耐热性
(1)将筛选获得的壮观丝衣霉YS-1接种以体积比2％的接种量接种至10mL酸性LB培养基(pH1.5)中37℃、220rpm下进行活化，将活化后的壮观丝衣霉YS-1接种至新鲜的酸性PDA培养基中，并使其在培养基中的OD600为0.1；
(2)分别在不同温度30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃静置培养24h；
(3)计算活菌数。
结果如表1所示：在30～40℃时，菌株具有较高的活性，活菌数能达到7.33～8.55log CFU/mL。
表1菌株YS-1在不同温度下的活菌数(log CFU/mL)
Figure GDA0003324454300000051
实施例3：壮观丝衣霉YS-1在降低叶酸废水中COD值的应用
将筛选获得的壮观丝衣霉YS-1以体积比1％的接种量接种至10mL酸性LB培养基(pH1.5)中35℃、140rpm下进行活化，当OD600达到0.6～0.8时，以体积比1％的接种量接种于300mL酸性LB液体培养基中35℃、140rpm培养14小时后，使OD600达到1.3。然后将菌液以体积比5％的接种量接种至叶酸废水中(该污水来自于常州市新鸿医药化工技术有限公司，pH约为1.5)，在35℃、140rpm处理叶酸废水，进行处理，在不同时段测定污水中COD值。COD测定方法：按照GB11914-89《化学需氧量的测定》。
如表2所示，该菌株对于叶酸废水中的有机物有很好的降解作用，经过12h处理的废水中的COD值已经降低54.2％，在处理24h后，COD值降低至89.5mg/L，有机物降解率达到93.2％，在处理72h后，降解率可达93.9％。
表2处理不同时间废水中COD值
Figure GDA0003324454300000052
实施例4：壮观丝衣霉YS-1在降低叶酸废水中氮含量的应用
将筛选获得的壮观丝衣霉YS-1以体积比1％的接种量接种至10mL酸性LB培养基(pH1.5)中35℃、140rpm下进行活化，当OD600达到0.6～0.8时，以体积比1％的接种量接种于300mL酸性LB液体培养基中35℃、140rpm培养14小时后，使OD600达到1.3。然后将菌液以体积比5％的接种量接种至pH约为1.5的叶酸废水中(该污水来自于常州市新鸿医药化工技术有限公司)，在35℃、140rpm处理叶酸废水，进行处理，在不同时段测定污水中氨氮值。
氨氮测定方法：参照HJ 535-2009《水质-氨氮的测定-纳氏试剂分光光度法》。
如表3所示，该菌株对于废水中的氨氮也具有很好的降解作用，在处理24h后，在废水中完全检测不到氨氮。
表3处理不同时间废水中氨氮含量
Figure GDA0003324454300000053
Figure GDA0003324454300000061
实施例5：壮观丝衣霉YS-1在降低叶酸废水中TDS的应用
将筛选获得的壮观丝衣霉YS-1以体积比1％的接种量接种至10mL酸性LB培养基(pH1.5)中35℃、140rpm下进行活化，当OD600达到0.6～0.8时，以体积比1％的接种量接种于300mL酸性LB液体培养基中35℃、140rpm培养14小时后，使OD600达到1.3。然后将菌液以体积比5％的接种量接种至pH约为1.5的叶酸废水中(该污水来自于常州市新鸿医药化工技术有限公司)，在35℃、140rpm处理叶酸废水，进行处理，在不同时段测定污水中TDS。
溶解性总固体(TDS)测定方法：参照GB/T 14415-2007《工业循环冷却水中溶解性固体的测定》中重量法测定水中溶解性总固体。
如表4所示，该菌株对于废水中的可溶性固体也有很好的降解作用，在用菌株处理了24h，可溶性固体就降解了96.2％，并且在72h之内，随着处理时间的延长，TDS值也在不停下降，最终可以降解98.1％。
表4处理不同时间废水中TDS值
Figure GDA0003324454300000062
实施例6：壮观丝衣霉YS-1在提高改善叶酸废水酸度中的应用
将筛选获得的壮观丝衣霉YS-1以体积比1％的接种量接种至10mL酸性LB培养基(pH1.5)中35℃、140rpm下进行活化，当OD600达到0.6～0.8时，以体积比1％的接种量接种于300mL酸性LB液体培养基中35℃、140rpm培养14小时后，使OD600达到1.3。然后将菌液以体积比5％的接种量接种至pH约为1.5的叶酸废水中(该污水来自于常州市新鸿医药化工技术有限公司)，在35℃、140rpm处理叶酸废水，进行处理，在不同时段测定废水pH值。
如表5所示，该菌株能够使得废水中的pH逐渐升高，呈现弱酸性。
表5处理不同时间废水中pH
Figure GDA0003324454300000063
实施例7：壮观丝衣霉YS-1在降低叶酸废水盐度中的应用
将筛选获得的壮观丝衣霉YS-1以体积比1％的接种量接种至10mL酸性LB培养基(pH1.5)中35℃、140rpm下进行活化，当OD600达到0.6～0.8时，以体积比1％的接种量接种于300mL酸性LB液体培养基中35℃、140rpm培养14小时后，使OD600达到1.3。然后将菌液以体积比5％的接种量接种至pH约为1.5的叶酸废水中(该污水来自于常州市新鸿医药化工技术有限公司)，在35℃、140rpm处理叶酸废水，进行处理，在不同时段测定水中的盐度。
盐度测定方法：参照F-HZ-DZ-HS-0052《海水—盐度的测定—盐度计法》，采用盐度计测量污水的盐度。
如表6所示，该菌株在废水中盐度的降解方面也起到一定的作用，在处理24h后，能够使盐度降低58％。(盐度主要是指污水中所含盐分物质浓度)
表6处理不同时间废水中盐度
Figure GDA0003324454300000071
实施例8：壮观丝衣霉YS-1在降低叶酸废水苯胺中的应用
将筛选获得的壮观丝衣霉YS-1以体积比1％的接种量接种至10mL酸性LB培养基(pH1.5)中35℃、140rpm下进行活化，当OD600达到0.6～0.8时，以体积比1％的接种量接种于300mL酸性LB液体培养基中35℃、140rpm培养14小时后，使OD600达到1.3。然后将菌液以体积比5％的接种量接种至pH约为1.5的叶酸废水中(该污水来自于常州市新鸿医药化工技术有限公司)，在35℃、140rpm处理叶酸废水，进行处理，在不同时段测定水中的苯胺。
苯胺的测定方法：参照GB T 11889-1989《水质苯胺类化合物的测定N-(1-萘基)乙二胺偶氮分光光度法》。
如表7所示，该菌株也能够降解废水中的苯胺，在菌株处理48h后，能够使得废水中苯胺含量降低88.9％。
表7处理不同时间废水中苯胺
Figure GDA0003324454300000072
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一株壮观丝衣霉(Byssochlamys spectabilis)，已于2020年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.19609。
2.一种污水处理剂，其特征在于，所述处理剂含有权利要求1所述的壮观丝衣霉。
3.根据权利要求2所述污水处理剂，其特征在于，所述壮观丝衣霉在污水处理剂中的质量百分数为50％～90％。
4.一种叶酸废水的处理方法，其特征在于，所述方法是将权利要求1所述的壮观丝衣霉加入至叶酸废水中，或在叶酸废水中加入权利要求2～3任一所述污水处理剂，对污水进行处理。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述壮观丝衣霉接种量为废水体积的1～5％，接种时的OD600为0.5～2。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在30～40℃下处理12～30h。
7.权利要求1所述壮观丝衣霉在处理强酸性废水中的应用；所述强酸性废水的pH不高于3.0。
8.权利要求1所述的壮观丝衣霉，或权利要求2～3任一所述的污水处理剂在污水处理中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下(a)～(d)至少一种：
(a)降低废水的COD；
(b)去除废水中的氨氮或TDS；
(c)降低废水中的盐度和苯胺含量；
(d)降低废水的酸度。
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