CN102268386B - 氨氧化细菌及其分离方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种氨氧化细菌及其分离方法与应用。该氨氧化细菌，其保藏编号为CGMCC No.4287。所述的氨氧化细菌可将氨转化成亚硝酸盐。该氨氧化细菌的分离方法包括包括如下步骤：将活性污泥进行驯化，打散，加入到富集培养基中，进行富集培养，取富集液涂布在硅胶平板上，30℃黑暗培养；长出菌落后，挑取单菌落到琼脂平板上，进行平板分离纯化，对分离出的菌株进行鉴定，获得氨氧化细菌。本发明的氨氧化细菌具有优异的氨氧化效果，氨氧化效果可达90％以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种氨氧化细菌及其分离方法与应用。
背景技术
氮在大气中大量存在，同时，氮元素是大分子的组成元素之一，因此，是生物所必不可少的营养元素，在生物的生存、延续和发展作用中扮演着重要角色。良好的氮素循环使得氮的各种价态存在形式趋于平衡。但随着工农业的发展与人民生活水平的提高，我国含氮有机物的排放量迅猛增加，氮循环的破坏导致其中一种或几种价态形式存在的氮得以累计，其破坏性也秧及到大小水体，严重威胁到我们赖以生存的生态空间。如今水体富营养化已经成为我国水环境面临的重大问题，严重地阻碍着我国国民经济的发展。氮素污染是引起水体富营养化的重要原因之一，因此污水的脱氮处理在废水处理过程中越来越显示其重要地位。目前，与物理化学脱氮方法相比，生物脱氮工艺因具有处理效果好、处理成本低、操作管理方便等优点而得到广泛应用，已经成为废水中去除氮素污染的最有效的方法之一。
生物脱氮的理论基础是微生物作用下的硝化作用和反硝化作用。在自然环境中，硝化作用主要是依靠微生物的消化能力来完成的，目前所提到的硝化作用作为自然界氮循环的重要环节之一，是指NH4 +或NH3被氧化为NO2 -至NO3 -的一系列生化反应。其中分为两个阶段，首先是亚硝化作用，把NH4 +或NH3到NO2 -的反应过程，是氮素循环的重要环节，由氨氧化细菌来完成。然后由硝化细菌把亚硝酸盐氮氧化为硝酸盐氮。氨氧化细菌有自养型和异养型之分，一般将氨氧化细菌归为硝化杆菌科。
近年来，国内外学者对废水生物脱氮工程实践中揭示出的问题和现象进行了大量理论和试验研究，力求进一步完善对氮素转化过程的认知，并提出了一些突破传统理论的新认识，其中就包括对氨氧化细菌的新认识。自养亚硝化细菌为硝化杆菌科的两个生理亚群之一，在自然界氮循环链中起重要作用，能将氨态氮转化为亚硝酸盐氮，并从该氧化过程中获得能量，同化无机碳化合物如CO3 2-、HCO3 -和CO2，合成细胞物质。在细菌系统发育图谱中根据16SrRNA序列同源性分析，把亚硝化细菌生理亚群中的亚硝化单胞菌属归为紫色细菌群(Proteobacteria)的β亚群。其它基于16S rRNA序列同源性分析或氨单加氧酶(Ammoniamonooxyg-enase，AMO)序列分析进行系统发育关系的研究表明，除海洋亚硝化球菌(Nitroso-ococcus oceanus)和嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)为紫色细菌群的γ亚群(Gammasubdivision or gamma subclass)外，亚硝化细菌各属构成紫色细菌群β亚群。除了亚硝化单胞菌(Nitrosomonas)属外，其它能把氨氧化成亚硝酸的细菌属包括亚硝化螺菌属(Nitrosospira)、亚硝化球菌属(Nitrosococcus)、亚硝化弧菌属(Nitrosovibrio)、亚硝化叶菌属(Nitrosolobus)、亚硝化胶团菌属(Nitrosogloea)、亚硝化囊菌属(Nitrosocystis)。自养硝化作用在自然界生物硝化过程中占主导地位，但在某些环境中，真菌、放线菌、异养细菌等异养硝化微生物进行化能有机营养，能将氨、羟胺或有机氮化合物如肟等氧化成亚硝酸和硝酸。实际上，一个世纪以前就有关于异养硝化微生物及其异养硝化作用的报道，近几十年研究者相继从不同类型生境发现和分离了多种具有硝化活性的异养微生物(包括细菌、放线菌、真菌)。其中，异养硝化细菌有反硝化假单胞菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、产碱杆菌、节杆菌、粪产碱菌、PB16假单胞菌以及一些新发现的菌种(或属)。
发明内容
本发明的目的是提供一种氨氧化效果的氨氧化细菌及其分离方法与应用。
本发明所提供的氨氧化细菌，命名为A.P-8(pseudomonas sp.)，已于2010年11月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.4287。
氨氧化细菌A.P-8CGMCC No.4287可将氨转化成亚硝酸盐。
本发明所提供的的氨氧化细菌的分离方法，包括如下步骤：
将活性污泥进行驯化，打散，加入到富集培养基中，进行富集培养，取富集液涂布在硅胶平板上，30℃黑暗培养；长出菌落后，挑取单菌落到琼脂平板上，进行平板分离纯化，对分离出的菌株进行鉴定，获得氨氧化细菌；
所述的富集培养基的成分为(NH4)2SO40.5g/L，KH2PO40.2g/L，CaCl.2H2O 0.04g/L，MgSO4.7H2O 0.04g/L，甲酚红0.5mg/L，Fe-EDTA 0.5mg/L；
所述琼脂平板的成分为(NH4)2SO42g/L，K2HPO40.75g/L，NaH2PO40.25g/L，MnSO4.4H2O0.01g/L，MgSO4.7H2O 0.03g/L，CaCO35g/L，甲酚红0.5mg/L。
本发明的氨氧化细菌具有优异的氨氧化效果，氨氧化效果可达90％以上，而现有的氨氧化细菌的氨氧化效果最高为80％。
附图说明
图1为NH4 +-N和NO2 --N值的变化。
图2为氨态氮、亚硝态氮和总氮的变化。
图3为16S rDNA扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析图谱。
图4为重组子PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析图谱。
具体实施方式
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
(一)培养基及试剂
富集培养基的配制：称取(NH4)2SO40.5g，KH2PO40.2g，CaCl.2H2O 0.04g，MgSO4.7H2O0.04g，甲酚红0.5mg，Fe-EDTA 0.5mg，溶解于1L蒸馏水中，用1mol/L的NaOH调节培养基pH为7.8～8.0，经121℃高温高压灭菌30min，静置冷却至室温，得到富集培养基。富集培养基的成分：(NH4)2SO40.5g/L，KH2PO40.2g/L，CaCl.2H2O 0.04g/L，MgSO4.7H2O 0.04g/L，甲酚红0.5mg/L，Fe-EDTA 0.5mg/L。
液体分离培养基的配制：称取(NH4)2SO42g，K2HPO40.75g，NaH2PO40.25g，MnSO4.4H2O0.01g，MgSO4.7H2O 0.03g，CaCO35g，甲酚红0.5mg，溶解于1L蒸馏水中，用1mol/L的NaOH调节培养基pH为7.8～8.0，经121℃高温高压灭菌30min，静置冷却至室温，得到液体分离培养基。液体分离培养基的成分：(NH4)2SO42g/L，K2HPO40.75g/L，NaH2PO40.25g/L，MnSO4.4H2O0.01g/L，MgSO4.7H2O 0.03g/L，CaCO35g/L，甲酚红0.5mg/L。
硅胶平板的配制：取155ml蒸馏水加5.5ml相对密度为1.84的浓硫酸，取185ml蒸馏水加22.0ml相对密度为119的浓盐酸，两者混合即为稀酸液；取500ml蒸馏水加82.59g硅酸钠(Na2SiO3·9H2O)，搅拌溶解即为水玻璃；分别吸取12ml水玻璃和8ml稀酸液于小烧杯中，快速搅拌混匀，倒入培养皿中，静置凝固。将凝固后的硅胶板放入水槽中，用自来水浸洗5～8次，每次15～25min。用1％的AgNO3溶液检查Cl-去除效果，如呈白色则继续冲洗。当Cl-除去之后，硅胶板再用冷却开水浸洗1次，无菌水(或蒸馏水)清洗1次，倒置过夜晾干。在每一硅胶板表层加入氨氧化细菌分离培养液2ml，然后放入烘箱中，35～45℃维持1.0～1.5h至表层无营养液流动，然后与培养皿盖子一同在紫外灯下照射30min，即为硅胶平板。
琼脂平板的配制：称取(NH4)2SO42g，K2HPO40.75g，NaH2PO40.25g，MnSO4.4H2O 0.01g，MgSO4.7H2O 0.03g，CaCO35g，甲酚红0.5mg，溶解于1L蒸馏水中，用1mol/L的NaOH调节培养基pH为7.8～8.0。加入10g琼脂，加热使其充分溶解，经121℃高温高压灭菌30min，静置冷凝成平板，得到琼脂平板。琼脂平板的成分：(NH4)2SO42g/L，K2HPO40.75g/L，NaH2PO40.25g/L，MnSO4.4H2O 0.01g/L，MgSO4.7H2O 0.03g/L，CaCO35g/L，甲酚红0.5mg/L。
格里斯试剂的配制：格里斯试剂由甲乙两种溶液混合而成。甲溶液：称取对氨基苯甲酸0.5g，溶于150ml10％的醋酸中，过滤，棕色瓶保存此试剂一个月内可用；乙溶液：称取0.1gα-萘胺溶于150ml10％的醋酸和20ml蒸馏水的混合液中，过滤，棕色瓶保存，此试剂一个星期内可用。使用前将甲液和乙液等体积混合。
(二)富集培养和分离纯化：
将采自污水处理厂的活性污泥进行驯化之后，取200mL污泥至装有玻璃珠的锥形瓶中，在30℃恒温、180rpm的条件下，空气浴恒温振荡培养箱振荡30min，使污泥充分打散，污泥颗粒或菌胶团中的活菌释放出来。打散后的污泥按质量比1∶10加入到盛有富集培养基的无菌的锥形瓶中，置于30℃恒温振荡培养箱中黑暗培养。在富集培养过程中，用格里斯试剂检测NO2 --N的生成情况，与此同时，测定NH4 +-N和NO2 --N的值，结果如图1，衡量富集培养的氨氧化效果。选取上述富集液中，在用格里斯试剂检测NO2 --N的生成情况时，呈现玫瑰红色的富集液，吸取0.01ml，采用涂布法均匀涂布在硅胶平板上，30℃恒温黑暗培养1～2周，观察菌落生长状况。长出针尖大小的菌落后，挑取若干个单菌落到琼脂平板上，采用“十字交叉划线法”进行平板分离培养。30℃恒温黑暗培养10～14天，观察菌落生长情况。对分离得到的初步确定为氨氧化细菌的菌株进行氨氧化效果检测。挑取菌株至液体分离培养基中，30℃恒温、黑暗培养17d，测定氨态氮、亚硝态氮和总氮的变化情况，结果如图2。
(三)菌株的鉴定：
通过肉眼和光学显微镜观察琼脂糖平板上生长的菌落形态特征，参照《伯杰细菌鉴定手册(第八版)》进行表观形态鉴定；通过透射电镜(JEM1400)观察菌株的内部结构。
菌落针尖大小，圆形，表面湿润，颜色呈黄色，显微镜观察菌体形态为杆状，与假单孢菌属特征基本一致。
参照《微生物学实验》对分离出的菌株进行革兰氏染色实验和相应的生理生化实验：淀粉水解试验、靛基质和硫化氢试验、糖发酵试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、接触酶试验、柠檬酸盐利用试验、伏-普试验(V.P.试验)、甲基红试验(M.R.试验)、需氧性试验对分离菌株进行初步鉴定，结果如表1所示。
表1.生理生化实验结果
表1中“+”表示阳性；“-”表示阴性。
采用TIANamp Bacteria DNAKit试剂盒提取分离菌株的DNA，用作16S rDNA扩增的模板。使用正向引物F为：5’AGAGTTTGATCCTCAG3’，反向引物R为：5’GCTTACCTTACGACTT3’进行扩增。
PCR反应体系(50μL)：5×PrimeSTARTM Buffer(Mg2+plus)：10μL；10mmol/L的dNTPMixture(各2.5mM)：4μL；DNA模板：1μL；正反向引物(10pmol/L)各1μL；Primes STARTMHS DNAPolymerase(2.5U/μL)：0.5μL；灭菌超纯水32.5μL。
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min；58℃退火12sec；72℃延伸1min；30个循环；72℃后延伸10min。
PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，通过和marker(DL2000)比较片段大小确定是否为目的片段，结果如图3。
使用琼脂糖凝胶回收试剂盒对含有目的片段的PCR产物进行胶回收。在50μlPCR管中加入4μL胶回收的产物、1μL pEASY-blunt载体，轻弹混匀，室温反应15min。将上述反应产物转至100μL大肠杆菌Trans-T感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激90s，立刻置于冰上2min，然后加入至300μL LB培养基(不含Amp+)中，37℃、260r/min孵育45min。取100μL菌液均匀涂布在LB平板(含Amp+)上，37℃倒置培养16h。挑取平板上的白色菌落于600μL的LB培养基(含Amp+)中，37℃、260r/min培养16h，采用M13F和M13R引物对菌液PCR扩增进行重组子阳性检测。M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13R：CAGGAAACAGCTATGACC。PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，通过和marker(DL2000)比较片段大小确定是否克隆成功，结果如图4。克隆成功的样品使用引物M13F和M13R进行测序。A.P-8菌株16S rDNA扩增的序列如序列表中序列1所示，将测序所得到的基因组序列经BLAST程序与GenBank核酸数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行比对分析，结果与假单胞菌相似性高达99％。
氨氧化细菌A.P-8，已于2010年11月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.4287。
A.P-8CGMCC No.4287菌株接入盛有富集培养基的无菌的锥形瓶中，置于30℃恒温振荡培养箱中黑暗培养。在富集培养过程中，用格里斯试剂检测NO2 --N的生成情况，与此同时，测定NH4 +-N、NO2 -N及TN的值。NH4 +-N值的测定采用纳氏剂紫外分光光度法。NO2 --N的值采用离子色谱法，离子色谱仪(仪器型号DIONEX IC-1000，阴离子分离柱LonPad AS11-HC，电导检测器ECD-1，淋洗液30mmol/LNaOH。水样用孔径为0.45μm的混合纤维滤膜进行过滤，进样量为1mL)TN值测定采用总有机碳分析仪(仪器型号SHIMADZU TOC-VCPH，总氮附件型号TNM-1，载气高纯空气，载气压力200kPa，载气流速150mL/min，水样用孔径为0.45μm的混合纤维滤膜进行过滤，加入过硫酸钾，121℃消解30min)。NH4 +-N、NO2 -N及TN的结果如表2所示。
综上所述，菌株A.P-8CGMCC No.4287的氨氧化效果可达90％以上，而现有的氨氧化细菌的氨氧化效果最高为80％(章正勇，陈旭，安立超.氨氧化细菌富集培养的实验研究[J].化学与生物工程，2007，24(7)：63～67)。
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (2)
1.一种氨氧化细菌，其为假单胞菌（Pseudomonas sp.），其保藏编号为CGMCC No.4287。
2.权利要求1所述的氨氧化细菌在将氨转化成亚硝酸盐中的应用。
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