CN101338282B - 一种异养硝化好氧反硝化细菌及其培养方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于环境微生物领域，涉及一种高效的异养硝化好氧反硝化细菌及其培养方法和用途。该细菌是恶臭假单胞菌种(Pseudomonas putida DN1.2)，保藏登记号为CCTCC M207075，能够有效脱除水体中的氨氮、亚硝酸氮、硝酸氮及其混合物，还可同时去除有机废水中的COD_Cr，适用于高浓度有机含氮废水、无机含氮废水的处理，脱氮过程中，不产生亚硝酸盐和硝酸盐的积累。使用该菌株处理废水工艺简单，脱氮效果稳定。

Description

一种异养硝化好氧反硝化细菌及其培养方法和用途

技术领域

本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种高效的异养硝化好氧反硝化细菌及其培养方法和用途。 

背景技术

含氮废水是目前环境污染治理中的重大问题。生物脱氮是目前被公认为废水脱氮中最经济、最有效的方法之一。传统的氨氮废水处理是通过自养硝化菌的硝化作用与异养反硝化菌的反硝化作用的组合工艺使氨氮转化为氮气。 

该工艺冗长，由于硝化和反硝化的工艺条件不同，需分别在两个系统中完成，造成了两方面不足。首先是能耗大，氨氮硝化要耗氧，也就是要耗能供氧，前置反硝化系统需设置回流比较大的混合液内回流，这也增加了能耗。其次，反硝化反应要有碳源作为电子供体，若污水中碳源不足(C/N过低)，则需投加甲醇等有机碳，这不仅增加了运行费用，还增加了运行管理和后续处理的难度。因此废水处理工程投资大，运行成本高。而且硝化细菌通常是自养硝化菌，增殖缓慢，容易在废水生物处理系统中被淘汰，由此影响废水生物处理系统脱氮效果的稳定性。因此国内外学者一直在寻找高效低耗的脱氮工艺。 

近几十年来，从土壤、深海火山口、污泥、湖水等处分离得到了多种具有硝化活性的异养微生物，包括有细菌、放线菌和真菌等，被称为异养硝化菌。这是一类具有重要应用价值的微生物资源，它们可以利用很多基质，包括无机N和有机N：如铵、胺、酰胺、N一烷基羟胺、肟、氧肟酸及芳香硝基化合物等。由于许多异养硝化菌也具有好氧反硝化作用，在氧化过程中形成多种无机和有机N化合物，包括一些气态N产物如氧化亚氮等直接脱出水溶液系统，这为研究开发简捷的含氮废水处理新工艺提供了基础，而具有好氧反硝化作用的异养硝化菌就是简捷脱氮新工艺的关键菌株。 

异养硝化菌易于培养，增殖较快，底物利用范围广，在废水生物脱氮系统中可以稳定存在。因此采用异养硝化菌开发设计简捷的废水脱氮新工艺，可实现生物脱氮工艺的快速启动和稳定运行，提高脱氮效率，降低运行成本。有望克服传统处理工艺在处理效率与经济适用两方面的矛盾，实现废水高效经济的脱氮，为解决日益严重的含氮化合物对环境的污染问题作出贡献。 

发明内容

针对以上问题，本发明的目的是提供一株具有异养硝化和好氧反硝化活性的细菌，该细菌具有脱除水体中氮素的能力。 

本发明的另一个目的是提供一种培养条件，使该细菌能表现出更强的异养脱氮能力。 

本发明的另一个目的是提供一种培养条件，使该细菌能表现出自养脱氮能力。 

本发明的另一个目的是提供新的细菌在水体生物脱氮中的应用，单独使用该细菌便可有效脱除水体中的氮素。 

通过本发明可达到以上各目的。 

本发明可以通过以下方式得以实现： 

1.本发明中的菌株是一种具有脱氮生物活性的细菌，可以单株脱除水体中的氨氮，还可以通过好氧反硝化脱除水体中的亚硝酸氮和硝酸氮。该菌株既可以异养生长，又能自养生长；既能在有机碳源条件下脱氮，又能在无机碳源条件下脱氮。在脱氮过程中，没有检测到亚硝酸盐和硝酸盐的积累。更具体地，该菌株属于恶臭假单胞菌属的恶臭假单胞菌Pseudomonas putida DN1.2，保藏登记号为CCTCC NO.M207075，保藏地点：中国典型培养物保藏中心，保藏时间：2007年5月25日。 

2.本发明菌株的分离鉴定： 

(1)培养基： 

A.自养硝化培养基(g/L)：(NH₄)₂SO₄2，K₂HPO₄1，MgSO₄·7H₂O 0.5，FeSO₄·7H₂O 0.4，NaCl 2。装瓶后按质量百分比为0.5％的比例加入CaCO₃，最后用1％的NaOH溶液调pH到7.2，121℃灭菌20分钟。 

B.硅胶平板的制作：将Na₂SiO₃·9H₂O配成比重为1.10的溶液，并过滤澄清。将等体积的上述溶液缓慢倒入比重为1.09的盐酸中，不断搅拌，使其混合均匀。在溶液混合均匀的情况下倒平板。静置24小时，待其凝固。用缓慢流水冲洗2～3天，以便除去C1^-。加AgNO₃检测，直到无白色产生为止。用煮沸的蒸馏水冲洗3次灭菌。 

C.分离培养基：在每一个硅胶平板培养皿中加入培养基A2mL，轻轻转动培养皿，使培养液均匀分布，打开烘箱在50℃烘箱烘至无水流动为止。 

D.牛肉膏培养基(g/L)：牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，调pH 7.2～7.4，121℃灭菌20分钟。 

E.有机碳源脱氮培养基(g/L)：KH₂PO₄0.7，MgSO₄·7H₂O 0.5，CaCl₂·2H₂O 0.5，(NH₄)₂SO₄0.3～2.5，葡萄糖0.5～4.0，NaOH调pH 7.2～7.4，121℃灭菌20分钟。 

上述培养基如制成固体培养基，则添加加琼脂1.5％～2.0％。 

(2)恶臭假单胞菌菌株DN1.2的分离纯化 

以发明人实验室长期运行的废水脱氮生物反应器中的污泥为样品，取100mL污泥，静置10分钟，去掉上清液，用剩下的污泥作为原液进行梯度稀释为10⁰、10^-1、10^-2。采用(1)中所述的分离培养基C平板培养，用移液枪在每个平板中加入10⁰、10^-1、10^-2样品各0.2mL，然后用灭菌玻璃珠均匀涂布。倒置放入加了水的干燥器中，以防硅胶平板干裂，30℃培养直至硅胶平板上长出单菌落。挑取单菌落采用培养基A平板划线，进一步纯化得到本发明中的菌株Pseudomonas putida sp DN1.2。后来发现该细菌能在培养基D中生长，于是采用培养基D进行菌种保藏。 

(3)恶臭假单胞菌菌株DN1.2菌落形态特征：在培养基A平板上培养2d后，解剖镜下观察到菌落直径约0.Smm，乳白色，菌落呈圆形、半透明，表面湿润、边缘较整齐。在培养基D上培养3d后，菌落浅黄色，近圆形，直径2～3mm，边缘较光滑。 

(4)恶臭假单胞菌菌株DN1.2菌体形态特征：透射电镜的观察表明菌体呈椭球或短杆状，500～600nm×800～900nm。 

(5)恶臭假单胞菌菌株DN1.2的生理生化特征： 

最适培养温度30～30℃，pH7.0～7.5，革兰氏染色阴性。主要的生理生化特性见表1。 

表1DN1.2菌株的主要生理生化特性 

注：+表示阳性反应或能利用；一表示阴性反应或不能利用 

(6)16SrDNA的PCR扩增与测序： 

实验仪器：BIO-RAD MJ Mini Thermal Cycler(PCR仪)，BIO-RAD PowerPac3000稳压电泳仪，GDS8000，Gene Company Limited凝胶成像仪 

实验方法：热裂解菌悬液，以基因组DNA为模板扩增16S rDNA，扩增引物采用细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1505R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，分别对应于大肠杆菌(Escherichia coli)16S rDNA8～27位和1487～1505位的核苷酸，引物合成由宝生物公司(TAKARA)完成。PCR反应体系采用50μl反应体系：10×缓冲液(含Mg²⁺)5μl，4μl dNTP(各2.5mmol/L)，10μmol/L引物各1μl，rTaq酶(5U/μl)0.5μl，10ng/μl DNA模板1μl，去离子水37.5μl。PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃1min，53℃1min，72℃1min30s，共30个循环；最后72℃延伸10min，4℃放置。扩增的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，验证后切下胶条，用DNA胶回收试剂盒(杭州V-gene)纯化PCR产物。回收产物与载体pMD18-T(TAKARA)16℃连接过夜，转化感受态大肠杆菌JM109，在含氨苄青霉素Amp(100ng/L)的LB平板上涂板，挑取单菌落培养并筛选阳性克隆，送公司测序，测序工作由上海英俊生物公司完成。 

(7)16S rDNA序列分析与系统发育分析： 

测序后得到DN1.2的16S rDNA序列1498bp，提交NCBI进行BLAST序列比对(登陆号：EF682071)，发现DN1.2与多株恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的16S rDNA序列相似性水平达到99％，结合菌株的形态学和生理生化鉴定特征，可初步确定DN1.2为Pseudomonas putida，命名为Pseudomonasputida sp.DN1.2。 

(8)恶臭假单胞菌菌株DN1.2的脱氮活性： 

菌株DN1.2同时具有自养脱氮和异养脱氮的能力，并且在两种脱氮过程中都不积累硝酸盐和亚硝酸盐。 

以葡萄糖为碳源，硫酸铵为氮源，DN1.2能去除氨氮。在初始氨氮浓度为80～100mg/L的有机碳源培养基中(初始COD_Cr约1000mg/L)，DN1.2经过10.5小时的培养，氨氮去除率可达50％～60％。并且培养体系中始终没有检测出硝酸氮、亚硝酸氮的积累。 

以葡萄糖为碳源，硫酸铵为氮源。在初始COD_Cr浓度在2000～3000mg/L，初始氨氮浓度为80～100mg/L时，培养24h后氨氮和COD_Cr都同步得到了较好的去除，去除率分别为75％～88％和75％～85％。 

以葡萄糖为碳源，硫酸铵为氮源。初始COD_Cr浓度2000mg/L，初始氨氮浓度约为90～100mg/L时，培养24h后检测氮元素的分布情况。系统中氨氮的去除率可达90％，水 体中总氮去除率可达88％，所残余的总氮几乎全为菌体细胞。 

以碳酸钙为碳源，硫酸铵为氮源。在初始氨氮浓度约为60mg/L的无机碳源脱氮培养基中，经过10个小时的振荡培养，DN1.2对氨氮去除率可达60％以上。并且在整个培养过程中，没有检测出硝酸氮和亚硝酸氮。 

本发明菌株还可以NaNO₂、NaNO₃、及其混合物为底物的进行好氧反硝化作用。以亚硝酸钠、硝酸钠、亚硝酸钠+硝酸钠(摩尔比1：1)为氮源，氮元素浓度均为50mg/L，碳源为0.1％葡萄糖，培养24h后对以上各氮源的氮去除率可达70％～85％。 

本发明中的菌株DN1.2在存在氮素如氨态氮和/或硝酸盐氮和/或亚硝酸氮的水体中，均有脱除氮素的活性，并且在较高的C/N比条件下，脱氮活性更强。这样，本发明菌株可用于多种含氮废水的处理。 

3.本发明中恶臭假单胞菌菌株DN1.2的培养 

(1)所使用的培养基： 

A.牛肉膏培养基(g/L)：牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl5.0，调pH7.2～7.4，121℃灭菌20分钟。 

B.有机碳源脱氮培养基(g/L)：KH₂PO₄0.7，MgSO₄·7H₂O0.5，CaCl₂·2H₂O0.5，(NH₄)₂SO₄0.5，葡萄糖0.5～4.0，NaOH调pH7.2～7.4，121℃灭菌20分钟。 

上述培养基如制成固体培养基，则添加加琼脂1.5％～2.0％。 

(2)本发明中恶臭假单胞菌菌株DN1.2培养条件 

将牛肉膏培养基斜面上保存的Pseudomonasputida sp DN1.2用接种环刮取一环菌分别接种于牛肉膏液体培养基或有机碳源脱氮液体培养基中，30～35℃，170～200rpm振荡培养，在10～16小时内可收获菌液。 

4.本发明中恶臭假单胞菌菌株DN1.2的使用方法 

本发明提供细菌在水体的生物脱氮应用，使用本发明提供的细菌可有效的脱除水体中的氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮。 

(1)使用前用有机碳源脱氮培养基活化菌株：从牛肉膏培养基斜面上刮取一环菌苔，接种入装有30mL～50mL有机碳源脱氮液体培养基的250mL锥形瓶中，30～35℃，170～200rpm振荡培养10～16小时，即可完成菌株活化。 

(2)将活化后的菌液按2％～10％比例接种于待处理含氮废水中，30～35℃，170～200rpm振荡培养或曝气，定时取样检测NH₄ ⁺-N、NO₂ ^--N、NO₃--N、TN、COD_Cr等去除情况。 

(3)检测方法 

NH₄ ⁺-N：采用水杨酸-次氯酸盐分光光度法

NO₂ ^--N：采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法 

NO₃ ^--N：采用DMP分光光度法 

TN：采用碱性过硫酸钾法消解紫外分光光度法 

COD_Cr：采用重铬酸钾消解分光光度法 

以上方法均参照中国环境科学出版社出版的《水和废水检测分析方法》(第四版)。 

NH₄ ⁺-N、NO₂ ^--N、NO₃ ^--N、TN、COD_Cr等的测定采用德国WTW多功能水质分析仪(The Spectroquant Analysis System PhotoLab S12)，型号PhotoLab S12，工作电压12V。消煮使用WTW公司产CR 2200加热器。测试试剂为默克公司生产的配套试剂。 

O.D值：采用北京普析通用公司产紫外-可见分光光度计，型号新世纪T6，波长600nm下测定培养液的OD值。 

(4)一种培养恶臭假单胞菌DN1.2体现更强的脱氮活性的方法，该方法包括：A.有机碳源条件下 

a)碳源为葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸钠，氮源均为硫酸铵，按照C/N(质量比)为2:1～16:1分别配制不同的有机碳源的培养基；pH为6.0～8.5；温度为25～37℃条件下培养细菌。 

b)优选的方法组合包括：碳源为葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸钠，按照C/N(质量比)为4:1～12:1分别配制不同的有机碳源的培养基；pH为7.0～7.5；温度为30～34℃条件下培养细菌。 

c)最佳的方法组合包括：碳源为乙酸钠、葡萄糖，按照C/N(质量比)为8:1～12:1分别配制不同的有机碳源的培养基；pH为7.5；温度为30℃条件下培养细菌。 

B.无机碳源条件下 

a)碳源为碳酸钙，氮源为硫酸铵，配方见菌株分离鉴定中的培养基A，配制自养硝化培养基；pH为6.0～8.5；温度为25～37℃条件下培养细菌。 

b)优选的方法组合包括：碳源为碳酸钙，氮源为硫酸铵，配方见菌株分离鉴定中的培养基A，配制自养硝化培养基；pH为7.0～7.5；温度为30～34℃条件下培养细菌。 

c)最佳的方法组合包括：碳源为碳酸钙，氮源为硫酸铵，配方见菌株分离鉴定中的培养基A，配制自养硝化培养基；pH为7.5；温度为30℃条件下培养细菌。 

5.本发明中恶臭假单胞菌菌株DN1.2用于含氮废水处理的脱氮条件 

(1)恶臭假单胞菌DN1.2用于氨氮废水处理的脱氮条件 

本发明菌株可用于COD_Cr为≤3000mg/L、氨氮含量为≤500mg/L、pH7～10的含氮废水的处理，25-37℃，曝气。 

其最佳脱氮条件为：COD_Cr为2000～3000mg/L、氨氮含量为100～300mg/L、pH7.0～ 7.5，30℃，曝气。 

(2)恶臭假单胞菌DN1.2用于含硝酸盐氮、亚硝酸盐氮及其混合物的废水处理的脱氮条件 

本发明菌株可用于COD_Cr为≤3000mg/L、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮及其混合物氮元素含量为≤150mg/L、pH7～10的含氮废水的处理，25～37℃，曝气。 

其最佳脱氮条件为：COD_Cr为2000～3000mg/L、氮元素含量为50～100mg/L、pH7.0～7.5，30℃，曝气。 

本发明中的铵态氮或氨态氮是指可溶性的铵根离子NH₄ ⁺-NH₃；氮氧化物是指NO和N₂O。 

本发明中的异养硝化作用广义上是指有机和无机氮化合物从还原态经生物氧化为多种氧化态的过程，狭义上是指异养微生物在好氧条件下将还原态-3价的氨氮或有机氮氧化为羟胺、亚硝酸盐和硝酸盐的过程。 

本发明中的反硝化是指微生物将NO₃ ^-还原为NO₂ ^-，继而再还原为N₂O、NO或N₂的过程。 

本发明中的脱氮是指水体中可溶性氮的去除，可溶性氮是指NH₄ ⁺、NO₂ ^-和NO₃ ^-。 

在本发明中的碳/氮比，又称C/N是指碳元素的质量与氮元素的质量之比。 

本发明中，恶臭假单胞菌是从废水生物脱氮反应器中分离筛选得到的，并作了专利程序的保藏，保藏号为CCTCC NO.207075，在本发明中，恶臭假单胞菌DN1.2等同于CCTCCNO.207075。 

本发明具有以下优点： 

(1)本发明菌株既可自养生长，又可异养生长，基质利用范围广，易于培养。 

(2)本发明菌株既能在异养条件下脱氮，也能在自养条件下脱氮。并且在脱氮过程中没有硝酸盐和亚硝酸盐的积累。 

(3)本发明菌株可同时去除有机废水中氨氮和COD_Cr。 

(4)本发明菌株还可以NaNO₂、NaNO₃及其混合物为底物进行好氧反硝化脱氮。 

(5)本发明菌株在异养条件下主要进行异化性脱氮。 

(6)本发明菌株适用于高浓度有机含氮废水、无机含氮废水的处理，而且在脱氮过程中，不会产生亚硝酸盐和硝酸盐的积累，可以在一个处理系统中完成快捷脱氮，不同于传统的硝化-反硝化脱氮途径。使用该菌株处理废水工艺简单，脱氮效果稳定。 

附图说明

附图1恶臭假单胞菌DN1.2在牛肉膏培养平皿上生长的菌落图 

附图2恶臭假单胞菌DN1.2菌体透射电镜显微照片 

附图3恶臭假单胞菌DN1.2菌体生长曲线 

附图4恶臭假单胞菌DN1.2培养前后体系中氮元素分布的变化 

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。 

具体实施方式

实施例1：本发明菌株的培养 

(1)牛肉膏培养基和有机碳源脱氮培养基，121℃，灭菌20分钟。 

(2)将菌株恶臭假单胞菌DN1.2接种至灭菌的牛肉膏斜面上，35℃活化培养10～16h备用。 

(3)将活化后的菌种分别接种于牛肉膏液体培养基或有机碳源脱氮液体培养基中，250mL三角瓶中装量50mL培养基，35℃，170～200rpm振荡培养10～16h。DN1.2在牛肉膏培养基中的生长曲线见附图3。从图中可以看出，DN1.2在牛肉膏培养基中生长很好，延滞期很短，在3～10小时内为对数生长期，10小时后即可达到稳定期。 

(4)4000rpm，10min离心收获菌体或直接将菌悬液转接于待处理的废水样品中。实施例2：本发明菌株在无机碳源条件下脱氮 

自养硝化培养基(g/L)：(NH₄)₂SO₄2，K₂HPO₄1，MgSO₄·7H₂O0.5，FeSO₄·7H₂O0.4，NaCl2。装瓶后按质量百分比为0.5％的比例加入CaCO₃，最后用1％的NaOH溶液调pH到7.2，121℃灭菌20分钟。 

使用自养硝化培养基，接种10％的菌悬液(培养方法见实施例1)，对照用同体积灭菌水代替，30℃，170rpm振荡培养10个小时，定时取样测定氨氮、硝酸氮、亚硝酸氮浓度的变化。实验结果见表2。从表2中可看出，在初始氨氮浓度为56.6mg/L的无机碳源脱氮培养基中，经过10个小时的振荡培养，DN1.2将体系中的氨氮降到了20.8mg/L，氨氮去除率为63.3％。并且在整个培养过程中，没有检测出硝酸氮和亚硝酸氮的积累，说明DN1.2具有在自养条件下去除氨氮的能力。 

表2DN1.2在无机碳源条件下对氨氮的去除 

实施例3：本发明菌株在有机碳源条件下脱氮 

有机碳源脱氮培养基(g/L)：KH₂PO₄0.7，MgSO₄·7H₂O0.5，CaCl₂·2H₂O0.5，(NH₄)₂SO₄0.5，葡萄糖1.0～4.0，NaOH调pH7.2～7.4，121℃灭菌20分钟。 

(1)有机碳源条件下对氨氮的去除 

使用有机碳源脱氮培养基(配制COD_Cr约1000mg/L，氨氮约80mg/L)，接种6.7％的菌悬液(培养方法见实施例1)，对照用同体积灭菌水代替，30℃，170rpm振荡培养12个小时，定时取样测定氨氮、硝酸氮、亚硝酸氮浓度的变化。结果见表3。从表3中可以看出，在培养基中存在有机碳源时，DN1.2也能去除氨氮。在初始氨氮浓度为82.3mg/L的有机碳源培养基中(初始COD_Cr约1000mg/L)，DN1.2经过10.5小时的培养，将体系中的氨氮降到了37.5mg/L，氨氮去除率为54.5％。并且培养体系中始终没有检测出硝酸氮、亚硝酸氮的积累。 

表3DN1.2在有机碳源条件下对氨氮的去除 

(2)在有机碳源条件下对氨氮和COD_Cr的同时去除 

使用有机碳源脱氮培养基，配制初始COD_Cr浓度分别为1000、2000、3000、4000(mg/L)的培养基，分别对应于葡萄糖浓度1‰，2‰，3‰，4‰，氨氮均为80mg/L左右，接种2％菌悬液(培养方法见实施例1)，对照用同体积灭菌水代替，30℃，200rpm振荡培养24小时后测定COD_Cr和氨氮的降解率。实验结果见表4。从表4可看出，DN1.2在初始COD_Cr为1000mg/L时对葡萄糖碳源的利用率最高，可以去除96.1％的COD_Cr，而在初始COD_Cr为3000mg/L左右时有最大的氨氮去除率，可以达到86％以上，在初始COD_Cr浓度在2000-3000mg/L时，氨氮和COD_Cr都同步得到了较好的去除，去除率分别为76.4％～86.1％和78.4％～82.6％。在COD_Cr小于等于3000mg/L时，氨氮去除率随着碳源浓度的增加而增加，氨氮的去除率与碳源的浓度大小呈一定的正相关性，而当初始COD_Cr浓度超过4000mg/L后，菌株对氨氮的去除受到明显的抑制。所有培养液中均未检出硝酸氮和亚硝酸氮的积累。因此，DN1.2能利用外加有机碳源进行异养生长，并同步去除碳源COD_Cr和氨氮。

表4DN1.2在有机碳源条件下对氨氮和COD_Cr的同时去除 

实施例4：本发明菌株以NaNO₂、NaNO₃及其混合物为底物的好氧反硝化脱氮 

培养基(g/L)：KH₂PO₄0.7，MgSO₄·7H₂O0.5，CaCl₂·2H₂O0.5，NaNO₃或NaNO₂按需浓度配制，葡萄糖1.0，NaOH调pH7.2～7.4，121℃灭菌20分钟。 

以亚硝酸钠、硝酸钠、亚硝酸钠+硝酸钠(摩尔比1：1)为氮源分别配制三种不同的反硝化培养基1#、2#、3#(配方见表5)，氮元素浓度均配为50mg/L，其他培养基成分相同(碳源均为0.1％葡萄糖)，接种菌悬液量均为2％(培养方法见实施例1)，30℃，200rpm振荡培养24h后测定氮的去除率。实验结果见表6。从表6中可看出，DN1.2在好氧条件下对亚硝酸氮和硝酸氮都能进行反硝化，反硝化率可达67.3％～82.5％。表明DN1.2具有好氧反硝化能力。 

表5反硝化培养基1#、2#、3#中氮源的组成 

              1#            2#           3# 

NaNO₂         3.6mM         0            1.8mM 

NaNO₃         0             3.6mM        1.8mM 

表6DN1.2的好氧反硝化脱氮作用 

              1#                 2#             3# 

          NO₂ ^-—N   NO₃ ^-—N  NO₂ ^-—N  NO₃ ^-—N  NO₂ ^-—N   NO₃ ^-—N 

0h(mg/L)  42        9.1^*     0        52       24.5      32.25 

24h(mg/L) 6.75      2.2      0.08     16.9     5.5       11.5 

去除率％  83.9      75.8     --       67.5     77.6      64.3 

N去除率％     82.5               67.3           70 

^*1#培养基中出现硝酸氮估计是由于亚硝酸钠药品在空气中部分氧化的原因 

实施例5：本发明菌株在有机碳源条件下对氨氮和总氮去除 

使用上述有机碳源脱氮培养基(配制初始COD_Cr约2000mg/L，氨氮约90mg/L)，接种2％的菌悬液(培养方法见实施例1)，对照用同体积灭菌水代替，30℃，200rpm振荡培养，24h后分别测定培养液和离心后上清液的总氮，计算细胞同化和异化脱氮的比例。实验结果见表7。根据表7的结果绘制体系中氮元素分布比例图，见附图4。从表7和附图4中可以看出，系统中氨氮的去除率为89.8％，去除的氨氮中有38.5％被同化为细胞内氮，有58.75％被完全去除(即表7中的脱氮率)，另有2.75％转化为了水体中的其它氮存 在形式，推测可能是羟胺。在此培养条件下，水体中总氮去除率为87.4％，系统总氮去除率为52.8％。DN1.2在有机碳源脱氮培养基中主要进行异化性脱氮。异化性脱氮过程去除的氨氮从水体中完全去除，避免了硝酸盐、亚硝酸盐等带来的危害，真正实现了水体的完全脱氮。菌体在脱氮过程中同化的氨氮所占比例不高，这意味着在此过程中菌体生物量的增长并不高。菌体对底物的高去除率和生物量的低增长率在废水处理中有很大的优点，一方面既高效去除了污染物，另一方面也减少了二次污染，降低了处理成本。 

表7DN1.2在有机碳源脱氮培养基中对氨氮和总氮的去除 

初始氨氮浓度(mg/L)　　　　　　　　　　　　　89.0 

24h后氨氮浓度(mg/L)                         9.0 

24h后NO_X-N浓度(mg/L)                        42.0 

24h后培养液总氮(mg/L)                       30.8 

24h细胞内氮(mg/L)                           11.2 

24h后离心上清液总氮(mg/L)                    

系统氨氮去除率(％)＝(89.0-9.0)/89.0×100％  89.8 

水体总氮去除率(％)＝(89.0-11.2)/89.0×100％ 87.4 

系统总氮去除率(％)＝(89.0-42.0)/89.0×100％ 52.8 

脱氮率(％)＝(89.0-42.0)/(89.0-9.0)×100％   58.8

Claims (9)

1.一种异养硝化好氧反硝化细菌，其特征在于该细菌是恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)DN1.2，保藏登记号为CCMCC M207075。

2.一种培养权利要求1中所述细菌的方法，其特征在于：该方法中碳源为葡萄糖，氮源为硫酸铵，按照C/N质量比为2∶1～16∶1配制有机碳源的培养基，在pH为6.0～8.5，温度为25～37℃条件下培养细菌。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：按照C/N质量比为4∶1～12∶1配制有机碳源的培养基，在pH为7.0～7.5，温度为30～34℃条件下培养细菌。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：按照C/N质量比为8∶1～12∶1配制有机碳源的培养基，在pH为7.5，温度为30℃条件下培养细菌。

5.一种培养权利要求1所述细菌的方法，其特征在于：该方法中碳源为碳酸钙，氮源为硫酸铵，在pH为6.0～8.5，温度为25～37℃条件下培养细菌。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征是：在pH为7.0～7.5，温度为30～34℃条件下培养细菌。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征是：在pH为7.5，温度为30℃条件下培养细菌。

8.一种在水体中脱氮的细菌培养物，含有效量的一种如权利要求1中所述的细菌。

9.一种权利要求1中所述的细菌在水体生物脱氮中的应用。

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