CN102220264A - 一株兼性厌氧反硝化细菌及其在水体生物脱氮中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株兼性厌氧反硝化细菌，该菌株命名为Pseudomonas stutzeri LZ-14，属于假单胞菌属的施氏假单胞菌，已于2011年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M2011119。该菌株能够有效脱除水体中的氨氮、硝酸氮、亚硝酸氮及其混合物，降低总氮浓度，还可同时去除有机废水中的COD_Cr，适用于较低浓度有机废水、较高浓度亚硝酸盐或硝酸盐废水的处理，具有更加广泛的适应性。脱氮过程中，不产生硝酸盐积累，有一定量亚硝酸盐累积，但随后24h内亚硝酸盐可被完全降解。使用该菌株处理废水工艺简单，脱氮效果稳定。利用该菌生物强化去除水中污染物时，在停留时间为8d时，投加LZ-14菌液强化使实际受污染河水中COD_Cr从33.9mg/L降到了15.9mg/L，去除率为53.1％；TN从4.07mg/L降低到了0.98mg/L，去除率为75.9％。

Description

一株兼性厌氧反硝化细菌及其在水体生物脱氮中的应用

技术领域

本发明涉及一株兼性厌氧反硝化细菌及其在水体生物脱氮中的应用，属于环境微生物领域。

背景技术

近年来，工业废水的大量排放以及农业大量施用化肥，导致硝酸盐、亚硝酸盐等含氮化合物污染地下水和地表水，氮素污染引起的水环境问题日益突出在饮用水中，硝酸盐及其衍生产物因具有致病、致癌作用而影响人类健康，含氮废水进入水体引发的水质恶化及富营养化问题日益严重，因此氮素污染亟待解决。

南四湖作为南水北调东线工程的重要调蓄湖泊和输水通道，目前正遭受点源、面源污染和人为的过度开发，生态功能退化。根据2007山东省环境状况公报，南四湖水质符合地表水V类标准，主要污染物为TN和TP，仍属轻度富营养化水平。国家对南水北调东线工程的水质要求是：2010年输水干线全线持续稳定达到地表水III类水质标准。由此可见，南四湖的治污任务严峻而紧迫。有关政府和专家拟采用南四湖周边大面积湿地。尤其是通过在河流入湖口构建人工湿地系统，进一步处理受污染河水，实现削减入湖污染负荷，改善入湖水质的目的，但人工湿地的去污效果受多种条件影响，波动较大，要彻底改善南四湖整个区域的水质，仍需进行强化处理。

生物反硝化脱氮是利用微生物的作用，在厌氧或缺氧条件下，以硝酸盐替代氧作电子受体将硝酸盐逐步还原为气态产物脱除，是一种经济有效的脱氮方式。研究表明，通过投加优势菌种进行生物强化，可以获得更好的去污效果。Naeem U D A等将一株异养硝化菌投加到生物脱氮系统中，氨氮和COD去除率分别提高了10％和11％；姚晓丽等将高活性反硝化细菌制剂应用于富营养化湖泊的脱氮，TN去除率为34.8％～38.2％，COD_Mn去除率为63.75％～66.89％，有效改善了湖水水质。植物根际作为土壤中微生物代谢活性最高的区域，存在着大量脱氮功能菌群，从土壤中分离出的细菌，65％以上具有反硝化能力。因此，从南四湖人工湿地主要植物芦竹的根际土壤中分离筛选出的高效反硝化细菌，可以为今后利用微生物强化治理南四湖氮素污染的工程应用提供基础资料和菌种来源。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的之一是提供一株兼性厌氧反硝化细菌，该细菌具有高效脱除水中氮素的能力。本发明的另一个目的是提供一种培养条件，使该细菌表现出更强的异样脱氮能力。本发明的另一个目的是提供新的细菌在水体生物脱氮中的应用，单独使用该细菌便可有效去除水体中的氮素。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一株兼性厌氧反硝化细菌，该菌株命名为Pseudomonas stutzeri LZ-14，属于假单胞菌属的施氏假单胞菌，已于2011年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2011119。其菌学特征为：细胞呈短杆状，直径约为2.0μm×0.5μm；菌落土黄色，低凸、圆形、边缘整齐、致密、半透明、光滑、有光泽；最适碳源为乙酸钠，可利用的碳源和氮源范围广泛；适宜在温度20～35℃的缺氧条件下进行脱氮；以乙酸钠为碳源、硝酸钾为氮源时，最佳C/N为5，最适pH值范围在7.0～8.0之间，此区间以外难以生长及保持脱氮能力。

本发明的菌株可以用于脱除水体中的氮，其可以有效的脱除水体中的硝酸盐氮、亚硝酸盐氮和总氮，其脱氮条件包括：本发明菌株可利用的碳源和氮源范围广泛，CODcr＜200mg/L、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮含量为＜40mg/L，pH 7.0～8.0，20～40℃。其最佳脱氮条件为：最适碳源为乙酸钠，最佳氮源为硝酸钾，CODcr为＜150mg/L，硝酸盐氮、亚硝酸盐氮含量为＜30mg/L，该菌株的最佳C/N为5，最适pH值7.5，最适温度35℃。

具体应用时，使用方法为：

(1)使用前用反硝化培养基活化菌株：将保藏培养基斜面上保存的施氏假单胞菌株LZ-14用接种环刮取1环菌苔，接种入装有200mL保藏培养基或反硝化培养基的250mL锥形瓶中，30℃恒温培养箱静置培养12h，即可获得菌株。

(2)将活化后的菌液接种于待处理的含氮废水中，投加量为受处理废水体积的5％，20～35℃，pH值范围在7.0～8.0之间，定时取样检测TN、NO₂ ^--N、NO₃ ^--N、CODcr等去除情况，直至含氮废水达到地表水III类水质标准要求(COD＜20mg/L，TN＜1mg/L)。

(3)检测方法

CODcr：重铬酸钾法；

TN：过硫酸钾氧化-紫外分光光度法；

TP：过硫酸钾消解-钼锑抗分光光度法；

NO₃ ^--N：紫外分光光度法；

NO₂ ^--N：N-(1-萘基)-乙二胺光度法。

以上方法均参照中国环境科学出版社出版的《水和废水检测分析方法》(第四版)。

OD值：采用UV-2450紫外分光光度计(Shimadzu)，在波长600nm下测定培养液的OD值。

本发明的菌株是通过筛选偶然得到的一种具有高效脱氮活性的细菌，可以通过兼性厌氧反硝化脱除水体中的亚硝酸盐氮和硝酸盐氮。经实验研究表明，该菌株最适碳源为乙酸钠，可利用的碳源和氮源范围广泛；适宜在温度20～35℃的缺氧条件下进行脱氮；生长繁殖迅速。以乙酸钠为碳源、硝酸钾为氮源时，该菌株的最佳C/N为5，最适pH值范围在7.0～8.0之间，此区间以外难以生长及保持脱氮能力。该菌株的脱氮过程主要发生在菌体生长的第12～36h，并伴随有一定量亚硝酸盐的累积，之后24h内亚硝酸盐可被完全降解。利用该菌生物强化去除水中污染物时，在停留时间为8d时，投加菌液使实际受污染河水中COD_Cr从33.9mg/L降到了15.9mg/L，去除率为53.1％；TN从4.07mg/L降低到了0.98mg/L，去除率为75.9％。与未投菌的对照组相比COD_Cr和TN去除率分别提高了24.9％和39.5％。

本发明中的反硝化是指微生物将NO₃ ^--N还原成NO₂ ^--N，继而再还原成N₂O、NO或N₂的过程。

本发明中的脱氮是指水体中可溶性氮的去除，可溶性氮是指NH₄ ⁺、NO₃ ^--N和NO₂ ^--N。

本发明中的碳/氮比，又称C/N是指碳元素的质量与氮元素的质量之比。

本发明的菌株具有以下优点：

(1)本发明菌株可利用的碳源和氮源范围广泛，易于培养。

(2)本发明菌株可用于处理高NO₂ ^-或高NO₃ ^-的废水，并且在脱氮过程中没有硝酸盐和亚硝酸盐的积累。

(3)本发明菌株可同时去除有机废水中的CODcr。

(4)本发明菌株可适用于较低浓度有机废水、较高浓度亚硝酸盐或硝酸盐废水的处理，具有更加广泛的适应性，可以适应不同的污染负荷。

附图说明

本发明提供的菌株命名为Pseudomonas stutzeri LZ-14，属于假单胞菌属的施氏假单胞菌，已于2011年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M2011119。

图1：施氏假单胞菌LZ-14菌体透射电镜显微照片(×20000)。

图2：施氏假单胞菌LZ-14菌体生长曲线。

图3：施氏假单胞菌LZ-14菌体培养前后体系中TN的去除率。

图4：施氏假单胞菌LZ-14菌体强化新薛河河水对CODcr去除的影响。

图5：施氏假单胞菌LZ-14菌体强化新薛河河水TN、NO₃ ^--N和NO₂ ^--N去除效果，其中，A：TN；B：NO₃ ^--N；C：NO₂ ^--N。

图6：施氏假单胞菌LZ-14菌体强化人工配水对CODcr的去除。

图7：施氏假单胞菌LZ-14菌体强化人工配水TN、NO₃ ^--N和NO₂ ^--N去除效果，其中，A：TN；B：NO₃ ^--N；C：NO₂ ^--N。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1本发明菌株的分离鉴定：

(1)培养基：

A、菌株分离、纯化、保藏培养基(/L)：CH₃COONa，2g；蛋白胨，15g；酵母膏，3g；葡萄糖，1g；NaCl，6g；KNO₃，1.5g；pH控制在7.0～7.2。

B、菌株筛选、脱氮培养基(DM：Denitrifying Medium)(/L)：CH₃COONa，2g；KH₂PO₄，0.4g；MgSO₄·7H₂O，0.6g；CaCl₂·2H₂O，0.07g；KNO₃，1g；Tris缓冲液12mL；微量元素2mL；pH控制在7.0～7.2。

上述培养基如制成固体培养基，则添加琼脂1.5％。

(2)施氏假单胞菌株LZ-14的分离纯化：

称取10g芦竹根际土壤样品置于250mL三角瓶中，加100mL无菌水及几粒玻璃珠，摇床振荡15min使土样分散均匀。待土样分散后，静置5min，吸取1mL土壤悬液至9mL稀释液(无菌水)，得到10^-2稀释度悬液，依次按10倍稀释法稀释至10^-7，由此制得各稀释度土壤悬液。

分别吸取各稀释度悬液0.1mL至(1)中所述的反硝化细菌分离培养基A用固体培养基平板培养(已放置过夜，无杂菌生长)，用玻璃刮刀将土壤悬液涂布均匀。之后将平板倒置，放入30℃恒温培养箱，培养至长出明显菌落。

挑取分离出来的菌株，在培养基A平板上多次划线纯化，直至显微镜下观察显示无杂菌为止，此时可认为本发明的菌株施氏假单胞菌株LZ-14已纯化完毕。

(3)施氏假单胞菌株LZ-14的菌落形态特征：在培养基A平板上培养3d后，显微镜下观察到菌落土黄色，低凸、圆形、边缘整齐、致密、半透明、光滑、有光泽。

(4)施氏假单胞菌株LZ-14的菌体形态特征：透射电镜观察结果表明菌体呈短杆状，直径约为2.0μm×0.5μm(如图1所示)。

(5)施氏假单胞菌株LZ-14的生理生化特征：

最适培养温度为20～35℃，最适pH值范围在7.0～8.0之间，缺氧条件下脱氮，革兰氏染色阴性。菌株LZ-14具有较为广泛的碳源谱，可利用碳源种类多样，还可以很好的利用铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐，氮源利用具有多样性。主要生理生化特征见表1和表2。

表1LZ-14菌株利用不同碳源对NO₃ ^--N的去除率

碳源类型	乙酸钠	柠檬酸钠	酒石酸钾钠	葡萄糖	蔗糖	蛋白胨	淀粉	乙醇	纤维素	乙酰胺
											去除率％	100	831	96.4	98.7	100	100	100	100	61.9	96.5

表2LZ-14菌株利用不同氮源的生长情况(以OD₆₀₀表示)

氮源类型	硝酸钾	亚硝酸钠	氯化铵	尿素	乙酰胺
						OD600/cm-1	0.124	0129	0141	0.271	0.092

(6)16S rDNA的PCR扩增与测序：

实验仪器：小型离心机(Eppendorf，转速＞12000r/min)；电泳仪(北京六一仪器厂)；PCR热循环扩增仪(Eppendorf)；凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)。

实验方法：从菌株LZ-14的新鲜斜面上直接挑取菌体，加入至含100μL双蒸水的离心管中，旋涡混匀后，沸水浴7min，12000r/min离心5min，上清液用于PCR扩增模板。扩增引物为一对通用引物。

正向引物为27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

反向引物为1492R：5’-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3’。

PCR反应在25μL体系中进行。反应体系的组成为：模板DNA 1μL；dNTP混合物1μL；rTaq DNA聚合酶0.2μL；正向引物1μL；反向引物1μL；双蒸水8.8μL。

PCR扩增条件：94℃变性5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min。循环30次；72℃延伸10min，4℃放置。用1％的琼脂糖凝胶对菌株的16S rDNA扩增产物做电泳检测，验证后切下胶条，用DNA凝胶回收试剂盒(上海生工生物工程有限公司)纯化PCR产物。回收后的PCR扩增产物委托上海生工生物工程有限公司进行测序。

(7)16S rDNA序列分析与系统发育分析：

测序后得到LZ-14菌株的16S rDNA长度为1387bp的序列，提交到Genbank与其他菌株进行比对(登录号为FJ588910)，发现菌株LZ-14与Pseudomonas stutzeri的进化距离最为接近，确定其属于假单胞菌属，初步认定其为施氏假单胞菌，命名为Pseudomonas stutzeriLZ-14。

实施例2本发明菌株的培养

(1)所使用的培养基

A、菌株保藏培养基(/L)：CH₃COONa，2g；蛋白胨，15g；酵母膏，3g；葡萄糖，1g；NaCl，6g；琼脂，12g；KNO₃，1.5g；pH控制在7.0～7.2。

B、菌株反硝化培养基(DM：Denitrifying Medium)(/L)：CH₃COONa，2g；KH₂PO₄，0.4g；MgSO₄·7H₂O，0.6g；CaCl₂·2H₂O，0.07g；KNO₃，1g；Tris缓冲液12mL；微量元素2mL；pH控制在7.0～7.2。

上述培养基如制成固体培养基，则添加琼脂1.5％。使用前，121℃，灭菌20分钟。

(2)培养条件

将保藏培养基斜面上保存的施氏假单胞菌株LZ-14用接种环刮取1环菌苔，接种入装有200mL保藏培养基或反硝化培养基的250mL锥形瓶中，30℃恒温培养箱静置培养12h，即可获得菌株。施氏假单胞菌LZ-14在反硝化培养基中的生长曲线见图2。LZ-14在培养基中生长很好，延滞期很短，在接种12h后进入对数生长期。24h后即可达到稳定期。

实施例3本发明菌株在有机碳源条件下脱氮

菌株反硝化培养基(DM：Denitrifying Medium)(/L)：CH₃COONa，2g；KH₂PO₄，0.4g；MgSO₄·7H₂O，0.6g；CaCl₂·2H₂O，0.07g；KNO₃，1g；Tris缓冲液12mL；微量元素2mL；pH控制在7.0～7.2。

使用反硝化培养基接种(培养方法见实施例1)，对照组用同体积灭菌水代替。加橡胶塞密封后放入30℃恒温培养箱静置培养，每隔12h取样测定取样监测TN变化情况，以确定菌株的脱氮能力。实验结果见图3。从图3中可以看出，菌株LZ-14在第12-24h的短时间内可将TN去除率增至80％以上，脱氮最为迅速，可达10.2mg/L·h，具有很好的反硝化能力。

结论：菌株LZ-14具有反硝化能力，脱氮过程主要发生在菌体生长的第12～36h，并伴随有一定量亚硝酸盐的累积，之后24h内亚硝酸盐可被完全降解。以乙酸钠为碳源，硝酸钾为氮源，在初始硝酸氮浓度为146.32mg/L的反硝化培养基中，菌株LZ-14经30℃恒温静置培养，24h基本完成脱氮，整个过程的总氮的去除速率约为6.10mg/L·h，在第12～24h时脱氮最为迅速，可达10.2mg/L·h。

实施例4本发明菌株强化人工湿地去污效果

模拟人工湿地采用盆栽的方式，以直径0.5m，深0.8m的塑料桶作为盆栽基础。桶底部填充15cm厚的土壤，为了尽可能的模拟实际现场状况，填充的土壤全部采用新薛河现有人工湿地表层熟土。将芦苇栽种桶中，每桶6-8棵，控制淹水深度在5～10cm之间，待芦苇根部长出新芽时开始试验。以不投加细菌的盆栽为空白对照组。

施氏假单胞菌株LZ-14培养方法见实施例1，扩大培养后对新薛河河水(低污染负荷)及人工配水(CH3COONa、KH₂PO₄及KNO₃，高污染负荷)进行生物强化，菌液投加量为受处理废水体积的5％，投加菌液中细菌数量经计数，含量约为3.6×10¹⁰个/mL。静置状态下进行污染物去除考察。

强化新薛河河水时，在停留时间为8d时，投加菌液强化使实际受污染河水中COD_Cr从33.9mg/L降到了15.9mg/L，去除率为53.1％，见图4；TN从4.07mg/L降低到了0.98mg/L，去除率为75.9％，见图5。与空白对照组相比COD_Cr和TN去除率分别提高了24.9％和39.5％，脱氮效果尤为明显，NO₃ ^--N从3.9mg/L降低到0.8mg/L，去除率达到80％。NO₂ ^--N含量未出现明显积累。处理后水质COD_Cr和TN指标能够满足地表水III类水质标准要求(COD＜20mg/L，TN＜1mg/L)。

如图6所示，强化人工配水时，在停留时间的前2d，COD_Cr降解较为迅速，空白对照组COD_Cr含量由初始条件下的142.98mg/L降至62.34mg/L，去除率达56.4％；投菌组COD_Cr含量由162.46mg/L降至70.13mg/L，去除率为56.8％。至第8d时，空白对照组COD_Cr降至33.12mg/L，去除率为76.8％；投菌组COD_Cr含量降至22.99mg/L，去除率为85.8％。从图7中可以看出，第8d时，空白对照组TN去除率为40.9％，而投菌组去除率为63.2％。菌株LZ-14强化作用显著。

Claims (4)

1.一株兼性厌氧反硝化细菌，其特征在于：该菌株命名为Pseudomonas stutzeri LZ-14，属于假单胞菌属的施氏假单胞菌，已于2011年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2011119。

2.根据权利要求1所述的兼性厌氧反硝化细菌，其特征在于：其菌学特征为：细胞呈短杆状，直径约为2.0μm×0.5μm；菌落土黄色，低凸、圆形、边缘整齐、致密、半透明、光滑、有光泽；最适碳源为乙酸钠，可利用的碳源和氮源范围广泛；适宜在温度20～35℃的缺氧条件下进行脱氮；以乙酸钠为碳源、硝酸钾为氮源时，最佳C/N为5，最适pH值范围在7.0～8.0之间，此区间以外难以生长及保持脱氮能力。

3.权利要求1所述的兼性厌氧反硝化细菌在水体生物脱氮中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：具体应用时，将培养得到的含有兼性厌氧反硝化细菌的菌液按5％的比例接种于待处理含氮废水中。

Images