CN107034168B - 一株异养硝化-好氧反硝化细菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株异养硝化‑好氧反硝化细菌及其应用，属于微生物领域，所述细菌为麦氏交替单胞菌SLNX2，于2015年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC NO.11757。本发明还提供一种利用所述细菌对养殖废水进行净化的方法，所述方法具体为：3株异养硝化‑好氧反硝化细菌在鱼类养殖水体中添加的终浓度控制在1.3×106CFU·mL‑1；所述方法三株复合施加净化效果优于单株效果，使养殖过程中水体氨氮、亚硝酸氮、硝酸氮、总氮和化学需氧量均低于不加菌的对照组，最大可分别低68.55％、48.36％、58.38％、40.02％、27.47％。

Description

一株异养硝化-好氧反硝化细菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体地涉及一株异养硝化-好氧反硝化细菌及 其应用。
背景技术
近年来，水产养殖行业的发展实现了由粗放式到集约化的转变，高密 度养殖模式带来高产量、高收益的同时却存在水体残饵、粪便等有机物积 累较快的问题。养殖水体氮浓度的快速上升，导致水体自净能力严重下降。 由于氨氮和亚硝酸氮等有害物质对水生动物的毒性较大，严重影响了水产 经济动物的健康和生长，给水产养殖业带来巨大的损失。同时，未经处理 的高氮、高有机物养殖废水，排入沿海水域，也会加剧近海的富营养化， 反过来影响接下来的养殖用水水质，因此降低养殖系统中氮浓度是提高养 殖水质的关键。
生物脱氮技术被认为是去除养殖污水氮元素最为有效且经济的方式， 且无二次污染。Kozasa(Toyocerin(Bacillus toyoi)as growth promotor for animalfeeding.Microbiol.Aliment.Nutr,1986,4(1):121-135)首次将微生 物制剂应用于水产养殖行业，此后越来越多的硝化细菌被各学者从不同环 境中分离筛选出来并进行后续脱氮特性研究，但传统自养硝化细菌去除水 体氨氮和亚硝酸氮之后，存在硝酸氮积累的问题，同时硝化细菌生长缓慢， 培养困难，且价格高。
水产养殖特殊的模式决定了脱氮过程中的硝化作用和反硝化作用只能 存在于好氧情况下。但传统理论认为，自养硝化作用与厌氧反硝化作用是 两个独立的部分，因此，硝化作用与反硝化作用不能存在于同一条件下进 行(潘玉瑾等，好氧反硝化菌P.chengduensis ZPQ2的筛选及其反硝化条 件优化.环境工程,2016,34(1):41-46。直到1984年，Robertson等(Aerobic denitrification:A controversy revived.ArchMicrobiol，1984，139(4):351-354) 在除硫和反硝化处理系统中首次分离出好氧反硝化菌泛养副球菌 (Para-coccus pantotropha)，异养硝化-好氧反硝化细菌的出现表明在好氧情况下可实现同时硝化反硝化。目前，筛选到的异养硝化-好氧反硝化细菌 种类越来越多，已报道的脱氮细菌有假单胞菌属(Pseudomonas)、盐单胞 菌属(Halomonasalkaliphila)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属 (Acinetobacter)(辛玉峰等，2011)和产碱菌属(Alcaligenes)等，目前大 多数学者的研究集中在异养硝化-好氧反硝化细菌的分离筛选以及脱氮特 性方面，将异养硝化-好氧反硝化细菌应用于实际海水养殖环节的报道尚少。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一株异养硝化-好氧反硝化细菌，所 述细菌与另外两株异养硝化-好氧反硝联合应用在水产养殖中，对养殖废水 具有很好的净化效果。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一株异养硝化-好氧反硝化细菌，所述细菌为麦氏交替单胞菌SLNX2， 分类命名：Alteromonas Macleodii，所述菌株于2015年11月27日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC NO.11757。
本发明还提供一种利用所述细菌对养殖用水进行净化的方法，所述方 法具体为：3株异养硝化-好氧反硝化细菌在养殖用水中总的终浓度控制在 1.3×106CFU·mL-1；所述的3株异养硝化-好氧反硝化细菌分别为嗜碱盐单 胞菌X3、花津滩芽孢杆菌SLWX2和麦氏交替单胞菌SLNX2，3株异养硝 化-好氧反硝化细菌在养殖用水中的终浓度相等；
本发明还提供一种利用所述细菌对养殖用水进行生物膜净化的方法， 生物膜的挂膜方法为添加初始浓度为105CFU·mL-1的3株异养硝化-好氧反 硝化细菌混合菌液于添加氮源和碳源的无菌海水中，3株异养硝化-好氧反 硝化细菌在混合菌液中的终浓度相等，以爆炸棉为载体，连续曝气，每5-7 天补加一次菌液、氮源和碳源，28天挂膜成功。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明3株SLWX2+X3+SLNX2异养硝化-好氧反硝化细菌对养殖用水 净化效果佳，使水中氨氮浓度、亚硝酸氮浓度、硝酸氮浓度、总氮浓度、 化学需氧量浓度分别低于对照组68.55％、48.36％、58.38％、40.02％、27.47％。 且优于三株菌的任何一株菌的单株效果。
附图说明
图1各组氨氮浓度的变化；
图2各组亚硝酸氮浓度的变化；
图3各组硝酸氮浓度的变化；
图4各组化学需氧量浓度的变化；
图5各组总氮浓度的变化。
菌种保藏信息：菌株编号为SLNX2，其分类命名为Alteromonas Macleodii；该菌株于2015年11月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 3号保藏编号为：CGMCC No.11757。
具体实施方式
下面通过实施例来对本发明的技术方案作进一步解释，但本发明的保 护范围不受实施例任何形式上限制。
实施例1
本专利所述菌株麦氏交替单胞菌(Alteromonasmacleodii)SLNX2筛选 自青岛市红岛刺参养殖池塘的沉积环境，泥样带回实验室经充分搅拌后， 无菌条件下取10g泥样，接入装有90mL无菌生理盐水中，振荡10min。 分别吸取10mL上清液接种于液体异养硝化培养基中，28℃、150rpm振荡 培养2～3天。重复接种培养3次后，取10mL富集液适当稀释后，取100μL 均匀涂布于异养硝化菌培养基平板，置入恒温培养箱，28℃培养2～3天。 挑选不同形态的单菌落进行平板划线分离，重复2～3次，直至得到纯的单 菌落。再接种于异养硝化菌分离培养基斜面，培养后4℃和-80℃冰箱保存。 在添加葡萄糖的条件下，将候选菌接种于添加氮源(亚硝酸钾、硝酸钾 或硫酸铵各含氮1.65mg·L-1)的600mL筛选培养基中，接种量控制在 1.8～1.9×106CFU·mL-1范围内，置于28℃、150rpm振荡培养。每隔24h 取一次样，测定NH4 +-N、NO2 －-N和NO3 －-N值。选取对三种无机氮去除效果 最佳的菌株。本专利所述菌株24h对氨氮、亚硝酸氮的去除率分别达到 100％、36.1％，72h对硝酸氮的去除率达到82.2％。
菌株在硝化细菌培养基平板上培养后观察其菌落形态呈圆形、边缘不 整齐，直径约为0.5mm，表面平坦；显微镜下细胞呈杆状，不形成芽孢， 革兰氏染色呈阴性。生理生化实验结果如表1所示，氧化酶、接触酶、硝 酸盐还原酶、淀粉水解、柠檬酸生长呈阳性；β-半乳糖苷酶、氧化酶、VP 实验、酪素水解、明胶水解、精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱酸酶、脲酶、吲哚产生、产H2S实验呈阴性；可利用碳源有D-葡糖-6-磷酸、 D-果糖-6-磷酸、多种二糖和多糖、D-山梨醇、甘露醇、阿糖醇、甘油等， 不能利用明胶、果胶、乙酸等。8％NaCl中仍能生长，在pH 5条件下不能 生长。
1、细胞形态和理化试验结果：
Figure BDA0001315104690000041
Figure BDA0001315104690000051
2、16S rRNA基因序列测定结果：
TACACATGCAGTCGAACGGTAACATTGTACTAGCTTGCTAGTAAGATGACGAGTGGCGGA CGGGTGAGTAATGCTTGGGAACTTGCCTTTGCGAGGGGGATAACAGTTGGAAACGACTGCTAAT ACCGCATAATGTCTTCGGACCAAACGGGGCTTCGGCTCCGGCGCAAAGAGAGGCCCAAGTGAGA TTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGACGATCTCTAGCTGTTCTGAGAGGAAGAT CAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCA CAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCA CTTTCAGTTGTGAGGAAAAGTTAGTAGTTAATACCTGCTAGCCGTGACGTTAACAACAGAAGAA GCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTA CTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGCTAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGG GATGGTCATTTAGAACTGGCAGACTAGAGTCTTGGAGAGGGGAGTGGAATTCCAGGTGTAGCGG TGAAATGCGTAGATATCTGGAGGAACATCAGTGGCGAAGGCGACTCCCTGGCCAAAGACTGACG CTCATGTGCGAAAGTGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACACCGTAAACGC TGTCTACTAGCTGTGTGTGTCTTTAAGACGTGCGTAGCGAAGCTAACGCGCTAAGTAGACCGCC TGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACACTTGACATGCTGAGAAGTTTCT AGAGATAGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCAGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGT CGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCATTAAGT TGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCA TGGCCCTTACGTGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATTTACAGAGGGAAGCGAGACAGTG ATGTGGAGCGGACCCCTTAAAGAATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGA AGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGAATACTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACA CACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGATGCAAAAGAAGTAGTTAGTCTAACCTTCGGGAGGAC GATTACCACTTTGTGTTTCATGACTGGTGTGAAGTC。
实施例2
菌株：三株异养硝化-好氧反硝化细菌均由本实验室筛选、保存，具有 异养硝化-好氧反硝化功能。嗜碱盐单胞菌(Halomonasalkaliphila)X3筛 选自象山港网箱鱼类养殖区富营养沉积环境，在氨氮含量为42mg·L-1的测 试液中，24h时，对氨氮、亚硝酸氮、硝酸氮的去除率分别为98.29％、99.07％、 96.48％。花津滩芽孢杆菌(Bacillus hwajinpoensis)SLWX2筛选自青岛市 红岛刺参养殖池塘的水体环境，24h对氨氮、亚硝酸氮和硝酸氮的去除率 分别达到100％、99.5％和85.6％，在1％-8％NaCl条件下均能生长
麦氏交替单胞菌(Alteromonasmacleodii)SLNX2筛选自青岛市红岛刺 参养殖池塘的沉积环境，24h对氨氮、亚硝酸氮的去除率分别达到100％、 36.1％，72h对硝酸氮的去除率达到82.2％。下文以W代表SLWX2，X代 表X3，N代表SLNX2。
圆斑星鲽：由青岛卓越海洋集团有限公司提供，规格为(98±6)g。
试验所用饲料：碟类慢沉颗粒配合饲料，由常熟泉兴营养添加剂有限 公司生产提供。
试验在青岛卓越海洋集团有限公司养殖车间进行，选取规格一致的圆 斑星鲽，在养殖池中暂养10天后，从中挑选健康、有活力的240尾进行实 验，每个规格为50L的塑料整理箱中加入30L消毒海水和10尾已消毒圆 斑星鲽；设置八个处理组，其中以不添加脱氮细菌的为对照组，细菌投放 组合类型如表1所示，每个处理组三个平行。实验期间，第5、11、17天 各投菌一次，菌液终浓度控制在1.3×106CFU·mL-1。实验共进行21天。
试验期间，各池保持不换水，定时补充新鲜淡水，维持水体体积不变。 使用充气泵充氧，使溶氧维持在7-9mg·L-1。每日上午9点投喂饲料。
每两天上午9点投饵前，使用YSI-556多功能水质分析仪测定水质pH、 溶解氧、温度、盐度。将箱内水尽量混合均匀后，在中央距离水面10cm 处采集水样。使用离心机将水样以转速6000r/min，离心5min，取上清液。 参照《海洋监测规范》(GB 17378.4-2007)，氨氮(NH4 +-N)的测定采用 次溴酸盐氧化法；亚硝酸氮(NO2 －-N)的测定采用盐酸萘乙二胺分光光度 法；硝酸氮(NO3 －-N)的测定采用锌-镉还原法，化学需氧量(COD)的 测定采用碱性高锰酸钾法，总氮的测定使用总有机碳(total organic carbon TOC)分析仪(TOC-VCPH,TNM-1)。
利用Excel软件进行数据处理，试验数据用平均数±标准差表示；采 用SPSS19统计软件，对数据作统计分析，显著水平P采用0.05，极显著 水平P采用0.01。
表1实验设计
Figure BDA0001315104690000071
Figure BDA0001315104690000081
结果分析
1、各组pH、溶氧、温度、盐度的变化
试验期间，pH、溶氧(DO)、温度(T)、盐度(Sal)四个指标各组 之间无显著差异(p﹥0.05)。pH值为7.69±0.23、DO为8.325mg·L-1±0.385 mg·L-1、T为21.95℃±0.55℃、Sal为29.7±0.6。各组各项指标值均处于 正常范围内，满足圆斑星鲽养殖条件。具体指标测定数值如表格2所示。
表2指标测定值
Figure BDA0001315104690000082
2、不同组合对氨氮去除效果
随着养殖时间的推移，各组氨氮浓度呈逐渐升高的趋势。如图1所示， 第5天第一次加菌之后，各加菌组氨氮浓度上升幅度均低于对照组，并于 第7-9天，各试验组氨氮浓度与对照组出现极显著性差异(p﹤0.01)，说 明第5天投加不同组合菌液之后，氨氮去除效果显著。从第11天开始，试 验组中单菌组对氨氮的去除效果开始下降，但复合组的去除能力持续有效， 其中W+X+N组合优势最为明显，与其他各试验组存在极显著性差异(p ﹤0.01)，尤其在第17天第3次加菌后，氨氮浓度明显下降。到第21天时， W+X+N组、W+X组、W+N组、X+N组、X组、W组及N组氨氮浓度相 比对照组分别低68.55％(p﹤0.01)、54.38％(p﹤0.01)、52.61％(p﹤0.01)、 44.93％(p﹤0.01)、40.74％(p﹤0.01)、33.48％(p﹤0.01)、26.16％(p﹤0.01)，说明异养硝化-好氧反硝化细菌对氨氮有很好的去除效果，其中 W+X+N组去除效果最明显，能将氨氮浓度维持在较低的水平。
3、不同组合对亚硝酸氮的去除效果
试验期间，各加菌组与对照组亚硝酸氮浓度第9天前均处于较低浓度， 第11天后开始逐渐积累增加。但如图2所示，第5天第1次加菌后，加菌 组的亚硝酸氮浓度始终低于对照组，第7-15天，除单菌组(W组、X组、 N组)之外，复合菌组均与对照组存在显著性差异(p﹤0.05)。从第17天 第三次加菌后开始，各加菌组均与对照组产生显著性差异(p﹤0.05)，可能是三株细菌已经逐步适应养殖水环境。到第19天时，W+X+N组、W+X 组、W+N组、X+N组、X组、W组及N组亚硝酸氮浓度与对照组差异达 到最大值，分别低48.36％(p﹤0.01)、41.25％(p﹤0.01)、35.56％(p﹤0.01)、 25.42％(p﹤0.01)、26.38％(p﹤0.01)、29％(p﹤0.01)、17.99％(p﹤0.01)， 试验结果说明复合细菌在去除氨氮的同时，对亚硝酸氮也有良好的去除效 果。
4、不同组合对硝酸氮的去除效果
整个养殖期间，各组硝酸氮浓度的变化呈现大致先升高后下降再升高 的规律。如图3所示，第5天第1次加菌后，第7天开始，除N组之外， 各加菌组硝酸氮浓度均低于对照组，说明投加的菌液可以起到反硝化的作 用。其中，W+X+N组反硝化作用最好，第1-13天将水体硝酸氮浓度维持 在较低水平，并于第13天达到最低浓度0.51mg·L-1。到第21天时，对照 组的硝酸盐氮已达到7.05mg·L-1,各加菌组均与对照组存在显著性差异(p ﹤0.05)(除N组)，但各加菌组间差异不显著(p﹥0.05)。第21天时， W+X+N组、W+X组、W+N组、X+N组、X组、W组及N组的硝酸氮浓 度分别比对照组低58.38％、31.66％、53.04％、53.20％、50.97％、42.61％、14.26％。说明复合细菌对硝酸氮也有良好的去除效果。
5、不同组合对有机物的去除效果
如图4所示，第1-5天，对照组与各加菌组之间重合度高，不存在显 著性差异(p﹥0.05)。第5天第一次加菌之后，第7天开始，除N组以外， 各加菌组COD浓度始终低于对照组，且均与对照组存在显著性差异(p﹤ 0.05)，说明投加异养硝化-好氧反硝化细菌对COD有一定的降解作用。试 验期间，W+X+N组对COD的去除效果最佳，与对照组存在极显著差异(p ﹤0.01)，W+X组次之。第13天时，W+X+N组、W+X组、W+N组、X+N 组、X组、W组及N组的COD浓度与对照组达到最大差异值，分别低 了27.47％、23.08％、14.29％、17.58％、10.99％、8.79％、3.30％。说明复 合细菌在去除无机氮的同时，对有机物也有一定去除效果。
6、不同组合对总氮的去除效果
随着试验的进行，各组总氮浓度缓慢上升，如图5所示，除N组以外， 其余各加菌组总氮浓度均低于对照组。整个实验期间，W+X+N组及W+X 组的总氮浓度均与对照组存在极显著差异(p﹤0.01)。第15天，与对照组 相比，W+X+N组、W+X组、W+N组、X+N组、X组、W组及N组的总 氮浓度分别低了40.02％、29.61％、18.58％、12.34％、29.45％、11.3％、2.65％。 试验结果表明，三株细菌可在养殖环境中去除一定的总氮。
7、不同试验组中圆斑星鲽的存活情况
试验伊始，各养殖箱中放入圆斑星鲽10尾，第21天，对照组出现大 量死鱼现象。如表3所示，圆斑星鲽存活数量分别为4尾、5尾、4尾，存 活率为0.4、0.5、0.4。随即停止试验。各加菌组除W组、N组、X+N组出 现少量现死鱼外，其余组均无死鱼现象。表明添加的三株异养硝化-好氧反 硝化细菌对圆斑星鲽无毒害及致病作用，并通过改善水体环境保证了圆斑星鲽的存活率。
表3不同试验组中圆斑星鲽的存活情况
Figure BDA0001315104690000111
实施例3
利用三株异养硝化-好氧反硝化细菌进行生物膜法处理养殖用水，生物 挂膜方法为添加初始浓度为105CFU·mL-1的三株混合菌液于添加氮源和氮 源的无菌海水中，3株异养硝化-好氧反硝化细菌在混合菌液中的终浓度相 等，以爆炸棉为载体，连续曝气，每5-7天补加一次菌液、氮源和碳源， 28天挂膜成功。此生物滤器可处理静止的和连续流动的高盐高氮废水，使 水体的无机氮和有机物浓度一直保持在较低的状态，效果优于自然挂膜的生物滤器。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所
<120> 一株异养硝化-好氧反硝化细菌及其应用
<130> 无
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1440
<212> DNA
<213> Altromonas Macleodii
<400> 1
tacacatgca gtcgaacggt aacattgtac tagcttgcta gtaagatgac gagtggcgga 60
cgggtgagta atgcttggga acttgccttt gcgaggggga taacagttgg aaacgactgc 120
taataccgca taatgtcttc ggaccaaacg gggcttcggc tccggcgcaa agagaggccc 180
aagtgagatt agctagttgg taaggtaacg gcttaccaag gcgacgatct ctagctgttc 240
tgagaggaag atcagccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc 300
agtggggaat attgcacaat gggggaaacc ctgatgcagc catgccgcgt gtgtgaagaa 360
ggccttcggg ttgtaaagca ctttcagttg tgaggaaaag ttagtagtta atacctgcta 420
gccgtgacgt taacaacaga agaagcaccg gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata 480
cggagggtgc gagcgttaat cggaattact gggcgtaaag cgcacgcagg cggtttgtta 540
agctagatgt gaaagccccg ggctcaacct gggatggtca tttagaactg gcagactaga 600
gtcttggaga ggggagtgga attccaggtg tagcggtgaa atgcgtagat atctggagga 660
acatcagtgg cgaaggcgac tccctggcca aagactgacg ctcatgtgcg aaagtgtggg 720
tagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacaccgtaa acgctgtcta ctagctgtgt 780
gtgtctttaa gacgtgcgta gcgaagctaa cgcgctaagt agaccgcctg gggagtacgg 840
ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt 900
ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc tacacttgac atgctgagaa gtttctagag 960
atagtttggt gccttcggga actcagacac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt 1020
cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgtccttagt tgccagcatt 1080
aagttgggca ctctaaggag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gacgacgtca 1140
agtcatcatg gcccttacgt gtagggctac acacgtgcta caatggcatt tacagaggga 1200
agcgagacag tgatgtggag cggacccctt aaagaatgtc gtagtccgga ttggagtctg 1260
caactcgact ccatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcag gtcagaatac tgcggtgaat 1320
acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtgggatg caaaagaagt 1380
agttagtcta accttcggga ggacgattac cactttgtgt ttcatgactg gtgtgaagtc 1440

Claims (1)

1.一株异养硝化-好氧反硝化细菌，其特征在于所述细菌为麦氏交替单胞菌SLNX2，分类命名：Alteromonas Macleodii，所述菌株于2015年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC NO.11757。
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