CN104745518A - 利用海洋交替单胞菌制备生物絮凝剂的方法 - Google Patents

利用海洋交替单胞菌制备生物絮凝剂的方法 Download PDF

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Abstract

利用海洋交替单胞菌制备生物絮凝剂的方法，涉及一种生物絮凝剂。所述交替单胞菌(Alteromonas sp.)H-6，保藏编号CGMCC No.10612。将甘油管中保藏的菌种接入种子培养基中培养，然后接入斜面培养基中继续培养；将新鲜斜面上的菌落接于种子培养基中培养，取种子液接入发酵培养基培养，得生物絮凝剂；将生物絮凝剂发酵液第一次离心，除去沉淀，收集上清液，在上清液中加入无水乙醇，于4℃冰箱静置过夜后进行第二次离心，除去上清液，将沉淀物溶于水中，用透析袋透析，向透析后的溶液中加入无水乙醇，静置后进行第三次离心，收集最终沉淀物，干燥后即得到生物絮凝剂纯品。无毒无害、无二次污染。

Description

利用海洋交替单胞菌制备生物絮凝剂的方法
技术领域
本发明涉及一种生物絮凝剂，尤其是涉及一种利用海洋交替单胞菌制备生物絮凝剂的方法。
背景技术
生物絮凝剂是一类由微生物产生的具有絮凝活性的天然生物高分子聚合物，其主要成分包括多糖、蛋白、多肽、核酸以及脂类等(Yim J H,Kim S J,Ahn S H,et al.Characterizationof a novel bioflocculant,p-KG03,from a marine dinoflagellate,Gyrodinium impudicum KG03[J].Bioresource Technology,2007,98(2):361-367.)。与传统化学絮凝剂相比，生物絮凝剂具有无毒、无二次污染、生物可降解等优点，因此可以被广泛应用于污水处理、发酵工艺、食品加工等领域(Salehizadeh H,Vossoughi M,Alemzadeh I.Some investigations on bioflocculantproducing bacteria[J].Biochemical engineering journal,2000,5(1):39-44.)。自然界中，能够合成生物絮凝剂的微生物涵盖了藻类、细菌、放线菌和真菌(Zhao G,Ma F,Wei L,et al.Usingrice straw fermentation liquor to produce bioflocculants during an anaerobic dry fermentationprocess[J].Bioresource technology,2012,113:83-88.)。然而，目前阻碍生物絮凝剂发展的主要原因包括：产量低、絮凝活性不及化学絮凝剂、生产成本高(He N,Li Y,Chen J.Production of a novel polygalacturonic acid bioflocculant REA-11 by Corynebacteriumglutamicum.[J].Bioresource Technology,2004,94(1):99-105.)。因此，继续筛选高产生物絮凝剂的菌株、优化发酵工艺提升絮凝活性、降低生产成本是解决当前生物絮凝剂应用局限性的重要思路。
海洋占地球表面积的71％，在辽阔的海洋中蕴藏着丰富的微生物资源。海洋微生物生活在海洋高盐、高压、低温、低营养或无光照等特殊环境之中，这就使海洋微生物能产生陆栖微生物所不能产生的结构新颖、作用独特的生物活性物质(王磊，宿红艳，杨润亚等.海洋交替单胞菌YTW-10抗植物病原真菌活性物质的发酵条件研究[J].鲁东大学学报，2011，35(7)：14-19)。Alteromonas属在海洋中分布广泛，最近的一项研究以Alteromonas属的菌株为实验菌株，发现单一菌株也可以对表层海水的碳循环做出与整个自然菌群相当的贡献，说明Alteromonas属的菌株在自然环境中扮演着重要的角色(Pedler B E,Aluwihare L I,Azam F.Single bacterial strain capable of significant contribution to carbon cycling in the surface ocean[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2014,111(20):7202-7207.)。作为多种环境中的优势菌株，Alteromonas属已经应用于不少领域。王磊等人的研究表明海洋交替单胞菌YTW-10能够对小麦赤霉病菌、西瓜枯萎病菌和玉米弯胞病菌有明显的抑制效果(王磊，宿红艳，杨润亚等.海洋交替单胞菌YTW-10抗植物病原真菌活性物质的发酵条件研究[J].鲁东大学学报，2011，35(7)：14-19)；鲜海军分离出的腐败交替单胞菌(Alteromonasputrefaciens)能够对对21种在印染工业中常用的分属偶氮染料类、三苯甲烷染料类和蒽醌类染料均具有较强的脱色能力(鲜海军.对两株具有多种染料脱色能力的腐败交替单胞菌(Alteromonas putrefaciens)的研究[J].应用与环境生物学报，2002，8(3)：294-297)；侯士昌等人筛选出的交替单胞菌属可以高效降解褐藻酸(侯士昌，温少红，唐志红等.一株高效褐藻酸降解菌的筛选、鉴定及其发酵条件的优化[J].研究报告，2014,38(7)：20-26)。目前，已有文献报道Alteromonas属的菌株可产多糖。Zilian Zhang等人研究了D-氨基酸对Alteromonas macleodii Strain JL2069所产胞外多糖的影响(Zhang Z,Li Z,Jiao N.Effects of d-Amino Acids on the EPS Production and Cell Aggregation of Alteromonas macleodii StrainJL2069[J].Current Microbiology,2014,68(6):751-755.)；Ananya Mehta等人研究了Alteromonas macleodii合成的多糖在纳米银生物质矿化方面的应用(Mehta A,Sidhu C,Pinnaka A K,et al.Extracellular polysaccharide production by a novel osmotolerant marine strainof Alteromonas macleodii and its application towards biomineralization of silver[J].PloS one,2014,9(6):e98798.)；而LeT等人重点研究了Alteromonas macleodii所产多糖的结构数据(LeT,Cérantola S,Ropartz D,et al.Structural data on a bacterial exopolysaccharideproduced by a deep-sea Alteromonas macleodii strain.[J].Carbohydrate Polymers,2012,90(1):49–59.)。然而，目前尚未有Alteromonas属的菌株与生物絮凝剂的合成相关的研究。
目前，生物絮凝剂的研发和应用方兴未艾，其极有可能在未来取代或部分取代传统的无机高分子和合成有机高分子絮凝剂，以高效、绿色、环保的特性和优势在水处理等领域独当一面。
发明内容
本发明的目的在于针对目前生物絮凝剂生产所存在的原料成本高、絮凝剂产量低、絮凝效果差等问题，提供交替单胞菌(Alteromonas sp.)H-6。
本发明的另一目的在于提供利用海洋交替单胞菌制备生物絮凝剂的方法。
所述交替单胞菌(Alteromonas sp.)H-6，已于2015年03月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.10612。
该菌的样品来源于南海SEATS站表层海水(北纬18°，东经116°)。
以下给出交替单胞菌(Alteromonas sp.)H-6的筛选及鉴定方法：
初筛方法：取南海表层海水样品加入液体筛选培养基于30℃、150rpm条件下富集培养24h，所得菌液经稀释涂布于固体筛选培养基中，于30℃下培养48h；挑取固体筛选培养基中生长快、透明圈大且有粘性的菌落接入发酵培养基中，于30℃、150rpm条件下培养48h，所得发酵液进行絮凝活性的判定，将具备絮凝活性的样品留作复筛。
复筛方法：将初筛所得具有絮凝活性的样品进一步划线分离得到单菌落；挑取单菌落再次接种于发酵培养基中，于30℃、150rpm条件下培养48h；所得发酵液进行絮凝活性的测定，将絮凝活性较好的样品转接平板培养基进行培养；重复上述步骤2～3次，最终获得一株絮凝活性较好且稳定的菌株交替单胞菌(Alteromonas sp.)H-6，于甘油管中保藏。
絮凝活性的判定：称取40mL高岭土溶液(10g/L)于50mL比色管中，依次加入2.5mLCaCl2溶液(10g/L)及1mL待测液，加去离子水至50mL刻度线，充分混合，静置，目测比色管中溶液是否有快速絮状沉淀过程，如有则判定该样品具备絮凝活性。
絮凝活性的测定：称取40mL高岭土溶液(10g/L)于50mL比色管中，依次加入2.5mLCaCl2溶液(10g/L)及1mL待测液，加去离子水至50mL刻度线，充分混合，迅速置于比色皿中，静置5min后，于550nm下测定其吸光度。以空白发酵培养基作空白测定。计算公式如下：
式中，A：待测样品的OD550值，B：去离子水的OD550值，D：发酵液稀释倍数。
16S rDNA及生理生化特征鉴定：提取菌株H-6基因组，根据细菌通用引物对基因组进行PCR扩增，获得1500bp左右的基因片段，测定碱基序列并做系统发育树。根据《伯杰细菌鉴定手册》、《常见细菌系统鉴定手册》及相关参考文献测定菌株H-6的生理生化特征。根据16S rDNA及生理生化特征鉴定结果(见表1)，最终确定筛得菌株H-6属于Alteromonas属。
表1 交替单胞菌(Alteromonas sp.)H-6生理生化特征
*参考文献：Han B Q,Dai J X,Wang H.Isolation and identification of algina-degrading bacteria andformation of alginase[J].Acta Oceanologica Sinica,1999,l18(4):555-561.
注：+表示阳性，-表示阴性，0表示未做
利用海洋交替单胞菌制备生物絮凝剂的方法如下：
1)将甘油管中保藏的菌种接入种子培养基中培养，然后接入斜面培养基中继续培养；
2)将新鲜斜面上的菌落接于种子培养基中培养，取种子液接入发酵培养基培养，得生物絮凝剂；
3)将生物絮凝剂发酵液第一次离心，除去沉淀，收集上清液，在上清液中加入无水乙醇，于4℃冰箱静置过夜后进行第二次离心，除去上清液，将沉淀物溶于水中，用透析袋透析，向透析后的溶液中加入无水乙醇，静置后进行第三次离心，收集最终沉淀物，干燥后即得到生物絮凝剂纯品。
在步骤1)和2)中，所述种子培养基的组成可为：蛋白胨2～7g/L、酵母膏0.5～2g/L、柠檬酸铁0.05～0.2g/L，海盐20～40g/L，pH7.0～8.0；所述培养的条件可为20～35℃下150rpm培养12～24h。
在步骤1)中，所述斜面培养基的组成可为：蛋白胨2～7g/L、酵母膏0.5～2g/L、柠檬酸铁0.05～0.2g/L，海盐20～40g/L，琼脂1.5～2.0g/L，pH7.0～8.0；所述继续培养的条件可为20～35℃下150rpm培养24～48h。
在步骤2)中，所述种子液接入发酵培养基培养的接种量按质量百分比可为种子培养基的4％；所述发酵培养基的组成可为：葡萄糖5～15g/L，小麦胚芽粉0.5～2.0g/L，K2HPO40.2～1.0g/L，KH2PO40.2～1.0g/L，海盐25～40g/L，pH7.0～8.0；所述培养条件可为20～35℃下150rpm培养36～56h。
在步骤3)中，所述第一次离心、第二次离心、第三次离心的条件均可为4000～6000rpm，离心时间可为10～20min；所述加入无水乙醇的加入量按体积比均可为上清液体积的2～4倍；所述透析的条件可为6000～8000Da的透析袋于4℃下透析8～12h；所述干燥可采用真空冷冻干燥。
本发明系首次成功利用交替单胞菌合成生物絮凝剂。经实验，所得生物絮凝剂产量为7.6g/L，生物絮凝剂主要成分为多糖(含量约为75％)和蛋白(含量约为22％)，最高絮凝活性为1332.33U/mL。该絮凝剂无毒无害、无二次污染，适合大规模生产，具有良好的应用推广价值。
附图说明
图1为本发明实施例中温度对交替单胞菌合成生物絮凝剂的影响。
图2为本发明实施例中不同溶度葡萄糖对交替单胞菌合成生物絮凝剂的影响。
图3为本发明实施例中不同小麦胚芽粉对交替单胞菌合成生物絮凝剂的影响。
图4为本发明实施例中不同海盐溶度对交替单胞菌合成生物絮凝剂的影响。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明，以便为更好地理解本发明提供依据。
本发明采用的微生物为交替单胞菌(Alteromonas sp.)H-6，由本实验室筛选所得。
实施例1.利用交替单胞菌合成生物絮凝剂。
将新鲜斜面上的菌落接于100mL种子培养基中，25℃、150rpm条件下培养16h后再接入发酵培养基培养。
实施例2.如实施例1所述培养条件，考察温度对交替单胞菌合成生物絮凝剂的影响。其区别在于发酵温度为20℃。
实施例3.如实施例1所述培养条件，考察温度对交替单胞菌合成生物絮凝剂的影响。其区别在于发酵温度为30℃。
实施例4.如实施例1所述培养条件，考察温度对交替单胞菌合成生物絮凝剂的影响。其区别在于发酵温度为37℃。
实施例5.如实施例1所述培养条件，考察不同葡萄糖溶度对交替单胞菌合成生物絮凝剂的影响。其区别在于葡萄糖溶度为25g/L。
实施例6.如实施例1所述培养条件，考察不同葡萄糖溶度对交替单胞菌合成生物絮凝剂的影响。其区别在于葡萄糖溶度为30g/L。
实施例7.如实施例1所述培养条件，考察不同葡萄糖溶度对交替单胞菌合成生物絮凝剂的影响。其区别在于葡萄糖溶度为35g/L。
实施例8.如实施例1所述培养条件，考察不同小麦胚芽粉溶度对交替单胞菌合成生物絮凝剂的影响。其区别在于小麦胚芽粉溶度为0.5g/L。
实施例9.如实施例1所述培养条件，考察不同小麦胚芽粉溶度对交替单胞菌合成生物絮凝剂的影响。其区别在于小麦胚芽粉溶度为1.0g/L。
实施例10.如实施例1所述培养条件，考察不同小麦胚芽粉溶度对交替单胞菌合成生物絮凝剂的影响。其区别在于小麦胚芽粉溶度为1.5g/L。
实施例11.如实施例1所述培养条件，考察不同海盐溶度对交替单胞菌合成生物絮凝剂的影响。其区别在于海盐溶度为30g/L。
实施例12.如实施例1所述培养条件，考察不同海盐溶度对交替单胞菌合成生物絮凝剂的影响。其区别在于海盐溶度为34g/L。
实施例13.如实施例1所述培养条件，考察不同海盐溶度对交替单胞菌合成生物絮凝剂的影响。其区别在于海盐溶度为40g/L。
本发明实施例中温度对交替单胞菌合成生物絮凝剂的影响参见图1，本发明实施例中不同溶度葡萄糖对交替单胞菌合成生物絮凝剂的影响参见图2，本发明实施例中不同小麦胚芽粉对交替单胞菌合成生物絮凝剂的影响参见图3，本发明实施例中不同海盐溶度对交替单胞菌合成生物絮凝剂的影响参见图4。

Claims (10)

1.交替单胞菌(Alteromonas sp.)H-6，已于2015年03月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.10612。
2.利用如权利要求1所述交替单胞菌制备生物絮凝剂的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将甘油管中保藏的菌种接入种子培养基中培养，然后接入斜面培养基中继续培养；
2)将新鲜斜面上的菌落接于种子培养基中培养，取种子液接入发酵培养基培养，得生物絮凝剂；
3)将生物絮凝剂发酵液第一次离心，除去沉淀，收集上清液，在上清液中加入无水乙醇，于4℃冰箱静置过夜后进行第二次离心，除去上清液，将沉淀物溶于水中，用透析袋透析，向透析后的溶液中加入无水乙醇，静置后进行第三次离心，收集最终沉淀物，干燥后即得到生物絮凝剂纯品。
3.如权利要求2所述方法，其特征在于在步骤1)和2)中，所述种子培养基的组成为：蛋白胨2～7g/L、酵母膏0.5～2g/L、柠檬酸铁0.05～0.2g/L，海盐20～40g/L，pH7.0～8.0。
4.如权利要求2所述方法，其特征在于在步骤1)和2)中，所述种子培养基中培养的条件为20～35℃下150rpm培养12～24h。
5.如权利要求2所述方法，其特征在于在步骤1)中，所述斜面培养基的组成为：蛋白胨2～7g/L、酵母膏0.5～2g/L、柠檬酸铁0.05～0.2g/L，海盐20～40g/L，琼脂1.5～2.0g/L，pH7.0～8.0。
6.如权利要求2所述方法，其特征在于在步骤1)中，所述继续培养的条件为20～35℃下150rpm培养24～48h。
7.如权利要求2所述方法，其特征在于在步骤2)中，所述种子液接入发酵培养基培养的接种量按质量百分比为种子培养基的4％。
8.如权利要求2所述方法，其特征在于在步骤2)中，所述发酵培养基的组成为：葡萄糖5～15g/L，小麦胚芽粉0.5～2.0g/L，K2HPO4 0.2～1.0g/L，KH2PO4 0.2～1.0g/L，海盐25～40g/L，pH7.0～8.0；所述培养条件可为20～35℃下150rpm培养36～56h。
9.如权利要求2所述方法，其特征在于在步骤3)中，所述第一次离心、第二次离心、第三次离心的条件均为4000～6000rpm，离心时间可为10～20min。
10.如权利要求2所述方法，其特征在于在步骤3)中，所述加入无水乙醇的加入量按体积比均为上清液体积的2～4倍；所述透析的条件可为6000～8000Da的透析袋于4℃下透析8～12h；所述干燥可采用真空冷冻干燥。
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