CN103160451A

CN103160451A - 一种假交替单胞菌及其用途

Info

Publication number: CN103160451A
Application number: CN2013100208414A
Authority: CN
Inventors: 彭志兰; 柳敏海; 罗海忠; 傅荣兵; 郝云彬
Original assignee: ZHEJIANG PROVINCE ZHOUSHAN CITY AQUATIC PRODUCTS INSTITUTE
Current assignee: ZHEJIANG PROVINCE ZHOUSHAN CITY AQUATIC PRODUCTS INSTITUTE
Priority date: 2013-01-21
Filing date: 2013-01-21
Publication date: 2013-06-19
Anticipated expiration: 2033-01-21
Also published as: CN103160451B

Abstract

本发明提供的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)，该假交替单胞菌于2012年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.6795。用作海水微生物絮凝剂上时其絮凝率在92—94%。与现有技术相比，本发明提供的假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）CGMCCNo.6795用作海水微生物絮凝剂时，絮凝活性高，经实际试用比较，絮凝率超过10%左右。

Description

一种假交替单胞菌及其用途

技术领域

本发明涉及的是一种假交替单胞菌及其用途，属化学中水处理技术领域和微生物学技术领域。

背景技术

微生物絮凝剂（Microbial Flocculants）是利用生物技术，从微生物本身或其分泌物中获得的一种安全、高效、且能自然降解的新型水处理剂，一般由糖蛋白、多糖、纤维素、蛋白质、DNA和聚氨基酸等高分子物质构成，它们的分子中含有多种官能团，能使水体中的胶体和悬浮颗粒相互凝聚、沉淀，从而改良水质。微生物絮凝剂相比其他絮凝剂具有絮凝范围广、絮凝活性高、安全无害、无二次污染等特点，因此越来越受到关注，成为当今世界絮凝剂方面研究的主要对象。

随着我国水产养殖业的迅速发展，高密度、集约化养殖所排放的废水给水域环境造成巨大的压力，而其他因素造成的环境污染又对养殖水源产生破坏，水的污染已成为阻碍水产养殖进一步发展的主要因素之一。将养殖用水进行处理再利用的循环水养殖系统被认为是一种环境友好的水产养殖模式，生物絮凝技术被认为是解决水产养殖产业发展所面临的环境制约和饲料成本的有效替代技术。基于生物絮凝技术的水产养殖模式被认为是一种具有良好经济效益和生态效益的水产养殖革新技术，既可以净化水产养殖水环境，还可以实现饵料的双重利用。

对于微生物絮凝剂，尤其是专用于海水的微生物絮凝剂，中国发明专利申请“海水微生物絮凝剂的制备方法”（申请公布号CN101993137）公开了一种海水微生物絮凝剂的制备方法，“采用产紫青霉菌种发酵培养而成，操作步骤包括发酵培养基制备、菌种发酵培养和絮凝剂制备；用土豆汁为原料制备发酵培养基，将产紫青霉菌种接于发酵培养基摇床发酵培养，再将发酵培养液离心分离沉淀、冷冻真空干燥获得海水微生物絮凝剂成品。”所得絮凝剂经絮凝活性检测，结果为絮凝率达83.6%。

发明内容

针对上述不足，本发明以提高针对海水循环水养殖系统中水质净化的絮凝率为目标，筛选了新的用于海水微生物絮凝剂的微生物，提出了一种假交替单胞菌及其用途。

本发明提供的假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.），该假交替单胞菌于2012年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6795。

保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）CGMCC No.6795，其分类命名为假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.），该菌株代号为Num-8，则名称假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）Num-8与假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）CGMCC No.6795等效。

本发明提供的假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）CGMCC No.6795是从循环水养殖生物过滤池底部生物活性污泥中分离得到的野生菌种经纯化、淘汰筛选所得。其各项特性如下：

1、形态特征：在扫描电镜下，菌体呈规则的短杆状或杆状，长为2.1—2.4μm，宽为0.6—0.7μm，无芽孢和鞭毛（见附图1）。革兰氏染色后在油镜下，菌体呈短杆状、杆状，为革兰氏阴性。

2、生化特征：氧化酶阳性、d-二蜜糖阴性、阿拉伯糖阴性、蔗糖阴性、L-鼠李糖阴性、维生素P阴性、葡萄糖阴性、不产硫化氢、柠檬酸盐利用阳性、色氨酸脱羧酶阴性、精氨酸双水解酶阴性、β-半乳糖苷酶阳性、尿素酶阴性，生长酸度为pH6—10，生长温度为20—30℃。

3、生理特征：能利用碳源中的葡萄糖、蔗糖、果糖，氮源中的蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵、硝酸钠、酵母浸粉。

4、培养特征：在营养琼脂培养基平板上过夜培养后，目视观察到菌落形态为乳白色，表面光滑，边缘整齐，中央有突起的圆形菌落。

5、保藏方法：营养琼脂斜面或瓷珠保种管-70℃超低温冰箱保存。

本发明提供的假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）CGMCC No.6795的用途，是应用于海水微生物絮凝剂，如以菌株的冻干粉为海水微生物絮凝剂，其絮凝率在92—94%。

与现有技术相比，本发明提供的假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）CGMCC No.6795用作海水微生物絮凝剂时，絮凝活性高，经实际试用比较，絮凝率超过10%左右。

附图说明

图1：假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）Num-8菌体扫描电镜显微图片，图中菌体呈规则的短杆状或杆状，无芽孢和鞭毛。

具体实施方式

一、假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）CGMCC No.6795的分离筛选：

培养基，培养基中所涉各组份的含量单位均为g/L：

a、固体分离培养基：以蛋白胨10.0、酵母浸粉2.0、柠檬酸铁0.15、氯化钠20.0、氯化镁6.0、氯化钙2.0、硫酸钠3.0、碳酸钠0.2、氯化钾0.6、磷酸氢二钠0.8、琼脂15.0混合后，调节pH至6.8—7.5，再在121℃下高压灭菌15min后制成。

b、液态分离培养基：以蛋白胨10.0、酵母浸粉2.0、柠檬酸铁0.15、氯化钠20.0、氯化镁6.0、氯化钙2.0、硫酸钠3.0、碳酸钠0.2、氯化钾0.6、磷酸氢二钠0.8混合后，调节pH至6.8—7.5，再在121℃下高压灭菌15min后制成。

c、营养琼脂培养基：以蛋白胨10.0、牛肉膏5.0、氯化钠15.0、琼脂15.0混合后，再在121℃下高压灭菌15min后制成。

d、筛选培养基：

d1、碳源筛选培养基：三种碳源筛选培养基分别以葡萄糖10.0、蔗糖10.0、果糖10.0为碳源与其余成分混合，在121℃高压灭菌15min后制成。

d2、氮源筛选培养基：六种氮源筛选培养基分别以蛋白胨5.0、牛肉膏5.0、尿素5.0、硝酸钠5.0、硫酸铵5.0、酵母粉5.0为氮源与其余成分混合，在121℃高压灭菌15min后制成。

筛选培养基中其余成分为柠檬酸铁0.15、氯化钠20.0、氯化镁6.0、氯化钙2.0、硫酸钠3.0、碳酸钠0.2、氯化钾0.6、磷酸氢二钠0.8。

分离筛选：

取循环水养殖生物过滤池底部生物活性污泥水为样品1000mL，充分混匀，取25mL污泥水样，加入到225mL灭菌生理盐水中，对稀释样品进行梯度稀释，稀释浓度分别为10⁰，10^-1，10^-2，10^-3，10^-4倍。将固体分离培养基倒入15—20mL至灭菌的培养皿中，待凝固后，用移液枪分别从不同稀释度溶液中吸取0.2mL加入到已配置好的培养皿中，然后用玻璃涂布棒均匀涂布。放置在温度为28℃的生化培养箱中培养24小时。挑取单菌落采用营养琼脂培养基平板划线纯化培养2次。纯化培养结束后从培养基上挑选单菌落，接种到装有50mL液态分离培养基的容量为150mL的锥形中，在温度为28℃、转速为160r/min下恒温振荡培养24h后作为种子液。加入1mL该种子液到装有100mL液态分离培养基的250mL锥形瓶中，在温度为28℃、转速为160r/min下恒温振荡培养96h。期间每隔12h测其絮凝活性以初步筛选出有较好絮凝活性的菌株。

所述絮凝活性测定方法为：

絮凝活性的初筛：在100mL比色管中加入4g/L高岭土悬浊液98mL，加入2mL培养液到此悬浊液中，充分振荡混匀后，观察到高岭土悬浊液中有较大的矾花出现，出现此现象的即为有絮凝活性的菌株。

絮凝活性的测定：将初筛出有絮凝活性的菌株采用平行发酵培养，通过相同条件培养后，以同体积的未加菌的培养液为空白对照，在相同条件下测其对波长为600nm的光的吸光度。最后通过公式[(A-B)/A]×100%计算其絮凝率（A为空白对照上清液的吸光度；B为样品上清液的吸光度）。

采用控制变量法（即在加碳源时氮源不加，首先筛选出碳源，在筛选出碳源的基础上添加不同的氮源）对初筛选出的菌株进行碳源、氮源的筛选，筛选结果：

最后确定以蔗糖为碳源，以硫酸铵、硝酸钠、蛋白胨、牛肉膏为氮源时选得的菌株为本发明提供的应用于海水微生物絮凝剂的假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.），其絮凝率为92—94%。尤其是以蔗糖为碳源，以牛肉膏为氮源时选得的菌株为本发明提供的应用于海水微生物絮凝剂的假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.），其絮凝率为94%。

二、假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）Num-8 16S rDNA的PCR扩增与测序：

用细菌总DNA提取试剂盒提取假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）Num-8基因组DNA，用所得基因组DNA为模板进行PCR扩增反应。扩增引物采用细菌通用引物，其中前引物为27F（5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′），后引物为1492R（5′-GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3′），引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR扩增反应体系：10mM 氯化镁 2.0μL，10×PCR buffer 2.5μL，10mM dNTPs 1.0μL，10 μM正反引物各1.0 μL，2 U/μL Taq DNA 聚合酶（Taq DNA polymerase，上海生工生物工程技术服务有限公司出品）1.0 μL，100 ng/μL 基因组DNA模板1.0 μL，双蒸水15.5 μL，共25μL。PCR扩增条件为：94℃预变性5 min，94℃ 1 min，58℃ 1min，72℃ 2 min，共30个循环，最后72℃延伸 10 min，4 ℃保存。

PCR扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳。其条带在1500bp左右。PCR扩增产物经克隆测序，测得16S rDNA序列为1437bp。该16S rDNA序列提交美国国立生物技术信息中心（NCBI）用BLAST（局部序列比对基本检索工具）进行序列比对（在GenBank中登录号为JX435820），比对结果显示与多株假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp. ）的16S rDNA序列相似性达到99%。选取相似性最高的序列构建系统发育树，结合细菌形态特征、生长条件、生理生化等鉴定结果确定假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）Num-8为假交替单胞菌属中的一个新菌种。

三、假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp. ）Num-8的培养：

所使用的培养基：

营养琼脂培养基：所含成份为牛肉膏5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、氯化钠5.0g/L、琼脂15.0g/L，pH值为6.8—7.5，经121℃高压灭菌15min后制得。

优化培养基：所含成份为蔗糖5.0—10.0g/L、牛肉膏2.5—5.0g/L、柠檬酸铁0.15g/L、氯化钠20.0g/L、氯化镁6.0、氯化钙2.0g/L、硫酸钠3.0g/L、碳酸钠0.2g/L、氯化钾0.6g/L、磷酸氢二钠0.8g/L，经121℃高压灭菌15min后制得。

培养条件：

将营养琼脂培养基斜面保存的假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）Num-8用接种环挑取一环该菌接种于优化培养基中，在26—32℃温度下以转速为140—200 r/min的摇床振荡培养18—24h后做为种子液。

四、假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）Num-8的使用方法：

从营养琼脂培养基斜面挑取一环菌苔或者从-70℃超低温冰箱保存的瓷珠保种管中挑取1颗瓷珠，接入装有50mL优化培养基的250mL锥形瓶中，在26—32℃温度下以转速为140—200 r/min的摇床振荡培养18—24h即可完成活化，将活化后的菌液按1%—2%体积比接种于优化培养基中进行继续培养36—96h。培养36h后的菌液即具有絮凝活性，可作为海水微生物絮凝剂原液。

五、海水微生物絮凝剂的纯化：

培养36—96h后的作为海水微生物絮凝剂原液的富集培养液即为发酵液，常温下将发酵液在转速为8000—10000r/min下离心10—20min，获得发酵上清液。将1倍体积的去离子水加入到发酵上清液中充分混匀后按照前述方法再次离心15min，弃去不溶物。然后在所余上清液中加入2倍体积的乙醇充分混匀后置于4℃冰箱中静置12h，弃去上清液，将下层沉淀真空干燥后即获得絮凝剂粗产物。将粗产物加入到适量蒸馏水中，再加入1倍体积的氯仿正丁醇（氯仿︰正丁醇为5︰2 ，v/v）充分混匀后，室温下静置12h。吸取上层液体在转速为8000—10000r/min离心15min，再将上清液在40℃下进行浓缩至原体积的1/5，加入2倍体积的乙醇，置于4℃冰箱中静置12h。弃去上清液，将下层沉淀真空干燥后获得纯海水微生物絮凝剂成品。

通过上述方法可得专门用于海水处理的微生物絮凝剂，该絮凝剂具有高絮凝活力，絮凝效果比较理想，工艺简便，便于应用推广。

Claims

1.一种假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.），其特征是该假交替单胞菌于2012年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6795。

2.如权利要求1所述的假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）CGMCC No.6795，其特征是该假交替单胞菌是从循环水养殖生物过滤池底部生物活性污泥中分离得到的野生菌种经纯化、淘汰筛选所得。

3.如权利要求1或2所述的假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）CGMCC No.6795的用途，其特征是应用于海水微生物絮凝剂，其絮凝率在92—94%。

4.如权利要求3所述的假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）CGMCC No.6795的用途，其特征是在所述海水微生物絮凝剂的制备中该菌的培养方法是将假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）Num-8菌种接种于优化培养基中，在26—32℃温度下以转速为140—200 r/min的摇床振荡培养18—24h后做为种子液；

所用优化培养基含有蔗糖5.0—10.0g/L、牛肉膏2.5—5.0g/L、柠檬酸铁0.15g/L、氯化钠20.0g/L、氯化镁6.0、氯化钙2.0g/L、硫酸钠3.0g/L、碳酸钠0.2g/L、氯化钾0.6g/L、磷酸氢二钠0.8g/L。

5.如权利要求3所述的假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）CGMCC No.6795的用途，其特征是所述海水微生物絮凝剂的制备方法是先将假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）Num-8菌种接入装有50mL优化培养基的250mL锥形瓶中，在26—32℃温度下以转速为140—200 r/min的摇床振荡培养18—24h完成活化，将活化后的菌液按1%—2%体积比接种于优化培养基中继续培养36—96h，得海水微生物絮凝剂原液；

6.如权利要求5所述的假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）CGMCC No.6795的用途，其特征是所述海水微生物絮凝剂原液的纯化方法是在常温下将海水微生物絮凝剂原液在转速为8000—10000r/min下离心10—20min，获得发酵上清液；再将1倍体积的去离子水加入到发酵上清液中充分混匀后按照前述方法再次离心15min，弃去不溶物；然后在所余上清液中加入2倍体积的乙醇充分混匀后置于4℃冰箱中静置12h，弃去上清液，将下层沉淀真空干燥后即获得絮凝剂粗产物；再将粗产物加入到适量蒸馏水中，再加入1倍体积氯仿正丁醇充分混匀后，室温下静置12h，其中氯仿正丁醇中氯仿和正丁醇的体积比为5︰2；然后吸取上层液体在转速为8000—10000r/min离心15min，再将上清液在40℃下进行浓缩至原体积的1/5，加入2倍体积的乙醇，置于4℃冰箱中静置12h；最终弃去上清液，将下层沉淀真空干燥后获得纯化的海水微生物絮凝剂。